Appunti di Lezioni su Cellule Staminali Emopoietiche (Parte 1) PDF

LEZ 23-24 11/11/2024 HEMATOPOIETIC STEM CELLS (PART.1) Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono definite dalla loro capacità di sostenere la produzione per tutta la vit...

LEZ 23-24 11/11/2024 HEMATOPOIETIC STEM CELLS (PART.1) Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono definite dalla loro capacità di sostenere la produzione per tutta la vita dell’individuo di tutte le linee differenziate mature ematopoietiche. Le HSC sono in grado di: ripopolare tutte le linee differenziative ematopoietiche, ad esempio, dopo un danno citotossico massiccio indotto da radiazioni o chemioterapia o dopo un trapianto. CELLULE DEL SISTEMA EMATOPOIETICO Compartimento mieloide: granulociti (neutrofili, eosinofili, basofili), monociti, eritrociti, piastrine (derivano dai megacariociti) Compartimento linfoide: braccio "adattativo" della risposta immunitaria, diviso in cellule B e T (citotossiche, helper, regolatrici) Il processo di emopoiesi produce circa 1011-1012 nuove cellule del sangue ogni giorno in un adulto umano. Nel midollo osseo, le HSC sono un tipo di cellula rara. Si stima che sia presente nell’ordine di valori inferiori allo 0,01% delle cellule totali. Com’è possibile che una cellula così rara dia origine a dei processi di questa portata? LE PRIME OSSERVAZIONI Cenni storici: La biologia delle radiazioni era di particolare interesse dopo l'avvento delle armi nucleari nella Seconda guerra mondiale e proteggere le popolazioni dall'esposizione alle radiazioni era un obiettivo di primaria importanza per la salute pubblica. Negli anni '60 la scoperta delle prime unità cellulari in grado di differenziarsi in cellule mature della linea emopoietica, denominate CFU-S (Colony Forming Unit-Spleen, colonie spleniche) ha definitivamente dimostrato l’esistenza di cellule nel midollo osseo in grado di dare origine a delle colonie miste che ricostituivano tutta la linea mieloide nella milza. Questi esperimenti sull’effetto protettivo di cellule midollari nei confronti di radiazioni ionizzanti erano già in corso negli anni precedenti. Lo schema sperimentale era lo stesso: somministrazione di una minima dose di radiazioni in grado di eliminare completamente l’emopoiesi in un modello di topo ricevente → morte entro 2 settimane Il salvataggio dell’animale avveniva tramite trapianto di midollo osseo Negli anni 1950: effetto terapeutico responsabile della riparazione del danno indotto dalle radiazioni nelle cellule ospiti mediato da fattori solubili rilasciati dalle cellule del midollo osseo trapiantate Fino alla metà degli anni 50 non si era capito che il motivo per cui il trapianto era in grado di salvare l’animale, era collegato ad una capacità rigenerativa delle cellule midollari. Till & McCulloch - 1961: crescita osservata di colonie a livello della milza in seguito al trapianto di cellule singeniche (stesso ceppo) del midollo osseo in topi irradiati letalmente. Le colonie CFU-S contengono una miscela eterogenea di cellule con destini differenziativi diversi: cellule granulocitarie, monocitico-macrofagiche, eritroidi e megacariocitiche o anche miste. Inducendo aberrazioni cromosomiche nelle cellule del midollo osseo del donatore e ritrovandole nelle colonie spleniche → il trapianto di midollo osseo è in grado di ripristinare l'emopoiesi nei riceventi irradiati in modo letale → IL MIDOLLO OSSEO contiene PROGENITORI EMATOPOIETICI CONTESTO STORICO: Limiting Dilution Assays (LDA) e osservazioni A) Till e McCulloch: poiché il trapianto endovenoso di cellule del midollo osseo di topi adulti normali può proteggere i riceventi da una dose letale di radiazioni, l’obiettivo era → determinare il numero minimo di cellule che proteggerebbero gli ospiti dalla letalità indotta dalle radiazioni Diversi gruppi di animali venivano reinfusi con dosi scalari di cellule midollari con l’obiettivo di determinare la quantità minima Indirettamente, si avevano così informazioni sulla frequenza di queste cellule progenitrici nel midollo - Per capire qual è il minimo di cellule da infondere, si trapianta un numero sempre più basso di cellule fino a che non indentifico il quantitativo minimo di cellule da somministrare affinché gli animali siano ancora in grado di sopravvivere. B) I primi esperimenti LDA hanno mostrato che distinti “noduli” sono diventati macroscopicamente visibili sulla superficie della milza nei topi irradiati iniettati con basse dosi di cellule singeniche del midollo osseo da 9 a 14 giorni prima. C) I grandi noduli della milza sono veri e propri cloni, ognuno derivato da una singola cellula parentale (CFU), come dimostrato dall'induzione di aberrazioni cromosomiche uniche tramite radiazioni → tutte le cellule in una colonia di milza derivano da un singolo progenitore (CFU fondatrice) Successivamente: iniezioni di cellule del midollo osseo che trasportano diversi marcatori genetici (cromosomici) che potevano poi essere tracciati nel topo ricevente per andare poi a vedere quali cellule ripopolavano e a quali linee differenziative davano origine. (Approccio ulteriormente perfezionato facendo un tracking a singola cellula. Ad oggi c’è una tecnologia per marcare una singola cellula midollare che poi si può andare a ricercare nell’animale ricevente trapiantato per andare a vere il destino di ogni singola cellula midollare) D) Nelle immagini si può notare, tramite colorazione con ematossilina ed eosina, la milza con tutte le colonie macroscopiche. Le colonie sono costituite da miscele di cellule mature della linea mieloide (eritroidi, megacariocitiche e granulocitarie/macrofagiche). E) Le cellule che producono colonie spleniche sono derivate da cellule che possono anche produrre progenie linfoide (trovata nel TIMO), dimostrando così il mantenimento di cellule con tutte le potenzialità di differenziazione. F) Alcune di queste colonie spleniche contengono cellule che generano colonie multi differenziative simili nelle milze di riceventi irradiati secondariamente → AUTO-RINNOVAMENTO Alcune cellule che danno origine a colonie spleniche, sono in grado di sviluppare altre colonie in esperimenti di trapianti successivi. Tuttavia, queste cellule sono meno efficienti rispetto a quelle midollari, perché la milza non è la loro nicchia naturale. La nicchia staminale (midollo osseo) è essenziale per mantenere la staminalità e il Long-Term Self-Renewal. Non tutte le cellule che attecchiscono nella milza sono vere staminali; alcune sono progenitori o perdono staminalità per l’ambiente inadatto, come suggerisce l'ipotesi di Schofield. G) La maggior parte di queste cellule dotate di auto-rinnovamento, sono cellule quiescenti (in uno stato dormiente o G0, fuori dal ciclo cellulare). resistenti ai farmaci o altri trattamenti che mirano specificamente alle cellule in divisione Uscendo un attimo dall'ambito puramente ematopoietico che stiamo descrivendo, questo serve a ricordarci che tale caratteristica è una delle principali ragioni per cui è difficile eradicare un clone di cellule staminali tumorali, in quanto non si dividono, sono quiescenti e dunque refrattarie a tutti quegli approcci farmacologici, che poi sono la stragrande maggioranza e che sono efficaci solamente sulle cellule attivamente proliferanti, mentre su questo tipo di cellule sono sostanzialmente inefficaci. CONCETTO DI GERARCHIA Queste osservazioni hanno portato alla conclusione che tutti i diversi tipi principali di cellule del sangue derivano durante la normale vita adulta da un pool comune di HSC auto-rinnovabili attraverso un processo di differenziazione gerarchica. Visione iniziale di emopoiesi: Cellula Staminale all’apice (auto-rinnovante, multipotente e tendenzialmente quiescente) - Progenitore mieloide o Globuli rossi, granulociti/monociti, piastrine - Progenitore linfoide o Timo→ Linfociti T e Midollo Osseo → Linfociti B FASI EVIDENZIATE DAL MODELLO DI ANALISI CLONALE I risultati degli esperimenti condotti in vitro con queste cellule (tramite colture in metilcellulosa) hanno dimostrato il rilevamento di colonie con caratteristiche differenziative miste: si sono sviluppate, cioè, colonie granulocito-macrofagiche, monocito-eritroidi ecc. Si dedusse che, oltre alla prima biforcazione in progenitore mieloide e linfoide, si sviluppassero poi anche degli altri progenitori ben definiti per le diverse linee differenziative → Stadi differenziativi diversi Nella linea mieloide, in particolare, c’è un progenitore a monte detto “GEMM”, da cui si generano ulteriori progenitori specifici per i granulociti, eritrociti, monociti e megacariociti. (GEMM= Granulocita, Eritrocita, Monocita, Megacariocita) Ciò che succede nella linea linfoide, invece, non è ancora del tutto chiaro. GERARCHIA EMATOPOIETICA Si possono distinguere tre livelli: 1) Cellule staminali ematopoietiche (HSC); possono essere distinte in base alla loro abilità temporale di dare origine ai lineage differenziativi maturi: HSC-LT (long-term, le più precoci e le più indifferenziate) - alta capacità di self-renewal, quiescenti, si dividono poco (consente di mantenere un basso numero di mutazioni). Danno origine al compartimento successivo, quello dei progenitori. HSC-IT (intermediate-term) HSC-ST (short-term, le più tardive). Sono cellule con un’alta capacità di self-renewal, quiescenti, ma che si dividono poco: ciò consente di mantenere un basso numero di mutazioni in queste cellule. Danno origine al compartimento successivo, ovvero quello dei progenitori. 2) Cellule progenitori ematopoietiche (HPC); sono cellule con una bassa capacità di auto-rinnovamento ma un’elevata capacità proliferativa: vanno in contro ad un numero altissimo di divisioni per dare origine a tutte le cellule figlie. Questo compartimento deve essere necessariamente rifornito da quello staminale. 3) Cellule ematopoietiche mature: queste cellule hanno perso la capacità di autorinnovamento, tranne in pochi casi (linfociti B e T), e hanno una capacità proliferativa limitata I progenitori che si generano dalle HSC sono di vario tipo: Progenitori multipotenti (MPPs), in cima alla gerarchia Progenitori multipotenti lymphoid-primed (LMPPs) Progenitori linfoidi comuni (CLPs) Progenitori mieloidi comuni (CMPs): - Progenitori granulociti-macrofagici (GMPs), si separa molto rapidamente dalla gerarchia - Progenitori megacariociti-eritroidi (MEPs) - Progenitori dendritici comuni (CDPs) La natura gerarchica dell’ematopoiesi minimizza il numero di mutazioni genetiche associate alla divisione cellulare. Il compartimento che si duplica attivamente, infatti, è quello dei progenitori e non quello staminale. Con l’invecchiamento, in realtà, aumenta il numero di cloni ematopoietici che hanno accumulato mutazioni oncogene, anche in assenza di malattia conclamata: age-related clonal hematopoiesis. MODELLI DELL’EMOPOIESI Modello rivisitato Il compartimento MPP contiene progenitori ristretti ai linfomieloidi (progenitori multipotenti innescati dai linfoidi, LMPP) che hanno perso il potenziale MegE - I dati sperimentali ci dicono che l’emopoiesi è un po’ più complessa di quello che abbiamo visto fino ad ora, dato dal fatto della scoperta del progenitore LMPP (Lymphoid-primed multipotent progenitor). LMPP è un progenitore con un primed linfoide, ma comunque multipotente che può dare origine anche a parte della linea mieloide, ad eccezione del lineage megacariocita-eritrocita. Questo è dovuto al fatto che nel compartimento dei progenitori multipotenti non c’è nessuna cellula che co-esprime contemporaneamente geni del lineage linfoide e del lineage megacariocita-eritroide, quindi i due compartimenti sono completamente separati.  Modello di bypass mieloide (più plausibile) I progenitori ristretti ai megacariociti e mieloidi vengono generati nel compartimento HSC più primitivo, che è in grado di auto-rinnovamento a lungo termine e ricostituzione di linee mieloidi ristrette. - Successivamente è stato scoperto il progenitore MyRP (myeloid-restricted progenitor), progenitore dei megacariociti ed eritrociti. Esso si origina molto precocemente, direttamente dalla cellula staminale, quindi mantiene la capacità di self-renewal paragonabile a quella staminale. In conclusione: il progenitore LMPP dà origine alla linea linfoide e granulocita-macrofagica il progenitore MyRP dà origine a tutta la linea mieloide. Com’è possibile quindi che ci siano dei progenitori multipotenti in grado di dare origine a tutte queste linee differenziative diverse? L’ipotesi è che siano in grado di dare origine a tutte queste linee differenziative perché co-esprimono contemporaneamente i geni caratteristici di più lineage. Nell'immagine, vediamo un progenitore multipotente che esprime geni appartenenti a diversi lineage (es. megacariocitario ed eritroide). La multipotenza deriva dal fatto che questi progenitori co-esprimono contemporaneamente i geni di tutte le linee a cui possono dare origine, rendendoli "pronti" per vari differenziamenti. Quando il progenitore diventa "restricted" o committed, cioè si impegna verso una specifica linea differenziativa, avviene un processo di selezione genica: Spegne i geni delle linee non pertinenti. Mantiene accesi solo i geni necessari al differenziamento scelto. Questo concetto è noto come "Multilineage Priming", ed è stato dedotto da osservazioni sperimentali. Ad esempio: I progenitori mieloidi comuni esprimono contemporaneamente geni di granulociti, megacariociti ed eritrociti, dimostrando che almeno il 50% di questi progenitori sono "pronti" per più programmi differenziativi. Anche nei progenitori linfoidi si osserva una co-espressione: circa il 20% esprime geni di entrambe le linee T e B. Questo fenomeno è evidente anche a bassi livelli di espressione nei progenitori meno differenziati, che esprimono geni di tutti i lineage potenziali. Quando il progenitore riceve un segnale per un commitment specifico, attiva i geni della linea scelta e spegne gli altri.