Cellule Staminali Emopoietiche - Lezione 21 Aprile PDF

Lezione 21 aprile: **CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE (CSE): caratteristiche morfologiche e funzionali:** L'emopoiesi è un processo che deriva da una *putativa cellula staminale emopoietica pluripotente* da cui poi derivano i vari progenitori della **filiera mieloide** e della **filiera linfoide**...

Lezione 21 aprile: **CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE (CSE): caratteristiche morfologiche e funzionali:** L'emopoiesi è un processo che deriva da una *putativa cellula staminale emopoietica pluripotente* da cui poi derivano i vari progenitori della **filiera mieloide** e della **filiera linfoide** e quindi poi tutto il processo differenziativo. La cellula staminale emopoietica, pur avendo delle caratteristiche tipiche grazie a cui la possiamo identificare, in realtà possiamo parlare di **compartimento staminale**, una cellula può avere delle caratteristiche **sia pluripotenti sia multipotenti,** a seconda del grado differenziativo può esprimere determinati marcatori, sebbene l'applicazione clinica oggi si focalizza sull'uso delle cellule staminali emopoietiche che esprimono il **CD34**, ma comunque è un compartimento staminale **eterogeneo** La cellula staminale emopoietica, come tutte le cellule staminali, ha due caratteristiche principali di **automantenimento** (self-renewal) e **capacità differenziativa**. In base alle capacità differenziative possiamo, da un punto di vista didattico, distinguerle in: - - - Il **midollo osseo** è un **serbatoio di cellule staminali**, fra cui la cellula staminale emopoietica ma anche mesenchimale. L'altro concetto è che questi termini di pluripotenza e multipotenza sono delle convenzioni per cui noi definiamo una capacità differenziativa, ma non distinguono cellule differenti tra di loro perché una stessa cellula staminale in determinate condizioni può avere caratteristiche di pluripotenza o multipotenza. Noi consideriamo una cellula staminale emopoietica **multipotente** perché la sua funzione è quella di generare progenitori midollari e quindi dare origine alla componente corpuscolata del sangue, ma la stessa cellula staminale emopoietica è anche in realtà **pluripotente** perché hanno anche capacità di dare origine anche a nervi, muscoli, fegato. Quindi una stessa cellula può avere in se caratteristiche differenti. Il midollo osseo è un serbatoio di cellule staminali. Nell'adulto è l'organo più ricco di cellule staminali. Noi abbiamo elementi cellulari di 2 tipi distinti: quelle di tipo **emopoietico** con le colonie, i **progenitori** e la **componente non emopoietica** che è costituita dalla componente mesenchimale stromale. Il midollo osseo è considerato un serbatoio perché abbiamo evidenza che le cellule staminali contenute nel midollo osseo abbiano la **capacità di migrare** e andare nei diversi organi (fegato, muscolo scheletrico, muscolo cardiaco, tessuto adiposo, a livello neuronale) ed è questa la caratteristica di **pluripotenza** delle cellule staminali emopoietiche, perché in determinate condizioni è stato dimostrato come ci sia un richiamo (soprattutto in condizioni di ipossia, ischemia tissutale), il **rilascio di chemochine** a livello locale è uno stimolo per mobilizzare cellule staminali dal midollo osseo. Esistono però anche **cellule staminali residenti** nei vari organi e vari tessuti che sono pronte per scopi di tipo rigenerativo. Questa capacità di migrazione della cellula staminale emopoietica la sfruttiamo per mobilizzare le cellule staminali, farle andare dal midollo al sangue periferico, per raccogliere le cellule staminali del sangue periferico per la sua applicazione clinica di trapianto delle cellule staminali**.** **CELLULE STAMINALI- MECCANISMI DI PLASTICITA'** Il concetto di pluripotenza e multipotenza sono però concetti funzionali non concetti che identificano tipologie differenti di cellule. La cellula staminale è sempre stata definita per la sua **plasticità** cioè la sua [capacità di modificare il suo programma differenziativo] ed essere quindi in grado di **differenziare in diversi tipi tissutali**. Vi sono varie teorie biologiche alla base dei meccanismi di plasticità di una cellula staminale, vi sono evidenze che a livello del midollo osseo vi possa essere persistenza di una putativa cellula staminale somatica in grado di acquisire poi caratteristiche di pluripotenza e dare origine a cellule staminali multipotenti (quindi neuronali, pancreatiche, epatiche, muscolari). Quindi abbiamo l'*Hemopoietic Stem Cell* che da origine a cellule staminali neuronali e le stesse cellule staminali multipotenti possano andare incontro a **de-differenziazione** e quindi ritornare ad acquisire caratteristiche di pluripotenza. Esistono poi modelli biologici che hanno dimostrato la capacità di **trans-differenziazione** delle cellule emopoietiche staminali in diversi compartimenti. Quindi meccanismi sia di trans-differenziazione, cioè attraverso la [modifica del programma trascrizionale della cellula staminale emopoietica] possono dare origine a [cellula staminale multipotente tessuto-specifico] e [tornare indietro]. Oppure un modello di **switch compartimentale,** cioè ipotizzare che la [cellula staminale emopoietica] è nel midollo osseo e [dal midollo osseo migri] nei vari [compartimenti] (muscolari, neuronali, epatiche) e dare origine attraverso questi diversi meccanismi a [cellule staminali organo-specifico]. Quindi meccanismi di transdifferenziazione, switch (quindi cellule staminali dal midollo la ritroviamo con caratteristiche emopoietihe a livello del muscolo), o **meccanismi di fusione cellulare.** Transdifferenziazione in cellule staminali ad es. epatiche e neuronali oppure la cellula staminale emopoietica migra a livello muscolare e da li poi da origine al tessuto specifico dell'organo, oppure meccanismi di fusione cellulare a livello dei compartimenti. Altri modelli biologici sperimentali hanno dimostrato la possibilità che il midollo osseo contenga anche **cellule staminali di altra natura** con caratteristiche differenti dalla cellula staminale emopoietica. Sicuramente le cellule **staminali mesenchimali** che rappresentano u[na quota delle cellule stromali del midollo] hanno caratteristiche di staminalità, è possibile che il midollo abbia cellule che hanno caratteristiche differenziative differenti da quella emopoietica, o è possibile che sia la stessa cellula emopoietica ad acquisire caratteristiche diverse in base al programma trascrizionale attivato. Un ultimo modello di plasticità della cellula staminale emopoietica è basato su delle evidenze della persistenza di **cellule staminali embrionali pluripotenti**, che sono tipicamente cellule embrionali fetali in [grado di dare origine a diversi tessuti]. Queste cellule embrionali persistono anche nell'adulto e si è visto che siano in grado di dare origine a **cellule staminali multipotenti** che vadano incontro a differenziazione in senso *neuronale, muscolare, epatico ed emopoietico*. Ci sono delle evidenze in alcune condizioni come ad es. la leucemia mieloide cronica le alterazioni genetiche presenti nella cellula staminale mieloide, quindi in tutto il compartimento mieloide, le ritroviamo anche in cellule di origine differente, ad es. in cellule endoteliali. Esistono a livello embrionale delle cellule emoangioblastiche che danno origine sia al tessuto endoteliale che al tessuto emopoietico, quindi non si esclude una persistenza di cellule emangioblastiche anche a livello midollare nella fase post-natale. [Quindi questi sono dei modelli di possibili meccanismi di plasticità:] Un modello vede cellule staminali differenti che diano origine a differenti tessuti. **CELLULE STAMINALI -- MODELLO DI TRANSDIFFERENZAZIONE:** Modelli di transdifferenzazione da un compartimento all'altro. E modelli di persistenza di **cellule embrionali totipotenti** in grado anche nella vita adulta di differenziare in cellule specializzate. E' possibile che questi modelli siamo applicabili tutti e 3, non siano in contrasto tra loro, e soprattutto dalle evidenze più recenti si vede la capacità della cellula staminale di acquisire, in base a come si trova, al compartimento, **caratteristiche differenti** e **modificare** le sue **capacità** **differenziative**.  Questo è il **modello di transdifferenziazione** che si può manifestare con diversi meccanismi, cioè a partenza dalla cellula staminale totipotente o pluripotente che si differenzia in una cellula staminale emopoietica. Essa può tornare indietro con meccanismi di de-differenziazione, quindi riacquisire caratteristiche di pluripotenza e poi riprogrammarsi in una cellula staminale di altra natura, quindi **multipotente**; oppure può transdifferenizare **da un compartimento all'altro**. La **cellula staminale emopoietica** ha molteplici funzioni e meccanismi di regolazione, che sono alla base del processo emopoietico e anche dei processi di trasformazione neoplastica, leucemica. La cellula staminale emopoietica dal punto di vista funzionale ha caratteristiche e capacità di **self-renewal** quindi di automantenere il proprio pool, ha capacità di andare incontro a **morte cellulare programmata** per apoptosi, capacità di **migrazione**, capacità **differenziative** e capacità di entrare in uno **stato di quiescenza** come un serbatoio di cellule staminali che non sono in attiva fase proliferativa ne differenziativa. La cellula staminale emopoietica può andare incontro, in seguito ad anomalie clonali, quindi trasformazioni e mutazioni, allo **sviluppo di cloni maligni** che sono alla base della biologia delle leucemie acute. **MODELLO COMPARTIMENTALE DELL'EMATOPOIESI**: Il modello dell'emopoiesi è un modello **compartimentale** in cui abbiamo [diversi compartimenti] che sono costituiti da diverse popolazioni cellulari. Quindi la cellula staminale emopoietica non è un\'unica cellula ma è un **pool di cellule staminali** che fanno parte di questo compartimento, che è differente dal compartimento dei progenitori che sono commissionati a differenziare verso le cells mature del sangue, infatti il compartimento staminale ha caratteristiche di **self-renewal**, di **maturazione**, può essere identificato con tecniche di tipo funzionale più che da un punto di vista morfologico al microscopio, quindi o per **caratteristiche** **immunofenotipiche** o per caratteristiche **funzionali** (cioè la capacità di dare origine in modelli vitro o in vivo all'emopoiesi). Quindi il compartimento staminale è costituito da cellule che hanno un'alta capacità di self-renewal, ma bassa capacità funzionale perché si mantengono in questo stato di quiescenza indifferenziato, col compito di mantenere questo pool che deve essere pronto a entrare in ciclo ed andare incontro al processo differenziativo, al contrario dei compartimenti dei precursori delle cellule mature che hanno alta capacità funzionale ma non hanno capacità rigenerative o di automantenimento. **[Come identificare il compartimento delle cellule staminali emopoietiche:]** Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente L'immunifenotipo è uno degli aspetti fondamentali per identificare la cellula staminale. Il **compartimento staminale** presenta popolazioni cellulari che hanno un fenotipo differente fra loro. A scopo clinico, trapiantologico per fare trapianto di cells staminali usiamo cellule che hanno **CD34**, però non tutte le cellule staminali, esiste un compartimento con capacità rigenerative che sono **CD34-** e **non esprimono il CD45** che è il marcatore tipico dei progenitori emopoietici. Poi nell'ambito delle **CD34+** è possibile identificare popolazioni con fenotipo differente: Alcune esprimono **CD33**, **CD90**, **KDR** e sono **CD38-**, **HLA-DR-**, **CD117-** (?recettore del c-kit) **, FLT3-**. Poi un compartimento più maturo che **non** ha il **CD133** (che è un marcatore di immaturità e che identifica cellule in grado di dare origine a progenitori e a cellule endoteliali (che hanno infatti il recettore KDR detto anche VEGFR2) e questo compartimento CD34+ esprime il **CD38**, **non** esprime **l'HLA-DR**, **esprime c-kit, CD71** e **FLT-3**, mentre è **negativo** per il **CD133** e **CD90** (che è espresso da popolazioni cellulari più **immature**). Quindi il fenotipo della cellula staminale è complesso, variegato, c'è un compartimento di cellule che hanno un grado di maturità differente, che sono in grado di avere automantenimento e andare incontro a processi differenziativi. La cellula staminale è in grado di acquisire o meno questi marcatori, quindi anche in questo caso non sono entità distinte ma sono fenotipi che possono essere modulati nella loro espressione. Poi passando dal compartimento staminale al compartimento dei progenitori il **CD34** via via viene **perso**, vengono acquisti altri marcatori immunofenotipici caratteristici delle varie linee: **CD33** è della **linea mieloide**, il **CD3** dei **linfociti T**, il **CD19** e **CD79a** dei **linfociti B.** Quindi viene **persa** questa **staminalità**, sebbene alcuni progenitori possono ancora esprimere il **CD34** ma poi progressivamente viene perso.  Quindi unendo l'immunofenotipo con le capacità funzionali abbiamo questo pool di **cellule staminali** in grado di rigenerare e di automantenersi (quini che sono **CD34+ e CD38-**), **cellule multipotenti** che mantengono ancora il **CD34** ma via via cominciano a diventare lineage specifici e quindi ad acquisire marcatori come **c-kit, l'flk2** via via poi acquisiscono i vari marcatori delle cellule progenitrici multipotenti, oligopotenti via via sempre più differenziati. Quindi la capacità rigenerativa è massima nel pool più indifferenziato e più bassa la capacità proliferativa, che diventa invece massima nel pool delle cellule commissionate delle varie colonie, per poi ridursi come attività proliferativa nei precursori lineage ristretti come eritroidi granulocitari, monocitari e linfocitari B e T. In questa slide possiamo vedere come si modifica il fenotipo passando dal compartimento staminale, dai progenitori linfoidi e mieloidi via via nelle cellule maggiormente differenziate: Quindi abbiano un **pool CD34-/+, CD38-,** poi viene acquisito il **CD34** e il **CD38,** poi viene nuovamente **perso il CD34** e **mantenuto** il **CD38,** poi via via acquisiti i marcatori di linea linfoidi, monocitari, granulocitari, linfociti B, eritroidi ecc... Questo fenotipo del compartimento staminale si associa a caratteristiche funzionali differenti perché la capacità rigenerativa di ripopolare il midollo osseo e quindi ricostituire tutto il midollo è mantenuta soprattutto da questo pool di cellule che hanno una **bassa espressione di CD34**, o addirittura sono **CD34-**, e in teoria sono le vere cellule staminali perché hanno maggiore capacità rigenerativa, mentre le CD34+ sono cells che hanno più bassa capacità di self-renewal ma hanno maggior capacità differenziativa delle varie popolazioni.  Possiamo identificare la cellula staminale per proprietà **immunofenotipiche** ma anche per **criteri di tipo funzionale**, cioè per definire una cellula staminale emopoietica non bastano le caratteristiche fenotipiche ma è anche necessario dimostrare che queste cellule sono in grado di differenziare e dare origine a cellule del midollo osseo. Questo lo possiamo fare in **vitro** con diversi modelli di test come le **LTC-IC,** le **CAFC**, le **CFU-Blast** sono tutti livelli in vitro in cui si prendono le cellule staminali che danno origine a queste colonie e che poi rigenerano progenitori eritroidi, mieloidi, monocitari ecc...Oppure la capacità differenziativa della cellula staminale emopoietica la possiamo studiare **in vivo** con diversi **modelli del trapianto** delle **cellule staminali** che possiamo studiare con **modelli animali** **pre-clinici** in vivo come ad es. il [modello di trapianto in utero della pecora], i modelli **SCID-mice** (topi immunodeficienti in cui si inoculano cellule staminali umane che devono essere in grado di rigenerare cellule del sangue), modelli **SCID-human** (in cui si utilizzano modelli mice-SCID con midollo osseo umano i cui pezzi vengono inoculati a livello sottocutaneo nel topo), ci sono poi **modelli dei primati mammiferi**, e poi c'è il **modello del trapianto di midollo osseo** (è il modello per eccellenza, in cui inoculiamo cellule staminali CD34+ poi in un soggetto che ha azzerato la propria emopoiesi per la chemio e radioterapia, e queste cellule in 2-3 settimane ripristinano completamente i valori di globuli rossi, neutrofili e piastrine). Quindi per definire una cellula staminale emopoietica questa deve essere in grado o in modelli in vitro o in modelli funzionali **in vivo** di **rigenerare midollo osseo.** Qui si vedono delle immagini di **metodi di studio della cellula staminale emopoietica**, queste **colture in vitro long term-IC assay** in cui si utilizzano delle cellule stromali, mesenchimali come supporto alle cellule staminali emopoietiche. Attraverso diversi step dopo 12 giorni nel topo e dopo 20 giorni nell'uomo queste cellule danno origine alle colonie che sono i progenitori degli eritrociti, granulociti e delle piastrine. Si vedono le **CFU-GM** colorate con tecniche di immunoistochimica, **CFU-granulo eritroidi mielo monocitarie**, le **CFU-E** (quindi progenitori eritroidi), **BFU**-**E** (progenitori eritroidi più indifferenziati). Quindi con questo metodo di long term culture (colture cellulari a lungo termine) si dimostra se le cellule che inoculiamo nella nostra piastra siano effettivamente cellule staminali emopoietiche perché devono dare origine a questo tipo di colonia. Quindi queste **colture midollari** sono colture a **lungo termine** che utilizzano **cellule stromali** perchè formano un supporto a queste cellule e permettono la formazione di focolai di **cellule emopoietiche** che **aderiscono allo stroma,** perché la cellula staminale emopoietica aderisce strettamente alla cellula stromale e da questi focolai [da una singola cellula] per la loro capacità proliferativa e differenziativa si [formano tutte le cellule emopoietiche mature].  Queste sono altre immagini di colture cellulari: Queste sono [colonie miste eritroidi granulocitarie] che vengono tipizzate con metodiche di immunoistochimica (quelle in rosso-marrone sono cellule eritroidi perché contengono emoglobina, mentre le altre sono progenitrici dei granulociti neutrofili che si colorano con l'ematossillina). Altro esempio sono le [colonie immature eritroidi] dette [BFU-E] (burst forming unit erythroid) che si sviluppano da singole cellule, in presenza di eritropoietina (fattore di crescita di queste cellule) sono in grado di dare origine a multi-colonie e quindi poi a progenitori eritroidi. Oltre a colonie in vitro abbiamo modelli **in vivo** come i **modelli di topo NOD/SCID** trattati con ***irraggiamento*** per portare a una distruzione delle cellule staminali e poi vengono inoculati con cellule staminali putative che devono essere in grado di rigenerare midollo osseo. Inoltre, una volta inoculate nel topo si vanno a prendere le cellule del midollo per fare dei saggi in vitro, le **LTC-IC,** le **CFU-S** colonie a livello della milza.  Quindi si possono fare diversi studi con queste cellule per dimostrare la loro capacità differenziativa.  Le cellule staminali emopoietiche possono anche essere analizzate in base alle loro **caratteristiche immunofenotipiche**, si deve purificarle e studiarle. [Come purifichiamo le cellule staminali emopoietiche:] Generalmente vengono purificate a partire dall'anello di **cellule mononucleate** in seguito o a espianto di midollo o aspirato midollare direttamente o attraverso processi di mobilizzazione delle cellule staminali di leucaferesi dal sangue periferico. Quindi identifichiamo l'anello di cellule mononucleate**,** si separa il plasma, l'anello di cellule mononucleate, il ficoll, gli eritrociti e i granulociti. Le cellule staminali stanno nella zona dell'anello di cellule mononucleate, a quel punto con le CD34 possiamo identificare 2 popolazioni: **Popolazioni CD34-** e popolazioni **CD34+** poi possiamo identificare le **popolazioni lineage --** e **lineage +** cioè che esprimono tutti i marcatori di linea ([CD2, CD3, CD14, CD16, glicoforina]**,** tutti i [marcatori eritroidi, mieloidi, monocitari)] e quindi identificare un pool di cellule più differenziate**,** il **CD34+ lineage+** e cellule **CD34+ lineage**- e una terza popolazione detta **CD34- lineage-.** Quindi usando delle metodiche di *purificazione immunomagnetica* usando anticorpi specifici anti-CD34 e contro i diversi marcatori specifici di linea legate a biglie immunomagnetiche possiamo ottenere la separazione di queste cellule. Questo ha senso per separare, caratterizzare sia da un punto di vista trascrizionale queste diverse popolazioni di cellule staminali che stanno nel compartimento staminale, per vedere che gene esprimono e da un punto di vista funzionale che capacità differenziative hanno. E' interessante che da studi di trascrittomica, cioè di **gene expression profiling** volti a identificare il profilo trascrizionale di questi 3 diversi gruppi cellulari nell'ambito della popolazione staminale, cioè [CD34- lineage]- (che sono quelle più indifferenizate), [CD34+ lineage-] e [CD34+ lineage+]. Si vede che il profilo trascrizionale cambia tantissimo, soprattutto tra le CD34- e le CD34+ c'è un gruppo di **geni down-regolati** in verde e **geni over-espressi** in rosso. Le **CD34 lineage- lineage+** hanno dei **profili trascrizionali** abbastanza **simili** anche se non uguali, ma il compartimento staminale CD34- ha un profilo trascrizionale completamente diverso. Quindi questi studi di trascrittomica su cellule sortate con metodiche o di sorting citofluorimetrico o immunomagnetico hanno permesso di identificare i geni che sono over-espressi e down-regolati nelle diverse popolazioni, in modo da definire le caratteristiche di queste diverse popolazioni.  E' stato visto che i geni che fanno parte della **replicazione del DNA**, del **DNA repairing**, del **DNA processing,** dell'**assemblamento della cromatina**, nei meccanismi di **metabolismo** e nello **stress ossidativo**, nei processi di **fosforilazione** e del **ciclo degli acidi tricarbossilici**, sono tutti geni che vengono modulati con queste funzioni in maniera diversa, sono **massimi** nelle **CD34+ lineage+** mentre **minimi** a livello delle **CD34- lineage-** Poi sono stati studiati i **geni del self-renewal** dimostrando che le cellule **lineage-** **CD34-** hanno alcuni geni come gli *Homeo box* che sono **down-regolati** rispetto all'over-espressione nelle cellule che esprimono sia **CD34** sia **marcatori di linea**, poi si vedono alcuni fattori di trascrizione sono differenzialmente espressi, recettori delle interleuchine e dei fattori di crescita sono over-espressi nelle cellule più indifferenziate e così via. **THE CHIAROSCURO STEM CELL -- A UNIFIED STEM CELL THEORY:** E questo ha permesso di arrivare anche ad un [nuovo modello di staminalità] della cellula emopoietica, non modelli rigidi, gerarchici, in cui esistono diverse tipologie di cellule distinte tra loro, in cui si ha una cellula CD34-, poi CD34+, poi acquisisce marcatori di linea, come step uno dietro l'altro distinti fra loro, ma come un **modello reversibile, flessibile, un continuo**, in cui c'è uno **shift** da un **compartimento all'altro** con fenotipo staminale più immaturo in grado di dare self-renewal a cellula staminale più differenziata e quindi con un maggiore potenziale proliferativo. E questo passaggio da questi 2 fenotipi è fluido, flessibile**,** una stessa cellula staminale emopoietica può acquisire un fenotipo di staminalità, di immaturità, di quiescienza, di self-renewal e poi successivamente acquisire un fenotipo più differenziato. E questo è possibile grazie al **remodeling della cromatina** che permette di transitare da una fase all'altra del ciclo cellulare, modificare, modulare l'espressione di geni per fattori trascrizionali o di recettori per le citochine e le interleuchine. Esistono **diversi modelli di regolazione** del processo **dell'emopoiesi**, perché nella maggior parte c'è un meccanismo di regolazione cell to cell contact nel compartimento staminale, mentre nel compartimento dei progenitori e dei precursori c'è una regolazione prevalentemente per interleuchine e fattori di crescita. Però anche se il controllo delle funzioni delle cellule staminali, quali il mantenimento del self-renewal, l'entrata in ciclo, la sua capacità differenziativa e questo modello flessibile di passaggio da uno stato all'altro è regolato finemente da questo meccanismo di contatto cellulare e tale meccanismo induce anche la produzione di fattori solubili che sono coinvolti nella regolazione del passaggio da uno stato di quiescenza a uno stato proliferativo e quindi avviare il processo emopoietico differenziativo. Ad es. è stato visto che il **TGF-beta**, **il TNF-alfa**, **leukemia inhibitory factor** (LIF), **interferon gamma** hanno una funzione [inibitoria] e quindi mantengono la cellula staminale in uno stato di quiescenza e tendono ad inibire la proliferazione.  Al contrario lo **stem cell factor**, **l'interleuchina-1**, **IL-3**, **IL-6**, **Fit3 ligand**, **IL-11** hanno un [effetto pro-proliferativo] sulle cellule staminali, tendono ad indurre il passaggio dallo stato di quiescenza allo stato proliferativo. Questo passaggio da uno stato all'altro regolato dai fattori di crescita e citochine che sono prodotte da cellule che fanno parte del microambiente, ad es. da cellule del compartimento stromale, dagli osteoblasti. Spesso sono prodotte in seguito a meccanismi di **cell to cell contact** cioè il contatto cellulare della cellula staminale emopoietica con le cellule della nicchia che **innesca** questo processo di cambiamento dello stato di quiescenza allo stato proliferativo attraverso la produzione di questi fattori. Vi è un **equilibrio tra fattori inibitori** e fattori **stimolatori** nella normale emopoiesi, poi alterazioni di questi meccanismi su base intrinseca ma anche estrinseca sono alla base della trasformazione maligna della cellula staminale emopoietica. I **fattori di trascrizione** coinvolti nel **blood** **development** cioè nell'emopoiesi: L'emopoiesi è regolata a livello intrinseco da **fattori trascrizionali** che vengono **attivati** o **inibiti** a seconda delle condizioni attraverso sia meccanismi di contatto cellulare sia attraverso citochine e fattori che agiscono attivando o meno i fattori trascrizionali. Possiamo identificare degli **stem cell trascription factor** che sono fattori trascrizionali richiesti per il self-renewal della cellula staminale emopoietica, per il survival (sopravvivenza della cellula) ossia **Runx1, Bmi-1, Gfi-1**, **GATA-2**, **Mll**, **Tel** sono fattori trascrizionali coinvolti nel self-renewal della cellula staminale emopoietica e anche nella trasformazione leucemica perché alterazioni, traslocazioni genomiche che coinvolgono questi fattori trascrizionali sono alla base di alcune forme di leucemie acute mieloide**.** Poi oltre a questi fattori trascrizionali staminali esistono anche fattori trascrizionali che agiscono a livelli più bassi, dei progenitori multipotenti e dei precursori commissionati, ossia i geni della famiglia GATA agiscono a vari livelli nel differenziamento eritroide, megacariocitario, a livello del differenziamento mieloide. Nel **differenziamento mieloide** abbiamo anche altri fattori come **Pu.1**, **C/EBPalfa**, **C/EBPepsilon** e **Gfi-1** che sono fattori trascrizionali critici coinvolti nella formazione di **granulociti neutrofili** e dei **monociti**, perché se facciamo un knock out di questi geni GATA-1, Pu.1, C/EBPalfa otteniamo un fenotipo di un topo che è privo di cellule del sangue maturo quindi si blocca completamente il processo maturativo della cellula staminale emopoietica e dei progenitori commissionati. Poi ci sono i **fattori trascrizionali della linea linfoide**, quindi la cellula staminale orientata in senso linfoide, come **Ikaros, Notch, Pax** tipicamente per i linfociti T, **Pax-5, E2A, EBF,** **Bcl-11**, **XBP-1** che sono fattori trascrizionali coinvolti nel differenziamento della cellula staminale orientata in senso linfoide verso i linfociti B. In questa tabella sotto riassuntiva sono evidenziati i vari **fattori trascrizionali** e come avviene la **regolazione dell'emopoiesi a livello trascrizionale**, dice il **pattern di espressione**, **dove sono espressi**, li troviamo nei progenitori, nelle cellule megacariocitarie ecc... Vediamo anche l'**effetto** **dell'over-espressione** di questi che porta [all'espansione di alcune popolazioni] ma non tutte e l'effetto del fenotipo del knock-out. Se facciamo knock-out dei geni **GATA** non abbiamo progenitori, si blocca l'eritropoiesi, la megacariocitopoiesi, e i linfociti T; se blocchiamo **Pu.1** blocchiamo il differenizamento mieloide e la formazione delle cellule T e B, **C/EBPalfa** non abbiamo neutrofili, **Pax-5** non si generano linfociti B, I**karos** non si generano cellule di natura linfoide ne B ne T. Quindi abbiamo diversi fattori trascrizionali di cui è stato dimostrato il ruolo nel differenziamento**.**  In questa altra tabella si visualizzano gli **effetti del knock out** di diversi **fattori trascrizionali** sia proliferativi come la **p21**, che portano un effetto di [aumentare la proliferazione] in alcuni casi e hanno un effetto sul [processo emopoietico]. Immagine che contiene tavolo Descrizione generata automaticamente Alcuni sono fattori trascrizionali Gfi1, Hox, c-myc che sono coinvolti poi nella **trasformazione leucemica.** Un altro fattore trascrizionale che si è dimostrato avere un ruolo fondamentale nel processo emopoietico è un sensore detto **Lkb1** che ha la funzione di [far sopravvivere le cellule staminali emopoietiche] codifica per una **serina/treonina chinasi** che fa da link tra metabolismo cellulare con produzione di ATP e crescita cellulare, quindi è coinvolta nell'omeostasi dell'energia delle cellule e in questo senso è fondamentale nel differenizamento delle cellule staminali ematopoietiche. E' stato visto che i *topi Lkb1 deficienti* per knock-out di tale gene hanno un quadro progressivo di **pancitopenia**, cioè **non si formano più le cellule dl sangue**, una perdita rapida del compartimento mieloide a livello midollare, del compartimento B linfoide e del compartimento delle cellule eritroidi, a dimostrazione che è un fattore critico coinvolto nel mantenere la cellula staminale emopoietica in uno stato di quiescenza e la sua inibizione o perdita di funzione **causa un'aplasia del midollo**, un bone marrow failure con aumentata **proliferazione di cellule staminali** **emopoietiche**. Quindi se manca le cellule proliferano di più, non si differenziano e c'è una perdita di funzionalità del midollo osseo. Quindi le due funzioni della cellula staminale emopoietica (self renewal/quiescenza) sono le funzioni principali che caratterizzano la cellula staminale emopoietica e che sono regolati a vari livelli, cioè a **livello trascrizionale**, a **livello metabolico**, a livello della **proliferazione cellulare** con proteine che regolano il ciclo cellulare (come p-21 e p-27), sono regolati attraverso meccanismi che non inducono la morte cellulare programmata (apoptosi), come per esempio MCL1 che è un fattore anti-apoptotico, e inoltre risentono di **segnali che provengono dal microambiente**, ovvero da quella che si chiama la ***nicchia emopoietica***, attraverso diversi meccanismi come il sistema Notch, WNT, TIE2/ANG1, ci sono diversi sistemi di regolazione da parte della nicchia che hanno un ruolo fondamentale nella regolazione del [mantenimento in uno stato di quiescenza.] Qui vediamo anche come possiamo **modulare**, quindi poi indurre anche **espansione** delle cellule staminali riattivando o inibendo diverse vie di segnale, per cui abbiamo **regolatori negativi** e **stimolatori positivi** dell'espansione delle cellule staminali, che è uno degli approcci clinici ormai da tanti anni studiato per scopi rigenerativi, quindi per utilizzare una cellula staminale e farla espandere in vitro. Conosciamo i vari meccanismi con [WNT, Notch, HedgeHog], ecc, che sono vie che stimolano la espansione, la crescita, cioè la **proliferazione delle cellule staminali**; al contrario [TGF beta1], le proteine del ciclo [p21, p18, p27] invece svolgono un\'**azione di tipo inibitorio sulla crescita** delle cellule. **LA NICCHIA DELLA CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA** La **cellula staminale** non è una cellula in sospensione, ma si trova **all\'interno della nicchia**, quindi a stretto contatto con cellule di origine stromale mesenchimale, in particolar modo vedremo il ruolo degli osteoblasti e il ruolo delle cellule endoteliali. La funzione delle staminali è regolata a **livello trascrizionale** con le citochine con funzione attivatoria o inibitoria, a **livello metabolico**, a **livello del ciclo cellulare** e sono meccanismi di regolazione che non possono prescindere dallo stretto legame che la cellula staminale ha con le cellule stromali, osteoblastiche, endoteliali, perché è proprio la **regolazione cellula mediata** per queste due tipologie cellulari che **attiva i vari meccanismi** (fattori trascrizionali, fattori stimolatori e fattori inibitori) per mantenere o lo stato di quiescenza o l\'auto mantenimento delle cellule staminali oppure avviare la cellula a un programma trascrizionale di tipo differenziativo. **STROMA**: Il concetto della nicchia è abbastanza recente, degli ultimi 10-15 anni, prima del concetto della nicchia però conoscevamo quello che era il ruolo dello **stroma** e delle **cellule stromali del midollo osseo**, cioè di tutta quella componente di **origine connettivale mesenchimale** non emopoietica, quindi non in grado di dare origine al tessuto emopoietico e progenitori emopoietici, ma in grado di dare un **supporto alle cellule staminali emopoietiche 🡪** un supporto duplice perché è sia di tipo [meccanico-strutturale], quindi hanno scopo di supportare la cellula staminale e di sviluppo delle cellule emopoietiche, ma anche [funzionale], atto a fornire un adeguato microambiente perché le cellule stromali producono fattori di crescita stimolatori o inibitori e inoltre promuovono lo stroma con meccanismi di adesione e contatto cellula-cellula, attivano programmi trascrizionali, fattori trascrizionali e quindi anche il microambiente midollare svolge un ruolo importante attraverso le proteine della matrice (fibronectina, osteopontina) che hanno un loro ruolo, perché le cellule staminali emopoietiche hanno il recettore per queste proteine della matrice extracellulare, quindi questo meccanismo regolatorio dello stroma, meglio definito come nicchia emopoietica, è estremamente importante a vari livelli. **EVENTI STORICI**: Storia di come nel corso degli anni si è partiti dall'identificazione dello stroma fino a coniare il metodo di cellule staminali mesenchimali nei primi tempi, quindi dimostrare le **cellule fibroblastiche** in grado di dare origine a **riparazione delle ferite**, fino a caratterizzare le **colony forming unit fibroblast** (colonie cellulari che danno origine specificatamente alle cellule stromali), fino ad arrivare al concetto della **nicchia** osteoblastica ed endoteliale e fino a distinguere i tipi diversi di nicchia in grado di regolare cellule staminali e progenitori, fino agli ultimi anni con la caratterizzazione dei **meccanismi che regolano la funzione della nicchia**, la caratterizzazione delle **molecole** che esprimono le cellule che fanno parte della nicchia e l\'identificazione delle **tipologie cellulari** che hanno questa funzione importantissima di tipo regolatorio.  Sicuramente i modelli genetici ci hanno aiutato a capire che lo [stroma della componente mesenchimale è fondamentale nel supportare il processo emopoietico], infatti dei **modelli murini knock-out** per diverse molecole (vediamo il recettore della laptina ad esempio) hanno dimostrato delle **alterazioni della componente mesenchimale** e come effetto successivo **un\'alterazione del processo emopoietico**. Nel midollo osseo abbiamo l\'esistenza di **due compartimenti staminali**: uno che comprende la cellula [staminale emopoietica] e uno che comprende la cellula [staminale mesenchimale], anche per quanto riguarda la cellula staminale mesenchimale esiste una gerarchia cellulare: a partire da cellule più indifferenziate a cellule **osteo-progenitrici** (che danno poi origine ad osteoblasti ed osteociti), cellule **condro-progenitrici** (che danno origine a condrobalsti e condrociti, quindi alla cartilagine), cellule che danno origine ad **adipoblasti e adipociti** e cellule che danno origine al **compartimento stromale**. Il midollo quindi ha una gerarchia nel compartimento staminale sia per quanto riguarda le cellule staminali emopoietiche sia per il compartimento di cellule mesenchimale, esse hanno caratteristiche di self-renewal quindi capacità di auto mantenimento e rigenerazione e via via poi cellule che vanno incontro attraverso step intermedi a dare origine a progenitori di osteoblasti, osteociti, condrociti, adipociti e cellule stromali. Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente **NICCHIA EMOPOIETICA** Dal concetto di stroma poi si è arrivati a un concetto più fine che quello di ***nicchia emopoietica***. Sono state identificate e caratterizzate quelle che sono le cellule che fanno parte della nicchia e come questa nicchia controlli il numero delle cellule staminali emopoietiche, la loro capacità di self-renewal e la loro capacità proliferativa, di quiescenza e la loro capacità differenziativa; quindi sono fondamentale per la **regolazione dell\'emopoiesi**. Il concetto di nicchia quindi parte con il concetto di un **micro-ambiente stabile** per la cellula staminale costituito **sia da cellule sia da componenti extracellulari** in grado di **ospitare uno più cellule staminali** e di **controllare l\'auto rinnovamento** e la capacità di produzione delle progenie. Le proteine della matrice extracellulare insieme alle molecole di adesione espresse da queste cellule definiscono anche dei **confini spaziali** della nicchia all\'interno della quale sono contenute le cellule staminali. [Caratteristiche della nicchia]: La nicchia è un ambiente che **isola la cellula staminale** e **la protegge dagli stimoli esterni** che possono indurre differenziamento o apoptosi e le **protegge anche dall\'eccessiva proliferazione**, cioè il meccanismo di controllo proliferativo della cellula staminale; quindi a mantenerla in equilibrio fra quiescenza e attivazione è un **meccanismo estrinseco**, ha partenza dalle cellule della nicchia che controllano e mandano i segnali inibitori attraverso le citochine e le molecole di adesione che inducono poi la staminale a non proliferare e mantenersi in uno stato di quiescenza. Quindi all\'interno della nicchia: - - - Possiamo distinguere due tipi di nicchie: la prima nicchia ad essere identificata negli anni '90 fu la ***nicchia osteoblastica*** costituita da cellule ossee, osteoblasti, osteoclasti, cellule stromali, ioni calcio e cellule staminali emopoietiche, è stato dimostrato che all\'interno di questa nicchia la cellula staminale si mantiene generalmente in uno **stato di quiescenza,** si **auto-rinnova**, ma **non prolifera** e non va incontro all\'attivazione del processo differenziativo. Al contrario la ***nicchia vascolare*** costituita da cellule endoteliali e staminali emopoietiche ha funzione di **stimolare la proliferazione** e il **differenziamento** della cellula staminale empoietica e anche il processo di **mobilizzazione e di migrazione** della staminale dal midollo osseo al sangue periferico e quindi poi ai vari organi e tessuti. Quindi sono due funzioni ben distinte anche se non è chiaro se siano anche da un punto di vista anatomico due nicchie ben distinte, è possibile che la nicchia emopoietica sia **[unica]**, dove abbiamo sia cellule osteoblastiche (orletto osteoblastico) sia cellule di tipo stromale e cellule vascolari e quindi la cellula emopoietica a seconda di dov\'è collocata da un punto di vista spaziale: se è attaccata alla cellula osteoblastica sta in uno stato di quiescenza, se invece è in contatto con una cellula endoteliale entra in circolo, va incontro a fenomeni di migrazione e si attiva il processo differenziativo.  Sicuramente ci sono vari sistemi, sia citochine solubili, sia fattori trascrizionali, sia ligandi che hanno un ruolo nella **regolazione della nicchia** delle cellule staminali. - La prima nicchia a essere descritta in letteratura è stata la ***nicchia osteoblastica*** in cui si dimostrava che non tutti gli osteoblasti dell\'osso trabecolare avevano questa funzione regolatoria sulle cellule staminali emopoietiche, ma solo le cellule osteoblastiche **CD45-** esprimenti **N-cadherin e SNO** (che è un fattore di staminalità) vanno in stretta connessione con la cellula staminale emopoietica e la [mantengono in uno stato di quiescenza]; al contrario le cellule endoteliali del sinusoidali svolgono questa funzione di nicchia vascolare opposta a quella della nicchia osteoblastica. Ci sono poi [diversi meccanismi] con cui la cellula osteoblastica e vascolare [regolano la cellula staminale] emopoietica: abbiamo delle cellule staminali che sono **quiescenti** in uno stato G0 e sono a livello della **nicchia osteoblastica**, cellule staminali emopoietiche vanno incontro self-renewal con meccanismi differenti, perché è stato dimostrato che possono avere anche meccanismi di **divisione asimmetrica** e meccanismi di **divisione simmetrica**, quindi la loro capacità proliferativa di self-renewal è estremamente complessa e prevede quindi due tipi di divisioni. Poi la cellula staminale emopoietica quando si trova nella componente vascolare della nicchia va incontro a **processi differenziati** e poi è in grado di **migrare** nelle sedi differenti. **LA STIMOLAZIONEDEGLI OSTEOBLASTI INCREMENTA LE HSC:** Come abbiamo dimostrato che la nicchia e le cellule osteoblastiche hanno questa funzione importante? In modelli murini è stato visto che **stimolando gli osteoblasti** con diversi meccanismi, facendoli over-esprimere il recettore del PTH, quindi rendendole più sensibili all\' 1-34PTH (fattore anabolico) queste cellule proliferavano e la proliferazione osteoblastica aumentava l\'espressione della **fosfatasi alcalina**, quindi aumentava il **numero delle cellule osteoblastiche**, e aumentava: il numero nei test delle colonie in vitro delle LTC-IC, il numero di progenitori midollari CD, il numero delle colonie spleniche, così tutto il processo emopoietico veniva **espanso**. Immagine che contiene mappa Descrizione generata automaticamentehttp://www.nature.com/nature/journal/v425/n6960/images/425778a-f1.2.jpg Quindi l'osteoblasto svolge questa funzione, la nicchia osteoblastica mantiene in uno stato di quiescenza la staminale emopoietica, ma a seconda poi degli stimoli che arrivano possono essere attivatori o inibitori della cellula osteoblastica; il paratormone che è un fattore anabolico, al contrario fattori come le BMPs inibiscono la proliferazione degli osteoblasti mantenendo questo stato di self-renewal, mentre stimolando gli osteoblasti la cellula staminale entra in circolo, prolifera, si espande e poi va incontro a un processo differenziativo. Altri modelli preclinici, per esempio in modelli mutanti di **topo senza runx2 e CBFB** (che sono fattori trascrizionali in cui manca la formazione osteoblastica) [non c\'è emopoiesi], quindi a livello del midollo, dimostrando che per quanto riguarda la **emopoiesi midollare gli osteoblasti sono fondamentali**. In questi modelli murini in cui non si generano osteoblasti si ha una **emopoiesi extramidollare** **nel sacco vitellino del fegato**, ma non si ha emopoiesi a livello midollare. Si attivano sistemi di emopoiesi a livello della nicchia vascolare, perché la nicchia vascolare è presente a livello del fegato e della milza, ed è un po quello che succede in alcune condizioni patologiche come la *mielofibrosi* dove il midollo osseo non funziona più e quindi tutta la emopoiesi midollare diventa extramidollare. Dopo questi primi studi sono stati pubblicati tantissimi lavori in cui la modulazione della formazione osteoblastica, l\'attivazione osteoblastica, l\'alterazione dei progenitori osteoclasti, avevano tutta una serie di effetti sul fenotipo emopoietico, quindi anche l\'attivazione di PTH, inattivazione di BMP con effetto inibitorio, la deplezione delle cellule osteoblastiche facendo dei knock-out di geni con il collageno, altri modelli di deficienza di altre molecole coinvolte nel differenziamento delle cellule osteoblastiche, la deficienza di osterix e così via fino agli ultimi modelli che hanno identificato in cellule che esprimono la glicoproteina nestina, coinvolte anche esse nel processo emopoietico. Dimostrato il ruolo fondamentale degli osteoblasti, della nicchia osteoblastica specializzata, poi i lavori si sono focalizzati su [quali sono i meccanismi con cui la cellula osteoblastica regola la staminale emopoietica], si vedono una serie di possibili meccanismi. la cellula staminale emopoietica e la osteoblastica colloquiano attraverso vari sistemi: attraverso ***molecole di adesione***, in maniera particolare il **sistema omotipico n caderin-/n-caderin**; attraverso **VLA4** con molecole adesione VCAM1, traverso **ICAM1** con LFA1, ecc, quindi la cellula staminale aderisce in maniera stretta alla cellula osteoblastica proprio per queste molecole di adesione. Poi anche attraverso ***molecole solubili e proteine della matrice***, infatti la staminale emopoietica esprime **CD44** che è il recettore dell\'**osteopontina** che è una molecola prodotta e rilasciata dagli osteoblasti o anche interagisce con la **fibronectina**. Ci sono altri fattori solubili per esempio **CXCL** **12** che interagisce con **CXCL4** (sistema chemochinico fondamentale per la motilità staminale, il self renewal, la survival e la migrazione delle cellule, è anche un target farmacologico); il sistema dell'**angiopoietina1** che è un fattore pro-angiogenico ma ha anche un ruolo, interagendo con **TIE2** sulle cellule staminali, ad agire perché poi tutto va su quelli che sono i meccanismi di beta catenina, p21, p 27, HOX, che regolano self renewal e stato di quiescenza, oltre a regolare i processi di adesione, survival e motilità. Un altro sistema importante è il ***sistema di Notch*** espresso dalla staminale emopoietica, mentre la cellula osteoblastica esprime il **ligando di Notch** e poi c\'è il ***sistema di WNT*** (le cellule osteoblastiche producono numerosi attivatori e inibitori di WNT, questo sistema interagisce con dei recettori e co-recettori LRP 5 e LRP6 per attivare quella che è la [via canonica e non canonica WNT], che hanno un ruolo preponderante attraverso la beta catenina nel meccanismo di self renewal.  Quindi anche in questo caso i modelli knock out di topo per diversi fattori, quindi CXCL12, ANG1, ligandi di Notch, hanno dimostrato il ruolo fondamentale di queste molecole, in questo caso sono **segnali extracellulari che regolano le staminali**, quindi a seconda del modello Knock out abbiamo osservato alterazioni sulla survival, la capacità rigenerativa, proliferativa e di quiescenza. Quindi abbiamo molecole extracellulari, fattori solubili, numerose citochine, interleuchine prodotte dalle cellule osteoblastiche che producono **fattori solubili** che agiscono sui vari recettori che sono presenti sulla cellula staminale emopoietica, **recettori di emopoietine** e **fattori di crescita emopoietici** come GCSF, IL-6, IL-3, chemochine, e così via. Quindi abbiamo detto il ruolo nei diversi processi differenziativi emopoietici e vedremo quali di questi fattori hanno anche un ruolo terapeutico e vengono utilizzati a scopo clinico, poi abbiamo detto i meccanismi di regolazione cell to cell contact mediati principalmente attraverso **molecole di adesione** come N-caderin, Notch, Jagged, VLA4, VLA5, ICAM, VCAM, e così via, che anche questi sono coinvolti nel processo di homing della cellula staminale che aderisce, quindi fa homing, con la nicchia osteoblastica e nella proliferazione, nel mantenimento dello stato di quiescenza. Il ***sistema WNT*** in particolare fra questi sistemi di regolazione da parte della nicchia osteoblastica è importante perché ha una **duplice funzione**, perché è un sistema **autocrino/paracrino** dato che l\'attivazione di WNT negli osteoblasti induce **espansione e proliferazione degli osteoblasti**, quindi nello stesso tempo il sistema WNT in maniera autoctona, prodotta dalle stesse cellule staminali emopoietiche e prodotta dalle cellule osteoblastiche, attiva una serie di geni che sono quelli coinvolti nel self-renewal e nel mantenimento di uno stato di quiescenza; quindi da un lato è un sistema che [agisce sulla nicchia], quindi sulle cellule osteoblastiche, da un altro è un sistema che [agisce sulla cellula staminale.]  Il sistema [WNT ha due vie]: - - **OSTEOCLASTI**: La nicchia osteoblastica però oltre ad avere gli osteoblasti contengono anche gli **[osteoclasti]** e, mentre gli osteoblasti hanno questa funzione di mantenimento di uno stato di quiescenza, del self-renewal, ma anche di espansione nel momento in cui c\'è un\' attivazione osteoblastica, gli osteoclasti hanno una funzione diversa, cioè nell\'ambito della nicchia emopoietica svolgono una funzione di **stimolazione della mobilizzazione delle cellule staminali**, quindi nel distacco dalla cellula staminale dal legame con la cellula osteoblastica, l\'entrata in circolo e quindi anche la **differenziazione in senso emopoietico** della cellula staminale. Queste due cellule osteoblastiche e osteoclastiche sono [regolate poi da fattori differenti]: abbiamo detto che gli osteoblasti sono regolati dal **paratormone** che attiva e da **BMP** che inibisce, gli osteoclasti sono invece attivati dal **RANK ligand** (o anche lo stress) che è il fattore principale di formazione osteoclastica che poi hanno questa funzione nella mobilizzazione.  **OSTEOCITI**: Nell'osso oltre agli osteoblasti e osteoclasti abbiamo anche gli [**osteociti**] che sono gli elementi terminali della serie osteoblastica, gli osteociti non hanno una funzione così essenziale come gli osteoblasti, perché il knock out degli osteociti non blocca la emopoiesi, ma sono coinvolti comunque nell'emopoiesi perché **producono rank ligand** e quindi hanno un effetto sulla **espansione degli osteoclasti** e **producono G-CSF** (un fattore di crescita granulocitario, che è un fattore che induce differenziamento in senso granulocitario da parte della cellula staminale emopoietica), quindi comunque hanno una funzione anche loro. - La [nicchia vascolare] è costituita da cellule endoteliali che supportano in maniera particolare la **proliferazione** della cellula emopoietica e la **differenziazione** della cellula emopoietica e quindi anche la mobilizzazione dell\'homing della cellula staminale che abbiamo detto può trasmigrare, ed è quello il meccanismo alla base del quale c\'è il trapianto di cellule staminali, perché le cellule staminali hanno la capacità di fare homing nella nicchia quando le iniettiamo a livello periferico e quando le mobilitiamo si staccano dalla nicchia e vanno in circolo nel sangue periferico. Questo procedimento avviene attraverso una **trasmigrazione nell'endotelio** presente a livello del midollo osseo e quindi questa funzione è fondamentale della cellula endoteliale. Poi le cellule endoteliali vanno a costituire una sorta di back up a livello di organi extra midollari soprattutto nella milza, ma anche fegato, quando il midollo osseo non funziona, quindi anche la nicchia vascolare ha un ruolo di **supportare il processo emopoietico** nel momento in cui il midollo osseo è in una situazione di non funzionamento. **RUOLO DELL'IPOSSIA** La nicchia vascolare quindi è costituita dall\'endotelio e questo meccanismo di regolazione da parte delle cellule endoteliali della nicchia vascolare su proliferazione, mobilizzazione e differenziazione della cellula staminale è mediato significativamente dall\'***ipossia***, perché è chiaro che le [zone intorno ai vasi sanguigni], quindi più irrorate nel midollo osseo, sono zone con **minor livello di ipossia**, cioè con **alti livelli di ossigeno**, mentre esiste un **gradiente** di ossigeno all\'interno del midollo osseo perché le [zone lontane dei vasi], quindi vicino alla nicchia osteoblastica, hanno **basso livello di ossigeno**. Gli altri livelli di ossigeno che sono presenti a livello delle zone perivascolari sono un segnale per la cellula staminale emopoietica per proliferare, mobilizzare e differenziare. Al contrario, i bassi livelli di ossigeno che noi abbiamo a contatto con la nicchia osteoblastica mantengono la cellula in **fase G0**, **non la fanno proliferare** e la mantengono in uno stato di quiescenza.  Il gradiente di ossigeno, basso ossigeno, mantiene la cellula staminale in quiescenza e attiva una serie di geni che hanno il ruolo di mantenimento della cellula staminale in quiescenza e self-renewal, e quindi la **mantengono viva** bloccando apoptosi. Al contrario, nella nicchia vascolare, con alti livelli di ossigeno si ha stimolazione di proliferazione, alti livelli di radicali liberi dell\'ossigeno, perdita della funzione di self renewal delle cellule staminali e invece attivazione del programma di tipo differenziativo; quindi il gradiente di ossigeno è importante nella **diversa funzionalità della nicchia** osteoblastica e della nicchia vascolare. Come funziona il gradiente d\'ossigeno? [alti livelli di ossigeno] portano alla **degradazione di HIF1alfa** attraverso idrossilazione e degradazione proteosomiale, al contrario i [bassi livelli di ossigeno] stabilizzano HIF1alfa che va nel nucleo insieme a HIF1beta, induce trascrizione e quindi abbiamo alti livelli di HIF1alfa, alti livelli di proteina e quindi over-espressione dei geni target dell\'ipossia.  Abbiamo anche dei *modelli preclinici* in vivo che hanno studiato l\' ipossia a livello midollare, uno è un metodo di **immunostaining** che si basa sul **metronidazolo** che compete l\'ossigeno e che quindi ci permette di dimostrare quello che è il gradiente di ossigeno; sicuramente il midollo anche in condizioni fisiologiche è un **organo ipossico** (i livelli di pressione parziale di ossigeno sono bassi) e i modelli murini sicuramente hanno livelli di ipossia maggiore, è un po\' più spinto come grado di ipossia rispetto a quello che avviene fisiologicamente nel midollo osseo umano; però sicuramente il midollo osseo è ipossico. Grazie a questi studi è stato visto il [modello e la distribuzione del gradiente di ipossia], dimostrando che nel modello classico la nicchia osteoblastica è tipicamente ipossica e la nicchia vascolare è tipicamente ad alti livelli di ossigeno. In realtà con questi modelli murini, studiando la distribuzione di ossigeno, si è visto che il modello è un pochino più complesso e ci sono alti livelli di pressione parziale di ossigeno a livello di zone ricche di arteriole anche a livello della zona endostale ossea e livelli più bassi di gradiente di ossigeno a livello di sinusoidi vicini alle cellule endoteliali. Quindi è un modello un più complesso del classico modello di gradiente di ossigeno, ma che comunque non cambia il concetto, cioè che nelle [zone di ipossia] la cellula staminale si mantiene in uno **stato indifferenziato**, **quiescente, di auto-mantenimento**; mentre nelle [zone di alto livello di ossigeno] (anche a livello endostale osseo dove ci sono arteriole) la cellula è in uno stato comunque **differenziativo proliferativo**. Anche questo modello contribuisce a un concetto di revisione della nicchia, che non sono due nicchie distinte anatomicamente, ma sono una **nicchia unica** in cui in alcune zone possiamo avere quindi la componente vascolare con alti livelli di ossigeno e in altre zone ci sono gli osteoblasti con bassi livelli di ossigeno, la nicchia è unica e abbiamo però queste doppie differenti funzioni.  Studi recenti hanno dimostrato [due ruoli fondamentali nella regolazione della cellula staminale] [emopoietica]: uno da delle *cellule peri-arteriolari* e *peri-vascolari* Nestina positive, le cellule perivascolari esprimono la nestina e producono chemochine come **SDF1, CXCL12, stem cell factor** e le cellule periarticolari **NG2+** e *cellule del sistema nervoso simpatico c*he sono presenti a livello della nicchia e che sono in grado anche esse di produrre chemochine (come il **CXCL12**, **interleuchine, TGFbeta**) e quindi in grado di svolgere anche una **funzione inibitoria** **sulla proliferazione** delle cellule staminali e **sul differenziamento** (perché il TGFbeta ha un effetto negativo di regolazione), CXCL12 è una chemochina che ha un ruolo fondamentale nella migrazione 'homing' delle cellule staminali. Queste nuove conoscenze hanno complicato ancora di più il quadro che era partito con solo due tipi cellulari, ossia osteoblasti e le cellule endoteliali, che sia arricchito anche di altri elementi che sono coinvolti nel mantenimento della cellula staminale in uno stato di quiescenza, l\'espansione della staminale e quindi l\'entrata in ciclo della cellula. Modello molto più complesso in cui [non ci sono distinzioni anatomiche] in cui all\'interno della nicchia sicuramente c\'è una zona dove abbiamo le osteoblastiche, ma poi abbiamo a livello arteriolare sinusoidale una serie di elementi cellulari in grado di regolare le funzioni di ciclo, quiescenza, rinnovamento delle cellule staminali emopoietiche.