Microbiologia Clinica PDF

MICROBIOLOGIA CLINICA: Sbobina a cura di Pratesi Martina. Frequentante il corso di tecnico di laboratorio biomedico.  GRAM+/-: I batteri gram +/- hanno una diversa composizione della parete batterica: GRAM +: hanno una parete molto spessa,...

MICROBIOLOGIA CLINICA: Sbobina a cura di Pratesi Martina. Frequentante il corso di tecnico di laboratorio biomedico.  GRAM+/-: I batteri gram +/- hanno una diversa composizione della parete batterica: GRAM +: hanno una parete molto spessa, molti strati si sovrappongono circa 40 strati di peptidoglicano; GRAM -: hanno una parete poco spessa, pochi strati si sovrappongono circa 2-3 strati di peptidoglicano. La parete batterica è costituita da un componente fondamentale, il peptidoglicano. Il peptidoglicano è un carboidrato presente in tutti i batteri; chimicamente è un polimero costituito da ripetizioni di due amminozuccheri NAG (acido n-acetil glucosammina) e il NAM (acido n-acetilmuramico) quest'ultimo si lega con una catena di quattro AA chiamata tetrapeptide. Di solito tendono a legarsi tra loro trasversalmente e donano così l'aspetto di un reticolo alla parete. COME AVVIENE LA SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO?: La sintesi del peptidoglicano avviene in un processo articolato in tre fasi: 1) Fase citoplasmatica; sintesi degli amminozuccheri (NAG e il NAM); 2) Fase di membrana; trasporto degli amminozuccheri dal versante citoplasmatico al versante extracellulare tramite il bactoprenolo, che lo trasporta dalla parte opposta della membrana e lo rilascia nello spazio extracellulare. 3) Fase extracellulare (fase di parete): al di fuori dell'ambiente cellulare abbiamo l’allungamento della catena e sovrapposizione di essa con la conseguente formazione del reticolo.  Il reticolo si forma in seguito alla formazione di un legame crociato (processo che viene denominato come transpeptidazione grazie alla presenza degli enzimi transpeptidase penicillin bains protein) t COMPOSIZIONE PARETE DEI GRAM +: La parete del gram positivo è costituita nel seguente ordine da: - Peptidoglicano; - Acidi teicoici: molecole a carica negativa, sono variabili e hanno una funzione antigenica e protettiva, controllano lo spostamento di cationi dentro e fuori dalla cellula; - Acidi lipoteicoici: legati alla membrana plasmatica (funzione di ancoraggio alla parete); proteine associate alla parete: diverse a seconda del batterio. COMPOSIZIONE PARETE DEI GRAM- : I gram - oltre allo strato di peptidoglicano posseggono una membrana esterna a doppio strato asimmetrico, ed è costituita da: - Internamente: fosfolipidi; - Esternamente: lipopolisaccaride, denominato anche strato LPS (endotossina). Sono presenti all'interno dello strato LPS le porine (proteine transmembrana, composta da 16 domini). Il lipopolisaccaride è presente solamente nei batteri gram - e svolge una funzione tossica; è composto dalle seguenti strutture: 1) Lipide A: è la parte tossica ed è uguale in tutti i gram - (endotossina); 2) Core: posta sopra al lipide A catena polisaccaridica è uguale in tutti i gram; 3) Antigene O: lunga catena polisaccaridica con proprietà antigeniche. Le funzioni dello strato LPS sono le seguenti: - Protezione: protegge dalle difese immunitarie dell'ospite (ANTIGENE 0 è variabile), - Contribuisce la carica negativa sulla superficie; - Funzione tossica; - Stabilizza la struttura della membrana esterna. UNA CURIOSITÀ: COM'È FORMATA LA PARETE DEI MICOBATTERI?: La parete dei micobatteri possiede uno strato abbastanza spesso di peptidoglicano (che strutturalmente è spesso come lo strato presente nei Gram+) legato a polisaccaridi esterificati con acidi micolici. CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI: I batteri si classificano in base a tre caratteristiche: 1) Proprietà tintoriali: 2) Morfologia e disposizione dei batteri: 3) Proprietà metaboliche e capacità di utilizzare O2. PROPRIETÀ TINTORIALI: I batteri vengono classificati in base alle loro proprietà tintoriali in: - Gram positivi; - Gram negativi; - Alcol-acido resistenti micobatteri. COLORAZIONE DI GRAM: La colorazione di gram è una speciale colorazione differenziale inventata dall'omonimo scienziato, permette di dividere in due grandi gruppi i batteri in base alla struttura della parete batterica: - Gram positivi(+) si colorano di blu-violetto; - Gram negativi (-) si colorano di rosso. Con il metodo di Gram, i coloranti utilizzati nella fase della colorazione violetto di Genziana e safranina formano un complesso con i ribonucleotidi intracellulari. Metodica per la colorazione di gram: 1) Fissazione: i batteri attraverso l'utilizzo del calore vengono fissati; esso avviene poiché la capsula quando viene riscaldata “cristallizza” e di conseguenza si fissa sul vetrino; 2) Colorazione: Utilizzo del colorante del cristal-violetto, colorante che viene inglobato dal peptidoglicano di entrambi tipi di batteri; il campione rimane a contatto con il colorante per 5 minuti; 3) Rafforzamento del colorante: Per rafforzare il legame tra il colorante e la parete il campione viene sottoposto ad una procedura dove si utilizza una soluzione di iodio ioduro di potassio denominata come Lugol; per l'azione che possiede prende il nome di sostanza mordenzante. 4) Decolorazione: i batteri vengono decolorati attraverso l'utilizzo di due sostanze: - Acetone: che scioglie i lipopolisaccaridi della membrana permettendo la fuoriuscita del colorante dalla membrana; - Etanolo al 100%: agisce disidratando la parete del peptidoglicano e nei gram + dove la parete è più spessa, la decolorazione comporta una restrizione della parete non permettendo la fuoriuscita del colorante. 5) Controcolorazione: L'ultimo passaggio della colorazione è l'utilizzo del secondo colorante, la safranina, definito come colorante di contrasto perchè permette di differenziare i batteri Gram positivi dai Gram negativi. COLORAZIONE DI ZIEHL-NISSEL: La colorazione di Ziehl-nissel è un tipo di colorazione che mette in evidenza i batteri alcol-acido resistenti noti come i micobatteri. I batteri alcool acido-resistenti sono dunque caratterizzati da resistenza all'acido e all'alcool e assumono una colorazione rossa nel preparato per l'analisi al microscopio, mentre i microrganismi non resistenti all'acido si colorano secondo la controcolorazione. MORFOLOGIA E DISPOSIZIONE: I batteri vengono classificati in: 1) Cocchi; 2) Bacilli; 3) Forma a spirale. COCCHI; I cocchi batteri hanno una forma sferica che può rimanere in forma isolata oppure possono unirsi fra loro per formare aggregati tra loro; - Cocchi/coccus singola cellula con una forma sferica; - Diplococchi/diplococcus: cocchi raggruppati in coppie, tra cui gli Enterococchi; - Tetra Cocchi/tetradi: cocchi raggruppati in gruppi di quattro a forma di un grappolo; - Streptococcus/streptococcus: cocchi raggruppati in catenelle, tra cui gli Streptococchi; - Stafilococchi/staphylococcus: gruppi irregolari di cocchi. Tra i batteri cocciformi vi sono alcuni tra i più importanti patogeni umani, tra cui stafilococchi, streptococchi e neisserie, agenti causanti di varie forme di polmoniti, meningiti, setticemie, gonorrea ed infezioni del tratto urinario. BACILLI: bacilli sono dei batteri a forma cilindrica e si classificano in: - Bacillus: singolo batterio a forma cilindrica; - Streptobacillus: bacillus raggruppati in catenelle. - Coccobacilli: batteri che hanno una forma tra un bacillo e un cocco. BATTERI CON FORMA A SPIRALE: - Vibrioni/vibrio: forma a virgola; - Spirilli/spirillum: forma a spirale più curva. - Spirochete: forma a spirale. CARATTERI METABOLICI: In base alla tolleranza verso l’ossigeno, i batteri vengono classificati in: 1) Aerobi obbligati (crescono SOLO in presenza di ossigeno); 2) Anaerobi obbligati (NON crescono in presenza di ossigeno); 3) Aerobi/anaerobi facoltativi (possono crescere sia in presenza che in assenza di ossigeno); 4) Microaerofili (crescono in presenza di basse concentrazioni di ossigeno 2-18% e concentrazioni di CO2 pari a 5-10%). STREPTOCOCCHI: La famiglia degli streptococchi possiede delle caratteristiche specifiche: - Gram +; - Diplococchi o streptococchi; - Capsulati; - Immobili; - Asporigeni; - Aerobi-anaerobi facoltativi; - Ossidasi-negativi: il test dell'ossidasi individua la presenza o assenza dell'enzima citocromo-c-ossidasi (IV complesso della catena di trasporto degli elettroni); - Catalasi negativi: la catalasi è un enzima appartenente alla famiglia delle idrolasi che scinde il perossido di idrogeno H2O2 (acqua ossigenata) nelle sue componenti fondamentali, ossigeno e idrogeno. - Esigenti dal punto di vista nutrizionale: viene utilizzato il terreno agar-sangue, un terreno nutritivo che contiene solitamente una percentuale pari al 5% di sangue di animale(di solito il più utilizzato è il sangue di montone). Il genere streptococcus rappresenta la popolazione microbica maggiormente presente nel cavo orale e nella faringe dell'uomo. Delle molte specie appartenenti a questo gruppo sono innocue per l'uomo, ma esistono alcune specie che sono sono dotate di un notevole potenziale patogeno, tra cui: - S.pyogenes; - S.agalactiae; - S.pneumoniae. CLASSIFICAZIONE DEGLI STREPTOCOCCHI: Gli streptococchi vengono classificati in due modi: 1) In base al tipo di emolisi prodotta in piastre di agar-sangue; 2) Classificazione di Lancefield. TIPO DI EMOLISI IN PIASTRE DI AGAR-SANGUE: Questa classificazione si basa sul tipo di emolisi che avviene all'interno delle piastre di agar-sangue (emolisi:distruzione degli eritrociti presenti nel sangue): - Alfa-emolitici (viridanti): determinano un emolisi incompleta; l'emoglobina contenuta nel terreno non viene completamente lisata e di conseguenza il terreno assume un viraggio sul verde (es: S.pneumoniae); - Beta-emolitici: determinano un emolisi completa all'interno del terreno, degradando completamente l'emoglobina. All'interno del terreno si forma, intorno alle colonie, un alone trasparente (es: S.pyogenes); - Gamma-emolitici: Abbiamo un’ assenza di emolisi di conseguenza il terreno rimane invariato (es: Enterococcus Faecalis). CLASSIFICAZIONE DI LANCEFIELD: Questa classificazione si basa sul tipo di antigene polisaccaridico contenuto nella parete del carboidrato C di parete. Sono stati identificati circa 20 gruppi sierologici, identificati con lettere dell'alfabeto (A-H,K-V): - GRUPPO A: S.pyogenes: - GRUPPO B: S.agalactiae; - GRUPPO C: S.equisimilis; - GRUPPO D: E.faecalis - GRUPPO G: S.anginosus. IMPORTANTE: Lo S.pneumoniae non possiede l'antigene C, quindi non rientra nella classificazione di Lancefield. STREPTOCOCCUS PYOGENES: Lo streptococcus pyogenes è uno streptococco beta-emolitico con antigene polisaccaridico di gruppo A. Lo S.pyogenes è un batterio a circolazione interumana e la sorgente di infezione è quindi rappresentata dall'uomo stesso. La frequenza di portatori sani (faringei) è di 4-25% e può raggiungere sino il 40-60% in alcune comunità infantili. COMPOSIZIONE STRUTTURALE DELLA PARETE: La cellula batterica di S.pyogenes è costituita da: - Capsula: capsula costituita da un polisaccaride, l'acido ialuronico; - Proteina M: proteina fibrillare che si estende dalla superficie delle cellule in forma di proiezioni filiformi; si distinguono circa 100 tipi sierologici (M1,M2,M3….). FATTORI DI VIRULENZA: La Virulenza è la capacità dei batteri di aderire alla superficie della cellula ospite, invadere le cellule epiteliali,eludere l'opsonizzazione e la fagocitosi e produrre una varietà di enzimi e tossine. I fattori di virulenza dello S.pyogenes sono delle componenti di superficie: CAPSULA: La Capsula è dotata di potere antifagocitario, è formata da acido ialuronico che, non essendo sostanzialmente diverso dall'acido ialuronico dell'ospite, è immunologicamente tollerato e non è quindi un antigene.  ACIDO LIPOTEICOICO (LTA): Acido lipoteicoico (LTA): si trova nelle fimbrie di superficie, svolgendo il ruolo di adesina. Questa è una molecola tossica per numerosi tipi cellulari. CARBOIDRATO C: Carboidrato C: rappresenta circa i ⅔ della parete ed è formato da polimeri ramificati di L-ramnosio e N-acetilglucosamina. PROTEINA F: Proteina F (fibronectin binding protein): è una molecola di superficie con funzione di adesina e di invasiva, in quanto favorisce l'adesione/penetrazione del batterio nella cellula ospite; si tratta di una FBP (fibronectin-binding protein) codificata per il gene prtF1. Il suo meccanismo d'azione viene definito a ponte:La proteina F si lega alla fibronectina (glicoproteina della matrice extracellulare sulla cellula dell'ospite) che è legata a un recettore superficiale, integrina della cellula ospite stessa. PROTEINA M: La Proteina M è il principale fattore di virulenza poiché si oppone alla fagocitosi e al killing ad opera dei polimorfonucleati, inibendo l'attivazione della via alternativa del complemento. La proteina M è una adesina e le sue due catene polipeptidiche sono uguali e complessate ad alfa-elica e caratterizzate dalla presenza nella loro sequenza di diversi blocchi di AA ripetuti. Queste proteine sporgono verso l'esterno essendo ancorate alla cellula (a livello del peptidoglicano e della membrana citoplasmatica) con l'estremità carbossi-terminale, idrofobica e contenente un motivo eptapeptidico altamente conservato. la porzione carbossi-terminale della proteina M è relativamente conservata mentre la porzione amino-terminale è ipervariabile nel tratto più distale. Questa variabilità è alla base della molteplicità dei sierotipi M: sono oltre 100 seriotipi oggi identificati sia in base alla reattività sierologica sia più recentemente, alla sequenza nucleotidica dei geni, denominati geni emm,che codificano le diverse varianti della proteina La proteina M è una proteina immunogena; gli anticorpi anti-M sono gli unici anticorpi anti streptococcici. Le proteine M vengono classificate in due classi: - Classe I: - Classe II: Entrambe le classi della proteina M sono in grado di causare malattie suppurative o glomerulonefrite, però solamente quelle appartenenti alla classe I, possono causare la febbre reumatica, poiché contengono una regione altamente conservata con epitopi reumatogeni che inducono una risposta verso antigeni self in pazienti affetti da febbre reumatica. ESOENZIMI: Gli esoenzimi, sono enzimi che vengono prodotti dalla cellula batterica e poi riversati nell'ambiente extra-cellulare: Streptochinasi: favorisce la fibrinolisi trasformano il plasminogeno plasmatico in plasmina; Desossiribonucleasi: degrada il DNA libero; C5a peptidasi:componente del complemento media infiammazione reclutando e attivando i fagociti. La C5a peptidasi inattiva il processo infiammatorio degradando il C5a. Riduce la chemiotassi dei neutrofili e fagociti mononucleati: Ialuronidasi: presunto spreading factor è una DNAsi di cui sono riconosciute 4 distinte variabilità antigenica denominate A,B,C e D. NAD glicoidrolasi: idrolizza il coenzima NAD. ESOTOSSINE: Le esotossine comprendono due distinte emolisine: - Streptolisina O; - Streptolisina S. Inoltre lo S.pyogenes produce delle esotossine pirogene (SPE). STREPTOLISINA O: Appartiene alle cosiddette emolisine O (ossigeno-labili), sono citolisine altamente conservate capaci di formare pori a livello della membrana, attive su un'ampia gamma di cellule dell'ospite oltre che sugli eritrociti. Sono definite tossine tiolo-attivate, poiché la loro attività dipende dall'integrità dei residui -SH, che sono rapidamente alterati dall’ossigeno; si legano al colesterolo delle membrane eucariotiche formando aggregati tossina-colesterolo che contribuiscono alla lisi cellulare attraverso un meccanismo colloido-osmotico. STREPTOLISINA S: La streptolisina S è costituita da un piccolo peptide che, una volta sintetizzato, tende a rimanere associato alla superficie batterica. Questa emolisina è attiva su un'ampia gamma di cellule ospite, in rapporto al peso, una delle più potenti citotossine conosciute. Essa è responsabile della beta-emolisi che caratterizza le colonie di S.pyogenes cresciute su agar sangue in aerobiosi. ESOTOSSINE PIROGENICHE STREPTOCOCCICHE (SPE): Sono una famiglia di superantigeni batterici in grado di produrre un grande varietà di citochine (interferone gamma ecc..) 1) SpeA; 2) SpeB; 3) SpeC; 4) SpeF. Sono tossine che sono prodotte da ceppi lisogeni e agiscono da superantigeni. Permettono il rilascio di grosse quantità che mediano diversi effetti biologici tra cui lo shock, l'insufficienza d'organo e il collasso. Le esotossine pirogeniche streptococciche sono responsabili dell'eritema della scarlattina; i superantigeni non vengono internalizzati ed elaborati come gli antigeni convenzionali, ma si legano dall'esterno della cellula APC e dei linfociti. PATOGENICITÀ DELLO S.PYOGENES: Nell’era pre-antibiotica gli streptococchi sono tra i principali patogeni umani. Dopo l'introduzione degli antibiotici, le malattie streptococciche sono ben controllate e la morte per tali infezioni è un evento molto raro. L'habitat degli streptococchi è rappresentato in genere dalle vie aeree superiori e vengono trasmessi da individui portatori ad individui suscettibili per contatti diretti interumani (es.goccioline di flugge). Le malattie causate da S.pyogenes si possono classificare in: Malattie suppurative: abbiamo la presenza e la replicazione attiva dal microrganismo nell'individuo (produzione di pus) e si classificano a loro volta in: 1. Localizzate (meno gravi): faringo-tonsillite,impetigine e scarlattina; 2. Invasive (gravi): Erisipela, fascite necrotizzante, febbre puerperale (shock-tossico). Malattie non suppurative post streptococciche; quando l'infezione è risolta, il batterio non è più presente nell’individuo ma si hanno delle sequele: 1. Glomerulonefrite (reni); 2. Febbre reumatica (articolazioni e valvole cardiache). MALATTIE SUPPURATIVE: MALATTIE SUPPURATIVE LOCALIZZATE: ANGINA STREPTOCOCCICA: L'Angina streptococcica o una faringite (faringotonsillite) caratterizzata da una infiammazione locale con essudato purulento,spesso accompagnata da: - Tonsillite;  - Febbre anche elevata; - Rigonfiamento dei linfonodi regionali. La malattia interessa principalmente i bambini e ha una durata media di due settimane. L'uomo è il solo ospite naturale di S.pyogenes e può albergare il microrganismo nella faringe in modo asintomatico. La trasmissione avviene per via aerogena; se l'infezione è sostenuta da un ceppo produttore di tossine pirogene SPE, può insorgere un caratteristico esantema (scarlattina), in dipendenza dalla sensibilizzazione dell'individuo. Il paziente affetto da angina streptococcica può essere trattato con penicillina con l'obiettivo di eradicare il microrganismo al fine di ridurre il rischi di insorgenza di altri quadri clinici ad eziologia immune, come la febbre reumatica o la glomerulonefrite acuta. Gli antibiotici utilizzati sono i beta-lattamici come: - Penicillina; - Augmentin (formato da amoxicillina e acido clavulanico inibitore dell'enzima beta-lattamasi che va a degradare l'anello beta-lattamico della penicillina). SCARLATTINA: La scarlattina si verifica negli individui che per precedenti infezioni da ceppi produttori di una diversa SPE abbiano sviluppato uno stato di ipersensibilità verso il componente comune della SPE prodotta dall'agente in quel momento. Quindi la scarlattina si può verificare più di una volta nello stesso individuo. La scarlattina si manifesta con un'eruzione cutanea caratterizzata da eritema diffuso con micropapule che dal volto diffondono a tronco,addome,estremità. Viene risparmiata l'area intorno alla bocca (pallore circolare). Lingua a “lampone” con papille ben evidenti. Febbre per 5-10 giorni. IMPETIGINE: Infezione cutanea superficiale che si presenta come un grappolo di vescicole che progrediscono e successivamente danno luogo a croste color miele. MALATTIE SUPPURATIVE INVASIVE: ERISIPELA: Infezione dei tessuti cutanei e sottocutanei, caratterizzata da eritema,edema, indurimento (che si presenta come chiazze rilevate di colore rosso fuoco) con un margine ben delimitato a rapida progressione. In genere interessa il volto e le estremità inferiori. (S.pyogenes può essere isolato dal tessuto sottocutaneo ed occasionalmente anche dal sangue). FASCITE NECROSANTE: Questa malattia può essere causata da ceppi: - Produttori di SPE (A,B,C ed altre SPE di recente dimostrazione); - Con abbondante capsula; - Generalmente la proteina M appartiene alla classe I. Segue in genere un trauma cutaneo caratterizzato da:  - Necrosi di cute e tessuti sottocutanei infetti; - Infiammazione (miosite) e necrosi del tessuto muscolare. SINDROME DA SHOCK TOSSICO: Nella sindrome da shock tossico, i sierotipi coinvolti sono quelli che posseggono la proteina M della classe I e II (denominate anche M1 e M2), che presentano capsule mucopolisaccaridi che di acido ialuronico. La sindrome si deve anche alla produzione di esotossine pirogeniche SpeA e SpeC. Fisiologicamente abbiamo una massiccia liberazione di citochine da parte di linfociti T e dei macrofagi attivati porta a gravi effetti sistemici quali: - Vasodilatazione; - Compromissione multiorgano; - Ipotensione; - Shock. FEBBRE PUERPERALE: Molto diffusa in passato come complicanza di parti o aborti (25%). Moltiplicazione di S.pyogenes nell'utero e successiva diffusione alla pelvi e al peritoneo con setticemia. MALATTIE NON SUPPURATIVE: FEBBRE REUMATICA: Si hanno processi infiammatori a carico: - Cuore (anche pancardite: endocardite+pericardite+miocardite); - Articolazioni (artralgie, artriti deformanti a decorso migratorio); - Vasi sanguigni; - Tessuto sottocutaneo; - Corea di Sydenham (chorea minore). I sierotipi coinvolti sono M1,3,5,6,18. Una faringo tonsillite da S.pyogenes innesca un processo morboso su base immunitaria (umorale e cellulare). Questi pazienti hanno elevati livelli di anticorpi anti streptococcici e autoreattivi e cellule T. Insorge 2-3 settimane dopo l'infezione acuta da S.pyogenes. Si manifesta nel 5% circa delle persone infettate. Il potenziale reumatologo varia da ceppo a ceppo. Il danno cardiaco si deve ad una reazione autoimmune: alcuni antigeni di S.pyogenes hanno reattività crociata con molecole presenti nel corpo umano: in particolare gli Ab evocati dal batterio si legano al muscolo cardiaco, a muscoli scheletrici, a muscoli lisci e infine anche ai vasi sanguigni. L'interessamento di endocardio,miocardio,pericardio (pancardite), comporta lesioni progressive e permanente delle valvole cardiache (MALATTIA CARDIACA REUMATICA). GLOMERULONEFRITE ACUTA: Questa malattia si manifesta principalmente nell'età infantile e insorge 1-4 settimane dopo la faringo-tonsillite o 3-6 settimane dopo l'infezione cutanea. Solo alcuni ceppi sono nefritogeni: M12 fra i cappi associati a faringo-tonsillite e M49 fra i ceppi associati a impetigine. Gli anticorpi verso la proteina M dei ceppi nefritogeni si formano con la proteina M complessi in eccesso di antigene (solubili e circolanti), che si depositano sulla superficie glomerulare. Il complesso immune attiva il complemento con la conseguente degranulazione dei basofili, liberazione di istamina che aumenta la permeabilità vascolare, liberazione dei fattori chemiotattici C3a C5a che reclutano cellule infiammatorie con la conseguente liberazione di enzimi lisosomiali. La reazione infiammatoria induce l'esposizione di epitopi criptici sulla membrana basale glomerulare che cross-reagiscono con gli anticorpi anti proteina M. Si manifesta con: - Edema; - Ipertensione; - Ematuria; - Proteinuria; - Diminuiti livelli sierici di fattori complementari. Le lesioni proliferative diffuse dei glomeruli in genere si risolvono spontaneamente in settimane/mesi. A differenza della febbre reumatica non si ritiene che la profilassi antibiotica possa prevenire le sequele glomerulonefriti. DIAGNOSI DI LABORATORIO: La diagnosi di laboratorio che viene effettuata su campioni clinici,che possono essere di due tipi: Tamponi faringei; Tamponi cutanei. Vengono effettuati su questi campioni dei tipi di esami che si classificano in base al metodo di diagnosi: Diagnosi diretta: ricerca del microrganismo o dei suoi componenti (antigeni) o del suo genoma in campioni provenienti dalla sua sede di replicazione. Non viene effettuata in ogni distretto corporeo ma solamente nella sezione del corpo a sospetta infezione. Per la ricerca dello S.pyogenes secondo questa tecnica vengono effettuate: 1) Esame microscopico; 2) Esame colturale; 3) Test di identificazione: insieme di test che indagano sulla presenza di caratteristiche strutturali del batterio; Diagnosi indiretta/sierodiagnosi: ricerca di anticorpi specifici per il microrganismo di interesse nel siero, componente liquida del sangue che non contiene i fattori della coagulazione o nel plasma, componente liquida del sangue che contiene i fattori della coagulazione. 1) Osservazione del titolo antistreptolisinico. DIAGNOSI DIRETTA: ESAME MICROSCOPICO: L’esame microscopico diretto in genere ha poco significato, poichè nella faringe dell'uomo sono presenti batteri commensali altri streptococchi. In questo tipo di esame viene effettuata la colorazione di Gram e si osserva in seguito dei cocchi gram positivi disposti a catenella. ESAME COLTURALE: L'esame colturale viene effettuato su un terreno nutriente, agar sangue di pecora al 5% per 24-48 h a 37 gradi. Le colonie in seguito alla crescita sul terreno appaiono di 1-2 mm di diametro, spesso con aspetto mucoso e circondate da un alone di beta-emolisi. IDENTIFICAZIONE: 1) Test di sensibilità alla bacitracina: La bacitracina è un antibiotico polipeptidico prodotto da un ceppo di Bacillus subtilis. La bacitracina è un antibiotico polipeptidico che inibisce la sintesi della parete cellulare (durante il processo di sintesi del peptidoglicano),attraverso la reazione di defosforilazione contro il bactoprenolo ed è attivo nei confronti dei batteri Gram-positivi 2) Identificazione sierologica del carboidrato C; 3) Identificazione mediante immunofluorescenza del carboidrato C DIAGNOSI INDIRETTA: OSSERVAZIONE DEL TITOLO ANTISTREPTOLISINICO: La Diagnosi diretta viene effettuata attraverso la titolazione di anticorpi antistreptolisina-O, utilizzato per definire il titolo anticorpale. Il processo è articolato nelle seguenti fasi: 1) Diluizione scalare del siero: 1:10-1:20-1:40-1:80-1:160-1:320-1:640-1:1280. 2) Aggiunta di SLO: incubatore per 60 minuti a 37 C. 3) Aggiunta di sangue di coniglio 5%: 45 min x 37C. 4) Lettura: osservare la presenza di anticorpi anti-streptolisina O. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE: Lo streptococcus pneumoniae è uno streptococco alfa-emolitico, sulle piastre di agar-sangue non avviene un emolisi completa,ma a differenza degli altri streptococchi alfa-emolitici presentano delle caratteristiche di autolisi. Lo S.pneumoniae non può essere classificato tramite la classificazione di Lancefield, poiché non possiede il carboidrato C di parete. Esso è un diplococco Gram +, la cui cellula possiede una forma piriforme o lanceolata con le porzioni più arrotondate che si fronteggiano nei tipici diplococchi. Possiede ulteriori caratteristiche: - Immobili;  - Asporigeni, - Aerobi-anaerobi facoltativi; - Catalasi negativi. Lo S.pneumoniae è un batterio che è stato studiato dallo scienziato inglese Frederick Griffith, ha osservato la presenza di due ceppi batterici: - Ceppi S (smooth): le colonie appaiono al microscopio lisce e mucose, prive di capsula; sono lucide e distribuite a goccia di rugiada. - Ceppi R (rough): le colonie appaiono al microscopio rugose,opache e non mucose. Inoltre si possono osservare degli altri tipi di colonie: - Colonie vecchie dello S.pneumoniae appaiono a pedina di dama o a cratere; ci. - Colonie fantasma per via della scomparsa delle cellule batteriche per meccanismi di autolisi. CARATTERI COLTURALI: I ceppi di S.pneumoniae non posseggono particolari esigenze colturali, ma per la loro crescita necessitano di condizioni di microaerofilia. Questi batteri si coltivano sulle piastre di agar-sangue e le colonie, in base all'emolisi incompleta vengono definiti alfa-emolitici; sono catalasi negativi e anaerobi facoltativi. IDENTIFICAZIONE: - Sensibilità all'optochina; - Fermentazione inulina; - Solubilità in bile (i sali biliari attivano una autolisina, LytA, che scinde i legami del complesso); - Reazione di rigonfiamento capsulare (reazione di Neufeld). FATTORI DI VIRULENZA: CAPSULA: Il principale fattore di virulenza è la capsula polisaccaridica composta da lunghi polimeri, lineari o ramificati, in cui si ripetono unità di 2-7 monosaccaridi. La presenza della capsula può essere evidenziata tramite: - Inchiostro di china: colorazione negativa con nigrosina; - Anticorpi monoclonali: Gli anticorpi monoclonali rivolti verso i componenti capsulari (antigeni capsulari). Questa tecnica è adoperata nella diagnostica microbiologica. La capsula polisaccaridica lo suddivide in oltre 90 sierotipi, raggruppati almeno in 40 sierogruppi sulla base di reazioni crociate dei vari sierotipi. Non tutti i tipi sierologici sono ugualmente patogeni: - 1,3,6,1,19,23 frequenti nelle infezioni polmonari invasive; - 3 frequente nell otiti medie; - 23 frequente nelle meningiti. Alcuni più frequenti nello stato di portatore, la percentuale di portatori varia in base alla stagione all’ età (più elevata in bambini in età scolare e prescolare). ALTRI FATTORI DI VIRULENZA:  1) Polisaccaride C: diverso dall'antigene di Lancefield, si tratta di un particolare polisaccaride simile ad un acido teicoico contente fosforilcolina, la quale si lega a un recettore cellulare dell'ospite per il fattore attivante le piastrine (PAF:platelet activating factor). 2) Le proteine di superficie: le proteine dello pneumococco si possono grosso modo suddividere in tre famiglie. Esse sono proteine legate covalentemente alla parete con un motivo eptapeptidico carbossi-terminale e si suddividono in: - Proteine leganti la colina: di questo gruppo fanno parte la proteina M dello S.pyogenes e la proteina A dello S.aureus. A questo gruppo appartengono due tipi di enzimi: 1) Ialuronidasi:la Ialuronidasi è un enzima che agisce neutralizzando l'acido ialuronico, uno zucchero presente nel tessuto connettivo. 2) Neuraminidasi: riduce la viscosità del muco e favorisce l'esposizione di recettori sulle cellule epiteliali. - Proteine leganti a lipoproteine: si classificano in altri tre tipi di proteine: 1) Proteina A (PspA): che interagisce con l'attivazione del complemento e con la captazione del ferro; 2) Proteina C (PspC): coinvolta nell'adevisità all'epitelio delle altre vie respiratorie; 3) Autolisina (LytA): sembra contribuire la patogenicità non tanto di per se, quan ESOENZIMI E TOSSINE: - IgA1-proteasi: idrolizza le IgA secretorie di tipo 1. Riduce la viscosità del muco e favorisce l’esposizione di recettori sulle cellule epiteliali. - Pneumolisina O (ossigeno-labili): La pneumolisina non è però una esotossina: è infatti prodotta nel citoplasma ed è rilasciata solo in seguito alla lisi cellulare. Distrugge cellule epiteliali e fagociti. Induce rilascio di TNF- e IL-1. PATOGENICITÀ DELLO PNEUMOCOCCO: Lo pneumococco produce malattia per la capacità di invadere e di moltiplicarsi nei tessuti. Il ruolo delle tossine non è certo; lo S. pneumoniae è un ospite frequente delle prime vie respiratorie (fino al 60% nei bambini, fino al 10% negli adulti) da dove, in presenza di concause predisponenti: - Infezioni respiratorie da virus; - Inalazione di anestetici irritanti; - Traumi toracici; - Insufficienza cardiaca. I fattori sopra elencati sono fattori in grado di favorire l’insorgenza di edema polmonare, che può raggiungere le vie aeree profonde provocando la polmonite. L'azione patogena è legata alla capacità di moltiplicarsi all'interno degli alveoli polmonari inducendo una intensa risposta infiammatoria che porta al consolidamento di uno o più lobi del polmone. MALATTIE CAUSATE DALLO S.PNEUMONIAE: Le malattie causate dallo S.pneumoniae sono: - Polmonite pneumococcica; - Otite-media: infiammazione che interessa l'orecchio medio, ovvero la cassa timpanica e tutte le strutture in essa contenuta (incudine,staffa e martello). Si presenta principalmente in età infantile, tanto che circa il 33% dei bambini viene colpito dalla malattia prima dei due anni di età. - Sinusite: Infiammazione dei seni paranasali. - Mastoidite: infezione delle cellule pneumatiche mastoidee che generalmente consiste in un otite media acute; le cellule pneumatiche mastoidee sono delle concamerazioni all'interno del processo mastoideo. - Meningite: infezioni a carico delle meningi. LA POLMONITE PNEUMOCOCCICA: La polmonite pneumococcica è da considerarsi una infezione endogena; il fatto che esista una notevole percentuale di portatori sani nella popolazione indica che esiste una efficace resistenza naturale nei confronti dello pneumococco; quindi,la polmonite pneumococcica si verifica se vengono alterate le normali difese naturali dell'apparato respiratorio come: - Rallentamento del riflesso epiglottale:(anestesia, morfina, intossicazione alcoolica); - Alterazione dell'apparato mucociliare:(infezioni virali, raffreddamento); - Alterazione fagocitosi alveolare: accumulo di fluidi negli alveoli insufficienza (cardiaca; inalazione di gas irritanti; edema polmonare; stasi polmonare da decubito). Lo pneumococco, una sorgente endogena di malattia, può comportarsi da patogeno opportunista. 1. MECCANISMO DI PENETRAZIONE E REPLICAZIONE: Le cellule dello S.pneumoniae arrivano a livello alveolare per inalazione di microgoccioline di saliva infette; successivamente attraversa le barriere mucose dell'ospite e dopo aver oltrepassato la mucosa del tratto respiratorio, lo pneumococco può raggiungere i seni nasali e l'orecchio medio. Si localizza nei bronchioli,dove prolifera e dà origine a un processo infiammatorio che inizia negli spazi alveolari con l'essudazione di un liquido ricco di proteine. I fluidi agiscono come terreno di coltura per batteri e facilitano la disseminazione agli alveoli vicini, causando tipicamente una polmonite. 2. EPATIZZAZIONE ROSSA: Lo stadio successivo alla replicazione negli alveoli è la epatizzazione rossa, poiché si osserva una marcata infiltrazione di globuli rossi, neutrofili e fibrina nel liquido alveolare. Grossolanamente, i polmoni appaiono rossi e sodi simili ad un fegato, da qui il termine epatizzazione. 3. EPATIZZAZIONE GRIGIA: Secondo stadio dell'evoluzione in polmonite lobare, in cui il parenchima polmonare è duro piuttosto che spugnoso e ha una colorazione grigiastra. Il colore è dovuto alla degradazione dei leucociti, dei globuli rossi e della fibrina che riempiono gli alveoli. 4. RISOLUZIONE: La risoluzione si ha quando vengono prodotti gli anticorpi specifici in grado di opsonizzare il microrganismo e renderlo meglio fagocitabile. PROGNOSI: Il livello di mortalità della polmonite pneumococcica è del 30% se non l'infezione non viene trattata e 5% se trattata. Ci possono essere delle complicanze come: - Pleurite; - Empiema; - Batteriemia: Fulminante in pazienti asplenici (pazienti che hanno una condizione fisiologica che ha comportato la perdita della totale funzionalità della milza); ad alto rischio in pazienti HIV-positiva. La batteriemia presenta mortalità del 25% anche se trattata. - Meningite; - Endocardite; - Pericardite. FARMACO RESISTENZA: In italia si osserva una resistenza contro la penicillina; alcune cefalosporine (soprattutto quelle più recenti) possono essere attive nei confronti dei ceppi penicillino-resistenti. I macrolidi sono considerati di seconda scelta nelle infezioni pneumococciche, da considerare soprattutto in pazienti allergici alla penicillina. Si osserva anche una resistenza all'eritromicina. Negli ultimi anni i fluorochinoloni sono diventati molto importanti nel trattamento della polmonite comunitaria, anche se sono stati segnalati dei ceppi resistenti ai fluorochinoloni. Non è mai emersa una resistenza dello pneumococco ai glicopeptidi, ma sono stati segnalati dei casi di tolleranza (ossia una risposta regolare dell'attività inibente di questi antibiotici associata però a una ridotta risposta all'attività battericida): PROFILASSI: VACCINO ANTI-PNEUMOCOCCICO: Esistono due tipi di vaccini anti-pneumococcico: - Vaccino polisaccaridico (PPV23): antigene polisaccaridico capsulare purificato da 23 sierotipi di Pneumococco. Protezione verso l’78% delle malattie batteriche da pneumococco non efficace nei bambini di età 10-2). RESISTENZA: - MDR-TB (MULTIDRUG RESISTANT): resistenza ad almeno isoniazide e rifampicina; - pre-XDR (EXTENSIVELY DRUG RESISTANT): ceppo MDR resistente anche ai fluorochinoloni. - xdr (extensively drug resistant): ceppo MDR resistente anche ai fluorochinoloni e ad almeno un altro farmaco di gruppo A. DIAGNOSI DI INFEZIONE LATENTE: - Test tubercolinico; - Test IGRA. E’ possibile dimostrare una infezione tubercolare latente in un individuo mediante la intradermoreazione alla tubercolina: - Tubercolina vecchia di Koch: coltura liquida di bacillo tubercolare, sterilizzata in autoclave, concentrata al calore e filtrata. - PPD (Derivato Proteico Purificato): Miscela di proteine micobatteriche purificate. TEST IN VIVO: TEST DI MANTOUX: Il test Mantoux è uno dei metodi più comuni e semplici da effettuare, per rilevare un'infezione tubercolare latente. Consiste nell'iniettare una piccola quantità di derivato proteico purificato (PPD) del Mycobacterium tuberculosis sotto la pelle, solitamente sul lato interno dell'avambraccio (test in vivo). Il test di Mantoux si esegue iniettando per via intradermica una quantità nota di tubercolina (o tubercolina PPD, che dir si voglia) sull'avambraccio del paziente con sospetta tubercolosi. Nel dettaglio, si iniettano 5 unità tubercoliniche. Ogni unità corrisponde a 0,000028 mg di derivato proteico liofilizzato in 0,1 ml di soluzione. Dopo un periodo di 48-72 ore, il paziente deve sottoporsi a un controllo dell'avambraccio, al fine di individuare e determinare le reazioni avvenute in corrispondenza del sito di inoculazione della tubercolina. In funzione della reazione risultante dalla somministrazione intradermica di tubercolina, è possibile capire se il paziente è positivo o negativo all'infezione da bacillo di Koch. In genere, si assiste alla comparsa di una chiazza di colore rosso che può avere dimensioni variabili. Tuttavia, ciò che si deve analizzare non è tanto l'estensione della chiazza rossa, bensì il diametro dell'indurimento dermico che si manifesta nel sito di inoculazione. Difatti, sulla base di tale diametro è possibile valutare se il test è positivo o negativo secondo i seguenti criteri: - Nessun indurimento: test negativo; - Indurimento con diametro inferiore ai 2 mm: test negativo; - Indurimento con diametro fra 2 e 4 mm: test dubbio; - Indurimento con diametro di 5 mm o superiore: test positivo. Il valore soglia che determina positività può essere di 5 mm, 10 mm oppure 15 mm in base alla classe di rischio cui appartiene il paziente. Specificità: bassa; Sensibilità: non soddisfacente. TEST IN VITRO IGRA (interferon-gamma release assay): Il test in vitro IGRA ossia il interferon-gamma release assay, che è stato introdotto nel 2005 nella routine diagnostica, consiste nel cimentare, per 16-24 ore, il sangue intero del soggetto indagato con particolari antigeni tubercolari come ESAT-6, CFP-10 o lo stesso derivato proteico purificato. Successivamente, dopo il tempo necessario alla processazione degli antigeni, si valuta mediante ELISA la presenza di interferone, che testimonia l'attività dei linfociti T sensibilizzati al M. tuberculosis. DIAGNOSI MICROBIOLOGICA: La diagnosi microbiologica per l'identificazione del M.tuberculosis è articolata in cinque fasi: - Esame batterioscopico; - Isolamento colturale; - Amplificazione genica; - Identificazione; - Antibiogramma. CAMPIONI: I campioni subiscono i seguenti passaggi: - Fluidificazione; - Decontaminazione; - Concentrazione. ESAME BATTERIOSCOPICO: L'esame batterioscopico viene effettuato con le seguenti metodiche: - Ziehl-Neelsen; - Kinyoun; - Fluorocromi. I vantaggi di questo esame sono: - Semplicità; - Rapidità; - Specificità. Gli svantaggi di questo esame sono:  - Bassa sensibilità; - Tipo di campione; - Tecnica di colorazione. I falsi positivi sono 5-10%: - Errori di laboratorio; - Terapia antimicobatterica. ISOLAMENTO COLTURALE: Il test di riferimento utilizzato per l'isolamento colturale è l'esame gold standard;L'isolamento colturale viene effettuato attraverso l'utilizzo di due tipi di terreni: - Terreni solidi; - Terreni liquidi. TERRENI SOLIDI: - Osservazione per 60 giorni a 37°C. - Tempo medio di crescita 18-25 giorni; - Specifico per micobatteri (molto selettivo); - Economico, - Semplice; - Adatto tutti I tipi campioni; - Consente di apprezzare caratteri delle colonie; - Tempo di risposta in genere 30-40 giorni se positivo; 60 giorni se negativo. TERRENI LIQUIDI: - Osservazione per 42 giorni a 37°C; - Tempo medio di crescita 5-14 giorni, - Sensibile; - Più rapido; - Tempo di risposta in genere 10-20 giorni Se positivo; 42 giorni se negativo: - Automatizzato: Utilizzo del sistema fluorimetrico MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube). 1) Il terreno viene addizionato con un supplemento sintetico a base di acido oleico (fonte di acido grasso) ed albumina (serve a detossificare e neutralizzare i legami tossici del metabolismo dell'acido oleico). 2) Vengono poi aggiunti una serie di antibiotici e sostanze verso le quali il batterio è resistente in modo da rendere il terreno selettivo. 3) Fatto tutto ciò si aggiunge il campione nel terreno e si mette ad incubare nello strumento. Lo strumento mantiene una temperatura di incubazione a 37 C° e allo stesso tempo monitora periodicamente la fluorescenza: una sostanza (indicatore fluorimetricobasato sull'ossigeno) se rileva una diminuzione dell'ossigeno nella provetta emette fluorescenza; questo è correlato ad una replicazione batterica che appunto consuma ossigeno. La funzione da incubatore a una temperatura fissa di 37°C ha uno svantaggio; altri micobatteri possono avere temperature di crescita diverse dai 37 C°; l'isolamento su terreno solido invece permette di  successivamente incubare a temperature differenti in base al sospetto clinico. Vengono impiegati sempre entrambi i terreni in quanti entrambi hanno dei vantaggi. In una piccola percentuale di casi in terreno liquido si verifica una contaminazione. IDENTIFICAZIONE: Dalla coltura positiva si esegue un esame microscopico con colorazione di Ziehl-Neelsen per vedere se effettivamente ci sono micobatteri (se si tratta di mycobacterium tuberculosis si osservano dei cordoni). Successivamente per identificare con certezza la specie si possono utilizzare diversi approcci: - Prove biochimiche - Test immunocromatografico (specifico per M. tuberculosis, eseguito in 15 min. utilizza anticorpi che legano un antigene specifico di M. tuberculosis). - MALDI-TOF; - Test molecolari (mediante ibridazione RO LE ENTEROBACTERIACEAE: Gli enterobatteri appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae, rappresentano il gruppo più ampio di bacilli gram-negativi di rilevante interesse medico. Le enterobacteriaceae si suddividono in due specie: - Patogeni: la loro presenza nell'organismo umano provoca sempre la malattia e fanno parte di questa classe di enterobacteriaceae: a) Salmonella typhi; b) Shigella species; c) Yersinia pestis.  - Patogeni opportunisti: fanno parte della flora normale e commensale dell'ospite e possono causare infezioni opportunistiche; fanno parte di questa classe enterobacteriaceae come: a) Escherichia Coli; b) Klebsiella pneumoniae; c) Proteus mirabilis. Scono diffusi nell'ambiente e risiedono abitualmente nell'intestino dell'uomo e nella maggior parte degli animali. Le enterobacteriaceae sono bacilli gram-negativi, corti e con le estremità arrotondate, tipicamente di 4-5 micrometri di lunghezza e possiedono le seguenti caratteristiche: - Asporigeni; - Mobili Per flagelli peritrichi (ad eccezione di Klebsiella e shigella); - Quasi costantemente provvisti di pili; - Aerobi-anaerobi facoltativi. Possono crescere in una notevole varietà di terreni di coltura selettivi, di cui il Mac-Conkey agar è il più utilizzato. Dal punto di vista nutrizionale, le enterobacteriaceae hanno esigenze nutrizionali semplici: - Fermentano il glucosio; - Riducono il nitrato; - Catalasi positivi; - Ossidasi negativi L'assenza di citocromo C rappresenta un'importante caratteristica facilmente evidenziabile (negatività al test dell'ossidasi) e utile per distinguere le Enterobacteriaceae da molti altri bacilli gram-negativi. ANTIGENI DELLE ENTEROBACTERIACEAE: I membri della famiglia Enterobacteriaceae sono antigenicamente molto complessi e possono essere identificati in base ai tre tipi di antigeni che posseggono: - Antigene K; - Antigene H; - Antigene O.  ANTIGENE K: L'antigene K è rappresentato generalmente dal polisaccaride capsulare, che viene definito V in Salmonella typhi (talvolta può essere anche di natura proteica). Gli antigeni K, possono essere associati con la virulenza, infatti ceppi con particolari antigeni K sono prevalentemente agenti di specifiche patologie, ne sono un esempio: - Escherichia coli: l'antigene K1, spesso responsabile di meningite neonatale; - Klebsiella pneumoniae: spesso causa di infezioni delle vie respiratorie, grazie ai tipi capsulari 1 e 2. ANTIGENE H: L'antigene che è rappresentato dalle proteine flagellari, quindi Klebsiella e Shigella che sono non-mobili ne sono sprovvisti. Gli antigeni H vengono denaturati rimossi con l'alcool o con il calore e agglutinati con gli anticorpi anti-H. ANTIGENE SOMATICO O: L'antigene somatico O è rappresentato dalla catena polisaccaridica del lipopolisaccaride (LPS). Gli antigeni O sono resistenti al calore e all'alcool,agglutinano con gli anticorpi anti-O. Certi antigeni O possono promuovere l’adesione alle cellule epiteliali ed essere associati a specifiche malattie umane come per alcuni ceppi di E. coli responsabili di diarrea (O:157) o di infezioni delle vie urinarie. Gli antigeni K, labili al calore, possono interferire con la ricerca degli antigeni O, ma possono essere rimossi facendo bollire il microrganismo. In aggiunta agli antigeni K, H e O la maggior parte delle Enterobacteriaceae può avere anche gli antigeni associati ai pili o fimbrie. CLASSIFICAZIONE: I membri della famiglia delle enterobacteriaceae sono strettamente correlati ai lro genomi. Attualmente sono stati individuati 40 generi e più di 150 specie; solamente 20 di queste sono importanti dal punto di vista clinico. Inoltre la loro classificazione può essere effettuata da una serie continua di “tipi” biochimica, in seguito ad una crescita sul terreno Agar MacConkey che contiene, inoltre, il lattosio come unica fonte di carboidrati. Gli enterobatteri si suddividono in: - Lattofermentati: che producono colonie rosse con un'area circostante di precipitazione dei sali biliari (ad esempio Escherichia coli); - Non fermentanti: (salmonella). La classificazione definitiva in specie viene effettuata in base a numerose caratteristiche metaboliche: - Utilizzo di alcuni substrati come fonte unica di carbonio; - Presenza di peculiari enzimi; - Prodotti del metabolismo specifici;  - Capacità di fermentare alcuni zuccheri: si esegue il test del rosso metile sia su enterobatteri fermentanti lattosio che non fermentanti. In questo test si mettono in evidenza enterobatteri che producono acidi misti seguito della fermentazione đel glucosio. Le specie con una fermentazione ad acidi misti abbassano il pH di un brodo glucosio fino a 4. Il test si esegue aggiungendo il rosso metile (vira a pH basso diventando rosso) a una brodocoltura. Con questo tipo di fermentazione (da glucosio ad acidi misti) il pH rimane inferiore a 4 anche dopo 48 ore facendo virare il colore rosso metile a rosso (altri tipi di fermentazione raggiungono gli stessi valori alle 24 ore ma poi il pH tende a risalire. Altro test utilizzato è il test di Voges-Proskauer che sfrutta il fattc che alcuni enterobatteri durante la fermentazione del glucosio producono acetoina come prodotto intermedio. La produzione di acetoina si evidenziò con l'aggiunta alla coltura di idrato di potassio e creatina che porta alla produzione di un complesso di colore rosso: - Produzione di idrogeno solforato; - Produzione di gas dalla fermentazione di idrogeno solforato; - ecc. TEST TRIPLE SUGAR IRON (TSI): Test che permette di valutare contemporaneamente la fermentazione del lattosio, la produzione di idrogeno solforata e la produzione di gas dalla fermentazione glucosio. Il terreno viene colato in un tubo e fatto solidificare con superficie inclinata, in questo modo si ottiene una parte alta in aerobiosi e una parte interna in anaerobiosi: - Colore giallo nel fondo e pendenza: fermentazione di glucosio e lattosio; - Colore giallo solo nel fondo: fermentazione solo del glucosio; - Colore rosso in entrambe le aree: nessuna fermentazione; - Presenza di bolle con conseguente rottura nel terreno: produzione di gas; - Precipitato nero nel ondo: produzione di idrogeno solorato. FATTORI DI VIRULENZA: Nella famiglia delle Enterobacteriaceae sono stati individuati numerosi fattori di virulenza: - Adesine; - Invasine; - Capsula; - Tossine; - Variazione di fase antigenica; - Sistemi di secrezione di tipo III:; - Sequestro dei fattori di crescita; - Resistenza al killing sierico. ADESINE: Le adesine sono macromolecole esterne alla parete cellulare coinvolte nell'adesione alle cellule dell'ospite; la maggior parte delle Enterobacteriaceae ha pili o fimbrie che mediano l'adesività alle cellule dell'ospite e sono classificati in quattro tipi: - Tipo I: permettono agli enterobatteri di resistere alla peristalsi e al flusso intestinale e quindi di colonizzarlo; - Tipo II: importanti fattori di virulenza che permettono al batterio di causare malattia al di fuori della sua nicchia abituale; - Tipo III; - Tipo IV. INVASINE: Le invasine sono proteine che agiscono localmente e contribuiscono ad invadere le cellule dell'ospite per facilitare la crescita e la diffusione del germe. CAPSULA: La capsula è rappresentata da uno strato che avvolge esternamente il batterio,generalmente di polisaccaridi acidici composti da 2-3 zuccheri che sono caratteristici di ogni microrganismo. Le Enterobacteriaceae capsulate sono protette dalla fagocitosı grazie agli antigeni capsulari idrofilici, i quali respingono la superficie cellulare idrofobica del fagocita. Questi antigeni interferiscono con il legame degli anticorpi al batterio, sono deboli immunogeni e deboli attivatori del complemento. TOSSINE: Una tossina è un "veleno" prodotto da alcuni microrganismi; alcune tossine prodotte dagli enterobatteri sono numerose e di rilevante interesse clinico; VARIAZIONE DI FASE ANTIGENICA: L’espressione degli antigeni capsulare K e flagellare H sono sotto il controllo genico del microrganismo; entrambi questi antigeni possono essere alternativamente espressi o inespressi (variazione di fase) proteggendo così il batterio dalla morte cellulare anticorpo-mediata. SISTEMI DI SECREZIONE DI TIPO III: Sono sistemi di circa 20 proteine comunemente usati da molti gram-negativi per secernere all'interno della cellula ospite specifiche proteine la cui produzione è indotta in risposta a segnali ricevuti o dal contatto batterio- cellula oppure da fattori ambientali come: - Tensione di O2; - Concentrazione di Ca2+ ; - Disponibilità di sostanze nutritive. SEQUESTRO DEI FATTORI DI CRESCITA: Il ferro è un importante fattore di crescita richiesto dal batterio, ma è legato al gruppo eme delle proteine (emoglobina o mioglobina) o alle proteine chelanti il ferro (transferrina, lattoferrina). Il batterio si oppone a ciò producendo in competizione i propri composti chelanti il ferro: - Siderofori enterobactina: complessi siderofori-ferro sono poi trasportati all'interno della cellula batterica attraverso specifiche proteine della membrana esterna. - Aerobactina. Il ferro può essere anche rilasciato dalle cellule ospiti in seguito all'azione delle emolisine prodotte dal batterio. RESISTENZA AL KILLING SIERICO (UCCISIONE MEDIATA DAL SIERO): I microrganismi virulenti, in grado di infezioni sistemiche, devono essere resistenti al killing sierico. Sebbene la capsula protegga il batterio dal killing ci possono essere altri fattori come il legame del CD3 agli zuccheri terminali delle lunghe catene O del lipopolisaccaride. Ad oggi viene eseguita una identificazione rapida attraverso delle card oppure attraverso MALDI-TOF (spettrometria di massa). Le Enterobacteriaceae importanti dal punto di vista medico appartengono a 10 generi e costituiscono 25 specie: - Escherichia - Shigella  - Salmonella - Proteus - Klebsiella - Yersinia - Enterobacter - Citrobacter - Morganella - Serratia LE INFEZIONI DEGLI ENTEROBATTERI: Gli enterobatteri possono causare tre tipi di infezioni: - Infezioni intestinali; - Infezioni extraintestinali; - Infezioni sistemiche. INFEZIONI INTESTINALI Sono infezioni esogene che si sviluppano in seguito ad ingestione di cibi contaminati con materiale fecale di individui a loro volta infetti (più diffuse in paesi con condizioni igienico sanitarie basse). Sono rappresentate da enteriti o gastroenteriti. Agenti eziologici principali sono: - Escherichia coli; - Salmonella spp; - Shigella spp; - Yersinia spp. Alcuni enterobatteri agiscono come batteri invasivi (Shigelle, Salmonelle, stipiti di E. coli) si localizzano nella porzione distale dell'intestino (tenue, colon) penetrando nella mucosa dove provocano alterazioni istopatologiche evidenti (causano dissenteria). INFEZIONI EXTRAINTESTINALI: Infezioni endogene rappresentate da infezioni: - Sistema nervoso centrale (meningite); - Basse vie respiratorie (polmonite); - Infezioni del sistema circolatorio; - Infezioni delle vie urinarie. INFEZIONI SISTEMICHE: - Infezioni endogene; - Febbri enteriche (tifo e paratifo) e in alcuni casi batteriemia; - Agenti Eziologici: a) S. typhi; b) S. paratyphi. MECCANISMI DI RESISTENZA Al CARBAPENEMI: Carbapenemi = beta lattamici di ultima generazione. Il motivo principale della resistenza ai carbapenemi sta nella capacità di produrre degli enzimi, le carbapenemasi, che vanno a degradare i carbapenemi; la resistenza legata alle carbapenemasi è molto elevata, inoltre è trasferibile attraverso plasmidi. I ceppi producenti carbapenemasi sono generalmente resistenti anche ad altri tipi di antibiotici. Alcuni tipi di carbapenemasi: - Metallo-beta-lattamasi (IMP, VIM, NDM); - Carbapenemasi a serina (KPC); - Carbapenemasi di tipo OXA (OXA-48). Un altro motivo della resistenza ai carbapenemi sta nel fatto che alcuni enterobatteri possono ridurre eliminare l'espressione delle porine, canali attraverso cui i carbapenemi entrano nelle cellule batteriche; questo limita l'ingresso dei farmaci, rendendo i batteri meno suscettibili ai carbapenemi. La resistenza legata alla modifica delle porine non è trasferibile poiché è il risultato di mutazioni; tuttavia la resistenza legata alle porine può diventare particolarmente problematica sé combinata ad altri meccanismi trasferibili, in questi casi la perdita di porzione può potenziare la resistenza. SALMONELLA: Sono stati descritti oltre 2000 sierotipi diversi, ma l'analisi i omologia del DNA ha rivelato che il genere è costituito da due specie: - Salmonella enterica; - Salmonella bongori. Le salmonelle sono dei parassiti intestinali dell'uomo e di numerosi animali sia selvatici e domestici, ma in corso di infezione possono essere isolate sia dal sangue che da diversi organi interni. Nell'uomo le infezioni da salmonella possono essere:  - Localizzate: enteriti (le più frequenti); - Sistemiche: si manifestano più raramente: a) Febbre enterica; b) Tifo addominale. Sono batteri mobili, non fermentanti il lattosio e spesso producono idrogeno solforato. Gli antigeni di salmonella comprendono tre tipi maggiori: - Antigene O; - Antigene H; - Antigene Vi. FATTORI DI VIRULENZA: - Endotossina; - Capsula: per S.typhi e alcuni ceppi di S.paratyphi; - Fattori di adesione e penetrazione; - Proteine della membrana esterna donano la specifica caratteristica di sopravvivere all'interno dei macrofagi. PATOGENICITÀ: La patogenicità in Salmonella è legata alla presenza di isole di patogenicità, loci cromosomici specifici, che contengono più geni che codificano per proteine coinvolte nella patogenicità,e sistemi di secrezione di tipo IIl (TTSS), un complesso di macromolecole presente in diversi batteri gram negativi virulenti che permettono di trasportare dentro le cellule dell'ospite alcune proteine effettrici: - Proteine SOP: salmonella outer protein; - SopB: enterotossina. Negli enterociti e nelle cellule M le salmonelle vengono internalizzate attraverso un processo di endocitosi indotto da proteine effettrici inoculate nella cellula mediante il sistema TTSS-1, codificato dall'isola di patogenicità SPI-1, che mediano il processo di riarrangiamento delle membrane, detto "ruffing", in cui sono coinvolti i microfilamenti di actina. La seconda isola di patogenicità, SPI-2, è correlata alla capacità di causare infezioni sistemiche e permette la sopravvivenza e la crescita dei microrganismi nei macrofagi. TIFO ADDOMINALE O ILEOTIFO (FEBBRE ENTERICA): Si tratta di una salmonellosi sistemica e l'unico ospite è l'uomo. Causato da S. typhi (sierotipo o serovar, ovvero classificazione in base a differenze antigeniche, quindi S.enterica sottospecie enterica sierotipo Typhi), una delle salmonelle maggiori. Trasmissione oro-fecale. VEICOLI DI INFEZIONE: Veicoli di infezione più comuni sono:  - Acque superficiali non potabilizzate; - Verdure od altri vegetali consumati crudi; - Molluschi raccolti da acque di mare contaminate da sbocchi fognari e consumati crudi (in quanto sono organismi che filtrano l'acqua del mare trattenendo le Salmonelle; particolarmente pericolose sono le ostriche nel cui epatopancreas le Salmonelle si moltiplicano attivamente). CONTROLLO DELLA TRASMISSIONE: Il controllo della trasmissione di Salmonella Typhi viene effettuato mediante: - Controllo della contaminazione fecale dell'ambiente; - Efficienti sistemi di smaltimento dei rifiuti organici di origine domestica e di potabilizzazione delle acque (igiene ambientale). DIAGNOSI DI LABORATORIO: Le diagnosi di laboratorio viene effettuata mediante due tipi di esami: - Emocoltura: batteri nel sangue durante le prime due settimane; - Coprocoltura: batteri nelle feci dalla 2-3° settimana. EMOCOLTURA: Per emocoltura si intende la coltura di un campione di sangue ottenuto in condizioni di sterilità. È un'importantissima tecnica per la diagnosi microbiologica di batteriemia o sepsi. Le infezioni più comuni sono provocate dai batteri che causano nel sangue batteriemie, ma ci sono altri agenti eziologici: - Funghi: fungemia; - Virus: viremia. Il test viene eseguito mediante prelievo di due o più campioni di sangue venoso da entrambe le braccia. Solitamente si utilizzano due flaconi per prelievo; - Uno per la ricerca degli anaerobi; - Uno per la ricerca degli aerobi. Il sangue deve essere raccolto in particolari contenitori detti "flaconi Bactec" (nei flaconi il sangue viene diluito, per diminuire l'attività battericida del siero o di eventuali antibiotici); all'interno dei flaconi è presente: 1) Terreno di coltura liquido arricchito (per aerobi, anaerobi, miceti o per uso pediatrico); 2) Composto che lisa leucociti (potrebbero falsare la rilevazione dei batteri); 3) Anticoagulante (SPS, sodio polianetolsulfonato) 4) Resina (ARD = Antibiotic Removal Device, lega e neutralizza antibiotici eventualmente presenti). COPROCOLTURA: La coprocoltura si basa sull'uso di un mezzo di coltura specifico che consente di isolare e far crescere Salmonella. Questi mezzi contengono sostanze che rendono l'ambiente favorevole per la crescita di Salmonella, ma che inibiscono la crescita di altri batteri contaminanti. Il termine "coprocoltura" si usa per fare riferimento alla coltura microbiologica per identificare la Salmonella in vari campioni. La coprocoltura è un test laboratoristico articolato in quattro fasi: 1) Prelievo del campione: Il campione che si vuole analizzare viene prelevato (ad esempio, feci di animali, alimenti contaminati, o acqua). Coltura iniziale: Il campione viene inoculato su un terreno selettivo per Salmonella. Questi terreni contengono sostanze che favoriscono la crescita di Salmonella e inibiscono i batteri concorrenti. I terreni di coltura selettivi comunemente usati per Salmonella sono: a) Agar SS (Salmonella-Shigella); b) Agar XLD (Xylose Lysine Deoxycholate). 2) Incubazione: Una volta inoculato il campione, il piatto di agar viene incubato a temperatura controllata (tipicamente a 37°C per un periodo che può variare da 24 a 48 ore). 3) Isolamento delle colonie: Dopo l'incubazione, si osservano le colonie sospette. Le colonie di Salmonella possono avere caratteristiche distintive in base al tipo di terreno di coltura, come ad esempio un cambiamento di colore o una morfologia specifica. 4) Test di conferma: Se le colonie mostrano caratteristiche sospette di Salmonella, vengono effettuati ulteriori test di conferma, come test biochimici (ad esempio, il test per la produzione di H2S, la reazione di O-antigene via agglutinazione, o l'uso della PCR). DIAGNOSI SIEROLOGICA: Sierologia (ricerca di anticorpi dalla 2°-3° settimana) diagnosi indiretta attraverso la reazione di Widal, reazione di agglutinazione con la quale si ricercano nel siero del paziente anticorpi anti-salmonelle. Ad oggi si eseguono test sierologici più specifici con l'utilizzo dei vari antigeni di Salmonella: - Alto titolo Ac anti-O: infezione in atto; - Alto titolo Ac anti-H: infezione pregressa o vaccinazione - Alto titolo Ac anti-Vi: stato di portatore. SALMONELLE MINORI: Causano gastroenteriti (batteriemia occasionale) meno frequenti di quelle sostenute da Stafilococchi. Enterotossici, ma più gravi (letalità nei bambini e nei soggetti debilitati può raggiungere il 5%); sono gastroenteriti sostenute da numerosi sierotipi di Salmonella, i principali: - S. typhimurium; - S. enteritidis. Il loro habitat è l’intestino umano e degli animali come colonizzatori transitori o patogeni. Trasmissione mediante alimenti contaminati derivati dagli animali infetti (es. uova crude, maionese, creme latte, gelati, carne poco cotta), si tratta quindi di una zoonosi e il numero di animali che possono essere infettati è enorme (animali domestici e selvatici). Il loro serbatoio naturale sono animali domestici (pollame, bovini, ovini, suini, cani, gatti). Non c'è serbatoio umano. Queste salmonelle vanno a localizzarsi nell'intestino tenue e crasso e la sintomatologia è rappresentata da diarrea acquosa. Dose infettante molto alta, i microrganismi devono moltiplicarsi fortemente nel cibo prima che sia ingerito. Risoluzione generalmente spontanea in tempi brevi. Infezione della mucosa dell'intestino tenue con infiammazione: 1. Ingestione ed invasione della mucosa intestinale 2. Penetrazione nelle cellule intestinali. 3. Infezione limitata all'intestino: i microrganismi che raggiungono sedi extraintestinali sono fagocitati ed uccisi; occasionalmente può esservi setticemia ed infezione in altri tessuti; 4. L'invasione delle cellule epiteliali stimola la liberazione di citochine proinfiammatorie che porta ad una infiammazione acuta nell'ileo e nel cieco con danno locale che porta a: - Diarrea; - Dolore addominale; - Vomito; - Febbre. Sintomi dopo 8-48 ore dall'ingestione di cibo contaminato. Nella maggior parte dei casi la gastroenterite acuta dura 2-5 giorni e guarisce da sola. Si può instaurare uno stato di portatore, meno frequente che nel caso della Salmonella typhi. La diagnosi viene eseguita solamente attraverso coprocoltura. SHIGELLA: Il genere shigella prende il nome dal batteriologo giapponese shiga che per la prima volta 1898 descrisse la dissenteria bacillare. La classificazione tassonomica è piuttosto semplice e sono state descritte quattro specie sulla base base dell'antigene O: - Shigella flexneri; - Shigella dysenteriae; - Shigella boydii;  - Shigella sonnei. L’habitat è l'intestino umano e infatti l'uomo ne rappresenta il serbatoio principale. Vengono eliminati nella fase acuta dissenterica con le feci e possono sopravvivere per settimane ad ambiente caldo e umido e per 9-12 giorni nel suolo a temperatura ambiente. Si trasmette per via oro-fecale, principalmente tramite mani contaminate e meno,comunemente attraverso l'attraverso o gli alimenti. il genere shigella non è mobile, quindi non presenta antigeni H (flagellari) e la tipizzazione sierologica si riferisce agli antigeni O. Il genere shigella si differenzia in quattro sierogruppi a cui corrisponde le quattro specie: - S.dysenteriae: sierogruppo A, 15 sierotipi; - S.flexneri: sierogruppo B, 8 sierotipi; - S.boydii: sierogruppo C; 19 sierotipi; - S.sonnei: sierogruppi D,1 sierotipo. PATOGENESI: Regolati da geni cromosomici che mediano: - Adesione dei microrganismi alle cellule; - Invasività; - Replicazione intracellulare; - Passaggio ad altre cellule. Un sistema di secrezione di tipo Ill media la secrezione di quattro proteine: 1) IpaA; 2) IpaB; 3) IpaC; 4) IpaD; All’interno delle cellule epiteliali e nei macrofagi. Queste proteine inducono il ripiegamento della membrana sui batteri che vengono così inglobati. Le specie di Shigella sono in grado di lisare i vacuoli fagocitici e di replicarsi nel citoplasma delle cellule ospiti (diversamente da Salmonella che si replica all'interno del vacuolo). Con il riarrangiamento dei filamenti di actina nelle cellule ospiti, i batteri sono spinti attraverso il citoplasma alle cellule adiacenti, in questo modo avviene il passaggio da cellula a cellula e le shigelle sono protette dalla clearance immunomediata. Le shigelle sopravvivono alla fagocitosi inducendo una morte programmata della cellula (apoptosi). Questo processo porta al rilascio di interleuchina-1ß, che causa l'attrazione dei leucociti polimorfonucleati verso i tessuti infetti. Ciò destabilizza l'integrità della parete intestinale e consente al batterio di raggiungere gli strati più profondi. SHIGELLOSI: DISSENTERIA BACILLARE: La shigellosi, nota anche come dissenteria bacillare, è caratterizzata da: - Crampi addominali; - Diarrea;  - Febbre; - Emissione di feci sanguinolente. I segni e i sintomi della shigellosi compaiono 1-2 giorni dopo l'ingestione dei bacilli. Nelle feci si trovano numerosi neutrofili, eritrociti e muco. In genere l'infezione è autolimitante e i sintomi cessano dopo 2-5 giorni. La condizione di portatore asintomatico del microrganismo nel colon si realizza in un piccolo numero di pazienti e rappresenta un serbatoio persistente di infezione. DIAGNOSI: La diagnosi viene effettuata tramite coprocoltura. ESCHERICHIA COLI: Il genere escherichia comprende cinque specie, ma solamente E.coli è clinicamente importante. L'habitat naturale è l'intestino dell'uomo e di molti animali, in questa sede è un comune commensale, ad eccezione di alcuni ceppi che hanno la capacità di dare patologie intestinali. Escherichia coli presenta l'antigene O con 117 tipi antigenici, l'antigene K con 100 varianti antigeniche è l'antigene H con 56; poiché la maggior parte dei ceppi possiede fimbrie è stata proposta una classificazione sierologica sulla base dell'antigene F. PATOGENESI: Escherichia coli possiede un ampio spettro di fattori di virulenza. Oltre a quelli comuni a tutti gli enterobatteri, le adesine e le esotossine, in particolare, giocano un ruolo specifico nel determinare la sede dell'infezione e il quadro clinico. I fattori di virulenza responsabili della patogenesi sono: - Adesine; - Esotossine. ADESINE: I ceppi di E.coli presentano numerose adesine altamente specializzate che permettono al batterio di aderire in maniera specifica alle cellule epiteliali dell'ospite. Queste comprendono: - Antigeni del fattore di colonizzazione: a) CFA/I; b) CFA/II; c) CFA/III; - Adesine aggreganti: a) AAF/I; b) AAF/II. - Pili a fasce: BfP; - Intimina; - Pili P: che si legano agli antigeni del gruppo sanguigno P; - Proteine Ipa: antigene plasmidico di invasione; - Fimbrie Dr: si legano ad antigeni del gruppo sanguigno Dr. ESOTOSSINE: L'escherichia coli può produrre le seguenti tossine: - Tossine Shiga: a) Stx-1; b) Stx-2; - Enterotossine termostabili: a) STa; b) STb; - Enterotossine termolabili: a) LT-I; b) LT-II; - Emolisine (HlyA). MALATTIE CAUSATE DA E.COLI:  - Setticemia; - Infezioni delle vie urinarie; - Meningite neonatale; - Gastroenteriti. SETTICEMIA: La setticemia causata da Escherichia Coli origina generalmente da una infezione delle vie urinarie o del distretto gastroenterico come ad esempio a perforazione intestinale. La setticemia da E.coli è favorita dalla presenza di una patologia di base del paziente come: - Cirrosi epatica; - Diabete; - Neoplasie; - Emopatie. I neonati sono maggiormente predisposti alla sepsi da E.coli per mancanza dell IgM. INFEZIONI DELLE VIE URINARIE: La maggior parte dei bacilli gram-negativi che causano infezioni delle vie urinarie originano dal colon, contaminano l'uretra risalgono sino alla vescica e possono migrare al rene o alla prostata. L'infezione alle vie è un'infezione ascendente piuttosto che un'infezione causata dal propagarsi del microrganismo per via ematica dell'apparato urinario. Anche se molti sono i ceppi di E.coli che possono causare infezioni urinarie, alcuni sierotipi specifici sono di più frequente isolamento. In particolare,sono frequentemente associati a infezioni urinarie quei ceppi in grado di produrre adesine, che mediano il legame alle cellule epiteliali di rivestimento della vescica e delle vie urinarie superiori, impedendo di conseguenza l'eliminazione del batterio con la minzione. L'emolisina HlyA, che lisa gli eritrociti e altri tipi cellulari, portano al rilascio di citochine e alla stimolazione di una risposta infiammatoria. MENINGITI NEONATALI: E. coli insieme agli streptococchi di gruppo B che causa la maggior parte delle infezioni del sistema nervoso centrale in neonati di età inferiore a un mese. Il 75% dei ceppi di E. coli meningitogeni possiede l'antigene capsulare K1 che presenta una reattività crociata con il polisaccaride capsulare di gruppo B di Neisseria meningitidis O. E. coli K1 è anche presente comunemente nell’intestino di donne gravide e di neonati. Non è noto il meccanismo della virulenza associata all'antigene K1. GASTROENTERITI: I ceppi di E.coli che causano gastroenterite sono suddivisi in più gruppi: - ETEC: enterotossigeni; - EPEC: enteropatogeni; - EIEC: enteroinvasivi,  - EHEC: enteroemorragici; - EAEC: enteroaggreganti. Gli stipiti EPEC e ETEC si localizzano a livello dell'intestino tenue e provocano la comparsa di enteriti diarroiche. Gli stipiti EIEC e EHEC si localizzano a livello dell'intestino crasso e provocano la comparsa di enteriti dissenteriche. Nell'azione patogena degli stipiti ETEC, EHEC e EAEC gioca un ruolo essenziale la produzione di tossine. Gli stipiti EPEC e EIEC non producono tossine e la loro azione patogena è legata al danneggiamento diretto o indiretto (mediante l'innesco di fenomeni infiammatori) delle mucose intestinali. E. COLI EPEC (ENTEROPATOGENI): EPEC aderiscono strettamente agli enterociti provocando la distruzione dei microvilli (con conseguente diarrea e malassorbimento) e la formazione di invaginazioni nella membrana degli enterociti attorno ai batteri. Lo stretto contatto è mediato da una proteina batterica della membrana esterna di 94 KDa codificata da un plasmide (intimina) che è coinvolta nella formazione di un "piedistallo" di fibre di actina che si forma nella cellula dell'ospite al di sotto dei batteri. Sono causa di epidemie di diarrea nei reparti di neonatologia; nelle comunità casi sporadici o epidemici di diarrea infantile; raramente diarrea negli adulti. E. COLI ETEC (ENTEROTOSSIGENI): Si legano lassamente alla superficie degli enterociti tramite fimbrie e rilasciano due tipi di tossine che penetrano nelle cellule senza danneggiare l'epitelio: - LT (termolabile) e Simile alla tossina colerica (causa diarrea con lo stesso meccanismo): Causa una sindrome molto simile al colera specialmente nei bambini malnutriti debilitati. Agisce attivando l'adenilato ciclasi, un enzima che porta ad un aumento dell'AMP ciclico; In Aumento dell'AMP ciclico porta alla fosforilazione di una serie di proteine che regolano i canali ionici, in particolare si apre il canale del cloro favorendone il rilascio nell’intestino e di conseguenza la fuoriuscita di sodio e acqua, causando così diarrea. - ST (termo stabile): prodotta in associazione o in alternativa al LT. E una piccola proteina non antigenica. Agisce attivando la guanilato ciclasi, un enzima che porta ad un aumento del GMP ciclico; l'aumento di GMP ciclico inibisce il riassorbimento di cloruro e sodio portando a una maggiore secrezione di acqua nell'intestino e quindi a diarrea. E. COLI EHEC (ENTEROEMORRAGICI): Principalmente appartenenti al sierotipo 0157:H7, riconosciuto una causa crescente di infezioni acquisite per via alimentare. Ceppi più comunemente responsabili di malattia nei paesi industrializzati. Bassissima carica infettante (circa 50 batteri). La maggior parte dei casi di malattia è stata attribuita al consumo di carne macinata di manzo contaminata durante la lavorazione e consumata poco cotta (malattia dell'hamburger); consumo di acqua o di latte succhi di frutta non pastorizzati contaminati da feci bovine. Conseguenze cliniche molto varie da una lieve diarrea ad una colite emorragica o alla sindrome uremico emolitica (sindrome che può portare ad insufficienza renale acuta e causata dalla tossina prodotta da alcuni ceppi, la tossina Shiga like, che agisce come la tossina di Shiga like, che agisce come la tossina shigella andando a legarsi ai recettori nelle cellule dei reni distruggendole andando a legarsi e quindi provocando danni diretti ai reni). MECCANISMI DI PATOGENESI: Sono simili a EPEC, ma in più liberano due potenti citossine - SLT1; - SLT2). Verotossina 1 o SLT1 (Shiga-like toxin 1), identica alla tossina di Shigella dysenteriae. La tossina si lega ad uno specifico glicolipide sulle cellule bersaglio (globotriaosilceramide) particolarmente abbondante sulle cellule intestinali e renali. La porzione attiva della tossina una volta all'interno delle cellule si lega all'rRNA 28S bloccando Ia sintesi proteica con conseguente distruzione dei villi intestinali, malassorbimento ed escrezione di fluidi. Gli effetti a distanza ad esempio sul rene sono conseguenti all'entrata in circolo, E. COLI EIEC (ENTEROINVASIVI): Sono molto simili a Shigella: immobili; non fermentano lattosio; come Shigella si attaccano alla mucosa dell'intestino crasso ed invadono le cellule per endocitosi, lisano la membrana del vacuolo endocitico e si moltiplicano all'interno della cellula che viene uccisa. Diffondono alle cellule contigue, causando una notevole distruzione della mucosa intestinale ed una forte infiammazione. La loro patogenicità è legata ad una isola di invasività che include numerose proteine della membrana esterna tutte codificate da un plasmide, Causa una forma dissenterica (simile a quella di Shigella) caratterizzata da: - Febbre; - Intensi crampi addominali; - Malessere ed abbondante emissione di feci: prima acquose quindi muco-sanguinolente e ricche di PMN (neutrofili).