Molekuláris biológia gyakorlat PDF

Molekuláris biológia Gyakorlat  Összes nukleinsav kivonása (1. gyakorlat) 1. Eppendorf csőbe 1,5 ml tenyészetet mérek 2. 3 percig 1400 rpme-n centrifugálom 3. Hozzá adok 200 l B-puffert (breaking-puffer) -> feltárja a sejtet 4. Homogenizálom a mintát...

Molekuláris biológia Gyakorlat  Összes nukleinsav kivonása (1. gyakorlat) 1. Eppendorf csőbe 1,5 ml tenyészetet mérek 2. 3 percig 1400 rpme-n centrifugálom 3. Hozzá adok 200 l B-puffert (breaking-puffer) -> feltárja a sejtet 4. Homogenizálom a mintát Vizes fázis 5. Üveggyöngyös feltárás: kb. 0,3 g, 0,4-0,6 mm átmérőjű üveggyöngyökkel (nukleinsav) 6. 3 perc vortex Interfázis 7. Tisztítás: (fehérje) 100 l telített fenol (fehérjéket és nitrátokat távolítja el) 1:1 Szerves fázis 100 l kloroform izoamil alkohol (24:1) (szerves 8. Rövid vortexelés és hozzáadunk 200 l TE-puffert és újra vortexeljük 7. lépés szennyezők) 9. Centrifugáljuk 5 percig 1400 rpm-en 10. A vizes fázist átmérjük Eppendorf csőbe és hozzáadok 200 l kloroform izoamil alkoholt 11. Centrifugálom 5 percig 12. Kicsapás alkohollal: 96%-os etanollal vagy izopropanollal 13. A kész mintát -20 °C-on tárolom (segíti a kicsapást) 14. Centriugáljuk 5 percig 1400 rpm-en 15. Elpárologtatjuk az etanolt és 50 l TE-pufferben visszaoldjuk a mintát és – 20 °C-on tároljuk  Nukleinsav kivonáshoz használt reagensek B-puffer: TE-puffer: ✓ Tris-HCl: biztosítja az enyhén lúgos (pH=8) pH-t -> ✓ Tris-HCl a nukleinsavak ezen a pH-n stabilak ✓ EDTA ✓ EDTA: nukleázok gátlása, Mg ionok megkötése ✓ SDS: a fehérje szennyezések eltávolítására szolgál ✓ NaCl: a nukleinsavak kicsapását segíti ✓ Triton X 100  Nukleinsavak emésztése (2. gyakorlat) A gyakorlat feladata: a minta emésztése DN-ázzal és különböző koncentrációjú RN-ázzal, az emésztett minták alapján meghatározzuk, hogy killer toxint termelő vagy nem termelő törzsről van-e szó. Szükségem van a feladat elvégzéséhez 100 l 1 mg/ml DN-ázra. (1 mg/ml = 1 mg/ 1000 l) A törzs oldatom koncentrációja: 10 mg/ml (10 mg/ml = 10 mg/ 1000 l) Számolás: vissza feléről indulunk Mi kell nekem? 1000 l -> 1 mg Mindenki tudjon mértékegységet 100 l -> x mg átváltani!!! x= 0,1 mg RN-ázra van szükség Mi van nekem? 1000 l -> 10 mg x l -> 0,1 mg x= 10 l -> Tehát 10 l-t kell bemérnem a törzsoldatból és kiegészíteni 90 l desztillált vízzel  Gélelektroforézis Agaróz gél futtatása Agaróz-gél készítése zsebek minták gélbe töltése fésű tálca elektroforézis gél molekuláris marker  Az emésztett minta futtatása Miért volt szükség emésztésre? A kinyert nukleinsav túl nagy molekulatömegű emésztés nélkül a gélen nehezen fut. 1. Minta előkészítés: 5 l minta + 2 l felvivő festék 2. 100 ml 1%-os agaróz gél készítése (TBE 10x / TAE 50x puffer és agaróz por) 3. A keveréket addig melegítjük amíg víz tisztaságú nem lesz (de NE forrjon fel!) 4. Össze rakjuk a gél formáját és bele öntjük az elkészített oldatot, megváruk míg megszilárdul. 5. A kész gélt bele tesszük a futtató kádba és puffert öntünk rá. 6. A gélen a zsebeket a negatív pólus felé alakítjuk ki, hiszen a nukleinsavak töltése negatív a foszfát csoport miatt. -> a negatív pólus felől fut a pozitív felé 7. Futtatjuk 45 percik 120 V feszültséggel.  A futtatáshoz használt reagensek Felvivő festék: TBE-puffer: ✓ Szacharóz: a sűrűsége miatt lehúzza a nukleinsavat ✓ Tris-HCl a zseb aljára ✓ Bórsav: pH miatt fontos ✓ EDTA: nukleázok gátlása, Mg ionok megkötése ✓ EDTA ✓ SDS: a fehérje szennyezések eltávolítására szolgál ✓ Brómfenol-kék: jelzi a front vonalat TAE-puffer: ✓ Tris-HCl ✓ Ecetsav: pH miatt fontos ✓ EDTA  Gél készítése Feladat: Készítsen 300 ml TBE 0,5 x tartalmú 1 %-os agaróz gélt. Nekünk TBE 10x van. -> Ebből kell hígítani 0,5 X-re. 10 : 0,5 = 20 x hígítást kell készíteni. 300 ml / 20 = 15 ml TBE puffer kiegészítve 285 ml desztillált vízzel. Agaróz por bemérése: 300 ml 1%-a -> 3 g  Alkalmazott koncentrációk: Az emésztés utáni gélkép 1U/ml DNáz 1 mg/ml RNáz Feladat: Killer és nem killer tulajdonságú élesztő törzsek 5 g/ml RNáz megkülönböztetése Killer toxint nem termelő törzs Killer toxint termelő törzs dsDNS kbp 7 dsDNS dsDNS dsDNS 1: kezeletlen minta dsDNS dsDNS 6 LdsRNS LdsRNS LdsRNS 2: DNáz-al kezelt 5 minta MdsRNS MdsRNS MdsRNS 4 3: gyenge RNáz-al 3 ssRNS ssRNS kezelt minta ssRNS ssRNS 2 4: erős RNáz-al kezelt minta 1 ds: dupla szálú, ss: egyszálú, L: large, M: medium PCR reakció (3. gyakorlat) A PCR reakcióhoz szükséges master mix optimális összetétele Összetevők Optimális mennyiség Puffer 1x Mg2+ 0,5-2,5 mM dNTP 20-200 mM Primer 0,1-0,5 M Polimeráz 1-2,5 U/100 l Templát 10-100 ng/reakció Desztillált víz Végtérfogat: 25-100 l Összetev Rendelkezésemre álló Szükséges anyagok Bemérendő ők anyagok (van) (kell) mennyiségek Számolás: vissza feléről indulunk Puffer 10x 1x (ezt fejből kell 40 l / 10 = 4 l tudni!) Mi kell nekem? 1,3 mmól -> 1 dm3 = 10 6 l Mg2+ 50 mM 1,3 mM (40 l * 1,3 mM) / 50 x mmól -> 40 l mM = 1,04 l dNTP 10 mM 130 M (40 l * 0,13 mM) / 10 x= 5,2 * 10 -5 mmól mM = 0,52 l Primer 2 M 0,4 M (40 l * 0,4 M) / 2 Mi van nekem? M = 8 l 50 mmól -> 1 dm3 5,2 * 10 -5 mmól -> X Polimeráz 2 U/l 2 U/ 100 l -> 0,2 0,2 U/ml * 2 U/l = 0,4 U/ml l x= 1,04 l Templát 50 ng/l 75 ng/reakció 1,5 l Desztillált Végtérfogat: 40 l 40 l –ből kivonom az Templát: víz eddig kiszámolt 50 ng -> 1 mikrol térfogatok -> 24, 54 l 75 ng -> x mikrol desztillált víz x= 1,5 l szükséges Különbségek a specifikus PCR és a tipizálás között Specifikus PCR Tipizálás (törzs jellemzése) Primer hossza 16-25 bp 10 bp Primer specifitása Tervezett, erősen Random primer (DE! a specifikus szekvencia ismert) Hőmérséklet 45-65 °C 36-42 °C Primer száma Páros (2, 4, 6..) 1 db Szigorúsága Szigorú Nem olyan szigorú Termék száma Egyenlő a primer pár > 1 termék számával. Restrikciós endonukleázos emésztés (4. gyakorlat) Restrikciós endonukleáz: a baktériumok védekező mechanizmusa a vírusok ellen, de molekuláris biológiában is jól alkalmazható a specifikus hastóhely miatt HAEU III Alkalmazása: géntérképezés H: nemzettség AE: fajnév, ahonnan először izolálták klónozás U: törzs RFLP (restrikciós fragment hossz polimorfózis) III: hányadikkén lett izolálva PCR-RFLP (tipizálásra alkalmas)  Hasítás mechanizmusa Mivel az alsó szál nyúlik túl, így 5’ ragadós Feladat: milyen véget kapunk, ha a restrikciós endonukleáz a vég keletkezik. szekvencia x. citozinja mellett hasít a kódoló szálon.  Az emésztéshez szükséges master mix elkészítése Van Kell Bemérendő mennyiség Templát 2345 ng/l 1500 ng 2345 ng -> 1 l 1500 ng -> x X= 0,64 l Végtérfogat 0,64 l x 10 = 6,4 l -> de mivel ez 10 l alatt van ez kevés -> 10 l végtérfogatra számolunk!!!!! Puffer 10x töménységű 1x 10 / 10 = 1 l (végtérfogat / a töménységgel) Restrikciós 5 U/l 1,5 U 1,5 U x 2 = 3 U endonukleáz 5 U -> 1 l 3 U -> x X= 0,6 l Bidesztillált víz Kiegészíteni 10 l-re -> 7,76 l Klónozó vektorok (5. gyakorlat) Önálló replikációra képes (replikációs origó) Genetikai markert hordoznak (általában domináns) - > a hordozó sejtek szelekciójának segítése Restrikciós helyeket tartalmaznak (Multicloning site=MCS) -> inszert beépítés céljából Minimalizált méret (nagyon kevés nem esszenciális szekvencia)– A klónozás hatékonnyá tétele (transzformáció, izolálás)  Emésztés restrikciós endonukleázzal 0 bp kbp 7 6,3 6 5 3792 4792 4 3 6300 bp 2 2508 2508 1 RE hasítóhely:1324 bp 1: teljes plazmid RE hasítóhely: 3832 bp 2: restrikciós endonukleázzal hasított plazmid 3: ha beépül egy 1000 bp hosszú insert  Filogenetikai fa Mi mondható el az ábráról: ✓ 40%-os hasonlósági szintnél két csoportra bomlanak, az egyik csoportba csak a 3-as izolátum kerül ✓ 85%-os hasonlósági szintnél az egyik csoport a4 újabb két csoportra bomlik ✓ A 2,4 izolátumok esetén 100%-os a hasonlósági szint, tehát klonálisan azonosak, ugyan az a két törzs 0% 40% 85% 100%