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Techniques d’immunofluorescence et dérivées MASTER II IQ Bio UE 2: Techniques d’Analyse, de caractérisation et de contrôle 26/11/2024 Hung LE  Contact [email protected] Hung LE, Phar...

Techniques d’immunofluorescence et dérivées MASTER II IQ Bio UE 2: Techniques d’Analyse, de caractérisation et de contrôle 26/11/2024 Hung LE  Contact [email protected] Hung LE, PharmD, PhD Ingénieur de Recherche Équipe Biofilms, Résistance, Interactions Cellules-Surfaces (BRICS), Laboratoire Polymères, Biopolymères, Surface (PBS), UMR 6270 CNRS Plateforme Protéomique PISSARO Imagerie par Spectrométrie de Masse Image illustrant des cellules bactériennes de P. aeruginosa (en vert) en train d'être phagocytées par des macrophages murin Processus de travail de l'imagerie par immunofluorescence L'immunofluorescence est une technique de laboratoire qui utilise des anticorps marqués par des fluorochromes (molécules fluorescentes) pour détecter des antigènes spécifiques (protéines, lipides, etc.) dans des cellules ou des tissus. Semba et al. analysis by current multiplexed imaging technologies for the molecular characterisation of cancer tissues. Br J Cancer (2024) Plan du cours: Techniques d’immunofluorescence et dérivées Introduction générale Structure des anticorps Anticorps Applications des anticorps Production d’anticorps Détection des Marquage des anticorps par les fluorochromes anticorps Amplification du signal en immunofluorescence Imagerie avec des Fonctionnement et structure de la GFP Protéines GFP et ses variantes Fluorescentes Applications des GFP en recherche et biotechnologie  Anticorps Qu’est-ce qu’un anticorps, un antigène? Quels est la structure des anticorps ? Quels sont les principaux rôles des anticorps ? Quels sont les usages actuels des anticorps en recherche biomédicale ou en thérapeutique ?  Anticorps Un anticorps ou une immunoglobuline (Ig) Un complexe protéique produit par le système immunitaire dans un organisme vivant pour détecter et neutraliser de manière spécifique les agents pathogènes ou les substances étrangères (antigènes)  Anticorps Un anticorps ou une immunoglobuline (Ig) Un complexe protéique produit par le système immunitaire dans un organisme vivant pour détecter et neutraliser de manière spécifique les agents pathogènes ou les substances étrangères (antigènes) ~ 150 Kda de taille L'anticorp est-elle de grande taille ?  Comparaison des tailles des biomolécules L'anticorp est-elle de grande taille ? https://book.bionumbers.org/ Negative-staining images and single-particle three-dimensional (3D) reconstructions of IgG1 antibody, The scale bar was 100 Å Zhang et al. 3D Structural Fluctuation of IgG1 Antibody Revealed by Individual Particle Electron Tomography. Sci Rep 5, 9803 (2015)  Combien d'anticorps pour couvrir le diamètre d'un cheveu ? Diamètre : 100 µm un cheveu un anticorps Taux moyen de croissance des cheveux : 0,4 mm par jour Quand le cheveu unique révèle une habitude de consommation (L’analyse par MALDI-MS/MS démontre une consommation de cocaïne sur les quatre mois précédant la collecte) Kernalléguen, Angéline, et al.Toxicologie Analytique Et Clinique 32.2 (2020): 97-105. Réponse immunitaire à la vaccination (antigens) et acquisition de l’immunité Système immunitaire inné Système immunitaire adaptatif Montero et al. (2024). Frontiers in public health, 11, 1326154 Qui produit des anticorps? Les anticorps sont exclusivement synthétisés par les lymphocytes B Lymphocytes B naïfs: les Lymphocytes B pas encore rencontré leur antigène spécifique Plasmocytes : La sécrétion des anticorps (Courte durée de vie) Lymphocytes B mémoire : l'immunité à long terme Moelle osseuse Rate, Ganglions lymphatiques Activation Différenciation Fatemeh Khani-Habibabadi, Kevin C. O’Connor, in Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology, 2024  Chronologie de la production d'anticorps après la vaccination Montero et al. (2024). Frontiers in public health, 11, 1326154 Rôle des anticorps 1. Reconnaissance des antigènes : Les anticorps se lient spécifiquement à un antigene grâce à leur structure unique Cette reconnaissance permet de marquer les agents pathogènes comme cibles pour d’autres cellules immunitaires 2. Neutralisation des antigènes : En se liant aux antigenes, les anticorps empêchent les agents pathogènes d’infecter les cellules du corps. Ils activent également d’autres mécanismes de défense, comme la phagocytose (destruction des agents pathogènes par les macrophages) ou le système du complément Mécanismes de neutralisation d'un virus par des anticorps Les anticorps peuvent neutraliser le virus en le rendant moins infectieux, soit en empêchant sa dispersion, soit en agglutinant plusieurs virus ensemble, facilitant ainsi leur élimination par les cellules du système immunitaire. Immobilisation du virus Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023)  Mécanismes de neutralisation d'un virus par des anticorps Les anticorps se fixent sur les protéines virales qui permettent au virus de pénétrer dans les cellules hôtes, bloquant ainsi l'attachement et l'entrée du virus dans la cellule. Blocage de l'entrée du virus dans les cellules Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023)  Mécanismes de neutralisation d'un virus par des anticorps Inhibition de la réplication virale Les anticorps inhibent la libération du virus dans le cytoplasme en empêchant les clivages ou la liaison aux récepteurs dans les endosomes. Les anticorps provoquent l’agrégation des virions produits à la surface des cellules infectées, bloquant leur dissémination. Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023) Mécanismes de neutralisation d'un virus par des anticorps Inhibition de la réplication virale Blocage de Immobilisation du virus l'entrée du virus dans les cellules Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023) Activités antivirales des anticorps neutralisants médiées par les fonctions effectrices dépendantes du Fc Les anticorps liés au virus déclenchent l'activation de la cascade du complément. Cela conduit à la formation du complexe d'attaque membranaire, qui perfore l'enveloppe virale et entraîne la destruction directe du virion. Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023) Activités antivirales des anticorps neutralisants médiées par les fonctions effectrices dépendantes du Fc En présence de cellules effectrices portant des récepteurs Fc, les virions recouverts des anticorps peuvent être être capturés par des cellules effectrices comme les macrophages via un mécanisme de phagocytose dépendante des anticorps. Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023)  Activités antivirales des anticorps neutralisants médiées par les fonctions effectrices dépendantes du Fc Les cellules infectées par le virus, recouvertes des anticorps, deviennent vulnérables à l’élimination par des cellules effectrices comme les cellules NK. Ce mécanisme repose sur l’interaction entre les récepteurs FcR et les anticorps, déclenchant une cytotoxicité dépendante des anticorps. Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023) Activités antivirales des anticorps neutralisants médiées par les fonctions effectrices dépendantes du Fc Burton, D.R. Antiviral neutralizing antibodies: from in vitro to in vivo activity. Nat Rev Immunol 23, 720–734 (2023) Structure des anticorps Site de reconnaissance de l’antigène ou PARATOPE Domain variable (V) Domaine Ponts disulfures constante (C)  Structure des anticorps Site de reconnaissance de l’antigène ou PARATOPE  4 chaînes polypeptidiques 2 chaînes lourdes (H, heavy): 440-550 aa, 50 kDa 2 chaînes légères (L, light): 220 aa, 25 kDa Ces chaînes sont reliées par des ponts disulfure, formant ainsi une structure en forme de "Y". Ponts disulfures  Structure des anticorps Site de reconnaissance de l’antigène ou PARATOPE  4 chaînes polypeptidiques 2 chaînes lourdes (H, heavy): 440-550 aa, 50 kDa 2 chaînes légères (L, light): 220 aa, 25 kDa Ces chaînes sont reliées par des ponts disulfure, formant ainsi une structure en forme de "Y". Ponts disulfures  3 fragments Deux fragments Fab (fragment antigen binding ) Un fragment Fc (Fragment cristallisable ) Fab Fc Fab  Structure des anticorps Site de reconnaissance de l’antigène ou PARATOPE  4 chaînes polypeptidiques Domain variable 2 chaînes lourdes (H, heavy): 440-550 aa, 50 kDa (V) 2 chaînes légères (L, light): 220 aa, 25 kDa Ces chaînes sont reliées par des ponts disulfure, formant ainsi Domaine une structure en forme de "Y". Ponts disulfures constante (C)  3 fragments Deux fragments Fab (fragment antigen binding ) Un fragment Fc (Fragment cristallisable )  2 domaines (régions) Domaine constante (C) Domaine variales (V)  Structure des anticorps Domain  4 chaînes polypeptidiques variable 2 chaînes lourdes (H, heavy): 440-550 aa, 50 kDa (V) 2 chaînes légères (L, light): 220 aa, 25 kDa Ces chaînes sont reliées par des ponts disulfure, formant ainsi une structure en forme de "Y". Domaine constante  3 fragments (C) Deux fragments Fab (fragment antigen binding ) Un fragment Fc (Fragment cristallisable )  2 domaines (régions) Domaine constante (C) Domaine variales (V) Domaines des anticorps Site de reconnaissance de l’antigène ou PARATOPE Domaine variales (V) : situés aux extrémités des 2 « bras ». Domain L'association entre un domaine variable porté par une chaîne variable lourde (VH) et le domaine variable adjacent porté par une chaîne (V) légère (VL) constitue le site de reconnaissance (ou paratope) de l'antigène. Domaine constante (C): caractérisés par une séquence en acides Domaine constante aminés très proche d'un anticorps à l'autre. (C) Chaque chaîne légère en possède un exemplaire noté CL. Les chaînes lourdes comportent, selon l'isotype, 3 ou 4 domaines constants CH1, CH2, CH3, (CH4). Activation du système du complément, Elimination des complexes immuns (anticorps liés à leur antigène) par les cellules immunitaires (via le récepteur Fc).  Classes d’Ig ou Isotypes 5 classes ou « isotypes », selon la structure des domaines constants des chaînes lourdes: gamma (γ), alpha (α), mu (μ), delta (δ), ou epsilon (Ԑ) correspondent respectivement aux immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. 2 isotypes de chaînes légères: κ (kappa) ou λ (lambda). Des sous-classes d'immunoglobulines (des variations plus spécifiques dans les chaînes lourdes) Ex.: l'humain possède quatre sous-classes d'IgG et deux sous-classes d'IgA.  IgG Immunoglobuline majoritaire dans le sérum (70 à 75% des Ig totales) Le principal isotype produit lors de la réponse immunitaire secondaire (Sécrétées après les IgM) Les IgG constituent la partie majeure des anticorps antibactériens et antiviraux. Les IgG constituent le principal arsenal de neutralisation des toxines bactériennes et de fixation des microorganismes favorisant ainsi leur phagocytose. Comporte quatre sous classes: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Les Ig totales représentent environ 10 à 20 % des protéines sériques (6 et 16 g/L).  IgM Forme pentamérique (agglutination+++), premières Ig sécrétées lors d’une réponse immunitaire Très efficace dans l’agglutination des antigènes. Plus efficace que les IgG dans l’activation du complément. L’apparition d’IgM contre un agent infectieux chez un nouveau-né signe une infection néonatale. Contrairement aux IgG, qui sont transférées de la mère au fœtus via le placenta, les IgM ne traversent pas la barrière placentaire. Leur présence chez le nouveau-né indique donc une production endogène de ces anticorps, souvent en réponse à une infection.  IgA  Sérum: 15% des Ig  Mais surtout importante par sa présence dans les sécrétions (digestives, respiratoires, génito-urinaires, colostrum, larmes).  Les IgA sécrétoires (IgAs) sont polymèriques: 2 IgA + chaîne J+ pièce sécrétoire.  Rôle fondamental dans l’immunité muqueuse  IgE Faiblement présente dans le sérum, IgE est fortement cytophile et se trouve principalement fixée sur les mastocytes et les basophiles. IgE joue un rôle dans l’immunité antiparasitaire grâce à la fixation aux récepteurs exprimés sur les polynucléaires éosinophiles IgE joue un rôle important dans l’hypersensibilité immédiate (allergie) en induisant la dégranulation des mastocytes et des basophiles auxquels elle se fixe (médiateurs inflammatoires libérés)  IgD Très faible concentration sérique (Moins de 1% des Ig sériques) Possède une longue région charnière qui la rend très sensible à la protéolyse. Fonctions biologiques mal connues. Applications des anticorps Western blot Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage cellulaire et tissulaire Thérapie par anticorps Vaccination, Single chain variable fragments (scFvs), Antibody- Drug Conjugates (ADCs) https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/ Applications des anticorps Le Western blot est une méthode permettant de détecter des protéines spécifiques au sein d'un échantillon complexe. Cette technique repose sur la séparation des protéines par électrophorèse, Western blot leur transfert sur une membrane, puis l'utilisation d'anticorps spécifiques pour identifier la protéine Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) d'intérêt. Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage cellulaire et tissulaire Thérapie par anticorps Vaccination, Single chain variable fragments (scFvs), Antibody- Drug Conjugates (ADCs) https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/ Applications des anticorps Western blot Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage cellulaire et tissulaire Thérapie par anticorps ELISA est une technique pour détecter et quantifier des molécules spécifiques (des protéines, des Vaccination, Single chain variable fragments (scFvs), Antibody- peptides, des anticorps ou des antigènes) dans un Drug Conjugates (ADCs) échantillon biologique. Elle repose sur l'utilisation d'anticorps ou d'antigènes couplés à une enzyme, qui, une fois activée, produit un signal mesurable https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/ Applications des anticorps Western blot Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage cellulaire et tissulaire Thérapie par anticorps Vaccination, Single chain variable fragments (scFvs), Antibody- Drug Conjugates (ADCs) https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/ L'immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour isoler et purifier (enrichir) une protéine d'intérêt à partir d'un mélange complexe, en exploitant l'affinité entre un anticorps spécifique et sa cible (antigène). Cette méthode repose sur l'utilisation de billes magnétiques (ou de l'agarose) recouvertes d'anticorps spécifiques qui se lient à la protéine cible, permettant ainsi sa séparation du reste du contenu cellulaire ou du lysat. https://www.aatbio.com/ Applications des anticorps Western blot Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage Une techniquecellulaire et tissulaire d'analyse et de tri de cellules ou de particules par Thérapie individuelles anticorps sur la base de leurs propriétés physiques et chimiques Vaccination, (la taille, Single chain la structure variable fragmentsdes cellules, (scFvs), la Antibody- granularité). Cette méthode Drug Conjugates (ADCs) consiste à mettre les cellules en suspension dans un flux de liquide et à les faire passer à travers un faisceau laser. https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/ Applications des anticorps Western blot Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage cellulaire et tissulaire Thérapie par anticorps L'immunisation passive , Antibody-Drug Conjugates (ADCs) https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/ Applications des anticorps Western blot Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunoprécipitation (Isoler et purifier des protéines) Cytométrie en flux Marquage cellulaire et tissulaire Thérapie par anticorps L'immunisation passive , Antibody-Drug Conjugates (ADCs) https://www.labtestsguide.com/ https://www.creativebiomart.net/  Les fonctions effectrices dépendantes de l'Fc des anticorps contribuent à la protection contre l'infection par le SARS-CoV-2 L'immunisation passive implique le transfert des anticorps préformés, afin de fournir une protection temporaire immédiate contre l'infection ou de réduire la sévérité de la maladie causée par l'agent infectieux Zhang et al. Beyond neutralization: Fc-dependent antibody effector functions in SARS-CoV-2 infection. Nat Rev Immunol 23, 381–396 (2023)  Les anticorps monospecifiques se lient aux antigènes présents sur les cellules cancéreuses, induisant leur mort par divers mécanismes: la perturbation des signaux de survie provenant des récepteurs de facteurs de croissance (HER2), l'activation des cellules immunitaires (cellules tueuses naturelles (NK) via la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) et la phagocytose cellulaire Thérapie par anticorps dépendante des anticorps (ADCP) par les macrophages), l'activation de la cascade du complément (cytotoxicité dépendante du complément (CDC)). Les anticorps bloquant les points de contrôle immunitaires se lient et activent des cellules immunitaires telles que les cellules T, entraînant la mort des cellules cancéreuses médiée par le système immunitaire. Paul et al. Cancer therapy with antibodies. Nat Rev Cancer 24, 399–426 (2024)  Les anticorps bispecifiques se lient à deux antigènes différents. La plupart des anticorps bispecifiques sont conçus pour lier les cellules T et les cellules cancéreuses, et rediriger les cellules T pour tuer les cellules cancéreuses. Thérapie par anticorps Les anticorps bispecifiques non engageurs de cellules T se lient à deux antigènes distincts sur la surface des cellules cancéreuses, entraînant une élimination directe des cellules cancéreuses Paul et al. Cancer therapy with antibodies. Nat Rev Cancer 24, 399–426 (2024) Thérapie par anticorps Paul et al. Cancer therapy with antibodies. Nat Rev Cancer 24, 399–426 (2024)  Dumontet et al. Antibody–drug conjugates come of age in oncology. Nat Rev Drug Discov 22, 641–661 (2023). Thérapie par anticorps Pipeline de conception de vaccins Peripheral blood mononuclear cell Cellules mononucléaires du sang périphérique: Lymphocytes (cellules T, cellules B, cellules NK) et de monocytes Comment sélectionner les antigènes cibles capables d'induire une réponse immunitaire robuste et protectrice (immunogénicité)? La vaccinologie inversée Identifier l'antigène et analyser la structure tridimensionnelle du complexe antigèn-anticorps monoclonal Penn State College of Medicine scientists engineered immunogens using areas of SARS-CoV-2’s spike protein that are less susceptible to mutations. These immunogens could someday be used as vaccine candidates in clinical trials. Pantaleo et al. Antibodies to combat viral infections: development Image credit: Penn State College of Medicine / Penn State (CC BY-NC-ND 4.0) strategies and progress. Nat Rev Drug Discov 21, 676–696 (2022)  Production d’anticorps Deux stratégies: Comment obtenir des Campagne d’immunisation sur animaux = anticorps polyclonaux anticorps à volonté? Faire des anticorps par un seul plasmocyte = anticorps monoclonaux  Différence entre anticorps polyclonal et anticorps monoclonal Anticorps monoclonaux : un type unique d'anticorps qui reconnaît un épitope précis d'un antigène. Anticorps polyclonaux : un mélange d'anticorps qui reconnaissent différents épitopes d'un même antigène. https://www.biosynth.com/ Campagne d’immunisation pour obtenir des anticorps polyclonaux 1. Immunisation 2. Collecte du serum 3. Purification par affinité antigénique https://www.rapidnovor.com/  Campagne d’immunisation pour obtenir des anticorps polyclonaux Préparation de l’antigène: nature, qualité, adjuvant (↗ réponse immunitaire) Les antigènes peuvent varier selon leur origine et leur complexité biologique Virus animal Sélection de l’hôte inactivés: ou atténués Lapins (réponse immunitaire robuste), Chèvres (volume élevé de Bactéries sérum),inactivées Pouletsou(procédure atténuées non-invasive, anticorps dans les Polysaccharides, Protéines œufs : IgY), Moutons ou porcs (grande quantité entièresde sérum ou sous-unités, Toxines et forte similitude avec le systèmeinactivées immunitaire (anatoxines) humain) Pour garantir une réponse immunitaire optimale et sécurisée : La pureté (absence d’endotoxines, de protéines étrangères ou d’autres contaminants), Immunisation : Voie d’administration la fonctionnalité et les structures (Injection sous-cutanée, antigéniques (la conformation des intramusculaire protéines ou et intradermique, des modifications intrapéritonéale), Injections post-traductionnelles), de rappel la concentration (boosters) précise, la stabilité « Induire une réponse immunitaire spécifique et durable sans provoquer Collecte du serum : Premier prélèvement (pour vérifier la réponse) et d'effets indésirables» collecte finale Purification par affinité antigénique : Chromatographie par affinité  Adjuvants pour renforcer l’immunogénicité Signaux de danger La réponse immunitaire suite à l’immunisation avec un Les adjuvants renforcent l’immunogénicité des vaccins antigène associé à un adjuvant Pollard et al. A guide to vaccinology: from basic principles to Zhao et al. Vaccine adjuvants: mechanisms and platforms. Sig Transduct new developments. Nat Rev Immunol 21, 83–100 (2021) Target Ther 8, 283 (2023). Immunogénicité: la capacité qu'a un antigène de provoquer une réponse immunitaire  Exemples d'adjuvants pour stimuler l'immunogénicité Nom de l'adjuvant Composition Mécanisme d'action Libération retardée de Adjuvant incomplet de Huile en émulsion dans l'antigène ; capture Freund l'eau facilitée par les macrophages. Libération retardée de l'antigène ; capture Huile en émulsion dans Adjuvant complet de facilitée par les l'eau avec Freund macrophages ; mycobactéries tuées induction de la costimulation. Libération retardée de Alun (alun l'antigène ; capture Gel d'alun d'ammonium d'ammonium) facilitée par les macrophages. Immunogénicité: la capacité qu'a un antigène de provoquer une réponse immunitaire  Campagne d’immunisation pour obtenir des anticorps polyclonaux Préparation de l’antigène: nature, qualité, adjuvant (↗ réponse immunitaire) Sélection de l’hôte animal : Lapins (réponse immunitaire robuste), Chèvres (volume élevé de sérum), Poulets (procédure non-invasive, anticorps dans les œufs : IgY), Moutons ou porcs (grande quantité de sérum et forte similitude avec le système immunitaire humain) Immunisation : Voie d’administration (Injection sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale), Injections de rappel (boosters) Collecte du serum : Premier prélèvement (pour vérifier la réponse) et collecte finale Purification par affinité antigénique : Chromatographie par affinité Les injections de rappel (boosters) permettent de renforcer la réponse immunitaire de l'animal hôte et d'augmenter la concentration d'anticorps spécifiques dans le sérum. Rappel de la réaction immunitaire  Campagne d’immunisation pour obtenir des anticorps polyclonaux Préparation de l’antigène: nature, qualité, adjuvant (↗ réponse immunitaire) Sélection de l’hôte animal : Lapins (réponse immunitaire robuste), Chèvres (volume élevé de sérum), Poulets (procédure non-invasive, anticorps dans les œufs : IgY), Moutons ou porcs (grande quantité de sérum et forte similitude avec le système immunitaire humain) Immunisation : Voie d’administration (Injection sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale), Injections de rappel (boosters) Collecte du serum : Premier prélèvement (pour vérifier la réponse) et collecte finale Purification par affinité antigénique : Chromatographie par affinité  Protocole d’immunisation Quantité sérum Espèce animal récupéré (moyenne) Chèvre 80 à 150 mL Cobaye 1 à 2 mL Poule 35 à 40 mL Rat 1,5 à 2 mL Souris 250 à 500 µL La dose d'antigène utilisée pour les rappels est Laboratoire AgroBio; groupe Stago généralement inférieure à celle de l'injection initiale. Les rappels sont souvent effectués sans adjuvant afin de minimiser l'inflammation excessive.  Purification des anticorps - Chromatographie d’affinité La purification d'affinité permet d'isoler soit des anticorps d'intérêt à partir de l'antigène qui a servit à l'immunisation Elle peut permettre de purifier des antigènes d'intérêt à partir d'anticorps. Les molécules servant de ligand sont fixées sur un support activable par des fonctions chimiques. Purification des anticorps 1. Immobilisation de l’antigène : L’antigène est fixé sur une matrice solide, telle qu’une résine d’agarose. 2. Capture des anticorps spécifiques : L’échantillon est introduit dans la colonne contenant l’antigène immobilisé. Les anticorps spécifiques se lient à l’antigène, tandis que les protéines non spécifiques sont éliminées lors du flux d’élution et des étapes de lavage. 3. Récupération des anticorps spécifiques : Les anticorps liés sont détachés en utilisant un tampon d’élution (tampon acide ou basique pour dissocier les interactions antigène-anticorps). https://www.mybiosource.com/  Avantages: Le prix est bon marché et la production est relativement rapide. En raison de la reconnaissance de plusieurs épitopes, l'affinité Les anticorps globale des anticorps pour l'antigène est plus élevée. Haute sensibilité pour détecter de faibles quantités de protéines. polyclonaux Forte capacité à capturer la cible de protéines (recommandé comme anticorps de capture dans l'ELISA sandwich). Facile à coupler avec des marqueurs d'anticorps, il est peu probable qu'il affecte la capacité de liaison. Désavantages: Variabilité entre les lots d'animaux différents à des moments différents. Comme il reconnaît plusieurs épitopes (les anticorps purifiés par affiliation présentent une réactivité croisée minimale), la possibilité d'une réactivité croisée est élevée. Moins de spécificité qu'un anticorps monoclonal  Anticorps polyclonaux Anticorps monoclonaux https://www.rapidnovor.com/  Comment obtenir des anticorps monoclonaux à volonté? G. Köhler C. Milstein (1946-1995) (1927-2002) L’idée: Travailler sur les myélomes Publication en 1975 – Les hybridomes Prix Nobel de médecine en 1984 avec N.K. Jernes – "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies" Les hybridomes Cellules B (qui produisent Cellules de myélome immortelles des anticorps mais ne se (qui se divisent indéfiniment mais divisent pas indéfiniment) ne produisent pas d'anticorps) Fusion chimique: une déstabilisation temporaire des membranes cellulaires, permettant ainsi aux cellules de se fusionner Formation des hybridomes présentant une double caractéristique Les résultats des expériences de fusion entre deux lignées cellulaires (B16-F1 et CHO) Rems, L., Ušaj, M., Kandušer, M. et al. Sci Rep 3, 3382 (2013)  Le principe général 1. Immunisation de la souris : La souris est immunisée avec l'antigène X. En réponse, la rate de la souris produit des cellules plasmatiques capables de sécréter des anticorps spécifiques contre cet antigène. 2. Préparation des cellules immortalisées : Des cellules de myélome, incapables de produire des anticorps ou dépourvues de l'enzyme HGPRT (Ig⁻ et HGPRT⁻), sont cultivées et sélectionnées in vitro. 3. Fusion cellulaire: La rate de la souris est retirée. Les cellules Ig (-), HGPRT (-) plasmatiques de la rate sont isolées et mélangées avec des cellules de myélome. La fusion cellulaire est induite pour produire des hybridomes. HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransférase) : L’enzyme qui permet aux cellules de recycler les purines et de survivre dans un milieu HAT HAT (hypoxanthine, aminoptérine et thymidine) medium: aminoptérine qui va inhiber la voie endogène de synthèse des purines/pyrimidines.  Le principe général 1. Immunisation de la souris 2. Préparation des cellules immortalisées 3. Fusion cellulaire 4. Sélection dans le milieu HAT: Les cellules résultantes sont placées dans un milieu sélectif HAT. Dans ce milieu : - Les cellules plasmatiques non fusionnées meurent naturellement, car elles ne sont pas immortelles. - Les cellules de myélome non fusionnées, dépourvues de HGPRT, ne survivent pas dans le milieu HAT. - Seuls les hybridomes survivent, car ils combinent les propriétés des deux types de cellules. Ig (-), HGPRT (-) HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransférase) : L’enzyme qui permet aux cellules de recycler les purines et de survivre dans un milieu HAT HAT (hypoxanthine, aminoptérine et thymidine) medium: aminoptérine qui va inhiber la voie endogène de synthèse des purines/pyrimidines.  Le principe général 1. Immunisation de la souris 2. Préparation des cellules immortalisées 3. Fusion cellulaire 4. Sélection dans le milieu HAT: Les cellules résultantes sont placées dans un milieu sélectif HAT. Dans ce milieu : - Les cellules plasmatiques non fusionnées meurent HAT HAT HAT naturellement, car elles ne sont pas immortelles. - Les cellules de myélome non fusionnées, dépourvues de HGPRT, ne survivent pas dans le milieu HAT. - Seuls les hybridomes survivent, car ils combinent les propriétés des deux types de cellules. Les cellules de myélome seules ne peuvent pas survivre dans un milieu HAT, car elles manquent de la voie de régénération HGPRT. Les cellules B seules (non immortalisées) ne peuvent pas se multiplier longtemps. HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransférase) : L’enzyme qui permet aux cellules de recycler les purines et de survivre dans un milieu HAT HAT (hypoxanthine, aminoptérine et thymidine) medium: aminoptérine qui va inhiber la voie endogène de synthèse des purines/pyrimidines.  Le principe général 1. Immunisation de la souris 2. Préparation des cellules immortalisées 3. Fusion cellulaire 4. Sélection dans le milieu HAT: Les cellules résultantes sont placées dans un milieu sélectif HAT. Dans ce milieu : - Les cellules plasmatiques non fusionnées meurent naturellement, car elles ne sont pas immortelles. - Les cellules de myélome non fusionnées, dépourvues de HGPRT, ne survivent pas dans le milieu HAT. - Seuls les hybridomes survivent, car ils combinent les propriétés des deux types de cellules. 5. Isolement et production : Ig (-), HGPRT (-) - Les hybridomes produisant des anticorps spécifiques à l'antigène X sont identifiés et sélectionnés. - Ces hybridomes sont ensuite cultivés en grande quantité pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques à l'antigène X. HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransférase) : L’enzyme qui permet aux cellules de recycler les purines et de survivre dans un milieu HAT HAT (hypoxanthine, aminoptérine et thymidine) medium: aminoptérine qui va inhiber la voie endogène de synthèse des purines/pyrimidines. Les animaux  Les souris BALB/c BALB/c est une lignée consanguine albinos, immunodéficiente. Les caractéristiques des souris BALB/c sont une reproduction facile et des variations de poids minimes entre les mâles et les femelles. Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG) Fusion des membranes cytoplasmiques Modification chimique des membranes cellulaires facilitant Rendement de fusion de l ’ordre du % la fusion entre les cellules DMSO renforce la viabilité cellulaire Alternative de fusion: Virus Sendaï Fusion physique : Electrofusion Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques Technique coûteuse Moins destructrice  Électrofusion Fusion Chimique Usage d'agents chimiques (ex. PEG : polyéthylène Utilisation de champs électriques pour aligner et Principe glycol) pour induire la fusion des membranes fusionner les membranes cellulaires. cellulaires. Formation de pores transitoires dans les Modification chimique des membranes cellulaires Mécanisme membranes sous l'effet de pulsations électriques favorisant leur coalescence. (électroporation suivie de fusion). Généralement non toxique si les paramètres sont Les agents chimiques (ex. PEG) peuvent être toxiques Toxicité bien ajustés. ou affecter la viabilité cellulaire. Équipement spécialisé (chambre d'électrofusion, Réactifs chimiques simples (ex. PEG) et matériel Matériel requis générateur d'impulsions). standard de laboratoire. Relativement rapide après préparation des Plus long, car le PEG nécessite des étapes d'incubation Temps requis cellules. et de lavage. Coût Coûteux (nécessite un équipement spécialisé). Plus économique (réactifs chimiques moins chers). Technique d'hybridation cellulaire ou hybridome Sélection sur milieu sélectif HAT Hypoxanthine Aminopterine Thymidine (bloque la synthèse de novo de bases nucléotidiques) Facteurs de croissance : IL6 b mercaptoethanol sérum de veau fœtal Fibroblastes (Cellules nourricières) sous atmosphère CO2 seuls les hybridomes se développent 1 x 105 cellules/ml  Le principe général 1. Immunisation de la souris 2. Préparation des cellules immortalisées 3. Fusion cellulaire 4. Sélection dans le milieu HAT: Les cellules résultantes sont placées dans un milieu sélectif HAT. Dans ce milieu : - Les cellules plasmatiques non fusionnées meurent naturellement, car elles ne sont pas immortelles. - Les cellules de myélome non fusionnées, dépourvues de HGPRT, ne survivent pas dans le milieu HAT. - Seuls les hybridomes survivent, car ils combinent les propriétés des deux types de cellules. 5. Isolement et production : Ig (-), HGPRT (-) - Les hybridomes produisant des anticorps spécifiques à l'antigène X sont identifiés et sélectionnés. - Ces hybridomes sont ensuite cultivés en grande Comment isoler des lignées d'hybridomes produisant quantité pour produire des anticorps monoclonaux chaque type d'anticorps monoclonal ? spécifiques à l'antigène X. HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransférase) : L’enzyme qui permet aux cellules de recycler les purines et de survivre dans un milieu HAT HAT (hypoxanthine, aminoptérine et thymidine) medium: aminoptérine qui va inhiber la voie endogène de synthèse des purines/pyrimidines.  1. Criblage des hybridomes : 5. Isolement et production : - Après plusieurs jours de culture, effectuer un test de criblage (comme un ELISA) sur le surnageant des puits contenant les hybridomes. - Rechercher les hybridomes qui produisent des anticorps spécifiques à l'antigène cible. 2. Clonage par dilution limite : - Sélectionner les puits positifs identifiés par le criblage. - Soumettre les hybridomes à un clonage par dilution limite pour isoler des lignées monocellulaires (un seul hybridome par culture). - Cela garantit que chaque lignée provient d’une seule cellule productrice d’anticorps monoclonal. 3. Vérification des clones : - Tester à nouveau les clones isolés pour confirmer leur capacité à produire des anticorps spécifiques. - Vérifier l’uniformité et la spécificité des anticorps par des techniques comme ELISA, Western blot ou immunofluorescence. 4. Production des anticorps monoclonaux en grande quantité: Cultiver les lignées d’hybridomes isolées (in vitro ou in vivo) et les stocker à long terme (congélation à -80°C ou dans de l'azote liquide). Production des anticorps monoclonaux en grande quantité On peut: soit cultiver in vitro les cellules (Production in vitro): la production d'anticorps est modeste (1 µg/ml) soit cultiver in vivo, en injectant la cellule dans la cavité péritonéale de la souris (Production en ascites): une tumeur se développe et on prélève le liquide d'ascite, qui contient 1 à 10 mg/ml d'anticorps monoclonal, soit 1000 fois plus. Production des anticorps monoclonaux en grande quantité Production in vitro flacons, ou plaques de cultures cellulaires 40 à 100 ml rendement de l’ordre du µg/ml production relativement pure contaminant par les substituts de sérum Production des anticorps monoclonaux en grande quantité Production in vivo Injection des hybridomes dans le péritoine de souris Développement d’une tumeur : ascite Prélèvement des anticorps par ponction de liquide d’ascite Purification du liquide d’ascite nécessaire Rendement élevé 10 g/l C’est la souris qui régule les conditions de culture !  Production in vitro Avantages Inconvénients Pas d’utilisation d ’animal Tous les hybridomes ne prolifèrent pas en réacteur (hors souris) Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal Pas de contraintes légales à Problèmes lorsque les glycosylations sont l’utilisation d’animaux nécessaires Pas de personnel Productions moins concentrées d’animalerie Contamination par les hybridomes morts Pas de contaminant Mab de plus faible affinité Plus chère pour de petite production  Production in vivo Avantages Inconvénients Concentration élevée en Ac Utilisation de l’animal (des Pas d’intermédiaire industriels préoccupations éthiques liées à l'expérimentation animale) Présence de protéines murines Contaminants Stress de la souris  Les anticorps monoclonaux Avantages: Reconnaissance hautement spécifique d'un épitope de l'antigène Les lignées cellulaires d'hybridomes immortelles ont la capacité de produire des quantités illimitées d'anticorps (Production massive) Bruit de fond et réaction croisée minimes Excellente affinité et purification Désavantages: Le développement d'anticorps monoclonaux prend du temps et nécessite des compétences techniques élevées. Ils peuvent produire de nombreux anticorps spécifiques, mais peuvent ne pas être détectés dans plusieurs espèces. Sensible aux changements d'épitopes. Même des changements mineurs de conformation peuvent entraîner une capacité de liaison considérablement réduite. https://www.bosterbio.com/blog/post/monoclonal-vs-polyclonal-antibodies-how-to-choose Plan du cours: Techniques d’immunofluorescence et dérivées Introduction générale Structure des anticorps Anticorps Applications des anticorps Production d’anticorps Détection des Marquage des anticorps par les fluorochromes anticorps Amplification du signal en immunofluorescence Imagerie avec des Fonctionnement et structure de la GFP Protéines GFP et ses variantes Fluorescentes Applications des GFP en recherche et biotechnologie  Marquage des anticorps avec des fluorochromes Qu'est-ce qu'un fluorochrome ? Les fluorochromes (fluorophores) sont des substances chimiques photoréactives capables d’absorber l’énergie lumineuse à une longueur d’onde donnée et d’émettre cette lumière à une longueur d’onde supérieure Les fluorochromes permettent de visualiser la localisation et la quantité d'antigènes ciblés Le choix des fluorochromes à coupler avec des anticorps dépend des longueurs d'onde d'excitation et d'émission. Note: Assurez-vous que la longueur d'émission du fluorochrome ne se chevauche pas avec celle d'autres fluorochromes utilisés dans une expérience de multiplexing (multiplexage). Si les émissions se chevauchent, il peut y avoir de la saturation du signal ou des interférences ttps://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence Le choix des fluorochromes à coupler avec des anticorps dépend des longueurs d'onde d'excitation et d'émission.  Immunofluorescence directe et indirecte l'anticorps primaire est directement l'anticorps secondaire est utilisé pour détecter l'anticorps conjugué à un fluorochrome. Cela permet primaire. L'anticorps secondaire est conjugué à un une détection directe de la cible d'intérêt. fluorochrome, ce qui permet d'amplifier le signal ttps://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence  Comparaison entre méthode directe et indirecte Immunofluorescence directe Immunofluorescence indirecte Plus long (Temps et étapes supplémentaires Temps Plus court (une seule incubation) nécessaires pour la liaison des anticorps secondaires Amplification du signal grâce à l'anticorps Amplification du signal Moins d'amplification secondaire Moins sensible, car une seule molécule Sensibilité Plus sensible, grâce à l'amplification du signal marque la cible Moins flexible (chaque anticorps doit être Plus flexible (un seul anticorps secondaire peut Flexibilité conjugué à un fluorochrome ou une enzyme) être utilisé pour plusieurs anticorps primaires) Idéale pour des applications nécessitant une Utilisation Simple et rapide pour des détections simples amplification du signal Marquage des anticorps avec 1. Préparation de l'anticorps L'anticorps est purifié (généralement par chromatographie). des fluorochromes pH ~7 (tampon phosphate, tampon carbonate) 2. Activation du fluorochrome Les fluorochromes sont souvent modifiés chimiquement pour contenir un groupe réactif qui peut se lier à une partie de l'anticorps : Réaction avec les amines: isocyanates, azotures d'acyle, esters N- hydroxysucci: Isothiocyanatesnimide (NHS), chlorures de sulfonyle, aldéhydes, glyoxals, époxydes, oxiranes, carbonates, halogénures d'aryle, imidoesters, carbodiimides, anhydrides et esters fluorophényles. Réaction avec les thiols : Maléimides, Iodoacetamides https://www.aatbio.com/ 3. Réaction de conjugaison Le fluorochrome activé est mélangé avec l'anticorps dans des conditions contrôlées (température, pH). Le fluorochrome réagit avec les groupes amines ou d'autres parties de l'anticorps (par exemple, des thiols). 4. Séparation et purification Après la réaction, le mélange contient des anticorps conjugués, des fluorochromes libres et potentiellement d'autres sous-produits. Les anticorps marqués sont séparés des fluorochromes libres par des techniques comme la dialyse, la chromatographie sur gel- filtration, ou la centrifugation. Martin C. et al., Pharmaceuticals 2019, 12, 176  Facteurs à considérer lors du marquage 1. Rapport de conjugaison : Le nombre de fluorochromes par anticorps doit être optimisé pour éviter la quenching (réduction de fluorescence due à une surconjugaison). Un rapport typique est de 1 à 5 molécules de fluorochrome par anticorps. 2. Compatibilité biologique : Le marquage ne doit pas affecter la capacité de l'anticorps à se lier à son antigène. Le choix du fluorochrome dépend de l'application (longueur d’onde adaptée au système de détection). 3. Stabilité : Les fluorochromes doivent être photostables pour résister aux conditions d'observation prolongées (éviter le photoblanchiment).  Amplification du signal en immunofluorescence L'amplification du signal en immunofluorescence est une méthode employée pour renforcer la détection de signaux faibles, en particulier lorsqu'on analyse des cibles de faible abondance ou lorsque les anticorps primaires et secondaires ne produisent pas un signal assez intense pour une visualisation optimale. Cette technique repose sur l'utilisation de réactifs amplificateurs, tels que des anticorps secondaires, des complexes enzymatiques ou d'autres molécules réactives, qui augmentent la quantité de signal détectable. Utilisation d'anticorps secondaires multiples Amplification enzymatique par TSA (Tyramide Signal Amplification) Méthodes biotin-streptavidine 1. Utilisation d'anticorps secondaires multiples: Un anticorps primaire spécifique à la cible est lié à plusieurs anticorps secondaires marqués par des fluorochromes. Chaque anticorps primaire peut lier plusieurs anticorps secondaires, augmentant ainsi le nombre de fluorochromes autour de la cible Lamines: Protéines du noyau cellulaire Yeon et al. Simultaneous amplification of multiple immunofluorescence signals via cyclic staining of target molecules using mutually cross-adsorbed antibodies. Sci Rep 12, 8780 (2022) 1. Utilisation d'anticorps secondaires multiples: Un anticorps primaire spécifique à la cible est lié à plusieurs anticorps secondaires marqués par des fluorochromes. Chaque anticorps primaire peut lier plusieurs anticorps secondaires, augmentant ainsi le nombre de fluorochromes autour de la cible Simultaneous multiplexed IF signal amplification via multiplexed FRACTAL in a mouse brain slice Lamines: Protéines du noyau cellulaire Yeon et al. Simultaneous amplification of multiple immunofluorescence signals via cyclic staining of target molecules using mutually cross-adsorbed antibodies. Sci Rep 12, 8780 (2022) 2. Amplification enzymatique par TSA (Tyramide Signal Amplification) Un anticorps est couplé à une enzyme (exemple : peroxydase de raifort, HRP). L'enzyme active un substrat fluorescent (comme la tyramide) qui se fixe de manière covalente aux protéines proches de la cible. Principe : Après que l'anticorps secondaire lié à l'enzyme (HRP) se fixe sur l'anticorps primaire, l'HRP permet l'oxydation de la tyramide, qui devient alors hautement réactive et se fixe sur les structures voisines de l'anticorps ou de l'antigène, amplifiant ainsi le signal. Avantages : Sensibilité très élevée, même pour des cibles à faible abondance. Yamauchi et al. Fluorochromized tyramide-glucose oxidase as a multiplex fluorescent tyramide signal amplification system for histochemical analysis. Sci Rep 12, 14807 (2022) 2. Amplification enzymatique par TSA (Tyramide Signal Amplification) Un anticorps est couplé à une enzyme (exemple : peroxydase de raifort, HRP). L'enzyme active un substrat fluorescent (comme la tyramide) qui se fixe de manière covalente aux protéines proches de la cible. Des fibres catécholaminergiques dans le cerveau du marmoset visualisée par FT-GO. Yamauchi et al. Fluorochromized tyramide-glucose oxidase as a multiplex fluorescent tyramide signal amplification system for histochemical analysis. Sci Rep 12, 14807 (2022)  3. Biotine-avidine Une méthode en biochimie permettant de lier de manière spécifique et très forte deux molécules : la biotine et l'avidine (ou la streptavidine). Cette interaction est utilisée pour amplifier les signaux ou pour faciliter l'isolement et la détection de protéines ou d'autres molécules d'intérêt (l'immunohistochimie, l'immunofluorescence, la PCR et le Western blot) Principe : La biotine (vitamine B7) peut se lier de manière covalente à l'anticorps. L'avidine est une protéine qui se lie très fortement à la biotine (très haute affinité). Mécanisme de fonctionnement : Conjugaison de la biotine : Un anticorps est conjugué à la biotine Conjugaison de l'avidine : L’avidine conjuguée à un fluorochrome. Elle est ensuite ajouté et se lie de manière extrêmement forte à la biotine. Amplification du signal : - Une seule biotine sur un anticorps peut se lier à plusieurs molécules d'avidine, - chaque molécule d'avidine pouvant être conjugée à un grand nombre de molécules de fluorochrome, amplifiant ainsi la détection. La biotine (vitamine B7), joue un rôle essentiel dans la production d’énergie à partir des nutriments, ainsi que dans la synthèse des acides gras et des acides aminés. Elle est à la fois apportée par l’alimentation et fabriquée par la flore intestinale. 3. Biotine-avidine Une méthode en biochimie permettant de lier de manière spécifique et très forte deux molécules : la biotine et l'avidine (ou la streptavidine). Cette interaction est utilisée pour amplifier les signaux ou pour faciliter l'isolement et la détection de protéines ou d'autres molécules d'intérêt (l'immunohistochimie, l'immunofluorescence, la PCR et le Western blot) Hickey et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods 19, 284–295 (2022) Plan du cours: Techniques d’immunofluorescence et dérivées Introduction générale Structure des anticorps Anticorps Applications des anticorps Production d’anticorps Détection des Marquage des anticorps par les fluorochromes anticorps Amplification du signal en immunofluorescence Imagerie avec des Fonctionnement et structure de la GFP Protéines GFP et ses variantes Fluorescentes Applications des GFP en recherche et biotechnologie  Imagerie avec des Protéines Fluorescentes Fonctionnement et structure de la GFP GFP et ses variantes Applications des GFP en recherche et biotechnologie  1- Fonctionnement et Structure de la GFP La Green Fluorescent Protein (GFP), ou Protéine Fluorescente Verte, est une protéine qui émet une fluorescence verte lorsqu'elle est excitée par la lumière ultraviolette ou bleue. Découverte dans la méduse bioluminescente Aequorea victoria dans les années 1960, cette protéine est devenue un outil essentiel en biologie cellulaire, en biotechnologie, et en recherche scientifique. Aequorea victoria 1- Fonctionnement et Structure de la GFP Le chromophore se forme naturellement lorsqu'elle se replie correctement Forme de cylindre La GFP présente une structure en feuillet β, formant un tube central qui constitue une cage protégeant son chromophore, la région responsable de la fluorescence. À l'intérieur de cette cage se trouve le chromophore, composé de trois acides aminés (Tyr66, Gly67 et Ser65), qui sont responsables de l'absorption de la lumière (395-480 nm) et de l'émission fluorescente (509 nm). 2. GFP et ses Variantes Au-delà de la GFP originale, plusieurs variantes spectrales ont été développées, offrant une gamme de couleurs différentes, ce qui permet d'élargir l'application de cette technologie à des expériences de multiplexage Image from Wikimedia Commons: GFPLikeProteins. 2. GFP et ses Variantes Au-delà de la GFP originale, plusieurs variantes spectrales ont été développées, offrant une gamme de couleurs différentes, ce qui permet d'élargir l'application de cette technologie à des expériences de multiplexage Image from Wikimedia Commons: GFPLikeProteins. https://www.jyi.org/ 3. Applications des GFP en Recherche et Biotechnologie GFP comme gène rapporteur GFP comme marquer cellulaire et moléculaire (interaction protein-protein) Le gène codant pour la GFP est fusionné à un promoteur ou à un gène cible. Lorsque le gène cible est exprimé, la GFP est également produite, émettant une fluorescence verte visible lors de l'excitation par une lumière bleue. Cela permet de mesurer ou de visualiser l'expression du gène cible en temps réel. Hoffman, R. Application of GFP imaging in cancer. Lab Invest 95, 432–452 (2015) 3. Applications des GFP en Recherche et Biotechnologie GFP comme gène rapporteur GFP comme marquer cellulaire et moléculaire (interaction protein-protein) Le gène codant pour la GFP est fusionné à un promoteur ou à un gène cible. Lorsque le gène cible est exprimé, la GFP est également produite, émettant une fluorescence verte visible lors de l'excitation par une lumière bleue. Cela permet de mesurer ou de visualiser l'expression du gène cible en temps réel. Souris transgéniques (en vert) exprimant le gène de la GFP Hoffman, R. Application of GFP imaging in cancer. Lab Invest 95, 432–452 (2015) 3. Applications des GFP en Recherche et Biotechnologie GFP comme gène rapporteur GFP comme marquer cellulaire et moléculaire (interaction protein-protein) Bactéries GFP Image illustrant des cellules bactériennes de P. aeruginosa GFP en train d'être Visualisation d'une souche d'E. coli phagocytées par des macrophages murin exprimant la GFP chez la souris Park, Pil-Gu, et al., Clinical and experimental vaccine research 1.1 (2012): 83-87. 3. Applications des GFP en Recherche et Biotechnologie GFP comme gène rapporteur GFP comme marquer cellulaire et moléculaire (interaction protein-protein)  TP : Transformation des bactéries avec un plasmide GFP Plasmide purifié contenant le gène GFP ainsi qu'un gène de résistance à la kanamycine l’électroporation Sélection Pseudomonas fluorescens MFP05 (Cellules compétentes) Milieu d’agar sélectif : TSA + Kanamycine (50 µg/mL Pseudomonas fluorescens MFP05-GFP 3. Applications des GFP en Recherche et Biotechnologie GFP comme gène rapporteur GFP comme marquer cellulaire et moléculaire (interaction protein-protein) Deux protéines sont fusionnées aux fragments FP(11) et FP(1-10). Lorsque les protéines A et B interagissent, les fragments FP s'assemblent pour former la structure complète de la protéine fluorescente, générant ainsi un signal fluorescent. https://blog.addgene.org/