Immunofluorescentie Les 3 PDF

**[Laboratoriumtechnieken: Immunologische laboratoriumtechnieken: Khadija Guerti: 1/10]** Slide 3 INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE - Voor opsporen auto-antistoffen Slide 4 - Immuunsysteem auto-immuun: afweer tegen eigen lichaam gaat meestal gepaard met auto-AL - Orgaanspecifieke auto-im...

**[Laboratoriumtechnieken: Immunologische laboratoriumtechnieken: Khadija Guerti: 1/10]** Slide 3 INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE - Voor opsporen auto-antistoffen Slide 4 - Immuunsysteem auto-immuun: afweer tegen eigen lichaam gaat meestal gepaard met auto-AL - Orgaanspecifieke auto-immuunziekten: 1 orgaan of weefsel betrokken - Niet-ograanspecifieke (systemische) auto-immuunziekten: volledige lichaam aangetast (lupus) - Auto-AL - Op verschillende niveaus belangrijke rol: - Diagnose - Inventarisatie: nagaan hoe ver ziekte gevorderd, hoeveel aangerichte schade - Behandeling - Follow-up - Prognostische waarde Slide 5 - Systemische lupus erythematosus (SLE) - BW ziekte BW verspreid over hele lichaam dus hele lichaam kan aangetast zijn - Naam afgeleid van latijn: Lupus= wolf, erythematosus = rood rode huiduitslag vlindervormig ter hoogte van aanzicht - Overgevoeligheid van licht - Aften in mond - Aantasting van bewegingsapparaat: zowel spieren als gewrichten kunnen aangetast zijn - Aantasting van nieren: EW in urine, bloed in urine - Aantasting hart - Aantasting longen - Syndroom van reinaud - Criteria om diagnose te helpen stellen - Afhankelijk van aantal en type criteria kan men indelen als waarschijnlijk Lupus,... Slide 6 - ANA's = anti nucleaire AL: belangrijk om Lupus te diagnosticeren Slide 7 - IIF om ANA's op te sporen - Oude techniek - In 1950 eerst beschreven: eerst Ag opsporen, 1957: AL en antinucleairen opsporen - HEB2 cellen = cellijn van humane epitheelcel tumor: ronde ovale kern, gelijk van uitzicht brengen veel Ag tot expressie in kern en cytoplasma dan kijken tegen welke Ag AL kunnen worden gevormd Slide 8 - Microscopieslides verdeeld in well - Op elke well een substraat gecoat om bepaalde stukken te binden - Substraat gefixeerd op glaasje (niet zelf in labo commercieel aangekocht) - Patiëntenserum verdunnen en afhankelijk van type antistoffen (ANA's 1:40, 1:80) - Op microscopieslides incuberen - Na incubatie: slides wassen -\> alle ongebonden materiaal weg - Conjugaat toevoegen: AL die humane AL gaan herkennen en waaraan fluorescerende stof aan gebonden - Incuberen conjugaat - Slides wassen om conjugaat weg te wassen - Dan coverslip - Dan onder microscoop fluorescentiemicroscoop detecteert fluorescentie indien gebonden Slide 9 - Tegenwoordig veel geautomatiseerd - Rekening houden met aantal factoren om juiste einresultaat te bekomen: - Gebruik juiste volume en juiste verdunningen - Respecteer incubatietijden (te lang= aspecifieke reacties) - Laat glaasjes niet uitdrogen (dan moeilijk aflezen) - Bewaar conjugaat in het donker (want als in licht gaat fluorescentie uitdoven) - Was glaasjes goed (om alle mogelijke aspecifieke reacties weg te wassen) - Voorkom carry-over tijdens het wassen (verschillende glaasjes in bak met welletjes dus zien dat geen materiaal overdracht) - Vermijd luchtbellen tijden afdekken van de glaasjes (luchtbellen zorgen voor moeilijk scherpstellen en dus bewaren) - Bewaar glaasjes in het donker (als bijhouden, of zeker tot aflezen) Slide 10 - Kritische variabelen: - AL van patiënt zelf belangrijke rol: hoe meer AL, hoe sterker de fluorescentie - Goed weten welk conjugaat om bepaalde AL op te sporen - Monogeen: IgG - Polygeen: Ag van de 3: IgG, IgA,... - Fixatiemateriaal - Testomstandigheden: controle temperatuur in ruimte, pH van buffers - Microscoop: type, objectief, gebruiksduur - Aflezer: tot nu toe door mensen: wel software beschikbaar, maar die zijn niet optimaal, waardoor altijd nog mensen om af te lezen dus ook wel variatie, veel opleiding om reproduceerbaar en correcte resultaten te interpreteren - Nomenclatuur (consensus ivm naamgeving om alle labo's dezelfde naamgeving te geven) Slide 11 - Hep2-cellen zijn cellen afkomstig van humane epitheelceltumor: mooie ronde ovale vorm - Celkern omgeven door kernmembraan - In celkern nucleoli - Kern omgeven door cytoplasma met daarin: - Mitochondriën verspreidt over hele cytoplasma vormend een netwerk - Ribosomen gehecht aan ER en verspreid over cyroplasma - Golgi apparaat aan 1 kant van celkern - Microtubuli - Centriolen - Cellen delen en doorlopen celcyclus - Cel niet in deling: interfase: - 2 groeifasen: G1 en G2 en S (DNA synthese) - Celdeling: mitose: - Bealnrgijk in beoordelen in aanwezigheid ANA's Slide 12 - Profase: chromatine verspreid over celkern, nog geen deling: onder microscoop - Metafase: chromatine rangschikken thv middellijn cel en daar condenseren - Onder fluorescentiemicroscoop te zien als platgedrukter - Anafase: chromatine naar polen en celdeling begint op gang te komen, maar chromatine heeft polen nog niet bereikt - Telofase: chromatine bereikt polen, maar nog niet gedeeld - Cytokinese: deling en uit 1 moedercel 2 dochtercellen - Rustende cellen in profase en in metafase heel belangrijk onder microscoop Slide 13 - 1 van de belangrijkst is opsporen van ANA - In celkern en cytoplasma veel Ag en daaraan kan AL tegen vormen bepaalde delen gaan fluorescentie vertonen - Patronen in verschillende labo's verschillende namen Slide 14 - ANA patronen (ook oranje vakjes identificeren in labo) - Negatief: niet fluoresceren - Nucleair: fluorescentie thv kern - Homogeen - Gestippeld -... - Cytoplasmatisch: fluorescentie thv cytoplasma - Fibrillair -... - Mitotisch: cellen in deling Slide 15 - Links: negatief - Midden: negatief of positief? Wel wat fluorescentie, maar te weinig dus toch negatief Slide 16 - Vooral weten welke patronen en dat fasen daarin een rol spelen en associatie antistoffen en ziektebeelden - Nucleaire patroon Slide 17 - Homogeen patroon: - Homogene, uniforme diffusie van hele celkern (interfase): weinig structuur - Cellen in metafase: intense, uniforme fluorescentie van chromatine - Antistoffen tegen dsDNA typisch bij SLE Slide 18 - Dens fijn gespikkeld - Gespikkelde fluorescentie van de kern van interfase cellen met karakteristieke heterogeniteit in grootte, helderheid, en verdeling spikkels - Grof gespikkelde fluorescentie van het chromatine in metafase cellen - Antilichamen tegen DFS-70 (70kDa EW) AL met goede prognose Slide 19 - Centromeer - Rits - AL tegen kinetochoor bij systemische sclerose of CREST Slide 20 - Fijn gespikkeld - Fluorescentie thv celkern in interfase, minder heterogeen - Chromatine thv metafase cellen fluoresceert niet - Nucleoli meestal ook zwart - AL tegen SS-A en SS-B (Sjögren syndroom (systemische auto-immuunziekte)= gekenmerkt door gewrichtsklachten en sycla klachten= droge ogen, droge mond) Slide 21 - Grof gespikkeld - Grof gespikkelde fluorescentie van kern - AL tegen RNP - Kan SLE, Sjögren syndroom of MCTD zijn Slide 22 - Nucleaire dots - Kernstippen - Afhankelijk van aantal: multipele of enkele - Doet denken aan auto-immune leverziekten (altijd GI richting lever denken als men dit ziet) Slide 23 - Nucleolair: ter hoogte van kernlichaampjes - Homogeen - Geblokt - Gespikkeld - Chromatine negatief - Antistoffen tegen Scl-70 en richting polymoyolitis (spierklachten op de voorgrond) Slide 24 - Kernmembraan: - Kan vergissen met homogene fluorescentie - Maar grote verschil: chromatine negatief in mitotische cellen - Als 2 cellen elkaar raken: intense aankleuring stukje celmembraan - Soms plooien in kernmembraan daardoor bovenop cel lijntjes Slide 25 - Cytoplasmatische patronen (niet altijd even klinisch relevant als nucleaire patronen) - Fibrillair - Draadjes: vimentine achtig, streepjes: actine-achtig - Antistoffen tegen GSC als dergelijk patroon gestreept verder testen voor GSC antistoffen typisch bij anti-immuun hepatitis - Gespikkeld - Onderste deel: gespikkelde - Jo-1 antistoffen of lysosomen kunnen ook zo een patroon geven die dingen verder testen - Reticulair/AMA - AL tegen mitochondriën - Mitochondriën verspreid over cytoplasma en vormen soort van netwerk - Anti-mitochondriale AL kunnen ook verder geïdentificeerd worden als hiermee geassocieerd: PBC - Golgi-achtig - Al tegen Golgi-apparaat: aan 1 kant celkern in cytoplasma - Patroon makkelijk herkenbaar - Niet vaak voorkomend - Klinisch minder relevant - Staafjes en ringen - Afwisseling ringen en staafjes ie fluroesceren in cytoplasma - Hangt af van leverancier cellijn afhankelijk van cellijn is het een patroon dat je kan oppikken - Geen klinische relevantie Slide 31 - Mitotische patronen in cellen in deling: - Meeste van patronen klinisch minder/niet relevant - Links: 2 stippen aan elke zijde celkern: AL tegen centriolen/centrosomen - Midden: spoeldraden die eruit komen: spoelfiguur of spindle - Rechts: fluorescentie thv plek waar cellen gaan scheiden: lijn tussen 2 cellen Slide 33 - ANA: antilichamen tegen nucleaire antigene (in celkern of celplasma verspreid over lichaam) - Dikwijls geassocieerd met systemische auto-immuunziekten - Meest bekende antistoffen tegen dsDNA die homogeen patroon veroorzaken, dat dan weer associeert met systemische lupus erythosis - ANCA: anti nutrofielen cytoplasmatische AL - AL tegen bestanddelen in azofiele granules in granulocyten - Vooral bij vasculitis - Kijken naar granulocyten - Op 2 manieren fixeren op glaasjes - Patronen herkennen - Cytoplasmatische ANCE (cANCA) - Tegen proteinase 3 - Pericnucleaire ANCA (pANCA) - Tegen MPO - Tegen elastase,... - Atypische ANCA (aANCA) - Geen AL tegen MPO, PR3 Slide 34 - Formaline fixatie of ethanol fixatie - Belangrijk om correcte classificatie ANCAs te doen - Ethanol: Ag migreren vanuit azidofiele granules daardoor in cytoplasma en afhankelijk van lading kunnen migreren - Sterke kationen migreren tot rond celkern: MPO - Zwakke kationen migreren weg van celkern: PR3 (ter plekke blijven liggen) - Dus in ethanol fixatie: als tegen MPO: rond celkern (perinucleair) als AL tegen PR3: cytoplasmatische fluorescentie - AL gericht tegen ANAs zijn ook gericht tegen celkernen van granulocyten gaan beeld gelijkend op perinucleaire fluorescentie, maar ANAs zijn geen ANCA's, dus in formaline fixatie zal geen fluorescentie aanwezig zijn - Formaline fixatie: granules intact: Ag in granules en op plaats waar normaal gezien: dus verspreid in cytoplasma en elke ANCA zal altijd cytoplasmatisch patroon veroorzaken in formaline fixatie Slide 35 - Rapporteren ANCA deed iedereen lang op zijn eigen manier nu gevraagd om in 4 klassen te rapporteren verwezen naar consensus statement - cANCA: in ethanolfixatie: cytoplasmatische fluorescentie - pANCA: in ethanolfixatie perinucleaire fluoresecentie - cANCA atypical: alles cytoplasmatische fluorescentie die niet typisch is - atypische ANCA: al de rest Slide 36 - zowel ethanol als formaline: granulaire fluorescentie - ethanol: cytoplasmatische fluorescentie: cANCA: AL tegen PR3 Slide 37 - fluorescentie thv kernrand: perinucleaire fluorescentie thv granulocyt - formalinefixatie fluoresceert ook in cytoplasma Slide 38 - Atypische ANCA - Formalinefixatie negatief - Kan ook door AL tegen celkern (ANA) daarom in hun labo ook mee Hep2 cellen om te kijken of ANA's aanwezig Slide 40 - ANA: celkern fluoresceert ipv rond celkern maar als dan Hep2 cellen: duidelijke fluorescentie thv celkern dus dan weet je zeker dat ANA is, maar dan in andere celsoort OP EXAMEN: NIET ECHT HIER EEN PATROON EN ZEG WELKE HET IS, WANT IS VOOR ECHTE KENNERS VOORAL BELANGRIJK TECHNIEK OP ZICH ANCA'S, WAAROM FORMALINE EN ETHANOL, WAAROM 2 FIXATIES Slide 41 ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay - Plaat gebaseerde techniek voor detectie en kwantificatie van peptiden, EW, AL en hormonen - Basiselementen - Coating/capturing - Plate blocking: niet gebruikte bindinsplaatsen blokkeren, ander aspecifieke reacties - Probing/detection - Signal measurement: detecteren signaal en omrekenen eventueel naar kwantitatief resultaat ahv callibratiecurve Slide 43 - Enzyme aan AL enzyme zet substraat om in gekleurd product kijken of al dan niet reactie - Directe binding Ag gedecteerd door primair AL = conjugaat hieraan enzym aan gekoppeld dan substraat aan gekoppeld dat wordt omgezet in kleur - Indirect: Ag detecteren met primair AL, maar niet gelabeld primair AL wordt herkend door secundair AL aan 1 primair AL kunnen verschillende secundaire AL binden waardoor signaal versterkt worden enzym gebonden aan secundair AL en dan substraat zal worden omgezet in kleur - Sandwich ELISAs: capture AL: gecoat op plaat en zorgt voor specifiekere binding Ag op plaat: specificiteit verbeteren van test - Tegelijkertijd een indirecte detectie met gebruik van primair en secundair AL dat gevoeligheid verbeterd (=indirecte assay) Slide 44 - Verschil tussen directe binding Ag op plaat en indirecte binding - Naast Ag bij direct: ook nog ander materiaal bindt op plaat - Bij inidrect: enkel Ag bindt op plaat = betere specificiteit Slide 45 - Bij directe detectie: primair AL toevoegen herkend gebonden Ag draagt label met zich mee (meestal enzym) primair AL bindt 1 op 1 met Ag wasstappen substraat toevoegen substraat reageert met enzym en substraat omgezet in gekleurd product µ Slide 46 - Indirecte detectie: Ag via capture AL gebonden op plaat primair AL toevoegen: herkent 1 op 1 Ag primair AL geen label dan secundair AL toevoegen wel gelabeld met enzym gaat primair AL herkennen per primair AL kan meer dan 1 AL binden dus per Ag meerdere labels als dan substraat toevoegen: versterking van signaal = gevoeligere test Slide 47 - Voordelen en Nadelen directe ELISA - Voordelen: - Sneller, want enkel 1 AL - Geen kruisreactiviteit van secundaire AL (met capture AL) - Nadelen: - Verlies van immuno-activiteit - Primair AL moet gelabeld worden elk afzonderlijk primair AL moet gelabeld worden = arbeidsintensief en duur (secundaire AL herkennen bepaalde stukken; hier per test specifiek AL nodig om specifiek Ag te detecteren) - Beperkt aantal geconjugeerde primaire AL - Geen flexibiliteit in keuze van primaire AL commercieel beschikbaar - Geen signaal amplificatie Slide 48 - Voordelen en Nadelen indirecte ELISA detectie - Voordelen: - Grote variëteit in gelabelde secundaire AL - Versatiel omdat veel primaire AL kunnen worden gemaakt in 1 specie en hetzelfde gelabeld secundaire AL kan worden gebruikt voor detectie - Maximale immunoreactiviteit van 1° AL is weerhouden, omdat niet gelabeld - Sensitivitieit is verhoogd omdat elk primair AL verschillende epitopen bevat die kunnen worden herkend door 2° AL amplificatie mogelijk - Verschillende detectiemethoden kunnen worden gebruikt met hetzelfde 1° AL - Nadelen: Slide 50 - Competitieve ELISA - Ag uit patiëntenstaal toevoegen aan plaat met capturing AL, maar ook zelfde Ag toevoegen met label aan Ag gaan binden op AL op plaat gelabelde Ag gaan ook proberen binden (=competitie) op AL uiteindelijk binding van gedeeltelijk Ag patiënt en Ag met label hoe meer Ag patiënt heeft, hoe meer door patiënt en omgekeerd - Hoge concentratie Ag in patiëntenstaal veel ongelabeld materiaal bindt = zwakke reactie - Als lage concentratie Ag in patiëntenstaal veel gelabeld materiaal bindt = hoge reactie Slide 51 - Detectiemethoden; - Chromogene substraten (meest gebruikt!): substraten worden door enzym in gekleurde substantie omgezet en dan met standaard spectrofotometer om te detecteren overal beschikbaar + visueel zichtbaar = extra controle op eindresultaat - Fluorescerende substraten: zelfde principe, maar fluorescentie meten lmet fluorometer en dit is niet standaard beschikbaar in elk labo dus niet standaard toegepast - Chemiluminescentie: speciale reader nodig, dus ook in praktijk niet te veel toegepast Slide 52 ELEKTROFORESE - = migratie van geladen deeltjes in een elektrisch veld - Toepassing: - Scheiding van EW in serum, urine, lumbaal vocht - Scheiden van iso-enzymen -... Slide 53 - Determinanten (niet kennen) maar dragen bij tot eigenlijke scheiding - Technieken Slide 54 - Capillaire zone elektroforese = scheiden van EW in buisjes smalle diameter en hoog voltage: snelle en efficiënte scheiding EW EW detectie (UV) op 200nm Slide 55 - EFM van EW - Negatief geladen deeltjes bewegen naar anode (+) - Migratie afhankelijk van lading, grootte en viscositeit medium - EOF van buffer - Bewegen van buffer naar kathode (-) - Snelheid afhankelijk van pH, lading, viscositeit,... - EOF \> EFM - Altijd netto-flow richting kathode en negatief geladen deeltjes die normaal richting anode zouden worden getrokken (=negatieve deeltjes) toch ook naar kathode, maar veel trager dan positieve lading Slide 56 - Overlopen, duidelijke figuur Slide 58 - Interpretatie - Oorsprong van EW - Synthese in de lever - Synthese in de lymfoïde organen - Functie van EW - Leeftijd van patiënt - Gebruikte methode/densitometer - Interferenties/artefacten Slide 59 - 5 fracties onderscheiden naast de grote albumine Slide 60 - Totaal eiwit - Hyperproteïnemie - Overwegend hypergammaglobulinemie - Polyklonaal of monoklonaal - Auto-immuunziekten, chronische inflammatie,... - Hypoproteïnemie - Overwegend hypoalbuminemie - Leverpathologie, malnutritie, nierpathologie - Normoproteïnemie - Normaal - Pathologisch Slide 61 - Albumine - Synthese: lever, functie: transportmolecule - Hyperalbuminemie: bij patiënten die albumine krijgen toegediend Slide 62 - Alfa1-antitrypsine Slide 63 - Alfa2-macroglobuline - Verhoogt bij ontsteking of inflammatie - Haptoglobine - Transportmolecule voor Hemoglobine dus als RBC in vivo kapot laag haptoglobine Slide 64 - Beta-1 fractie - Transferrine - M-proteïne Slide 65 - Beta-2 fractie - C3 - Rol in afweer - Verhoogd bij inflammatie - M-proteïne Slide 66 - Gammafractie - Hypergammaglobulinemie - Polyklonaal - Monoklonaal - Hypogammaglobulinemie - Pasgeborenen hebben weinig immunoglobuline, nefrotisch syndroom: verlies via nieren Slide 67 - Toename in alfa 1 en 2 fractie: positieve acute fase EW nemen toe bij inflammatie: beeld van acute inflammatie Slide 68 - Daling albumine fractie: negatief EW, maar reageert niet snel, dus enkel bij chronisch, ook hoge alfa 1 en -2 Slide 69 - Als lever niet goed functioneert: verminderde aanmaak: albumine, alfa 1en -2, transferrine, maar EW thv lymfoïde organen zullen in verhouding toegenomen lijken, want daar geen probleem, gamma-fractie typisch verhoogd - Dal dat normaal gezien wordt tussen beta2 en gamma niet aanwezig: beta2 rechtstreeks overlopen in gamma = betagamma-brug Slide 70 - Nefrotisch syndroom - Via nieren veel verloren-\> EW via urine verloren - Albumine daalt: te weinig albumine in bloedvaten om vocht daar te houden en vocht lekt naar interstitiële ruimte oedemen: vochtophopingen - Lichaam probeert oncotrische druk in stand te houden daardoor verhoogd alfa2 macroglobuline = groot EW dat niet door nieren lekt zo proberen door verhoogde aanmaak wel oncotische druk in stand te houden - Alfa2 fractie gaat dus enorm hoog zijn (meestal ook smalle fracties) - Dus kenmerk: laag albumine en hoog alfa 2 fractie Slide 71 - Gamma fractie kan polyklonaal verhoogd zijn, meestal op respons op infectie of inflammatie egaal, klokvormig betekent meestal niet zo veel, vaak voorbijgaand Slide 72 - Gamma fractie kan oligoklonaal zijn oligoklonale productie als respons op infectie Slide 73 - Monoklonale piek in de gammafractie: 1 zelfde immunoglobuline aangemaakt = grote piek Slide 74 - Identificeren van piek door immuunfixatie = elektroforese, op verschillende laantjes, elk laantje incuberen met AL tegen bepaald Ig als monoklonaal EW, heel sterke band ter hoogte van een van de zware ketens en meestal ook 1 van de lichte ketens - In geval van oligoklonaal patroon, alles, en zwakker in intensiteit (zie slide 75-76) Slide 77 - Extra piek in beta2 fractie veroorzaakt door jodiumhoudend contrast: interferentie (niet verwarren met monoklonaal EW) STUK URINAIRE EW NIET KENNEN!! EXAMEN