LEZIONE 2 (03-03-2022).docx

**Biologia cellulare 03/03/2022** **Organizzazione del laboratorio di colture cellulari** Il laboratorio di colture cellulari e il luogo in cui lavoreremo durante le esercitazioni. La finalità principale di questo laboratorio in cui vengono manipolate colture cellulari e manteniamo colture cellula...

**Biologia cellulare 03/03/2022** **Organizzazione del laboratorio di colture cellulari** Il laboratorio di colture cellulari e il luogo in cui lavoreremo durante le esercitazioni. La finalità principale di questo laboratorio in cui vengono manipolate colture cellulari e manteniamo colture cellulari è quello di preservare la sterilità delle nostre colture cellulari evitando contaminazioni da parte di altri agenti contaminanti come batteri funghi virus che possono interferire con il nostro lavoro. In questo laboratorio vengono quindi attuato una serie di norme che possano ridurre questo problema, una di queste norme e il controllo della circolazione dell'aria, infatti, in un laboratorio non troverete mai finestre aperte ma condizionatori per il ricircolo dell\'aria questo riduce il rischio di contaminazioni i flussi d\'aria che possono interferire con le apparecchiature che utilizziamo o che possono interferire con la sterilità. solitamente nei dintorni del laboratorio o nelle immediate vicinanze è presente uno stabulario ovvero luogo ovvero contenuti gli animali da esperimento, questo spazio non è adiacente solitamente al laboratorio di colture cellulari in modo da evitare contaminazioni da parte di parassiti o patogeni che derivano dagli animali da esperimento che potrebbero contaminare le nostre colture. Allo stesso tempo è necessario che lo stabulario si avvicina al laboratorio in quanto nel momento in cui sia necessario prelevare tessuti organi dagli animali per poi manipolarli nell\'area delle colture cellulari, per preservare al massimo la vitalità del campione prelevato grazie al quale poi potremo allestire una coltura e successivamente una linea cellulare è importante cercare di ridurre al massimo i tempi tra l'espianto dei tessuti o degli organi e la loro messa in coltura. Inoltre, vi sono una serie di norme igieniche che l\'operatore deve seguire. Nel momento in cui non si opera sotto la cappa biohazard e necessario nebulizzare i guanti con alcol al 70% Per cercare di ridurre il rischio di contaminazione della coltura, nonostante il laboratorio sia un\'area pulita non può essere comunque garantita la sterilità di tutto ciò che tocchiamo o che portiamo a contatto con la nostra cultura. Le principali norme igieniche da tenere sono quindi ad esempio capelli legati utilizzo di guanti uso di un camice le cui maniche coprano i guanti e così via. il laboratorio di colture cellulari inoltre deve avere un flusso di personale limitato in quanto si cercherà di mantenere la sterilità delle colture cellulari e quindi evitare la maggior probabilità di contaminazioni delle colture cellulari. Linee colture primarie provenienti dall\'esterno da biopsie devono seguire un periodo di quarantena atto è svolto per verificare se queste siano eventualmente contaminate da qualche agente, la coltura cellulare in quarantena verrà quindi mantenuta in coltura separatamente rispetto alle altre colture che sono presenti in laboratorio in modo che qualora sia contaminato non vada ad intaccare le linee sterili o gli operatori che le maneggiano e che utilizzano le stesse strumentazioni. **Regole Generali:** 1. 2. 3. 4. 5. 6. **All'interno del laboratorio sono richiesti i servizi di**: - - - La bombola di CO2 utilizzata per mantenere costante la percentuale e la pressione di CO2 nell\'incubatore luogo all\'interno del quale noi manteniamo le colture nelle condizioni migliori possibili per la loro crescita, le condizioni di crescita riguarderanno quindi temperatura umidità percentuale di CO2 e di ossigeno. Principali aree del laboratorio - - - - - - tutte queste aree possono essere raccolte in un\'unica stanza oppure ove possibile essere divise in due stanze separate in modo da avere una stanza in cui riusciamo a mantenere maggior sterilità e un\'area "sporca" in cui potremmo lavare e sterilizzare la vetreria. separando queste aree due in due stanze riusciamo a ridurre di nuovo il rischio di contaminazioni per le nostre colture. Se tutte queste aree sono concentrate in un'unica stanza, l'area di manipolazione sterile deve essere posta ad una estremità e l'area di lavaggio e sterilizzazione dall'altra parte. 1. - - Per mantenere il flusso laminare d\'aria efficace e necessario che la superficie della cappa sia comunque il più libero possibile in quanto più materiale si appoggia sulla superficie più il flusso verrà ostacolato. Gli altri materiali necessari per il mantenimento delle colture devono essere accessibili nell'area di stoccaggio. - - - Sotto cappa è presente un sistema di connessione alla pompa a vuoto, La pompa a vuoto e un motorino che sta all\'esterno della cappa bioHazard e che ci permette per l\'appunto di creare il vuoto sotto cappa. sotto cappa sarà quindi presente un rubinetto al quale colleghiamo una serie di tubi in plastica e un recipiente che funge da trappola e raccolta per i liquidi che vengono aspirati sotto cappa, questo contenitore può essere sia sotto cappa o meglio ancora fuori dalla cappa sempre per il concetto che meno materiale è presente sulla superficie della cappa più il flusso d'aria non sarà ostacolato. il raccoglitore dei liquidi aspirati sarà collegato con un altro tubo connesso direttamente alle pipette per aspirare i liquidi che si desidera eliminare. Questo è un sistema molto pratico è importante però ricordarsi di porre all\'interno del raccoglitore di liquidi della candeggina che serve ad azzerare il rischio biologico e a evitare possibili contaminazioni veicolate dall\'impianto di aspirazione. **Area di incubazione**: è costituita da un incubatore, strumento costituito da uno spazio interno rivestito da pareti e ripiani d\'acciaio tutto questo per ottimizzare pulizia e decontaminazione in quanto l\'incubatore è il luogo in cui andiamo a ricreare le condizioni di crescita ideali per le nostre colture. La condizioni di crescita ottimale viene quindi ricreata all\'interno dell\'incubatore grazie a parametri che vengono mantenuti costanti come temperatura a 37 ° con piccole variazioni a seconda delle esigenze cellulari, percentuale di anidride carbonica solitamente mantenuta al 5%, questo parametro infatti richiede la disponibilità di una bombola di anidride carbonica nelle immediate vicinanze dell\'incubatore e un umidità relativa al 5% prendendo quindi l\'ambiente molto umido e ideale per la crescita di eventuali contaminanti, esistono incubatori automatizzati nei quali la dispensazione dell\'acqua è automatica oppure incubatori in cui sul fondo è presente una vaschetta nella quale porre l\'acqua sterile e demineralizzata contenente anche soluzioni tossiche come soluzioni di ammonio quaternario che interferiscano con l\'eventuale crescita di eventuali parassiti la soluzione che va aggiunta non deve però essere allo stesso tempo tossica per le nostre cellule in coltura, esistono soluzioni in commercio che per l\'appunto non sono tossiche per le cellule in coltura ma che allo stesso tempo vanno ad inibire la crescita di eventuali contaminanti che a 37 ° in acqua crescerebbe molto bene. l\'incubatore composto da pareti e ripiani in acciaio e possiede sistemi di controllo che ci consentono di mantenere controllati i parametri all\'interno del dell\'incubatore. l\'incubatore possiede due porte di accesso uno sportello più interno fatto di vetro trasparente che ci permette di vedere le colture hai uno sportello più esterno abbastanza spesso in quanto deve isolare l\'incubatore per mantenere stabili i parametri, una volta aperto qui nello sportello esterno sarà possibile visualizzare prima di aprire lo sportello interno le cellule in coltura individuandole prima di aprire lo sportello interno e riuscendo così a ridurre al massimo il tempo di apertura dello sportello interno consentendo quindi un miglior mantenimento dei parametri interni all\'incubatore e una minor probabilità di contaminazioni da parte dell\'esterno. l\'incubatore è in grado di mantenere stabili i parametri anche in quanto possiede una camicia esterna isolante che può essere composta d\'acqua o d\'aria posta all\'interno della struttura delle pareti dell\'incubatore. - - - - - - i sistemi di decontaminazione non sono presenti in tutti gli incubatori ma sono una caratteristica molto vantaggiosa, in quanto la possibilità di effettuare una decontaminazione con un ciclo a 120 a 130 ° per un determinato tempo è utile per garantire la purezza delle colture cellulari. un\'altra possibilità di decontaminazione e la nebulizzazione da parte dell\'incubatore di soluzioni di perossido di idrogeno o di acqua ossigenata. Il ciclo di sterilizzazione a base della temperatura di 120 o 130 ° è possibile farlo solo negli incubatori con camicia ad aria. gli incubatori con camicia ad aria sono anche notevolmente più leggeri rispetto agli incubatori con camicia d\'acqua. In caso di blackout gli incubatori con camicia d\'acqua sono in grado però di mantenere costante la temperatura per un periodo di tempo molto più lungo rispetto a quanto non faccia un incubatore con camicia ad aria e chiaro che nel momento in cui nella struttura in cui si lavora è presente una coltura in linea di continuità il problema del blackout è già risolto e si è avvantaggiati anche già solo dalla presenza di un incubatore con camicia ad aria - - - - - -  2. a. b. Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente non tutti i materiali sono autoclavabili:  3.  Pericolosità dell'azoto: Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente **DISPOSIZIONE LABORATORIALE:**