Núcleo y Expresión Génica 2023 - Apuntes de Medicina - Universidad de Chile PDF

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APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 APUNTES PARA EL CURSO BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR 2023 Núcleo y expresión génica 1 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 Núcleo y expresión génica Redactado por: Vicente Cornejo Muñoz y Sebastián Arroyo Concha. Edición 2023: Valeria Sabaj Diez Introducción El núcleo corresponde a un compartimento celular, propio de las células eucariontes, en el cual se localiza el material genético. La imagen de la Figura 1, obtenida por microscopía por fluorescencia, corresponde a un núcleo celular. Los diferentes colores indican distintas moléculas, las cuales participan en distintos procesos que ocurren en este organelo; las zonas que emiten fluorescencia azul representan las moléculas de DNA, las más oscuras corresponden a cromatina en mayor grado de compactación que las más claras; las zonas de fluorescencia verde corresponden a lugares donde están Figura 1. Núcleo visto a través de ocurriendo transcripción de RNA y las de fluorescencia roja son microscopía por fluorescencia. regiones donde se está procesando RNA mensajero (RNAm). A partir de esta imagen se puede concluir que existe una organización específica, no homogénea en el núcleo, lo cual se encuentra muy relacionado con la expresión génica y su regulación, como se verá más adelante. Las relaciones causa‐efecto entre organización nuclear y expresión génica, son complejas y algunas aún no se han dilucidado completamente. Núcleo, información genética y su expresión Para comenzar a analizar la relación entre núcleo, información genética y su expresión, resulta adecuado hacer mención al ya clásico experimento de transferencia nuclear somática (SCT) ‐al que con falta de rigurosidad a menudo se denomina clonación‐ que dio origen en 1996 al primer mamífero generado por esta técnica: la oveja Dolly. En esta técnica, se extrae el núcleo de una célula somática de un individuo y se transfiere al ovocito de un segundo individuo del cual previamente se ha removido su DNA nuclear. Posteriormente este ovocito es implantado en el útero de un tercer individuo, obteniéndose un individuo de fenotipo similar al del individuo del cual se obtuvo el núcleo somático. Con esto último, se puede afirmar que el fenotipo de un individuo depende en gran medida de la expresión de la información que radica en el núcleo. Otros experimentos ya han demostrado que, dentro del núcleo, es el DNA la Figura 2. Componentes del fenotipo. molécula que porta la información hereditaria. Es importante recordar que el fenotipo de un individuo ‐ o el de una célula‐ no depende exclusivamente de su información hereditaria, también del entorno (ambiente) en el que se encuentre. Esto se aplica Núcleo y expresión génica tanto a los individuos multicelulares, como a las células individualmente y, en el ejemplo mencionado de transferencia nuclear, también se aplica a los núcleos. Efectivamente, el entorno directo del núcleo (donde se encuentra el DNA y los genes) lo constituye el citoplasma; al transferir el núcleo a un nuevo citoplasma (el del ovocito) este nuevo ambiente induce una extremadamente compleja modificación de la expresión de los genes del núcleo de origen somático que se conoce como reprogramación nuclear. Esta reprogramación incluye la activación y la inhibición de la expresión de múltiples genes, lo que determina, a la larga, y luego de múltiples rondas de proliferación, a la formación de un individuo completo con sus diferentes tipos celulares donde cada tipo celular expresa diferentes grupos de genes. Entonces, el conjunto de DNA nuclear (genoma) es el mismo, pero su expresión se modifica 2 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 radicalmente. En lo cotidiano, cada célula recibe constantemente múltiples y cambiantes señales de su entorno, las que impactan en el aumento, disminución o inhibición total de la expresión de subconjuntos variados de genes. En términos globales, entonces, cada célula individual en su particular microambiente, expresa diferencialmente un conjunto de genes de acuerdo a los cambios constantes que ocurren en su entorno. Diferentes mecanismos que llevan a la modificación de la expresión génica, se activan en respuesta a señales del medio. Por ejemplo, para que se gatille la respuesta de proliferación celular se requiere, entre otras, del aumento de transcripción de algunos genes. Uno de los mecanismos más clásicos de interacción de las células con su entorno es la unión ligando‐receptor de membrana (para mayor detalle de este y otros mecanismos de comunicación intercelular, ver el capítulo). En términos muy simples, la unión de ligandos presentes en el medio a los receptores de membrana, inducen cambios conformacionales en estos últimos, lo que provoca que proteínas de señalización intracelular se activen y generen una cadena de señales. En el esquema de Figura 3. Modelo de aumento de transcripción activada la figura 3, la última proteína intracelular activada por un ligando presente en el medio extracelular. ingresa al núcleo, modifica una proteína unida al DNA y esto lleva a la activación de la transcripción del DNA en ese gen en particular (en el capítulo 6, se analizará la transcripción en detalle). DNA y fenotipo La información del DNA radica fundamentalmente en las secuencias de sus nucleótidos, la cual se expresa a través del proceso de transcripción en moléculas de RNAs y, en el caso de los mensajeros, continúa con el proceso de traducción, generando diversas proteínas. Las proteínas no son el producto final de la expresión de todos los genes, en algunos casos, el producto final funcional es un RNA, es el caso del tRNA, rRNA y una serie de otros RNA que participan en la regulación de la expresión génica (lncRNA, miRNA, etc). Es importante destacar que todas estas moléculas presentan información molecular, aunque sólo la del DNA sea rigurosamente hereditaria. El fenotipo se puede observar a nivel de individuo, a nivel celular (por ejemplo, en la morfología de las células) y también a nivel molecular. A este último nivel, se puede, por ejemplo, analizar las proteínas o los mensajeros presentes en distintas células o tejidos. Variaciones en la expresión génica Si comparamos las proteínas presentes en dos tejidos, como muestra la Figura 4, se observa algunas que se expresan en ambos, en igual o distinta proporción, pero también existen proteínas que se expresan de manera exclusiva en uno y otro tejido. Esta observación da cuenta de la Núcleo y expresión génica variación en la expresión génica de células diferenciadas. Figura 4. Diferencias en proteínas de cerebro (A) e hígado (B). 3 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 Existen diversos procesos, fisiológicos algunos (envejecimiento, por ejemplo) y patológicos otros (cáncer, por ejemplo), que se asocian a cambios en la expresión génica. Por ejemplo, existe una regulación diferenciada de genes según la edad de los individuos; la figura 5 muestra los diferentes niveles de hormona de crecimiento según edad de los individuos. Figura 5. Cambios en la concentración de hormona del crecimiento a lo largo de los años. Los niveles de expresión de algunos genes presentan variaciones a mucho menor plazo. Por ejemplo, en la figura 6 se muestra las variaciones en los niveles de diversos mensajeros a lo largo de 24 horas, en varios tejidos de babuino. Figura 6.Variación en los niveles de mensajeros a lo largo de 24 horas en diferentes tejidos de babuino. Núcleo celular Para analizar la estructura y organización del núcleo, se revisará primero la envoltura nuclear y luego, su interior. Envoltura Nuclear El núcleo ocupa aproximadamente un 10% del volumen celular total y se encuentra delimitado por la envoltura nuclear. Esta envoltura posee una serie de características estructurales que le permiten formar parte directa o indirectamente de procesos como la expresión génica y transporte selectivo de sustancia entre núcleo y citosol, dad de dicho transporte, entre otros. La envoltura nuclear está formada por una doble membrana y los complejos de poro nuclear, según se describe a continuación. a. Doble membrana y espacio perinuclear: Se describe una membrana nuclear externa y otra interna separadas entre sí por un espacio intermedio denominado espacio perinuclear. La membrana nuclear externa es continua con la membrana del retículo endoplásmico rugoso, y el espacio Núcleo y expresión génica perinuclear, se continua con el lumen del retículo endoplásmico. Figura 7. Vista general de la envoltura nuclear. A: Microscopía electrónica de transmisión.; B: esquema. 4 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 b. Complejos Poro Nuclear (CPN): Corresponde a una organización macromolecular de aproximadamente 400 proteínas que se ubican entre la membrana nuclear externa y la interna y que actúan con permeabilidad selectiva, permitiendo el transporte entre núcleo y citosol. Ejemplos de moléculas o agregados moleculares que se transportan a través de los CPN son: agua, iones, múltiples proteínas (DNA polimerasa, topoisomerasa) mRNA, subunidades ribosomales mayor y menor, entre otras. Las diferentes proteínas que conforman el complejo, pertenecen a la familia de las nucleoprorinas (Nups) entre las cuales se reconocen 30 tipos diferentes entre sí (Figura 8). El centro del poro, lejos de ser un espacio abierto, se encuentra ocupado por las colas de las nucleoporinas del anillo central del CPN (Figura 10) y éstas constituyen una especie de cedazo molecular que, permite el paso libre de moléculas muy pequeñas, agua e iones y regula el paso de las de mayor tamaño. Figura 8. Nucleoporinas presentes en la estructura de los complejos de poro nuclear. Transporte núcleo‐citoplasma Se ha determinado que las proteínas que son importadas desde el citosol hacia el interior del núcleo presentan ciertas secuencias aminoacídicas que actúan como señales moleculares para el ingreso al núcleo; estas secuencias se han denominado secuencia de localización nuclear (SLN). Una de las primeras en ser reconocida es una corta secuencia ricas en aminoácidos con carga positiva como lisina y arginina. De manera similar, se ha constatado la existencia de señales de exportación nuclear en las proteínas que pasan desde núcleo al citosol (señal de exportación nuclear, SEN). Las señales de localización son señales necesarias y suficientes para el destino de las proteínas; la figura 9 muestra un experimento en que una proteína con mutación en la SLN, permanece en el citosol (B) en lugar de dirigirse al interior del núcleo como ocurre cuando la secuencia señal se encuentra conservada (A). Estas secuencias de destino son reconocidas por proteínas denominadas genéricamente karioferinas o transportinas, pudiendo ser importinas (las que participan en la entrada de las proteínas al núcleo, uniéndose a la SLN) o bien exportinas (en el caso de las que participan en la salida de moléculas desde el núcleo al citosol, uniéndose Figura 9. Efecto de una mutación en SLN a las SEN). Núcleo y expresión génica El complejo formado por la señal y la importina/exportina, se denomina complejo proteína cargo‐importina o bien proteína cargo‐exportina (de acuerdo a la señal). El complejo será reconocido por el CPN, donde interactúa con determinadas nucleoporinas permitiendo de esa manera el transporte a través de la envoltura nuclear. 5 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 En el proceso de importación al núcleo, a nivel citosólico se forma el complejo proteína cargo‐ importina, este complejo se une a nucleoporinas del CPN e interactua con motivos de aminoácidos que se encuentran repetidos múltiples veces en las colas de nucleoporinas que ocupan el canal central del CPN, y una vez dentro, se une al complejo una pequeña proteína denominada Ran que lleva Figura 10. Importación (A) y exportación (B) nuclear. asociado GTP (Ran‐GTP). Esta unión favorece la liberación de la proteína cargo de importina. Ran‐GTP junto con importina son llevadas hacia el citosol donde a través de Ran metaboliza el GTP que lleva unido a GDP y, en esta nueva conformación, Ran‐GDP disminuye su afinidad por importina, liberándose de ésta y permitiendo su unión con nuevas moléculas cargo a ser importadas el núcleo (Figura 10). El mecanismo de exportación de moléculas desde el núcleo al citosol, es similar al descrito. Nucleoesqueleto: El interior del núcleo presenta una compleja red de proteínas que forman un verdadero esqueleto intranuclear. Una de las proteínas mayoritarias que se describen en este esqueleto, corresponde a las proteínas lámina, que pertenecen a la familia de los filamentos intermedios del citoesqueleto (Ver Capítulo citoesqueleto). Las proteínas lámina se distribuyen por debajo de la membrana nuclear interna, asociadas a ella por proteínas de transmembrana (por ejemplo, por la proteína LBR o Receptor de Lámina B), y hacia el interior del núcleo, se asocia a segmentos de cromatina en cuyo DNA se describen secuencias de unión a proteínas lámina. Adicionalmente, se describe proyecciones de este polímero hacia el interior del núcleo. Se ha sugerido que, en la periferia del núcleo, estas proteínas lámina promueven que se establezca un espacio de aumento de la compactación de la cromatina, mediante la unión directa o indirecta de proteínas asociadas a aumento de la compactación y silenciamiento de la transcripción del DNA, como por ejemplo, la proteína de heterocromatina 1 (HP1). Cromosomas y cromatina El DNA presenta en el núcleo de una célula de la especie humana, presenta en su conjunto una longitud total aproximada de 1,80 mt, y está contenido en un núcleo de aproximadamente 5 um en promedio. En los seres humanos, el DNA se encuentra fragmentado en 46 moléculas, los denominados cromosomas, que en metafase alcanzan un grado de compactación tal, que se hacen visibles al microscopio óptico. En interfase, las moléculas están presentes, pero no son visibles microscopía óptica ni electrónica (Figura 11 A y B); Núcleo y expresión génica sin embargo, el desarrollo de la técnica FISH, que emplea sondas fluorescentes (Ver anexo), permitió identificar y localizar cada cromosoma en el Figura 11. Células nucleadas observadas al microscopio núcleo durante la interfase (Figura 12). óptico de luz y electrónico de transmisión (A y B, Efectivamente, los cromosomas ocupan respectivamente; Territorios cromosómicos (C) donde cada color corresponde a un cromosoma diferente. espacios específicos al interior del núcleo, en lo que se ha denominado territorios cromosomales (Figura11 C). 6 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 El DNA en el núcleo, se asocia a proteínas básicas denominadas histonas, las cuales forman un octámero con 2 pares de cada tipo de histona (2x (H2A, H2B, H3 Y H4)) en torno al cual aproximadamente 146 pares de bases de DNA se enrolla casi 2 veces formando lo que se denomina nucleosoma (DNA + octámero). Esto ocurre a lo largo de la mayor parte del DNA formando lo que se denomina fibra nucleosomal (Figura 12). Figura 12.Nucleosoma. A) octámero de histonas y DNA nucleosomal; B) modelo de nucleosoma con DNA en color rosa; C) Fibra nucleosomal Las colas de las histonas nucleosomales se posicionan fuera del nucleosoma, de tal manera que la interacción entre estas colas de histonas de diferentes nucleosomas, permite la asociación de nucleosomas entre sí (Figura 13). Estas colas presentan múltiples modificaciones químicas como acetilaciones, metilaciones, ubiquitinaciones, etc, las cuales modifican la asociación entre Figura 13. Interacciones entre nucleosomas, aumentando o disminuyendo la compactación de la nucleosomas. cromatina y el acceso de la maquinaria de transcripción. En interfase, la fibra nucleosomal cromatina no se organiza en una estructura regular, sino que se pliega irregularmente tanto en zonas de mayor como de menor compactación. Las zonas de mayor compactación usualmente se encuentran en la periferia nuclear y periferia del nucléolo (no en el interior del nucléolo), son inactivas transcripcionalmente. Los genes que se encuentran expresándose en la mayor parte de las células, que codifican para proteínas del metabolismo o citoesqueleto, se denominan house keeping genes y se encuentran en zonas de cromatina descondensada. Por otro lado, los genes que son tejido específicos (tissue‐specific genes) que sólo transcriben en algunos tipos celulares, se encontrarán inactivos en la mayor parte de las células, formando parte de cromatina más compactada (por ejemplo, el gen de la insulina en las células que no sean las células beta del páncreas) y sólo se encontrará en cromatina más descompactada y en transcripción en dichas células específicas. Cada cromosoma, compuesto por fibra nucleosomal plegada con mayor o menor grado de compactación, presenta regiones que, estando lejanas linealmente, se asocian entre sí. A este tipo de organización de la cromatina, intermedia entre fibra nucleosomal y el territorio cromosómico, se denomina Dominio de Asociación Topológica (TAD, por sus siglas en inglés); es muy relevante que estos Núcleo y expresión génica dominios permiten una cercanía espacial entre las regiones del DNA que contienen las secuencias que se transcribirán y las regiones que contienen secuencias de DNA que regulan la transcripción de las primeras (Ver apunte correspondiente). De esta forma, genes presentes en un mismo TAD comparten secuencias reguladoras de la transcripción (figura 14). 7 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 Figura 14. Secuencias que transcriben, presentes en el TAD número 2 (círculos rojos) comparten una secuencia reguladora de la transcripción (enhancer). Proteínas que flanquean al TAD2 permiten su aislamiento de los TAD 1 y 3 La unión de proteínas específicas a ambos flancos del DNA, permite aislar los diferentes TADs, impidiendo que secuencias reguladoras de la transcripción de un TAD modifiquen la actividad transcripcional de genes presentes en un TAD diferente (figura 15). Núcleo y expresión génica Figura 15. Proteínas aisladoras que flanquean los TADs, impiden que la secuencia reguladora de la transcripción (enhancer en este caso) presente en un TAD (TAD#2 en la figura) regule la expresión de genes presentes en un TAD diferente (TAD#1 en la figura) 8 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 Finalmente, es importante señalar que los TADs en un momento específico, pueden encontrarse activos o inactivos transcripcionalmente (Figura 16). Compartimiento B Cromatina transcripcionalm ente inactiva. Compartimiento A Cromatina transcripcionalmente activa Figura 16.Distribución de un cromosoma al interior del núcleo, con TADs activos (azul y verde) e inactivos transcripcionalmente (rojo y amarillo). Resumen En el núcleo existe una organización no homogénea pero específica. La expresión génica depende tanto del ambiente como del genotipo. Tanto DNA como RNA y proteínas presentan información. Existe una expresión génica que varía: temporalmente, entre células y en procesos patológicos. El núcleo se encuentra delimitado por un envoltura nuclear conformada por una membrana nuclear externa e interna y CPN. La envoltura nuclear regula la comunicación núcleo‐citosol a través del NPC. El transporte nuclear es un mecanismo altamente regulado, dependiente de la presencia de secuencias aminoacídicas que actúan como señales de entrada y de salida del núcleo (SLN SEN), de proteínas karioferinas y de RAN‐GTP/RAN‐GDP. Las proteínas lámina participan no sólo en la forma y resistencia a las fuerzas de deformación a las cuales está sometido el núcleo, sino también en la regulación de la expresión génica a través de su unión con cromatina. El núcleo contiene el material genético en forma de moléculas de DNA asociadas a proteínas (cromatina) que organizan cromosomas, y se distribuyen en su interior en territorios cromosómicos. La cromatina se organiza en fibras de 5 a 24 nm, en un plegamiento no jerárquico, distribuida en un compartimiento A, de menor compactación y uno B, de mayor compactación. En los diferentes estados de condensación de la cromatina participan diversas proteínas y modificaciones químicas tanto de ellas como del DNA. Núcleo y expresión génica Los diferentes estados de condensación de la cromatina se relacionan con su capacidad de transcripción, siendo la cromatina A transcripcionalmente activa y la B transcripcionalmente inactiva. 9 APUNTES DE BIOLOGÍA CELULAR y MOLECULAR – UNIVERSIDAD DE CHILE‐ MEDICINA 2023 Anexos Técnica Fish: es utilizada para visualizar ácidos nucleicos con sondas fluorescentes; por ejemplo, diferentes cromosomas. Se utiliza una “sonda” que corresponde a una secuencia de nucleótidos con fluoróforos de una determinada longitud de onda que es complementaria a alguna secuencia de DNA conocida, por ejemplo, de un cromosoma, y con ello se localiza la región en que éste se ubica. Para el caso de la identificación de territorios cromosómicos, el procedimiento se lleva a cabo durante la interfase. Figura anexo, Cariotipo y territorios cromosómicos en el núcleo, empleando la técnica Fish. Bibliografía 1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Walter, P. (2002). Molecular biology of the cell. 6th ed. New York: Garland Science, pp.208‐246. 2. Sabaj, Valeria. “Expresión Génica 1”, ME0121106008: Biología Celular y Molecular, (Santiago, Universidad de Chile, 2017). Clase Expositiva. Núcleo y expresión génica 1 0