PCR Ciclo de Replicación

Ciclo de Replicación de PCR

• En el 2do ciclo de replicación, la extensión de la hebra nueva llega a un límite y es más corta.
• La amplificación se produce de manera aritmética (menor) ciclo a ciclo, exponencialmente amplificando un área específica.

Receta para un PCR

• Se mezclan en un tubo: buffer (agua y sales que aportan un pH estable y un contenido de otros elementos necesarios para la polimerasa), ADN original y "primers" diseñados para una secuencia en particular.
• Se coloca el tubo en un termociclador, el cual realiza cambios de temperatura rápidamente, ejecutando los ciclos que le indiquemos.

Resultados del PCR

• Los resultados se evalúan en geles de agarosa, el cual tiñe el ADN con bromuro de etidio para hacerlo fluorescente.
• El ADN queda en un lugar específico porque tiene el tamaño esperado para obtener un resultado.

Aplicaciones del PCR

• Se utiliza para detectar patógenos, ya que es muy sensible y específico.
• Una pequeña cantidad del ADN del patógeno es detectada, aunque solo haya una bacteria.

RT-PCR

• Se utiliza para detectar virus que tienen ARN como material genético.
• Después de la retrotranscriptasa, se puede realizar el PCR.

Diagnóstico

• Se intenta amplificar un segmento en particular que pertenece al genoma del virus.
• La polimerasa 3 requiere un "primer" para polimerizar, si no está la polimerasa no se replica el ADN.

Diseñar un Primer

• Se utiliza un "primer" diseñado con una secuencia en particular, mezclado con un ADN en particular y por complementariedad de bases se espera que el "primer" se alinee con la hebra de ADN templado.

Uso de un PCR

• Debe conocerse el lugar que queremos amplificar, el cual está acotado por los 2 "primers".
• Se tienen 3 cambios de temperatura que se repetirán muchas veces (entre 30 a 40 veces).

Ciclos de PCR

• Existe un área Target, por lo que debemos diseñar un "primer" que calce en los márgenes del área Target.
• Un "primer" se alinea a la hebra original y otro "primer" del mismo tipo se alinea a la hebra recién construida en la replicación anterior.

IFAT

• Técnica para el diagnóstico dónde un macerado del tejido o sangre se coloca en un portaobjetos.
• Se utiliza un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario conjugado con una molécula fluorescente (FITC).

TEST ELISA

• Ensayo mediado por anticuerpos, detecta proteínas.
• El test se lleva a cabo en unas "Placas de Elisa" de 96 pocillos, el plástico que se utiliza está diseñado para que las moléculas (proteínas) se peguen a sus superficies.