PRUEBA 4 GENÉTICA.docx

PCR. ==== Polymerase chain reaction (PCR) → tipo de tecnología importante en la biología molecular. - Una pequeña cantidad despreciable de ADN original que al replicarla, obtenemos una cantidad más grande de ADN. Tener una cantidad pequeña de ADN original y que este fragmento se multiplique n...

PCR. ==== Polymerase chain reaction (PCR) → tipo de tecnología importante en la biología molecular. - Una pequeña cantidad despreciable de ADN original que al replicarla, obtenemos una cantidad más grande de ADN. Tener una cantidad pequeña de ADN original y que este fragmento se multiplique nos permite obtener un gen nuevo. ### DIAGNÓSTICO. Para un diagnóstico se intenta amplificar un segmento en particular que pertenece al genoma del virus. - - La polimerasa 3 requiere un "primer" para polimerizar, si no está la polimerasa no se replica el ADN. Este "primer" fisiológicamente es de ARN.  Podemos utilizar un "primer\" diseñado con una secuencia en particular, mezclarlo con un ADN en particular y por complementariedad de bases esperar que el "primer" se alinee con la hebra de ADN templado. - La pol 3 necesita un OH libre apareado en 3'. ### DISEÑAR UN PRIMER. 1. 2. Al venir en gran cantidad (12 nanomoles) tendremos miles de millones de moléculas que podremos utilizar para muchas acciones diferentes. En Chile cuesta aproximadamente \$8.000 o \$10.000. ### USO DE UN PCR. Debemos conocer el lugar que queremos amplificar, el cual está acotado por los 2 "primers". Cada uno apunta a una de las hebras. Tendremos 3 cambios de temperatura que se repetirán muchas veces (entre 30 a 40 veces). Cada ciclo de cambio de temperatura, se le conoce como ciclos de PCR. - - - - ### CICLOS DE PCR. Existe un área Target, por lo que debemos diseñar un "primer" que calce en los márgenes del área Target. 1. 2. 3. 4. 5. Un "primer" se alinea a la hebra original y otro "primer" del mismo tipo se alinea a la hebra recién construida en la replicación anterior.  Primer forward → se alinea a la hebra original de ADN y en a la hebra construida en la replicación anterior. Primer rivers → se alinea a la hebra construida en la replicación anterior y en la hebra original de ADN. En el 2do ciclo de replicación, la extensión de la hebra nueva llega a un límite, es más corta. Se amplifican de una forma aritmética (menor), ciclo a ciclo se va exponencialmente amplificando un área específica. -  A PARTIR DE MUY POCAS COPIAS ORIGINALES OBTENEMOS MILES DE MILLONES DE COPIAS. ### RECETA PARA UN PCR. - - - - Se mezclan en un tubo con un buffer (agua y sales que aportan un pH estable y un contenido de otros elementos necesarios para la polimerasa. Ej: magnesio). Colocamos el tubo en un termociclador, el cual realiza cambios de temperatura rápidamente, ejecutando los ciclos que le indiquemos. 1. 2. 3. Para los PCR utilizamos TAC polimerasa, la cual resiste altas temperaturas por qué vive en fuentes hidrotermales. - ### RESULTADOS. Evaluamos los resultados del PCR en geles de agarosa, el cual tiñe el ADN con bromuro de etidio para hacerlo fluorescente. 1. 2. 3. 4. El ADN quedó en un lugar específico porque tiene el tamaño esperado para obtener un resultado. En el caso de la imagen en blanco y negro, tenemos 4 pacientes, de los cuales solo 3 dieron un resultado positivo (hubo amplificación por PCR), la muestra que dió un menor tamaño no hubo una amplificación de PCR, por lo que no está en la ubicación deseada. ### APLICACIONES PRINCIPALES. - - → Si el patógeno está presente, los "primers" calzan y ocurre la amplificación, obteniendo como resultado experimental una gran cantidad del fragmento pequeño del ADN del patógeno. Los PCR son muy sensibles, una pequeña cantidad del ADN del patógeno es detectada, aunque solo haya una bacteria. También, es muy específico para detectar patógenos, si el patógeno no está presente la señal que transmite el 0. RT-PCR. ------- Existen virus que tienen ARN como material genético, por lo que no se pueden detectar directamente por el PCR. - Después de esto podemos realizar el PCR, que pasaría a llamarse RT-PCR por la retrotranscriptasa. PCR EN TIEMPO REAL. ------------------- Hoy en día se utiliza un termociclador acoplado a un fluorómetro en vez de usar un gel de agarosa. El cual además de generar cambios de temperatura, genera Fluorescencia, tiñendo fluorescente el ADN amplificado. - - - TEST CON ANTICUERPOS. --------------------- Anticuerpos → proteínas que se unen fuertemente a otras proteínas, existen algunos casos donde se unen a otras moléculas (lípidos). - - ### FUNCIONES FISIOLÓGICAS. - - Porque los virus aglutinados no pueden infectar, tienen que estar como unidades libres. - ### FUNCIONES EN EL LABORATORIO. Se usan para diagnosticar, tienen un área variable y un área constante. - - En el cuerpo tenemos cientos de millones de anticuerpos diferentes, y cada uno es producido por un linfocitos diferente. - Estos linfocitos que producen esa variedad de anticuerpos diferentes son generados durante nuestro desarrollo embrionario. También, se eliminan (selección negativa) líneas de linfocitos que con sus anticuerpos reaccionan a proteínas propias del organismo. Quedando con una diversidad de linfocitos B y anticuerpos que se unen a millones de cosas diferentes al azar. Para cualquier proteína que nos invada de algún patógeno, existirá algún linfocito B que tenga anticuerpos que calcen con esa proteína exógena. El sistema inmune media una reacción celular para que ese linfocito en particular se replique masivamente. También podemos hacer anticuerpos mediante un conejo. 1. 2. 3. 4.  El plasma sanguíneo del conejo que fue inyectado, semanas después estará lleno de anticuerpos específicos para el patógeno. No muere por la enfermedad pero su cuerpo estará lleno de anticuerpos específicos para esta enfermedad. El área variable es la encargada de unir el anticuerpo con las proteínas, por lo que podemos marcar el área constante mediante moléculas fluorescentes o con enzimas que generan color. - ### DETECTAR PATÓGENOS. Para detectar patógenos utilizamos dos anticuerpos en serie. 1. 2. De esta forma podemos detectar más de una enfermedad. ### IFAT. Técnica para el diagnóstico dónde un macerado del tejido o sangre (dónde se ubica el patógeno) se coloca en un portaobjetos, se baña en acetona o metanol para que las células colocadas anteriormente queden fijas y permeables (Pueden ingresar anticuerpos en la célula) 1. 2. 3. En IFAT el anticuerpo secundario está conjugado con una molécula fluorescente (FITC). Por lo que debe observarse bajo microscopio de Fluorescencia. -  Imagen 1: Bacteria Piscirickettsia. Está bacteria al ser intracelular puede invadir las células eucariontes y ubicarse en su citoplasma. Imagen 2: Célula eucarionte, su núcleo y la bacteria unida a esta célula. TEST ELISA. ----------- Ensayo mediado por anticuerpos, detecta proteínas. Elisa → ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. - - - El Test se lleva a cabo en unas "Placas de Elisa" de 96 pocillos, el plástico que se utiliza está diseñado para que las moléculas (proteínas) se peguen a sus superficies. Tener 96 pocillos permite realizar 96 muestras al igual que el PCR.  ### FORMAS DE REALIZARLO. Similar al IFAT Las proteínas del paciente las colocamos en cada uno de los pocillos de las "Placas de Elisa". 1. 2.  Si la proteína del patógeno está presente, el anticuerpo primario se va a pegar una vez agregado. Si la proteína del patógeno no está presente, el anticuerpo se va a soltar. 3. 4. 5. El anticuerpo secundario está marcado con enzimas llamadas peroxidasas o fosfatasas alcalinas. 6. Solo se colorea la solución de revelado si la proteína del patógeno está presente. Entre más proteínas del patógeno haya, más anticuerpos primarios primarios, más enzimas y más coloración habrá. MAYOR COLORACIÓN → MÁS PATÓGENOS. El diagnóstico se evalúa en los "Lectores de Elisa", corresponden a aparatos que hacen pasar un láser o luz a través de los pocillos y mediante un detector ubicado al otro lado de los pocillos podemos medir que tan oscuro es el líquido. MÁS OSCURO → MÁS PATÓGENOS. Este sistema nos permite tener en cuestión de segundos un resultado.  Los positivos se colorearon de amarillo, los negativos contienen liquido pero no se colorearon. De esta forma, podemos observar un positivo en el test de Elisa. Lector de Elisa, donde colocamos la placa Elisa para que lea el resultado. ELISA - Serología Cuando queremos detectar patógenos humanos, utilizamos otro sistema más sensible. Un test serológico, que detecta anticuerpos específicos que el paciente creó contra el patógeno. 1. 2. 3. Si el paciente está contagiado con el virus, va generar una reacción inmune generando anticuerpos contra la enfermedad. Por lo que, los anticuerpos del suero del paciente se van a unir a la proteína del patógeno. 4. Este es un test más sensible que el anterior, ya que un paciente puede tener poca infección (recién comenzando) pero ya al haber montado una reacción inmune, su plasma sanguíneo va a estar lleno de anticuerpos contra el patógeno. TRANSGÉNICOS. ============= Evolución artificial del choclo mediante cruzas. TRANSGENESIS ARTIFICIAL. ------------------------ Proceso de modificación genética directo y específico, donde se implica el traspaso de un gen de una especie a otra, en ocasiones entre reinos, no necesariamente de la misma especie. A los organismos que se le inserta un gen de otra especie se les conoce como "GMO/OMG". - -  Una buena parte de la soya (85 - 90%) cultivada es transgénica, sobre el 75% del maíz que se cultiva es transgénico.  El número de hectáreas dedicadas a los transgénicos ha crecido a través de los años. Hoy en día la mayoría de las hectáreas dedicadas a cultivos son transgénicas. Los transgénicos son de bastantes variedades pero los más comunes son: - - - - - Los transgénicos no son un problema para la salud humana, la gran mayoría de los estudios realizados acreditan que estos no son un problema para la salud humana. ### MITOS SOBRE LOS TRANSGÉNICOS. - Estos genes pueden pasar a la célula del intestino grueso en personas que se les retiró el intestino delgado. - Personas alérgicas a la nuez comieron soya transgénica con un gen de nuez, lo que les produjo alergia. - Le dieron un transgen en particular que estaba presente en una papa a unos ratones, no murieron pero sí presentaron problemas de nutrición. Estos casos excepcionales fueron las causales para crear estos mitos. ### REALIDADES SOBRE LOS TRANSGÉNICOS. - Los cultivos agrícolas tradicionales tienden a la homogeneización, les interesa las más rendidoras o las que el público quiere. Los transgénicos harían el cultivo agrícola más eficiente, llegando en algún momento a ser todos transgénicos. POSIBLE SOLUCIÓN; TRANSGÉNICOS QUE NO PRODUCEN POLEN. - No es un problema importante cuando transan las grandes empresas, solo a nivel de agricultores locales. POSIBLE SOLUCIÓN: REGULACIÓN ESTATAL. -  Podemos observar que el choclo aún conserva su especie nativa. TRANSGÉNESIS EN CHILE. ---------------------- La ley permite la producción de semillas transgénicas, no de productos. Encontrando hectáreas dedicadas a la producción de semillas transgénicas para su venta. Ej. El tomate, no podemos decir que es un alimento transgénico. Ya que en Chile no se permite la comercialización de productos transgénicos, sólo la cruza de genes. La mayoría de los alimentos que están en los supermercados contienen extractos de soya y maíz los cuales contienen un porcentaje elevado de transgénicos. -  Pollo grande → para carne. Pollo pequeño → ponedor de huevos. Fueron modificados durante décadas para llegar a lo que son hoy en día, no mediante transgénesis pero si modificados genéticamente. INSERCIÓN DEL GENOMA (TRANSFECCIÓN) -----------------------------------  Las plantas transgénicas son generadas por la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual causa naturalmente tumores en las plantas, donde la bacteria crece en estos tumores hasta que el tumor termina cayendo al suelo, esparciendo la enfermedad. La bacteria genera el tumor mediante un plásmido llamado Plásmido TI, el cual tiene 3 áreas principales. Genes de transferencia → está encargada de transferir los genes del plásmido al genoma de la célula huésped, el cual se transfiere a dos genes principales. - - Ya a este punto el plásmido de agrobacterium ya se ha modificado para que en vez de tener estos 3 genes usados en biotecnología, tenga solo los de transferencia. A los cuales le agregamos el plásmido en forma recombinante, un gen de interés (cualquiera).  Lo que se infecta con agrobacterium portando el gen de interés, son yemas germinales de la planta que queremos generar de forma transgénica. - El gen de interés se utiliza para infectar estas yemas totipotenciales (crecidas en laboratorio) y cuando son finalmente cultivadas, toda la planta tiene células ya modificadas mediante agrobacterium. Las semillas resultantes generaron plantas transgénicas. ### EJ. PLANTA CON UN GEN DE INSECTO  ### EJ. TOMATE LARGA VIDA. Maduración o senescencia → se echa a perder por la vejez del alimento. Putrefacción → se echa a perder por bacterias. En el tomate, la senescencia está controlada por la hormona Etileno. Pero en este Tomate larga vida, le agregaron una proteína que rompía el etileno. Esta proteína solo se expresa en el momento de la senescencia, no al momento de maduración. Este gel que controla la proteína de un fago de un virus que rompe la vía del etileno, debe ser producida sólo en senescencia. - ### EJ. TRANSGÉNICO COMERCIAL DE MONSANTO. Produce una proteína que mata larvas de insectos llamada bacteria bacillus thuringiensis (Bt), muchas plantas están modificadas con el gen de esta proteína. - -  ### EJ. TRANSGÉNICO CON IMPACTO SOCIAL. Fue generado para contrarrestar un virus que afecta a la papaya, virus que impide el crecimiento de la papaya. - ### EJ. TRANSGEN DEL ARROZ. El principal alimento es el arroz, se intentó agregar vitamina A a los granos de arroz. Esta serie de proteínas (2 o 3) fueron puestas en un transgen generando el "Arroz dorado".  ### EJ. TRANSGÉNICO CON RESISTENCIA A HERBICIDAS. Si plantamos un determinado vegetal este va a tener competencia por nutrientes y agua con las malezas, las cuales debemos eliminar utilizando herbicidas. - Monsanto inventó un sistema donde le provee un herbicida para las malezas llamado "Glifosato", el cual provee la semilla transgénica que rompe el herbicida volviendo a la planta resistente al herbicida. El problema de esto es que las malezas se han ido haciendo resistentes al glifosato, por lo que la recomendación en vez de cambiar el herbicida, ha sido agregar mayor cantidad de Glifosato. POR ESTE MOTIVO EN ARGENTINA Y BRASIL HAN LLEGADO A USAR 10 VECES LA CANTIDAD DE GLIFOSATO. Esa concentración de Glifosato es tóxica y cancerígena, provocando un problema de salud grave en muchas personas. No es generado por el transgénico en sí, pero si por un producto relacionado. - Este transgénico al ser el más común y más usado, ha dado una mala fama a los transgénicos en general, contaminando el suelo con grandes cantidades de herbicidas. PERSPECTIVAS. -------------  Todos estos ya están en una etapa avanzada de experimentación, pero lejos de la parte comercial. Que tan lejos lleguen dependerá de la opinión pública. - TERAPIA GÉNICA. =============== Se ha experimentado con terapias génicas, las cuales buscan modificar o insertar ADN dentro de las células dañadas para poder compensar el problema. ### VIRUS ADENO-ASOCIADOS. Usan virus para lograr transferir el genoma, los más usados son los virus "Adeno-asociados", los cuales no son efectivos por sí mismos, generalmente necesitan adenovirus. - Los virus adeno-asociados se pueden controlar si queremos tener una expresión transiente o podemos agregar proteínas para que la expresión sea permanente. - ### RETROVIRUS. Esta es otra forma de terapia génica, la cual consta de modificar las células del paciente y su reinserción en el paciente. - Los retrovirus también tienen la propiedad de insertar el ADN en la célula huésped. - También existen tecnologías para microinyectar ADN, a veces se integran por azar. TIPOS DE INMUNIDAD. ------------------- Las dos actúan como un sistema completamente integrado, dependen el uno del otro por lo que si no hay una señal del sistema innato no se gatilla la inmunidad adaptativa. - Ej. Casi todas las bacterias tienen LPS, nosotros tenemos unas proteínas que calzan con LPS nativamente, generando una reacción inmune. Relativamente genérica → generalmente actúa contra todas las áreas de los patógenos, no contra unas específicas. Presente en la mayoría de los seres vivos → deben mantener su homeostasis, y lo hacen prohibiendo que otros organismos invadan o modifiquen esa homeostasis. RESPUESTA RÁPIDA, RELATIVAMENTE GENÉRICA, PRESENTE EN LA MAYORÍA DE LOS SERES VIVOS. - Humoral → anticuerpos, patógenos extracelulares. Células → células (T), patógenos intracelulares. RESPUESTA MÁS LENTA (DÍAS O SEMANAS), AUMENTA EN MAGNITUD CUANDO SE REPITE LA INFECCIÓN, PRESENTE SOLO EN VERTEBRADOS MANDIBULADOS. CÉLULAS PRINCIPALES. -------------------- Los linfocitos o "glóbulos blancos", durante el desarrollo embrionario son capaces de generar una gran variedad de ellos mismos. Su genoma es igual entre las diferentes células, excepto en un área en particular que cambia y genera una gran diversidad de células en el desarrollo embrionario. Su área variable va a codificar para las proteínas principales que tienen linfocitos. Linfocitos B → anticuerpos. Linfocitos T → receptores de células (T).  Las células accesorias no son específicas. ### LINFOCITOS Linfocitos B → maduran en la médula de los huesos, sus receptores más importantes son los anticuerpos que producen. ANTICUERPO QUE LOS HACE ÚNICOS. Linfocitos T → maduran en el timo. RECEPTOR DE CÉLULAS T QUE LOS HACE ÚNICOS.  Ambos linfocitos generan una diversidad de células en nuestro organismo. - - ### INMUNIDAD ADAPTATIVA. Cuando el linfocitos B se encuentra con el antígeno cambia radicalmente, pudiendo replicarse masivamente y sus anticuerpos que tenía como receptores de membrana podrán ser exportados al plasma sanguíneo mediante el cambio de su área constante. - PORQUE FUE SELECCIONADA Y ES LA QUE DEBE REACCIONAR CONTRA EL PATÓGENO. Los linfocitos son aumentados en la reacción inmune, reclutados para mejorar sus receptores y además, algunos quedan como células de memoria. -  Una reacción inmune primaria es mucho más rápida y potente cuando ocurre una reinfección. Es decir, que si un individuo se infecta una vez con el virus, la segunda vez que se infecte su respuesta va a ser mucho mayor y más rápida, generando anticuerpos efectivos y específicos conocidos como las inmunoglobulinas G (IgG). - ### RESPUESTA INMUNE HUMORAL. 1. 2. 3. 4. Al presentar péptidos de un patógeno que son desconocidos para los linfocitos, cuando la proteína se une al péptido del MHC significa que es una proteína exógena. 5. 6.  7. 8.  PROMOVIENDO LA REPLICACIÓN MASIVA DEL LINFOCITO B QUE TIENE LOS ANTICUERPOS PARA ESTE PATÓGENO, ALGUNAS SE CONVIERTEN EN CÉLULAS PLASMÁTICAS Y EN CÉLULAS DE MEMORIA. Células plasmáticas → atacan directamente el patógeno produciendo anticuerpos solubles (pueden estar en el plasma sanguíneo) Células de memoria → quedan con la capacidad de gatillar rápidamente ante una segunda inyección, produciendo anticuerpos específicos. Los anticuerpos bloquean a los patógenos y lo que está rodeado por anticuerpos se vuelve target para otras células del sistema inmune. Las Células Natural Killer son las encargadas de matar todo lo que esté rodeado de anticuerpos. Las proteínas del complemento actúan solas, pero existe una parte que actúa ligada al anticuerpo, destruyendo lo que está unido a los anticuerpos y para limpiar los anticuerpos que quedan sobrando. PRINCIPIO DE COMUNICACIÓN. -------------------------- Nuestra inmunidad adaptativa responde de forma más rápida, más potente y por más tiempo. VACUNAS -------  De esta forma han generado vacunas de muchos tipos. No todas las cantidades para generar una respuesta inmune y generar antígenos, terminan generando una reacción inmune y que protege ante la venida de la enfermedad. - La reacción inmune al ser un proceso complejo, para generar estas células de memoria específicas deben darse procesos complejos tales como, el patógeno ser fagocitado. Un patógeno inactivado no está completo, por lo que no genera la respuesta inmune. - - - Por lo mismo, las vacunas modernas tienen solo la superficie del patógeno, en el laboratorio se creó la superficie del patógeno o virus y eso es lo que finalmente se inyecta, el cual tiene una recepción en el sistema inmune porque es similar al patógeno. Son buenas generando una reacción inmune protectora. - LAS MÁS MODERNAS TIENEN FRAGMENTOS DE UNA SUPERFICIE DEL PATÓGENO. Vacunar con cualquiera de estas opciones no significa que necesariamente va a generar una reacción inmune que posteriormente genere una memoria que proteja contra la enfermedad. Por este motivo en casi todos los casos, se deben utilizar Adyuvantes. ### ADYUVANTES. Cualquier compuesto extra no antigénico que aporta la vacuna. Adyuvantes → serie de componentes no antigénicos que son necesarios para que la vacuna funcione. General - - - - - Estimulación inmune - - - - ### NUEVAS VACUNAS COVID-19 Con el Covid una serie de tecnologías de vacunación debieron adaptarse a este virus, cambiando la parte básica y molecular de cada vacuna. Las peores vacunas han tenido una tasa de contraindicaciones de 1 en 1 millón y las mejores vacunas han tenido una tasa de 1 en 100 millones. No son problemas muy graves, pero provocan que la persona ya vacunada tenga que volver al hospital por algún problema que va más allá del dolor. - Las cuatro tecnologías han sido buenas, con una buena tasa de protección. - - Afectan de forma muy atenuada, replicándose muy basal. Al producir las proteínas del Covid nuestro sistema inmune lo reconoce como un patógeno produciendo la reacción inmune. - La punta de estas proteínas es el área importante, es la producida de forma recombinante. Se produce la proteína y es inyectada en una vacuna que lleve los adyuvantes adecuados. - Al entrar en contacto con la célula una parte de la membrana se fusiona con la membrana de la célula dejando entrar al ARNm, traduciendo esta parte de la proteína. Una vez dentro de la célula ésta será presentada por el MHC a los linfocitos T provocando una reacción inmune contra esta proteína. Su principal inconveniente es que el ARN es bastante frágil por lo que da la impresión de que hay que conservarlo a temperaturas muy bajas (Ej. -70°), su transporte se ve complicado porque la disponibilidad de un freezer menor de 70 u 80 grados es muy baja. Las tecnologías de Vector viral y de ARNm encapsulado, son las más modernas por lo que aún se está evaluando si su capacidad de protección es efectiva contra la enfermedad y a la tasa de problemas secundarios que puedan causar.