Tıbbi Biyoloji: Rekombinant DNA Teknikleri

Yeni bir bileşim olayı. DNA’da doğal olarak meydana gelir ve genetik varyasyonlar oluşturur.

Rekombinasyon sonucunda oluşan değişikliklerden bazıları hücrenin/bireyin değişen çevresel şartlara adaptasyon göstermesini sağlar, bazıları ise hücre/birey için zararlı olabilir.

Günümüzde DNA rekombinasyonu hücre dışı ortamda yani test tüpleri içinde gerçekleştirilebiliyor.

rDNA teknolojisinin kullanıldığı alanlardan biridir. Spesifik bir gen veya DNA dizisinin klonlanması ve tanımlanmasını sağlar.

rDNA teknolojisinin kullanıldığı alanlardan biridir. Gen ürünlerinin (Protein veya RNA) ilaç olarak kullanılmak üzere (aşı, enzim, hormon, antikor gibi) etkin ve yüksek miktarda üretimi sağlar.

rDNA teknolojisinin kullanıldığı alanlardan biridir. Mutasyon/polimorfizm tespiti ile hastalıkların tanısı, genetik defektlerin düzeltilmesi, Adli Tıpta-DNA parmak izi ve hastalıkların mekanizmalarını çözmek için transgenik model organizmaların üretimi sağlar.

rDNA teknolojisinin kullanıldığı alanlardan biridir. Zor iklim ve çevre şartlarına dayanıklı, verimi yüksek bitki ve hayvanların üretilmesini sağlar

1960’lı yıllarda bulunan ve DNA’yı özel bölgelerden kesen enzimlerdir.

Bir tek hücreden mitoz bölünme ile üretilen ve genetik olarak birbirinin aynı hücreler grubudur.

Rekombinant DNA’nın elde edildikten sonra bir konak hücreye aktarılması ve hücrelerin bölünerek çoğalması sırasında rDNA moleküllerinin ve rProteinlerin saf ve yüksek miktarda elde edilmesini sağlayan yöntemdir.

DNA/Gen/Protein düzeyinde klonlama, Hücre düzeyinde klonlama, Organizma/çekirdek düzeyinde klonlama olmak üzere üç kategoriye ayrılır.

1950’li yıllarda başlayan ve 1978 yılında ilk tüp bebeğin doğumu ile büyük bir başarıya ulaşan, günümüzde de devam eden bir teknolojidir.

Klonlanacak genin hücresel kromozomdan bağımsız şekilde replike olabilen bir Taşıyıcı DNA molekülüne (vektöre) yerleştirilmesi, rekombinant Vektör DNA’nın transfer edileceği ve çoğaltılabileceği uygun bir Konak hücre bulunması, rekombinant ve non-rekombinant konak hücre klonlarının kolayca seleksiyonunun yapılması.

Genomik DNA’nın saf olarak elde edilmesi, hedef genin veya gen bölgesinin Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile çoğaltılması, genomik DNA ve vektör DNA’nın aynı RE ile kesilmesi, DNA Ligaz enzimi ile vektör ve genomik DNA parçalarının birleştirilmesi, rekombinant vektör DNA’sının konak hücreye aktarılması, rekombinant klon seçimi.

DNA’ya ulaşmak için önce varsa hücre duvarı ve sonra hücre membranının parçalanması fiziksel ve kimyasal yöntemlerle sağlanır.

Lizis tamponu içinde bulunan deterjan, tuz, EDTA, Proteinaz K enzimi, RNaz A enzimi DNA’nın parçalanmasını ve arındırılmasını sağlar.

Lizis aşamasında parçalanan hücresel atıkların uzaklaştırılması için DNA’yı tutma özellikli spin kolonlar içeren saflandırma kitleri kullanılır.

Restriksiyon endonükleaz enzimleri (RE) DNA’yı özel bölgelerden kestiği için kullanılır.

Hedef gen dizisinin en azından bir kısmının önceden bilinmesi gerekir. PCR için, kalıp DNA, sentetik 1 çift primer, Taq DNA polimeraz enzimi, dNTP’ler, uygun tampon çözeltisi ve PCR cihazına ihtiyaç vardır.

Spesifik bir nükleotit çifti dizisini tanır ve bu dizi içinde spesifik kesim yaparlar.

Tanıma dizileri 4, 5, 6, 7 ve 13 nükleotit uzunluğunda olabilir ve palindromik / ters tekrar şeklindedir.

İki iplikteki kesim noktası karşılıklıdır ve çift iplikli DNA’nın her iki ipliğinde küt uçlar oluşur.

İki iplikte kesim noktaları farklıdır ve çift iplikli DNA’nın her iki ipliğinde birbirine komplementer tek iplikli DNA kuyrukları oluşur.

Genomik DNA ve vektör DNA’nın aynı RE ile kesilmesi, aynı uçlara sahip kesilmiş DNA’ların birleştirilmesi için gereklidir.

DNA Ligaz enzimi kesilmiş DNA moleküllerinin uçlarını birleştirerek tam DNA molekülünü oluşturur.

Kendini bağımsız olarak replike edebilmeli, vektörün çoğaltılabileceği uygun bir konak hücresi olmalı, seçilebilir belirleyici (muhbir gen) bölge/bölgeleri taşımalıdır, vektör istendiğinde konak hücreden kolayca izole edilebilmelidir.

Klonlanacak genin büyüklüğü, konak hücrenin tipi, klonlanan genden protein ürünü elde edilme ihtiyacı vb.

Bakterilerde doğal olarak bulunan, dairesel ve çift sarmal yapıdaki kromozom dışı DNA molekülleridir. 5–10 kb uzunluğunda gen taşıyabilirler.

Bakteriyofaj λ, bir bakteri virüsüdür ve gen taşımak için kullanılır.

Plazmit ve bakteriyofajlardan daha büyük DNA parçaları taşıyabilen vektörlerdir.

Birden fazla konakçı hücrede replike olan vektörlerdir.

Rekombinant proteini yüksek miktarda üretmek için kullanılan, promotor bölgesi bulunan vektörlerdir.

Genom sekanslama projeleri için uygun, 100-500 kb DNA taşıyabilen vektörlerdir.

İnsan Genom Projesinde kullanılan, kendi sentromer ve telomerlerine sahip, 1 Mbp DNA taşıyabilen vektörlerdir.

Elektroporasyon, mikroenjeksiyon, partikül bombardımanı (gun shot), lipofeksiyon gibi yöntemlerle rekombinant vektör DNA’sı konak hücreye aktarılır.

X-Gal, ß-galaktozidaz enziminin substratıdır ve bu enzim X-Gal’ı parçaladığında mavi renk oluşur. Bu yöntem, rekombinant ve non-rekombinant bakteri kolonilerinin ayırt edilmesinde kullanılır.

Rekombinant proteinlerin kontaminasyondan arındırılması ve saf olarak elde edilmesi gereklidir.

Bir koyunun meme epitel hücresinin çekirdeği, çekirdeği alınmış bir yumurta hücresine transfer edilerek zigot elde edilip başka bir koyuna nakledilerek aynı genotip ve fenotipte kuzu elde edildi.

Nükleer klonlama çalışması, farklılaşmasını tamamlamış yetişkin memeli hücrelerinin yeniden programlanabileceğini gösterdi.