24 Questions
Cul es el propsito principal de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)?
Amplificar un segmento especfico de ADN
Qu requisito es necesario para que la polimerasa 3 complemente el ADN?
Un primer diseado con una secuencia especfica
Cuntos ciclos de temperatura se realizan tpicamente en un protocolo de PCR?
30-40 ciclos
Qu es necesario conocer para disear un primer para una PCR?
La secuencia del segmento de ADN que se desea amplificar
Qu es el rea Target en un protocolo de PCR?
La regin del ADN que se va a amplificar
Cul es el propsito de los primers forward y reverse en una PCR?
Alinear el ADN original y el ADN recin construido
Cul es el costo aproximado de un primer diseado en Chile?
$8.000 a $10.000
Qu es lo que se-repeatirn muchas veces en un protocolo de PCR?
Los ciclos de temperatura
¿Cuál es el propósito de utilizar dos anticuerpos en serie para detectar patógenos?
Detectar más de una enfermedad
¿Qué se utiliza en la técnica de IFAT para fijar y hacer permeables las células?
Acetona o metanol
¿Qué se coloca en cada uno de los pocillos de las placas de Elisa en el ensayo ELISA?
Proteínas del paciente
¿Qué ocurre si la proteína del patógeno no está presente en el ensayo ELISA?
El anticuerpo primario se suele
¿Qué es lo que se colorea en el ensayo ELISA si la proteína del patógeno está presente?
La solución de revelado
¿Qué tipo de moléculas están conjugadas con enzimas en el ensayo ELISA?
Anticuerpos secundarios
¿Cuál es el propósito de la técnica de IFAT?
Detectar patógenos
¿Qué permite realizar 96 muestras al igual que el PCR?
El ensayo ELISA
¿Cuál es el propósito de utilizar un buffer en el proceso de PCR?
Para proporcionar un pH estable y un contenido de elementos necesarios para la polimerasa.
¿Qué tipo de polimerasa se utiliza en el proceso de PCR?
Taq polimerasa
¿Qué es lo que se busca evaluar en un gel de agarosa después de un proceso de PCR?
El tamaño del fragmento de ADN amplificado.
¿Qué es lo que se requiere para que ocurra la amplificación en un proceso de PCR?
La coincidencia de los primers con el ADN del patógeno.
¿Qué es lo que se puede detectar utilizando el proceso de PCR?
Una pequeña cantidad de ADN del patógeno.
¿Qué es lo que se utiliza para detectar virus que tienen ARN como material genético?
RT-PCR
¿Qué es lo que se puede realizar después de la amplificación por PCR?
La evaluación de los resultados en un gel de agarosa.
¿Qué es lo que se utiliza para detectar patógenos en tiempo real?
PCR en tiempo real
Study Notes
Ciclo de Replicación de PCR
- En el 2do ciclo de replicación, la extensión de la hebra nueva llega a un límite y es más corta.
- La amplificación se produce de manera aritmética (menor) ciclo a ciclo, exponencialmente amplificando un área específica.
Receta para un PCR
- Se mezclan en un tubo: buffer (agua y sales que aportan un pH estable y un contenido de otros elementos necesarios para la polimerasa), ADN original y "primers" diseñados para una secuencia en particular.
- Se coloca el tubo en un termociclador, el cual realiza cambios de temperatura rápidamente, ejecutando los ciclos que le indiquemos.
Resultados del PCR
- Los resultados se evalúan en geles de agarosa, el cual tiñe el ADN con bromuro de etidio para hacerlo fluorescente.
- El ADN queda en un lugar específico porque tiene el tamaño esperado para obtener un resultado.
Aplicaciones del PCR
- Se utiliza para detectar patógenos, ya que es muy sensible y específico.
- Una pequeña cantidad del ADN del patógeno es detectada, aunque solo haya una bacteria.
RT-PCR
- Se utiliza para detectar virus que tienen ARN como material genético.
- Después de la retrotranscriptasa, se puede realizar el PCR.
Diagnóstico
- Se intenta amplificar un segmento en particular que pertenece al genoma del virus.
- La polimerasa 3 requiere un "primer" para polimerizar, si no está la polimerasa no se replica el ADN.
Diseñar un Primer
- Se utiliza un "primer" diseñado con una secuencia en particular, mezclado con un ADN en particular y por complementariedad de bases se espera que el "primer" se alinee con la hebra de ADN templado.
Uso de un PCR
- Debe conocerse el lugar que queremos amplificar, el cual está acotado por los 2 "primers".
- Se tienen 3 cambios de temperatura que se repetirán muchas veces (entre 30 a 40 veces).
Ciclos de PCR
- Existe un área Target, por lo que debemos diseñar un "primer" que calce en los márgenes del área Target.
- Un "primer" se alinea a la hebra original y otro "primer" del mismo tipo se alinea a la hebra recién construida en la replicación anterior.
IFAT
- Técnica para el diagnóstico dónde un macerado del tejido o sangre se coloca en un portaobjetos.
- Se utiliza un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario conjugado con una molécula fluorescente (FITC).
TEST ELISA
- Ensayo mediado por anticuerpos, detecta proteínas.
- El test se lleva a cabo en unas "Placas de Elisa" de 96 pocillos, el plástico que se utiliza está diseñado para que las moléculas (proteínas) se peguen a sus superficies.
Aprende sobre el ciclo de replicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo la extensión de la hebra nueva y la amplificación aritmética. También se proporciona una receta básica para un PCR.
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