lekarska-mykologie.docx.pdf

Charakteristika hub a houbových organizmů heterogenní, polyfyletická skupina eukaryotických jednobuněčných a mnohobuněčných organizmů mají blíže k živočichům (říše Animalia) než k rostlinám (říše Plantae), se kterými byly v minulosti tradičně spojovány nepřítomnost plastidů produktem metabol...

Charakteristika hub a houbových organizmů heterogenní, polyfyletická skupina eukaryotických jednobuněčných a mnohobuněčných organizmů mají blíže k živočichům (říše Animalia) než k rostlinám (říše Plantae), se kterými byly v minulosti tradičně spojovány nepřítomnost plastidů produktem metabolismu je polysacharid glykogen lyzozómy v buňkách hub buněčnou stěnu nejčastěji tvoří polysacharidy (mannany, galaktomannany, glukany, chitin a chitosan nebo celulóza) přítomnost sterolů v cytoplasmatické membráně vláknitých hub, jejichž blokování se využívá například při antimykotické léčbě Mikroskopické houby „mikromycety“ o tvoří mikroskopické vegetativní či rozmnožovací struktury pozorovatelné pod mikroskopem. o Porosty a některé jejich struktury mohou být viditelné i pouhým okem. o „plísně“ – mikroskopické vláknité houby (vidíme mycelium) o zástupci říše Fungi Dle morfologie rozeznáváme: Kvasinky, Vláknité houby, Dimorfní houby Kvasinky - tvoří blastokonidie, pseudomycelium, chlamydospory (rýžový nebo kukuřičný agar) Vláknité houby - základní stavební jednotkou je hyfa a soubor hyf tvořící mycelium - mycelium vegetativní – ukotvující houbu v substrátu - mycelium generativní – nesoucí rozmnožovací struktury (pohlavní, nepohlavní) Dimorfní houby - tatáž houba může vytvářet hyfy i kvasinkovité útvary Vegetativní stélka: přehrádkované mycelium coenocytické mycelium (nepřehrádkované) pseudomycelium – pučící elipsoidní buňky jednobuněčná nemyceliální stélka v životním cyklu se střídá anamorfa (nepohlavní stádium) s teleomorfou (pohlavní stádium) obě stádia jsou morfologicky, časově a prostorově oddálené holomorfa = anamorfa + teleomorfa (houba v celém životním cyklu) synanamorfa – více forem nepohlavních stádií u některých zástupců není teleomorfa/anamorfa známa (vzácná, nenalezená, nebo se vůbec netvoří) některé teleomorfní rody jsou spojeny s několika typy anamorfy (anamorfní rody s odlišnými typy konidiogeneze) Nepohlavní rozmnožování anamorfa (mitosporní, imperfektní, dříve Deuteromycota) rozmnožují se mitózou za vzniku konidií (nepohlavní buňky) Terminologie: o mikrokonidie – malé, jedno- či dvoubuněčné konidie (u hub tvořící dva typy konidií) o makrokonidie – velké, mnohobuněčné konidie o chlamydospory (chlamydokonidie) – silnostěnné buňky o blastokonidie (blastospora) – buňka kvasinek oválného či kulovitého tvaru o arthrokonidie (arthrospory) – vznikají segmentací hyf o sporangiospory (sporangiokonidie) – vznikají endogenně ve sporangiu konidie vznikají na konidiogenních buňkách na konidioforech proces vzniku konidií se nazývá kondiogeneze Konidiomata o specializovaný multihyfální útvar, na kterém (nebo uvnitř kterého) se tvoří konidiofory (nebo jen konidiogenní buňky) a konidie Základní typy konidiomat: o synnema (koremie): svazek dlouhých, vzpřímených, spletených konidioforů na vrcholu rozvětvených o sporodochium: polštářkovitý útvar hyf s palisádovitě uspořádanými konidiofory na povrchu hostitele o acervulus: útvar podobný sporodochiu, ale zanořený v pletivu hostitele  o pyknida: kulovitý nebo lahvicovitý útvar na povrchu nebo v pletivu vytvořen umělý systém organizace: o Hyfomycety – konidiogenní buňky se tvoří na povrchu mycelia o Coelomycety - konidiogenní buňky se tvoří uvnitř uzavřených útvarů (acervulus, pyknidy) Nepohlavní rozmnožování vegetativní stélka: o Hyfy vytvářejí somatické útvary: ▪ stromata – kompaktní somatická struktura v níž dochází k vytvoření plodnice ▪ sklerocia – slouží k přetrvání nepříznivých podmínek ▪ pseudosklerocia – husté myceliální shluky připomínající sklerocia Pohlavní rozmnožování o teleomorfa o rozmnožují se meiózou za vzniku spor (pohlavních buněk) o Zygospora - pohlavní spora zygomycet (Zygomycota), vznikající spojením dvou stejných buněk opačného pohlaví (gamet) o Askospora – pohlavní spora vřeckovýtrusých hub (Ascomycota), vznikající ve vřecku (askus) o Basidiospora - pohlavní spora stopkovýtrusých hub (Basidiomycota), vznikající na stopce bazidie Výživa hub způsob výživy heterotrofní příjem organických látek živočišného a rostlinného původu získávají živiny nejjednodušší cestou – nejprve jsou využity rozpustné cukry a aminokyseliny => poté škrob => pak celulóza a pektiny => nakonec lignin a tuky příjem pouze nízkomolekulárních látek (jednoduché cukry – monoa disacharidy, aminokyseliny, mastné kyseliny, steroly, vitamíny) složitější látky (polysacharidy, pektiny, proteiny, lignin) jsou rozkládány vně buněk za pomoci extracelulárních enzymů často se jedná o hydrolytické enzymy vytvářené poblíž růstového vrcholu hyfy a přes plazmatickou membránu dochází k jejich exkreci produkty štěpení vstupují do buněk, kde jsou dále zpracovány intracelulárními enzymy a začleněny do metabolismu Ekologie hub Ekologické skupiny hub o dle způsobu získávání živin o Paraziti - (obligátní, fakultativní) - získávají živiny z živých buněk rostlin, živočichů či jiných hub o Predátoři – "dravé houby" o Saprofyté - získávají živiny z odumřelých těl rostlin či živočichů ▪ houby klíčová úloha ▪ odlišné mechanizmy podle skupiny hub, substrátu, ekosystému Symbionti - rovněž absorbují živiny z buněk živého organismu, ale za to hostiteli prokazují službu (mutualistická symbióza); rostlinám například pomáhají absorbovat z půdy minerální látky (mykorhiza) Nomenklatura nomenklatura hub se řídí podle Mezinárodního kódu botanické nomenklatury Basionym - v nomenklatuře rostlin a hub: původní název, pod kterým byl taxon popsán, tj. název, na kterém je založen nějaký pozdější platný název (Sterigmatocystis nidulans Eidam) Klinicky významné mikroskopické huby v poslední době stoupá počet případů mykóz u člověka o možnými důvody jsou slabší imunita lidí o častá léčba antibiotiky (potlačuje veškerou bakteriální flóru => snazší invaze houbového patogena) o případně rozmach cestování (přenos hub z jiných oblastí) o zvýšený záchyt (diagnostika) známo 99 000 druhů hub dle Dictionary of Fungi 2008 z toho cca 560 druhů je patogenních pro člověka dle Atlas of Clinical Fungi (2013) původci onemocnění jsou vláknité houby a kvasinky většinou běžně se vyskytující ve vnějším prostředí a přirozeně kolonizující vnitřní a vnější prostředí organizmu  většina hub patří mezi oportunní patogeny, kteří vyvolávají infekci u jedinců s oslabeným imunitním systémem výjimku představují dermatofyty specializovaní patogeni - anamorfy hub z řádu Onygenales, oddělení Ascomycota způsobující kožní a plicní onemocnění – Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides a Paracoccidioides Patogenita hub Mikroskopické houby působí: o Mykózy – onemocnění způsobená houbami o Mykotoxikózy – onemocnění způsobené toxiny hub o Mykoalergózy – onemocnění alergického charakteru vyvolané antigeny mykotického původu o Mycetismy – houba přítomna v těle, působí jen útlakem okolních tkání Klasifikace mykóz z hlediska klinického: o povrchové - kožní a slizniční o systémové - zasahující více vnitřních orgánů (hluboké nebo orgánové) Klasifikace mykóz dle lokalizace o Kožní mykózy ▪ povrchové mykotické infekce kůže a vlasů nebo nehtů ▪ dochází k patologickým změnám v hostiteli v důsledku přítomnosti infekčního agens a jeho metabolitů o Jiné povrchové mykózy ▪ povrchové mykotické infekce kůže a vlasu (kosmetické) ▪ nevznikají patologické změny a není buněčná odpověď od hostitele o Podkožní mykózy ▪ chronické, lokalizované infekce kůže a podkožního vaziva ▪ původci půdní saprofyté o Systémové a subkutánní mykózy způsobené dimorfními houbami ▪ původci mykotického onemocnění jsou dimorfní houbové organizmy, které mohou překonat fyziologické a buněčné obranné mechanizmy lidského hostitele tím, že mění jejich morfologické formy ▪ jejich výskyt je geograficky omezen ▪ primárním místem infekce jsou obvykle plíce po inhalaci konidií o Oportunní systémové mykózy ▪ mykotické infekce, které se vyskytují téměř výhradně u oslabených pacientů, jejichž normální obranné mechanismy jsou narušeny ▪ původci infekce jsou kosmopolitní, saprofytické houby ▪ pokud dochází k invazi do tkání, hovoříme o invazivních mykotických onemocněních (IFD) Fyziologie klinicky významných mikroskopických hub Kultivace o Sabouraudův agar s 2 – 4% glukózy s přídavkem antibakteriálních látek (chlormfenikol nebo gentamicin) o obohacení Sabouraudova agaru thiaminem – podporuje růst a pigmentaci řady vláknitých hub o cykloheximid – potlačuje růst rychle rostoucích nepatogenních saprofytických hub o optimální kultivační teplota 28 – 30 °C o teplota inkubace 36 ± 1 °C většina původců oportunních mykóz (kandidy, aspergily, zygomycety) o jiná, podle potřeby, např. 30 °C u identifikačních souprav o u dimorfních druhů souběžná kultivace ve 25 °C a 37 °C o doba kultivace se pro jednotlivé skupiny, rody i druhy liší Biochemická aktivita o využití při identifikaci o u kvasinek a kvasinkovitých organizmů schopnost asimilovat a štěpit cukry a dusíkaté látky o produkce řady enzymů a jiných exolátek (elastáza, proteázy, lipázy, ureáza apod.) o např. ureázový test pro rozlišení Trichophyton rubrum a Trichophyton interdigitale Antigenní struktury o pro vláknité houby platí čím je kultura starší tím více antigenů lze při rozpadu hyf rozpoznat (např. průkaz aspergilózy dvojitou imunodifuzí v gelu) o detekce kapsulárního glukuronoxylomananu (latexová aglutinace) – diagnostika kryptokokové meningitidy o detekce a stanovení aspergilového galaktomananu (metoda ELISA) - diagnostika invazívní aspergilózy o stěna mikroskopických hub je pro makrooraganizmus vysoce antigenní a pro nedostatek enzymů je jím velice špatně odstraňována Patogenita o většina klinicky významných druhů nenapadá zdravý makrooraganizmus o důležité posouzení nálezu mikromycet v klinickém materiálu v souvislosti se zdravotním stavem pacienta a s přihlédnutím k predisponujícím faktorům (tumory, diabetes mellitus, autoimunitní choroby, stavy po transplantacích, dlouhodobé užívání kortikoidů a širokospektrých antibiotik atd.) o mykózy mívají často chronický průběh ke kterému přispívá obtížná destrukce buněčné stěny o hlavní úloha v obraně proti mikromycetám připadá na buněčnou imunitu (leukocyty – fagocytóza) Epidemiologie o epidemiologický výskyt není pro mykózy typický o pouze hromadný výskyt např. dermatofytóz Terapie o antimykotika – lokální a systémová Mykologická diagnostika Akreditace zdravotnických laboratoří o národní certifikační autoritou je Český institut pro akreditaci (ČIA) o Standardní operační postup (SOP) – soupis všeho potřebného k provedení určitého vyšetření o Příručka kvality – definuje všechny řídící procesy v laboratoři o Externí hodnocení kvality o Nepodkročitelné minimum diagnostiky mykóz laboratoří lékařské mykologie - požadavky na vybavení a metodologii mykologické laboratoře  Odběr a zpracování materiálu na mykologické vyšetření Odběr materiálu na povrchové mykózy ▪ Odběry nehtů, kožních šupin a vlasů ✔ Kožní šupiny - po předchozím ošetřením 70% alkoholem a oschnutí, odebíráme kožní šupiny seškrábnutím z postiženého místa sterilním skalpelem do sterilní zkumavky nebo přímo do Petriho misky s kultivačním médiem. Materiál odebíráme z okrajů ložiska na rozhraní zdravé a chorobně změněné tkáně, kde je vitalita mykotického agens největší. ✔ Vlasy a chlupy - po očištění odebíráme epilační sterilní pinzetou, odebíráme zejména nějakým způsobem změněné, polámané vlasy a chlupy. Snažíme se především odebrat folikulární část vlasu. Odstřižené vlasy nad úrovní pokožky nejsou vhodný materiál. ✔ Odběr z povrchu nehtu - po dekontaminaci 70% alkoholem a oschnutí, odstřihneme okraj nehtu a sterilním skalpelem se seškrabe keratin vnitřní části nehtu a nehtového lůžka do sterilní zkumavky nebo na Petriho misku s médiem. ✔ Nešupící se ložiska – zdrsnit sterilním skalpelem, prach setřít na suchý sterilní tampón. ✔ Mokvající kožní ložiska – stěr tamponem do transportního média. ✔ Před odběrem klinického materiálu na mykologické vyšetření nesmí být postižená místa 10-14 dní ošetřována žádnými lokálními antimykotiky a až 6 týdnů celkovými antimykotiky. ✔ Odběrové sady (AMIES - univerzální, FUNGI-QUICK, CAT) + Hemokultivační lahvičky Mykologická diagnostika o průkaz etiologického agens vyšetřované infekce o průkaz přímý – nález houby nebo jejich složek ve vyšetřovaném vzorku o průkaz nepřímý – průkaz specifických stop, které houba v organizmu zanechala (průkaz protilátek) o Průkaz přímý ▪ Mikroskopické vyšetření klinického materiálu ▪ Kultivace etiologického agens ▪ Identifikace etiologického agens ▪ Stanovení citlivosti k antimykotikům ▪ Průkaz antigenů ve vyšetřovaném vzorku o Nepřímý průkaz – omezené použití ▪ negativa: ▪ častý výskyt protilátek i u relativně zdravých jedinců ▪ imunosuprimovaní jedinci mohou mít nedostatečnou protilátkovou odpověď – falešná negativita Mikroskopické metody – přehled Nativní preparát o vyšetření vaginálního sekretu o modifikace v diferenciální diagnostice kvasinek a vláknitých hub Louhový preparát (včetně modifikace obarvením např. pomocí Myco-Ink) o vyšetření dermatologických a gynekologických vzorků o vyšetření bioptických a nekroptických vzorků Barvení podle Grama o vyšetření vzorků ze sliznic  o vzorků z primárně sterilních materiálů Barvení podle Giemsy o vyšetření vaginálního sekretu o diagnostika Pneumocystis jiroveci (trofozoity) Barvení pouzder o diagnostika Cryptococcus neoformans Barvení podle Grocota nebo Gram-Weigertovo barvení o diagnostika Pneumocystis jiroveci (cysty) Fluorescence (včetně imunofluorescence) o vyšetření dermatologických, bioptických a nekroptických vzorků o diagnostika Pneumocystis jiroveci (trofozoity i cysty) Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy součást saprofytické mikroflóry člověka v dutině ústní, ve střevě a na poševní sliznici oportunní patogeni nejčastější původci: Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Sacharomyces, Torulopsis, Trichosporon aj. 1. kvasinky náležející do třídy Saccharomycetes oddělení Ascomycota ▪ askosporogenní ▪ asporogenní - pouze nepohlavně se rozmnožující kvasinky 2. bazidiomycetní – kvasinkovitá stádia oddělení Basidiomycota (dimorfizmus) Ascomycota vřeckovýtrusé houby nejpočetnější skupina, cca 60% známých taxonů, cca 65 000 druhů do tohoto oddělení patří většina známých mitosporních (imperfektních) hub (žijících pouze jako anamorfy), dříve Deuteromycota vegetativní stélka o haploidní přehrádkované mycelium, přehrádky (septa) mají centrální jednoduchý pór o kvasinkovité pučící buňky, psudomycelium životní cyklus haplo-dikaryotický (haplo-diploidní a diploidní) při pohlavním procesu dochází ke vzniku dikaryotických hyf, kde v koncových buňkách tzv. askogenních hyfách – z nich vznikají vřecka (asci, askus) zralé vřecko je diploidní buňka, ve které probíhá meioza za vzniku askospor, obvykle v počtu 8 spor v jednom vřecku plodnice (askomata) buněčná stěna dvouvrstevná, základní složkou chitin a -1,3-polyglukan nepohlavní rozmnožování dělením (vzácné), fragmentace stélky, tvorba konidií základní typem pohlavního rozmnožování je gametangiogamie – splynutí morfologicky diferencovaných gametangií : samčí větev mycelia nese anteridium, samičí větev nese několik kulovitých askogonů s jedním nebo několika vláknitými výrůstky – trichogyny životní cyklus o haplo-dikaryotický o haploidní je vegetativní mycelium a plodnice, dikaryotické jsou pouze askogenní hyfy o do životního cyklu je vložena dikaryotická fáze charakteristická tzv. konjugovanými mitózami (současné mitózy obou jader) Basidiomycota stopkovýtrusé houby společným znakem je tvorba bazidie (meiosporangium), bazidiospor (meiospor) tvořících se exogenně na sterigmatech (stopečkách) vegetativní stélku tvoří přehrádkované mycelium, ve stěně přehrádek jsou vytvořeny dolipóry (podoba pláště soudku) s parentozómem primární mycelium – vznik klíčením bazidiospory, 1jaderné, u někt. zástupců může chybět sekundární mycelium – dikaryotické, jeho vznik souvisí se somatogamickou kopulací dvou buněk primárního mycelia konjugované mitózy jsou spojeny s tvorbou přezek (Pucciniales a někteří další zástupci přezky netvoří) Pohlavní rozmnožování o somatogamie (kopulace dvou mycelií nebo bazidiospor) nepohlavní rozmnožování o arthrokonidie, blastokonidie, chlamydospory a sklerocia o anamorfa se obvykle tvoří na dikaryotickém myceliu  životní cyklus dikaryotický Kvasinky a kvasinkám blízké organizmy Morfologie o vegetativní stélka je nejčastěji ve formě jednotlivých kulovitých či oválných pučivých buněk – blastokonidií (3-15 μm), některé druhy vytvářejí tzv. pučivé pseudomycelium a chlamydospory, vzácně se vyskytuje i hyfální přehrádkované mycelium Nepohlavní rozmnožování o pučení za vzniku blastokonidií (holoblastická konidiogeneze), po odpadnutí dceřinných blastokonidií zůstávají na povrchu mateřské buňky zřetelné jizvy o prosté dělení buněk o u vláknitých typů tvorba arthrokonidií (holoarthrická konidiogeneze) Pohlavní rozmnožování o somatogamie (kopulace dvou vegetativních buněk) o vzniká diploidní zygota o vřecko se tvoří většinou přímo ze zygoty (holozygotní) nebo jako výrůstek zygoty (exozygotní) o u vláknitých typů kopulují nepříliš diferencovaná gametangia - gametangiogamie Kvasinková stádia oddělení Basidiomycota Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales o anamorfa Sporobolomyces o anamorfa Rhodotorula Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales,Tremellaceae o anamorfa Cryptococcus – teleomorfa Filobasidiella o anamorfa Trichosporon Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes, Malasseziales o anamorfa Malassezia Kvasinky oddělení Ascomycota (Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales) o Candida, Geotrichum, Saccharomyces Rod Candida (Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales) nejvýznamnější a nejčastěji nalézán v klinickém materiálu původcem kandidóz o povrchové (kožní, slizniční) o systémové slizniční kandidózy: kandidóza sliznice pochvy, kandidoza ústní sliznice kožní kandidózy: plenková dermatitida u kojenců, kandidozy kůže a nehtů invazivní infekce se vyskytuji především u oslabených osob a u osob léčených kombinací širokospektrých antibiotik nejběžnější je Candida albicans, dále C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsillosis a další Candida albicans o Morfologie záleží na typu substrátu ▪ tvoří blastokonidie, pseudomycelium, chlamydospory (rýžový nebo kukuřičný agar), zárodečné klíčky (germ tubes, G-test) o Morfologii kvasinek ovlivňuje přítomnost živin v substrátu ▪ zdroj C - mono-, di-a oligosacharidy ▪ zdroj N - amonné ionty a aminokyseliny o Kultivace ▪ vhodná kultivační teplota je 30 - 37°C ▪ doba kultivace 24 – 48 hodin ▪ schopnost růstu při 40 - 45°C ▪ na bakteriologických půdách vytvoří za 24 hodin drobné, lesklé, bílé kolonie (chlebová vůně) ▪ na Sabouraudově agaru s 4% glukozy tvoří krémové, neprůhledné, matné, vypouklé kolonie s typickou vůní o Patogeneze ▪ komenzál lidské sliznice (kandidy jsou v malém počtu v dutině ústní, ve střevě, v oblasti vaginy a dalších slizničních površích, aniž vyvolávají chorobné příznaky) ▪ vyskytují se také na kůži v místech s vlhkou zapářkou (zdroj infekce v případě oslabení imunitního systému) ▪ většina kandidoz je endogenního původu ▪ schopnost rychlého klíčení ve tkaních ▪ schopnost měnit povrchové struktury (parazitická forma se vyznačuje přítomností pseudomycelia jehož tvorba je indukována přítomností séra) ▪ podmínky za nichž se uplatňuje jako patogen: u nedonošených novorozenců než se u nich vytvoří normální mikroflora při hormonálních změnách (těhotenství, diabetes mellitus, endokrinní poruchy) oslabené imunitě (imunosuprese), těžká celková onemocnění místní poruchy bariér (déletrvající zavedení kanyl a katetrů) o Slizniční kandidózy ▪ kandidóza ústní sliznice (Candidosis mucosae oris ) – na sliznici úst a jazyka se tvoří bílé splývající povlaky (pablány) ▪ u imunokompromitovaných osob a novorozenců, než se u nich vytvoří normální mikroflora ▪ tvoří 4 formy 1. akutní pseudomembranózní forma (soor, moučnivka) – bělavé povlaky na sliznici úst, jazyku a patře, mohou přejít i na ústní koutky, sliznice vypadá jak posypaná moukou 2. akutní atrofická forma - zarudnutí a bolestivost ústní sliznice, bez přítomnosti povlaku, vzniká po léčbě širokospektrými antibiotiky 3. chronická atrofická forma - projevuje se zarudlými ložisky bez povlaku, postihuje lidi se zubní protézou 4. chronická hypertrofická forma ▪ vaginální kandidóza (Vulvovaginitis candidosa ) chronické onemocnění charakterizované zánětlivě zduřelou a červenou vulvou s bělavým tvarohovitým výtokem a svěděním u mnoha žen však probíhá asymptomaticky predisponující faktory: gravidita, hormonální terapie, diabetes mellitus, antibiotická terapie, nižší pH prostředí,výživa(kvasinky jsou mlsné a je-li mlsná i jejich hostitelka, to uvítají) rezervoárem infekce je střevo  ▪ Kvasinková balanitida - kandidoza předkožkového vaku postihuje především starší obézní muže, diabetiky, muže při kontaktu s ženami s vaginalni kandidozou o Kandidózy kůže a nehtů ▪ vznikají v místech vlhké zapářky ▪ profesionální onemocněni kuchařek, pekařů a cukrářů, plenková dermatitida, kandidové paronychium -postihuje osoby máčející často ruce ve vodě o Invazivní kandidová onemocnění (systémové kandidóza) ▪ poměrně vzácné v porovnání s povrchovými kandidozami ▪ charakteristické přechodem kvasinkové formy ve vláknitou ▪ nejčastěji postihuje močové cesty a ledviny ▪ vysoká úmrtnost při kandidémie – kvasinkové infekci krevního řečiště ▪ postihuje především imunosuprimované pacienty ▪ nejčastěji se vyskytující kvasinkou byla C. albicans, nejvyšší mortalitu však vykazovaly infekce vyvolané C. glabrat a C. krusei o kandidurie - vylučování kandid moči, obv. při kandidové infekci močových cest, kolonizace močových katetrů Ostatní kandidy o Candida tropicalis ▪ izolovaná ze čtvrtiny invazivních kandidoz (C. albicans z poloviny) ▪ po C. albicans druha nejčastěji nalézaná na sliznicích ▪ infekce střev, respiračního traktu, na sliznici pochvy ▪ u nemocných leukemii se jeví patogennějši než C. albicans ▪ všeobecný komenzál v ústech, trávicím ústrojí, v plicích, ve vagině, na pokožce lidi a zvířat o C. parapsilosis – nejhojnější komenzální kvasinka na kožním povrchu, často kolonizuje katetry a způsobuje katetrové sepse o C. dubliniensis - tvoří zárodečné kličky a chlamydospory ve shlucích, zatímco C. albicans jednotlivě o C. glabrata, C. krusei, C. kefyr Rod Cryptococcus (Fungi, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales, Tremellaceae) běžně se vyskytující v půdě a na různých alkalických substrátech častý zdroj kryptokoků bývá trus městských holubů nebo klecových ptáků na rozdíl od kandid netvoří pseudomycelium tvoří mohutná polysacharidová pouzdra, kolonie opouzdřených kmenů mají výrazně mukózní vzhled multilaterální pučení pozitivní ureázový test Cryptococcus gattii o výskyt je omezen na oblasti v Austrálii, Africe, Indii, Mexiku, Brazílii ad. o ekologická vazba na několik druhů Eucalyptus Cryptococcus neoformans o teleomorfa Filobasidiella neoformans - mycelium tvoří přezky, jednotlivé, stopkaté, kyjovité holobazidie, bazidiospory se tvoří v řetízcích na vrcholu bazidie Rod Geotrichum (Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales, Dipodascaceae) nejvýznamnější druh Geotrichum candidum ubikvitní saprofyt, vyskytuje se v mléčných výrobcích, ale i v půdě, ve vodě, v aktivovaných kalech z odpadních vod apod. pro člověka může být sekundárním patogenem nejčastěji izolován z dýchacích cest a gastrointestinálního traktu zejména u osob s diabetem nebo s imunosupresí> příležitostné infekce různé lokalizace arthrokonidie Rod Malassezia (dřive Pityrosporum) (Fungi, Basidiomycota, Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes, Malasseziales, Malassezia) nejčastěji nalézaný druh Malassezia globosa, M. sympodialis a M. furfur saprofytická obligátně lipofilní kvasinky (kromě M. pachydermatis) běžnou součástí kožní mikroflory člověka a dalších teplokrevných obratlovců  příčinou povrchového onemocnění kůže pityriasis versicolor – povrchová mykoza lokalizovaná pouze ve stratum coroneum, při které na kůži vytváří světlé skvrnky bez zánětu hyfy prorůstají mezi rohovými buňkami a dokonce jsou schopny intracelulární invaze. V napadených buňkách dochází k rozrušení keratinu a ztrátě organel, buňky se odlučuji onemocnění je časté v tropickém a subtropickém pásmu pro vznik onemocnění je klíčová přeměna saprofytické blastokonidiální formy malassezii na myceliální, která napadá povrchové oblasti rohové vrstvy k průkazu slouží mikroskopické vyšetření kožních šupin z ložisek, které zobrazí krátké segmentované hyfy a hroznovité shluky spor- nazýváno „spaghetti and meatballs“ M. pachydermatis u nedonošenců a imunokompromitovaných > katetrové sepse s pneumonií Seberoická dermatitida (SD) o chronicky probíhající dermatoza vázaná na oblast obličeje kde je nejvíce mazových žláz o projevuje se tvorbou v mastných žlutavých šupinek a většinou i zarudnutím o postihuje především novorozence během prvních 3 – 4 týdnů života ve vlasové oblasti o výskyt v dospělé populaci se odhaduje na 3–5 % s vyšším výskytem u mužů než u žen Rod Rhodotorula (Fungi, Basidiomycota, Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales) nejčastěji nalézaný druh Rhodotorula mucilaginosa (syn. R. rubra) rozšířený druh po celém světě, osidlují vlhké prostředí, lze ho izolovat ze vzduchu, půdy, vody... obvykle kontaminant či doprovodná mikroflora ojediněle může vyvolat onychomykózu i systémové onemocnění tvoří charakteristické růžové, oranžové až cihlově červeně zbarvené kolonie Rod Saccharomyces (Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales, Saccharomycetaceae) dlouho považován za nepatogenní pro člověka Saccharomyces cerevisiae bývá izolován z více než 8% případů vaginálních mykoz rovněž zaznamenány případy výskytu u pneumonií a sepsí morfologie: elipsoidní i kulovité blastokonidie, některé kmeny tvoří cylindrické až protáhlé buňky, vytváří rudimentární bohatě větvené pseudomycelium, pravé mycelium se nevytváří v praxi se ve velké míře využívá hlavně v kvasném průmyslu Rod Trichosporon (Fungi, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Tremellomycetidae, Tremellales, Trichosporonaceae) nejvýznamnější je Trichosporon asahii původce tzv. bílé piedry v tropických a subtropických oblastech bílá piedra - postižení vlasů- vznik drobných uzlíků tvořených buňkami této kvasinky onemocněni kosmetického charakteru Trichosporon asahii o kolonie bílé až krémové, povrch suchý sametový s radiálními brázdami o pučící blastokonidie chybí, tvoří arthrokonidie o pozitivní ureaza (Geotrichum – negativní ureaza) Rod Sporobolomyces (Fungi, Basidiomycota, Pucciniomycotina, Microbotryomycetes, Sporidiobolales) rozšířen v životním prostředí (lidé, savci, ptáci, a rostliny) běžně izolovány z ovzduší, listy stromů a pomerančové kůry původce mykotických infekci, zvláště u imunosuprimovaných pacientů nejčastější druh Sporobolomyces salmonicolor kolonie mají máslovitý charakter a lososové zbarveni, mohou se podobat Rhodotorula tvoří blastokonidie oválného až protáhlého tvaru, pseudomycelium, pravé hyfy a ledvinovité balistokonidie Diagnostika kvasinek Význam určování kvasinek pro diagnostickou praxi Klinický: o časné zahájení cílené léčby infekce o selhání léčby v důsledku rezistence k antimykotikům (flukonazol - Candida krusei a Candida glabrata) o důležité určování kvasinek zejména na hematoonkologických odděleních, známých nejvyšší četností a pestrostí non-albicans druhů o u pacientů v neutropenii je třeba pravidelně monitorovat kolonizaci sliznic (kvantita, ale i druhové spektrum kvasinek s cílem odlišit stálé a přechodné mykoflóru) Epidemiologický: o hledání zdroje nozokomiálních infekcí (např. fungémií u pacientů s venózními katétry) V řadě případů stačí pouze odlišit Candida albicans od ostatních kvasinek rodu Candida či ostatních rodů Kdy by měl být v laboratoři vždy určen druh kvasinky o diagnóza, zakládající podezření na mykotickou infekci (rizikové skupiny pacientů) o v případě cíleného požadavku na mykologické vyšetření o při izolaci z primárně sterilní lokality o v případě kvasinky izolované z míst osídlovaných běžnou mikroflórou o jedná-li se o čistou kulturu o zjevnou kvantitativní převahu kvasinkové nad bakteriální populace o při záchytu významného množství kandid na více místech nebo opakovaném v jedné lokalitě v případě používání chromogenní půdy je nutné určit kultury předběžně identifikované jako druhy známé svou rezistencí in vitro k systémovým antimykotikům Metody identifikace kvasinek o lze rozdělit na fenotypové a genetické o Fenotypové metody obvykle využívají rozdíly v morfologii, biochemické a enzymatické aktivitě nebo antigenním složení kvasinek. o Genetické metody jsou založené na druhových odlišnostech v sekvencích nukleových kyselin. Při analýze DNA, případně RNA nebo proteinů využívají řadu různých přístupů Vyšetřovací metody v klinické mykologii o Kultivační metody o Mikroskopické metody o Sérologie (stanovení antigenu, protilátky) o Enzymatické testy o Biochemické testy o Molekulárně-biologické metody (nestandardní) o Kultivační metody ▪ Sabouraudův glukozový agar – (glukóza 40 g, pepton 10 g, agar 15 g, dest. voda 1000 ml) ▪ SAB + antibiotika ▪ SAB bujón ▪ Selektivně diagnostická média – fluorogenní, chromogenní média ▪ Rýžový agar, 24 – 48 hodin, pokojová teplota ▪ Kukuřičný agar ▪ nárůst za 24 – 48 hodin při 30 °C, případně 37 °C ▪ Selektivně diagnostické kultivační půdy média obsahují fluorogenní nebo chromogenní substráty detekující enzymatické aktivity kvasinek, nejčastěji beta-N acetylhexosaminidázy, beta-glukosidázy nebo fosfatázy Výhody o při primární kultivaci rychlé, i když jen orientační určení druhů, nejčastěji se vyskytujících v klinickém materiálu o snadná detekce směsných kultur čímž významně přispívají ke zjednodušení procesu identifikace Nevýhody o vyšší náklady o vývojově starší jsou fluorogenní média, používaná pouze k určení Candida albicans, nedostatkem je difúze fluoreskujících substancí do agaru, což ztěžuje odlišení C. albicans ve směsných kulturách o nutnost hodnocení v ultrafialovém světle Chromogenní média o CHROMagar Candida - zlatý standard - využití pro předběžnou identifikaci čtyř druhů kandid: ▪ C. albicans - žlutozelené až modrozelené kolonie ▪ C. tropicalis - tmavě modré až modrošedé kolonie ▪ C. krusei - světle růžové až purpurové, matné, nepravidelné kolonie ▪ C. glabrata - růžové, lesklé, okrouhlé kolonie ▪ nespolehlivé je odlišení C. dubliniensis od C. albicans dle tmavě zeleného zbarvení kultur ▪ v ČR název Colorex Candida(Trios) hotové médium o další nejčastěji používané médium CandiSelect 4 (Bio-Rad Laboratories) ▪ identifikuje stejné druhové spektrum kandid ▪ ve srovnání s médiem CHROMagar má zcela odlišné a ne tak výrazně diferencující zbarvení kolonií ▪ určování kandid, zejména non-albicans, na chromogenních médiích je považováno za předběžné a mělo by být následně ověřeno podrobnou identifikací o Bird Seed Agar (BD Diagnostics) – médium pro diferenciaci Cryptococcus neoformans na základě vysoce specifické aktivity fenoloxidázy, vedoucí k tvorbě charakteristického tmavohnědého melaninu, C. albicans tvoří bílé kolonie ▪ Makromorfologie kolonií Barva Textura – hladká, drsná Vzhled – lesklé, matné Profil kolonie o 1. hladká kolonie o 2. hladká kolonie s vyvýšeným středem o 3. hladká kolonie, kráterovitá o 4. plochá kolonie o 5. kráterovitá kolonie ve středu zvlněná o 6. vyvýšená, zvlněná kolonie o 7. plochá, zvlněná kolonie o 8. rhiziodní kolonie s pseudomyceliem Povrch a okraj kolonie o 1. centrálně pruhovaný (v koncetrických kruzích)  o 2. radiálně pruhovaný (radiálně zvrásněný) o 3. ucelený okraj o 4. lalokovitý okraj o 5. pilovitý okraj o 6. cípovitý okraj o 7. rhizoidní okraj o Mikroskopické metody ▪ mikromorfologické hodnocení kultur ▪ morfologické znaky: klíční vlákna, chlamydospor velikost a tvar blastokonidií arthrokonidie, askospory vláknité struktury: mycelium, pseudomycelium ▪ používají se nativní a barvené preparáty ▪ nativní preparát je součástí tzv. testu klíčících vláken (germ tubes, GT - test) – rychlá cílená identifikace C. albicans ▪ mikroskopické vyšetření se provádí po 2 – 4 h inkubace při 37 °C vyšetřované kultury v séru, příp. jiném bílkovinném médiu ▪ pozitivní nález - krátká myceliální vlákna, vyrůstající z jednotlivých blastokonidií ▪ nutné zkušenosti k rozlišení pravých klíčních hyf od časné produkce pseudohyf ▪ tvoří je také C. dubliniensis a vzácně C. tropicalis ▪ velmi dobrá senzitivita a 100% specifita byly zjištěny při provedení testu přímo z hemokultur v bezprostřední návaznosti na barvení podle Grama, což významně urychlilo diagnostiku nejčastějšího původce kandidémií ▪ nativního preparátu se využívá při hodnocení mikromorfologie kvasinek, kultivovaných na rýžovém nebo kukuřičném agaru ▪ tvorba chlamydospor u C. albicans a C. dubliniensis ▪ Louhový preparát určen ke znázornění dermatofytů, jiných vláknitých hub a kvasinek v kůži, nehtech, vlasech, vousech a chlupech nelze identifikovat nevypovídá o životaschopnosti ▪ Modifikace louhového preparátu barvení houbových elementů barvivem MykoInk houby přijímají barvivo selektivně a vzorek je dostatečně projasněn 10% KOH ▪ Barvené preparáty barvení podle Grama - vyšetření vzorků ze sliznic a primárně sterilních materiálů barvení postupem Wirtze a Conklina (5% roztok malachitové zeleně) je možné hodnotit počet a morfologii askospor u perfektních druhů kvasinek po inkubaci na speciálních médiích (agar podle Gorodkové, V-8 juice agar atd.) průkaz pouzdra kryptokoků - negativní barvení tuší (Burriho barvení) o Sérologické metody ▪ stanovení vysoce imunogenního antigenu buněčné stěny (manan) ▪ stanovení protilátek proti němu (antimanan) ▪ detekce přítomnosti antigenu kryptokoků glukuronoxylomananu v séru, likvoru, moči a bronchoalveolární tekutině latexovou aglutinací ▪ Stanovení mananu do séra i jiných tělních tekutin je vylučován při invazívní kandidové infekci může být detekován latexovou aglutinací (Pastorex Candida, Bio-Rad) s detekčním limitem 15 ng mananu/ml, výsledek je udáván kvalitativně ELISA (detekční limit 1 ng mananu/ml, Platelia Candida Ag, Bio-Rad), výsledek je udáván kvantitativně obě metody využívají k detekci monoklonální protilátku EBCA-1  metoda je standardizována pro použití v séru senzitivita testu je udávána od 40 % do 75 % specificita od 49 % do 100 % zvýšení senzitivity a specifity dosáhneme při kombinaci průkazu mananu s průkazem protilátky antimananu metodou ELISA (Platelia Candida Ab, Bio- Rad) exprese antigenu na povrchu buněčné stěny je u jednotlivých druhů kandid rozdílná senzitivita testu závisí na druhu kandidy vyvolávající infekci ▪ Komerční testy identifikující: společně C. albicans a C. dubliniensis (Bichro-Latex Albicans, resp. ELITex Bicolor albi-dubli) C. dubliniensis (Bichro-Dubli, ELITex dubliniensis) C. krusei (Krusei Color, ELITex krusei) detekce je prováděna latexovou aglutinací s využitím monoklonálních protilátek proti antigenům buněčné stěny latexová aglutinace k průkazu kryptokoků, např. souprava Pastorex Cryptococcus (BioRad Laboratories) Aglutinační testy o (ELITex Bicolor albi-dubli) o identifikuje společně C. albicans a C. dubliniensis o červený latex + monoklonální protilátka o zelená disociační tekutina o koagulace blastokonidií nesoucích příslušný antigen s latexovými částicemi o červená sraženina v zeleném roztoku o Enzymatické testy ▪ průkaz činnosti specifických enzymů ▪ komerčně využíván pro rychlý screening především C. albicans a C. glabrata ▪ k identifikaci C. albicans jsou využívány L-prolin-aminopeptidáza a beta-galaktosaminidáza, např. BactiCard Candida (Remel) nebo AlbiQuick (Hardy Diagnostics) ▪ identifikace C. glabrata je založena na detekci enzymu trehalázy, někdy i maltázy, což zvyšuje specifitu testu, např. Glabrata RTT (Fumouze Diagnostics) nebo Rapid Trehalose Assimilation Broth (Remel) o Biochemické testy o definitivní druhové určení kvasinek o založeno na testování schopnosti utilizace různých zdrojů uhlíku, případně dusíku o biochemické reakce mohou probíhat aerobně nebo anaerobně o asimilace cukrů a dusíkatých látek- testy se obecně označují jako auxanogramy o štěpení cukrů (fermentace) - testy se označují zymogramy o komerční soupravy - založeny na testování schopnosti utilizace různých zdrojů uhlíku ▪ manuálních systémy - soupravy, které vyžadují ruční provedení a jejichž výsledky se posuzují prostým okem ▪ poloautomatizované, resp. plně automatizované systémy – vyhodnocení jednotlivých reakcí, případně technická příprava je prováděna pomocí přístrojů ▪ finální druhová identifikace se obvykle provádí numericky, nejčastěji pomocí osmičkového kódování, u sestav se širšími databázemi pomocí počítačových programů ▪ RapID Yeast Plus Systém (Remel) degradace specifických substrátů detekovaná různými indikátorovými systémy (5 testů prokazuje asimilaci a 13 hydrolýzu) jednoduchá inokulace identifikace po 4 hodinách při 30 °C dodatková činidla elektronické vyhodnocení spolehlivost výsledků 78% ▪ Uni-Yeast-Tek (Remel) kolorimetrická souprava asimilace 7 cukrů, průkaz utilizace KNO3, urey  uprostřed kukuřičný agar pro hodnocení mikromorfologie inkubace při 22–30 °C po dobu 2–7 dní. ▪ AUXACOLOR 2 obsahují 15 testů, z nich 13 prokazuje asimilaci sacharidů a alkoholů, zbylé dva citlivost k cykloheximidu a přítomnost fenoloxidázy vyhodnocení kolorimetrické, tj. na základě změny barvy média pro stanovení numerického profilu je nutné navíc vyhodnotit šest morfologických znaků 24 – 72 h inkubace při 30 °C spolehlivost výsledků 84% ▪ CandidaTest21 (Erba Lachema) asimilace 20 zdrojů uhlíku a utilizaci urey hodnotí se 13 turbidimetrických a 8 kolorimetrických reakcí, které je v určitých případech nutné doplnit o mikromofologické znaky inkubace při 25–30 °C po dobu 24 h. pro identifikaci je možné využít diagnostický program spolehlivost výsledků 87% ▪ API 20 C AUX (bioMérieux) asimilace 19 zdrojů uhlíku při 37 °C po dobu 48–72 h hodnocení turbidimetrické (porovnávání stupně zákalu s negativní kontrolou) v některých případech jsou vyžadovány dodatečné testy (utilizace KNO3, produkce ureázy nebo schopnost růstu při 42 °C) spolehlivost identifikace méně obvyklých druhů je vyšší než u souprav založených na hodnocení barevných změn spolehlivost výsledků 89% ▪ ID 32 C (bioMérieux) asimilace 24 cukrů, 5 organických kyselin, citlivost k cykloheximidu, hydrolýza eskulinu hodnocení intenzity zákalu lze provádět po inkubaci 48–72 h při 30 °C prostým okem nebo pomocí přístroje vyhodnocení testu se provádí na základě oktalového kódování pomocí programu Apiweb považována za jednu z nejspolehlivějších souprav (nejmenší chybovost v případě méně obvyklých druhů kvasinek) spolehlivost výsledků 96% ▪ Micronaut-C (Merlin Diagnostika) poloautomatizovaný systém vyhodnocován fotometrem, příp. vizuálně ▪ Vitek (bioMérieux) plně automatizovaný systém kolorimetrickou identifikaci kvasinek pomocí řady testů automatická identifikaci pomocí databáze, obsahující 52 kvasinkových druhů ▪ Biolog YT MicroPlate (Biolog) nejrozsáhlejší databáze využívá 94 biochemických testů v mikrotitrační destičce možno diferencovat 267 druhů kvasinek z 53 rodů výsledky jsou přístrojově vyhodnoceny celkem třikrát, za 24, 48 a 72 h kultury je před testováním nutno inkubovat na BUY agaru (Biolog) při 30 °C o Hemokultivace ▪ odběr krve pacienta a inokulace do hemokultivačního média v lahvičkách, které jsou pak dále inkubovány a sledovány v automatickém systému ▪ standardně jsou očkovány lahvičky určené pro aerobní kultivaci, případně jsou doplňovány i o lahvičky pro kultivaci anaerobní ▪ při podezření na mykologickou infekci – speciální mykologiké lahvičky ▪ hemokultivační vyšetření (HMK) je jedno z nejpřínosnějších vyšetření při podezření na invazivní kandidózu ▪ cílem je nejen informovat o pozitivním výsledku, ale i včas identifikovat původce infekce  ▪ odběr HMK před zahájením terapie, a to minimálně dva odběry (2x 7–10 ml) s časovým odstupem (max. do hodiny) nebo ze dvou různých odběrových míst ▪ odběr po zahájení terapie – lahvičky se sorbentem ▪ doporučuje se, aby byly lahvičky s hemokulturou vloženy do automatického kultivačního systému do jedné hodiny od jejich inokulace ▪ systém monitoruje produkci CO2 množících se mikroorganismů ▪ automatické systémy kolorimetrický systém BacT/Alert (bioMérieux, Francie) o přítomnost CO2 je monitorována pomocí kolorimetrického senzoru v každé lahvičce o výsledkem je změna barvy indikátoru (z tmavě zelené na žlutou) o přístrojem je detekována i nepatrná změna barvy senzoru o pozitivita či negativita vzorků je určována pomocí rozhodovacího programu o vzorky jsou automaticky monitorovány a vyhodnocovány každých 10 minut o inkubace probíhá při 35 – 370C fluorimetrický systém Bactec (Becton Dickinson, USA) o systém využívá k detekci CO2 principu fluorescence o hemokultivační nádobky mají na dně senzitivní vrstvu, která je od média oddělena speciální membránou propouštějící pouze CO2 o CO2 reaguje s vodou za vzniku kys. uhličité, přičemž klesá lokální pH o hodnota pH má vliv na množství fluorescence a nepřímo se tak měří množství CO2 vzniklé při metabolismu mikroorganismů o inkubace probíhá při 350C o hodnota TTD (time to detection) je uváděna u každé pozitivní hemokultury o TTD je dobu (v hodinách) od vložení nádobky do přístroje do vyhodnocení pozitivity o pokud nedojde do sedmi dnů k ohlášení pozitivity, je hemokultura považována za negativní o TTD závisí na druhu mikroorganismu a na jeho množství v odebrané krvi o vysoká záchytnost kandid v mykologickém médiu, srovnatelná v obou systémech o doba růstu C. glabrata 2x delší než C. albicans a 3x delší než C. tropicalis o C. glabrata – nejvyšší mortalita o Histologický průkaz ▪ průkaz blastokonidií či pseudomycelií pomocí histochemických metod z tkáně ▪ popíšeme i míru postižení okolní tkáně, invazivitu procesu a přítomnost zánětu v okolí ▪ nutnost odeslání vzorku na mykologickou kultivaci ▪ barvení HE (hematoxilin-eozin) – namodralé zbarvení PAS (periodic acid Schiff) – červené zbarvení o při oxidaci polysacharidů kyselinou jodistou vznikají aldehydy, které reagují o s Schiffovým reagens a vytváří komplex s fialově červeným zbarvením stříbření dle Grocotta – černé zbarvení o Kyselina chromová převádí složky buněčné stěny mikromycet na aldehydické sloučeniny, které mají redukční vlastnosti, díky čemuž jsou schopné z pracovního roztoku redukovat elementární stříbro, které se stává viditelným v místě jejich výskytu o Laboratorní diagnostika invazivní kandidózy ▪ Podle kritérií EORTC/MSG za prokázanou invazivní kandidózu je považována infekce potvrzená histologicky nebo mikroskopicky průkazem blastokonidií či pseudomycelií ve vzorku získaném invazivními technikami (biopticky, peroperačně, endoskopicky) nebo kultivačně ze vzorku asepticky odebraného z normálně sterilních lokalit vykazujících klinické či radiologické známky infekce ▪ pro průkaz invazivních onemocnění vyvolaných Cryptococcus neoformans je uznáván průkaz antigenu latexovou aglutinací v mozkomíšním moku  ▪ MALDI-TOF MS analýza buněčných proteinů hmotnostní spektrometrií hmotnostní spektrometrie je založena na rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových hmotností v elektrickém a magnetickém poli rychlá a velmi přesná identifikaci bakterií, plísní a kvasinek Příprava vzorku o jednotlivé kolonie jsou přeneseny na určitou pozici nosiče – terčíku MALDI target o vzorek je ošetřen speciální matricí a usušen Princip o laser ozáří směs vzorku a matrice o matrice absorbuje energii pulsu a její rozklad ionizuje molekuly vzorku, především ve vysokých koncentracích přítomné ribozomální proteiny o pozitivně nabité ionty jsou pak na krátkou vzdálenost urychleny silným elektrickým polem a vstupují do vakua v trubici detektoru, kde se pohybují rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji Vyhodnocení výsledků o vzorek (tj. kolonie mikroorganismu) je druhově identifikován porovnáním jeho hmotnostního spektra s databází o výstupem srovnávacího algoritmu je druhová identifikace mikroorganizmu s přiřazenou hodnotou skóre Výhody o vysoce přesná o aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů o mnohem rychlejší ve srovnání s tradičními metodami (provedení samotné analýzy v řádu minut) o ekonomicky efektivní Nevýhody o vysoké pořizovací náklady Aspergilózy zástupci rodu Aspergillus - popsáno 339 druhů, kolem 40 druhů popsáno jako původci mykotických infekcí u člověka oportunní patogeni saprofyté celosvětově rozšířeni, jsou přítomny v půdě, ve vzduchu, v rostlinných i živočišných zbytcích častý kontaminant potravin a krmiv aspergilóza je po kandidóze druhé nejčastější mykotické onemocnění u silně imunokompromitovaných pacientů  Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans Postižení respiračního systému má 3 základní formy: o alergickou plicní aspergilózu o plicní aspergilom o invazivní aspergilózu (IA) původci povrchových infekcích – onychomykózy (mykóza nehtového aparátu) původci infekce zevního zvukovodu – otomykózy původci myktoxikóz - producenti mykotoxinů (aflatoxin) poškozujících ledviny a játra, zdrojem jsou zejména arašídy, oříšky kešu, pistácie a sušené plody Alergická plicní aspergilóza o bronchiální astma, exogenní alergická alveolitida a alergická bronchopulmonální aspergilóza (ABPA) o plicní onemocnění způsobené hypersenzitivitou k aspergilovým antigenům při kolonizaci dolních dýchacích cest aspergily o postihuje především nemocné s astmatem a cystickou fibrózou o výskyt ABPA v populaci: u astmatiků se uvádí 1-2 %, u nemocných s cystickou fibrózou cca 8-10 % o při tomto onemocnění jsou dýchací cesty kolonizovány aspergilem, k invazi do organizmu nedochází o klinickými příznaky jsou kašel, dušnost, teplota o Diagnostiká kritéria alergické bronchopulmonální aspergilózy (ABPA) ▪ astma ▪ okamžitá kožní reakce na Aspergillus ▪ kultivační průkaz aspergila ve sputu, přítomnost IgG a IgE proti A. fumigatus v séru ▪ výskyt plícních infiltrátů na CT hrudníka ▪ eozinofílie v krvi, ve sputu a v bronchoalveolární laváži ▪ průkaz aspergilového antigenu v séru Aspergilom o u pacientů s preexistujícími dutinami v plících o aspergilom je projevem saprofytické kolonizace plicních dutin vzniklých většinou po prodělané plicní tuberkulóze, z rozpadlého tumoru (Jovresova kaverna), při invazivní plicní aspergilóze o houba do okolní tkáně neinvaduje, ani nedochází k diseminaci infekce o rentgenologický nález ukáže typický obraz vzdušné dutiny s pohyblivým kulovitým útvarem uvnitř, který je tvořen shlukem hyf, zbytků tkání, fibrinu a zánětlivých buněk Aspergilom – diagnostika o rentgen nebo CT hrudníku o kultivace ze sputa je pozitivní jen v 50 % případech o přítomnost protilátek IgG proti A. fumigatus Invazivní aspergilóza (IA) o k infekci dochází aspirací konidií ze vzduchu o plicní (80-90%) nebo sinonazální infekce u imunosuprimovaných jedinců o podle invaze do plicních struktur se rozlišují 3 typy plicní aspergilózy – bronchoinvazivní aspergilóza, angioinvazivní aspergilóza a nekrotizující aspergilóza o u 10 – 20% případů infekce diseminují do CNS, kůže či jiných lokalit o příznaky plicní IA je neustupující horečka i přes léčbu ATB, kašel, bolest na hrudi, dušnost o při invazivní sinonazální aspergilóze dominují příznaky: horečka, kašel, bolest hlavy, výtok z nosu, lokální bolest, bolest v krku o při šíření infekce krevním řečištěm dosahuje mortalita 50 – 100% o konidie pronikají do alveolů, kde v závislosti na stavu hostitele o postupně vyrůstají ve formě hyfových vláken o růst mycelia má 3 fáze: ▪ 1. fáze logaritmického růstu - bohatá látková výměna spojená s tvorbou organických substrátů nutných k výstavbě myceliální stěny. Je podmíněna dostatkem živin a hlavně glukózy v okolní tkáni. V této fázi může být uvolňován galaktomanan, který pak detekujeme v materiálu z dolních dýchacích cest nebo v séru. ▪ 2. fáze stacionární - po vyčerpání zdrojů glukózy ▪ 3. fáze - lýza a destrukce hyf o Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, vzácně pak A. oryzae o Diagnostika IFD (invazivní mykotické onemocnění) ▪ Podle mezinárodních kritérií jsou IFD děleny: Prokázané  pravděpodobné možné ▪ Mezinárodních kritéria: přítomnost predispozičních faktorů klinické projevy onemocnění (dušnost, radiologický nález plicních infiltrátů) průkaz mykózy pomocí mikrobiologických technik (přímá mikroskopie, kultivace klinického materiálu, detekce antigenů, histologický průkaz mykotických vláken ve tkáni) nestandardizované postupy – panfungální PCR, specifická PCR v reálném čase o Prokázaná invazivní aspergilóza ▪ histo/cytopatologický průkaz vláken získané aspirací tenkou jehlou nebo z bioptického vzorku tkáně s průkazným vztahem (mikroskopicky nebo nesporně zobrazovací technikou) k poškozené tkáni nebo ▪ pozitivní kultivace ze vzorku získaného sterilním odběrem z normálně sterilního místa (s výjimkou vzorků moči a sliznic), které klinicky nebo radiologicky odpovídá místu infekce o Pravděpodobná invazivní aspergilóza ▪ přítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a jednoho mikrobiologického kritéria a jednoho velkého (nebo dvou malých) klinických kritérií s klinickými projevy místa (orgánu) odpovídajícími infekci o Možná invazivní aspergilóza ▪ přítomnost alespoň jednoho z rizikových faktorů hostitele a buď jeden mikrobiologický faktor nebo jeden velký klinický faktor (nebo dva malé) odpovídající infekci o Mikrobiologické faktory (IA) ▪ pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. Ze sputa nebo BAL ▪ pozitivní kultivace nebo mikroskopický průkaz Aspergillus spp. Z aspirátu ze sinusů ▪ pozitivní antigen – galaktomanan – v BAL, likvoru, krvi (v krvi minimálně ze dvou po sobě jdoucích odběrů) o Klinický materiál pro mykologické vyšetření (IA) ▪ za ideální se považují vzorky odebrané přímo z podezřelého ložiska invazivními technikami (biopticky, endoskopicky, peroperačně) ▪ v případě, že nemáme tuto možnost, snažíme se odebrat materiál z postižené lokality, např. BAL při postižení plic, výplach z dutin, mok při ložiskovém postižením CNS ▪ technika odběru by měla maximálně omezit možnost kontaminace vzorku ▪ při malém množství získaného materiálu nebo hrozí-li vyschnutí, je vhodnější odebírat přímo do tekutého kultivačního media nebo sterilního fyziologického roztoku ▪ vzorky dodáme do laboratoře co nejrychleji, v případě nutnosti uchováváme při 4 °C, materiál odebraný do kultivačních medií uchováváme při pokojové teplotě o Diagnostika IA ▪ Mikroskopické metody: septované hyfy s charakteristickým dichotomickým větvením o histologický průkaz (PAS, stříbření dle Grocotta, barvení HE) o nativní preparát o barvení podle Grama ▪ Kultivace klinického materiálu : kultivační průkaz ze sterilních tkání získaných biopsií, bronchoalveolární laváže, pleurálního výpotku, hemokultury kultivace na Sabouraudově glukózovém agaru při 30 – 37 °C, následná identifikace na diagnostických médiích nejdříve můžeme očekávat narostlé kolonie aspergilů za 24–48 hod u druhu Aspergillus fumigatus nebo Aspergillus flavus kultivační vyšetření má vysokou specifitu (92 %) v případě pozitivního nálezu, ale nízkou senzitivitu (50 % a méně) ve srovnání s dalšími metodami ▪ Interpretace nálezu významný je nález oportunních patogenů z primárně sterilních lokalit (krev, mozkomíšní mok, bioptické tkáně) při izolaci z materiálů, jako je sputum nebo i sekret z dolních dýchacích cest (DDC), musí být nález interpretován s velkou opatrností o Nekultivační diagnostické metody ▪ metody sérologické – využívající detekci antigenů, protilátek nebo metabolitů ▪ metody molekulárně genetické – detekující nukleové kyseliny aspergilů ▪ Detekce galaktomananu zástupci rodu Aspergillus uvolňují při svém růstu do okolí exoantigeny, které mohou být detekovány v tělesných tekutinách jedním z těchto exoantigenů je termostabilní heteropolysacharid, který je součástí buněčné stěny houby – galaktomanan (GM) na zvířecích modelech byla prokázána korelace mezi mykotickou náloží ve tkáních a množstvím detekovatelného GM v séru faktory ovlivňující množství GM: fáze růstu hyf, mikroprostředí, ve kterém probíhá infekce, imunitní stav jedince, stav funkce ledvin a antimykotická léčba pravidelný a rutinní monitoring GM umožňuje zkrátit časový interval do stanovení diagnózy pro jeho detekci je možno použít latexovou aglutinaci a zejména sendvičovou ELISu metody se liší detekčním limitem i senzitivitou komerčního užití – latexová aglutinace (Pastorex Aspergillus, BioRad) a sendvičová ELISA (Platelia Aspergillus, BioRad, Francie) oba komerční sety využívají vazbu antigenu s králičí monoklonální protilátkou EB-A2 ELISA – vyšší citlivost, výsledek je udáván jako index pozitivity (IP) – tj. poměr mezi optickou denzitou testovaného vzorku a optickou denzitou kontrolního séra obsahujícího přibližně 1 ng GM/ml o pozitivní se označuje vzorek s IP > 0,5 o pozitivní pacient je nemocný s více než 2 po sobě jdoucími pozitivními odběry o test je primárně určen pro detekci GM v séru, ale lze ho použít k detekci GM i v jiných tělesných tekutinách ev. v tkáních ▪ Detekce 1,3-ß-D glukanu součástí buněčné stěny většiny hub glukan se vylučuje o něco později než galaktomanan a jeho koncentrace je nižší pro laboratorní diagnostiku se využívá schopnosti glukanu reagovat s lyzátem amébocytů ostrorepa Komerční kity: o FungitellTM, cutt-off 80 pg/ml, kolorimetrická o Fungitec GTM, cutt-off 20 pg/ml, kolorimetrická o Wako WB003, cutt-off 11 pg/ml, turbidimetrická ▪ Cut-off je hodnota tzv.cut-off indexu pozitivity (cut-off IP), tedy hodnota indexu pozitivity, od které je vzorek označen jako pozitivní a ovlivňuje senzitivitu testu Výhody o pozitivita v časných stadiích invaze houby o široké spektrum patogenů, které lze detekovat (i nevýhoda) o umožňuje monitorovat status infekce a léčebnou odpověď Nevýhody o vysoká cena o laboratorní náročnost o falešné pozitivity (např. laboratorní kontaminace) o falešné negativity (malé množství materiálu vstupujícího do reakce (5 μl), vysoká koncentrace bilirubinu) Využití v diagnostice o verifikaci infekcí vzácnými mykotickými agens o konfirmace falešných pozitivit GM  Identifikace druhů rodu Aspergillus o makroskopická a mikroskopická morfologie o sledování produkce sekundárních metabolitů o molekulární genetika o Molekulárně genetické metody ▪ specifická PCR v reálném čase – kvantifikace fungální nálože ▪ identifikace do rodu a druhu – části genu pro rRNA (18S, 5,8S a 28S) nebo sekvence mezerníků (ITS) ▪ pro sledování genetické příbuznosti druhů je u aspergilů nutná sekvenční analýza dalších lokusů o Vnitrodruhová typizace aspergilů ▪ PCR-RFLP s následnou sekvenční analýzou genu pro ß-tubulin (benA) či genu rodlet A (rodA) - pro rozlišení druhů fenotypicky podobných A. fumigatus ▪ multilokusová sekvenční typizace (MLST) – sekvenování fragmentů „referenčních“ genů – využívána pro rutinní typizaci umožňující mezinárodní srovnávání izolátů o Aspergillus – makroskopické znaky ▪ rychle rostoucí, plně vybarvené kolonie do pěti dnů ▪ kolonie bohatě pigmentované (v odstínech žlutozelené, hnědé a černošedé) ▪ pigmentace je výrazná na Czapek-Doxově agaru (CZ) ▪ kolonie se hodnotí na standardních živných médiích: Czapkův agar s kvasničným extraktem (CYA), agar se sladovým extraktem (MEA), CZ při standardní kultivační teplotě: 25°C, 37°C ▪ Makroskopické znaky: rychlost růstu zbarvení kolonií, spodní strany kolonií, povrchová struktura kolonií velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech vzhled konidiální hlavice pod binokulární lupou ▪ Nativní preparát: vlákna hub se špatně smáčejí a v preparátu často bývají vzduchové bubliny, je lépe použít místo vody 10 až 20% vodný roztok glycerolu, který nevysychá tak rychle. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kys. mléčnou. o Nepohlavní stádium ▪ konidiofor vyrůstá přímo ze substrátu nebo ze vzdušných hyf ▪ měchýřek (kolumelu) ▪ fialidy (konidiogenní buňky) v jedné nebo ve dvou řadách nad sebou (uniseriátní a biseriátní) ▪ konidiální hlavice - měchýřek s fialidami a řetězci konidií ▪ tlustostěnné buňky zvané „Hülle cells“ ▪  o Pohlavní stadium ▪ Tvorba drobných plodnic (menších než 1mm) typu kleistothecium ▪ teleomorfa Eurotium, Emericella, Neosartorya ▪ Kleistothecium: uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána Aspergillus fumigatus kontaminant potravin, oportunní patogen člověka a jiných živočichů častý ve vlhkém, teplém prostředí (kompost, ale i zvlhčovací systémy, obytné prostory) zodpovědný za 90% všech případů IA termotolerantní - roste i při 55°C adaptace na nedostatek kyslíku > přežití v zánětlivé tkáni a umožňuje šíření do jiných orgánů produkuje mykotoxiny gliotoxin, verruculogen, fumitremorginy aj. dvě podskupiny – ve vzduchu a ve vodě druhy fenotypicky podobné: A. lentulus, A. viridinutans, Neosartorya fischeri, N. pseudofischeri, N. undagawae diagnostcký znak: A. fumigatus roste při teplotě 50°C a neroste při 10°C, kdy ostatní zaměnitelné druhy rostou (výjimkou je A. viridinutans) kolonie rychle rostoucí při 25 i 37°C, zelené, sametové konidiofory uniseriátní s široce kyjovitým měchýřkem konidiální hlavice typicky sloupcovité konidie kulovité nebo téměř kulovité, zelené, bradavčité, 2,5-3 μm v průměru Aspergillus flavus rychle rostoucí, žlutozelené, roste i při teplotě až 48 °C výskyt v půdě, na potravinách (arašídy, koření, obiloviny) produkuje aflatoxin B1, 3-nitropropionovou kyselinu, kojovou, aspergilovou a cyklopiazonovou kyselinu z 10% původce bronchopulmonárních infekcí konidiofory biseriátní i uniseriátní, bradavičnaté s kulovitým nebo téměř kulovitým měchýřkem konidiální hlavice paprsčité konidie kulovité nebo téměř kulovité, bradavčité Aspergillus niger kontaminant potravin rostlinného tak i živočišného původu produkuje naphtho-4-pyrony, malforminy a u několika kmenů produkce ochratoxinu A z 5% původcem IA, otomykózy optimální klíčivost konidií v acidofilním prostředí teplotní optimum je 30°C specifickým diagnostický znakem je přítomnost kalcium oxalátum ve formě krystalů v patologickém vzorku kolonie rychle rostoucí, černé, zrnité, často produkuje žlutý pigment do agaru konidiofory biseriátní, hladké s kulovitým měchýřkem konidiální hlavice paprsčité konidie kulovité nebo téměř kulovité, černé, nepravidelně bradavčité, 3,5-5 μm v průměru Aspergillus terreus rychle rostoucí, okrové, sametové, roste i v 37 °C na potravinách a v budovách, bývá izolován i z půdy původce IA se sklonem k diseminaci, sekundární kožní infekce konidiofory biseriátní, hladké s téměř kulovitým měchýřkem konidiální hlavice sloupcovité konidie kulovité až elipsoidní, hladké, malé, 1,5 - 2,5 μm v průměru na substrátovém myceliu se tvoří kulovité buňky Aspergillus nidulans kolonie rychle rostoucí při 25 i 37 °C, sametové, zelené tvorba plodnic – syn. teleomorfa Emericella nidulans kontaminant potravin  produkuje mykotoxin sterigmatocystin aj. vyskytuje se vzácně, virulentnější než A. fumigatus, vyšší rezistence k některým antimykotikům plodnice kulovité, 100-300 μm v průměru, obalené vrstvou světle žlutých až béžových „hülle cells“ vřecka kulovitá, s 8 askosporami, askospory červené, čočkovité, hladké konidiofory biseriátní, hladké, nahnědlé s kulovitým měchýřkem konidie v řetízcích, kulovité, bradavčité Mukormykózy (zygomykózy) ubikvitní saprofyté z řádu Mucorales (na rostlinách, organických substrátech, v půdě, na exkrementech) kontaminantami klinického matriálu z prostředí (snadno se šíří vzduchem) vzácné oportunní infekce s vysokou mírou mortality rostoucí tendence výskytu u pacientů imunosuprimovaných, fagocytóza je důležitým obranným mechanizmem respirační cesta, kožní poranění invazivní infekce - rhinocerebrální a pulmonární mukormykózy, vzácněji gastrointestinální kožní infekce u těžkých popálenin a závažných poranění otomykózy zevního zvukovodu (starší diabetici) rhinocerebrální forma o postihuje hlavně diabetiky s acidózou o začíná ve vedlejších dutinách nosních odkud se šíří do očnicové dutiny a dále zasahuje CNS o vyvolá obstrukci nosu, mohutné zduření nosu, tváří a horního rtu, otok očnice o postižená tkáň nekrotizuje o k úmrtí dochází v průběhu 1 – 2 týdnů pulmonární forma o postihuje hlavně pacienty s těžkou neutropenií, s hematogenními malignitami, po transplantaci kožní dřeně a po dlouhodobé léčbě kortikosteroidy gastrointestinální forma o vzniká vzácně u nedonošených dětí, podvyživených pacientů a pacientů s postižením střev otomykóza - zánět zevního zvukovodu projevující se vatovitým povlakem od žlutobělavé po zelenočernou barvu ve zvukovodu afinita hyf ke stěnám velkých cév, do kterých prorůstají + rychlý růst => živého trombu (spleť hyf, trombocytů, lymfocytů) => embolii => smrti jsou rezistentní k antimykotikům, účinný je pouze amfotericin B (nasazení do 6 dnů od vzniku mykózy) klinicky významné rody Rhizopus, Mucor, Rhizomucor,Lichtheimia(Absidia), Cuninghamella z Mucorales invazivní mukormykózy – Rhizopus microsporus, Rhizopus oryzae, Rhizomucor pussillus, Lichtheimia corymbifera, Cuninghamella bertholletiae, Apophysomyces elegans Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales mnohojaderné (coenocytické) neseptované mycelium, přehrádky pro oddělení rozmnožovacích struktur buněčná stěna tvořená chitinem nepohlavní rozmnožování pomocí sporangiospor uvnitř sporangií nesených sporangiofory sporangia - monosporická, multisporická vývojově odvozenější druhy – redukce počtu spor u řady zástupců přítomnost kolumely (sterilní sloupeček) případně s apofýzou sporangium se otvírá rozpadem stěny, na bázi zůstává tzv. límeček apofýza - rozšířená část sporangioforu přímo pod sporangiem rhizoidy stolony životní cyklus haplobiotický s převahou haploidní generace – vegetativní stélka je haploidní, zygota je jedinou diploidní buňkou, při jejím klíčení proběhne meióza a vyroste nová haploidní stélka o pohlavní proces – gametangiogamie – vzniká zygospora o homotalické druhy – gametangia vznikají i na stejném myceliu o heterotalické druhy – gametangia vznikají na pohlavně odlišných myceliích (+ a –) Kultivační média vhodná pro identifikaci zygomycetů o kultivačně nenáročné o sladinový agar (SL) o agar s maltextraktem (MEA) termofilní, max. 50 – 52°C o bramborodextrózový agar (PDA)  o Sabouraudův agar (SAB) a podobná média s obsahem peptonu, kvasničného extraktu nebo maltextraktu o rostou rychle 1-3 dny (mycelium) o kultivační podmínky: při 25 °C a 37 °C po dobu 3-7 dní o některé druhy je vhodné kultivovat i při 45 °C nebo 50 °C. o zygospory se tvoří obvykle při 20 °C Rhizopus o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae o Rhizopus microsporus, Rhizopus oryzae o nejčastější původce mukormykózy o stolony, svazečky sporangioforů, rhizoidy o deštníkový tvar kolumely o Rhizopus microsporus ▪ kolonie světle hnědé až šedé, výška 10 mm ▪ termofilní, max. 50 – 52°C ▪ heterothalický druh ▪ stolony a rhizoidy vytvořeny; rhizoidy jednoduché ▪ sporangiofory hnědavé, vyrůstají po 1-2 na stolonech proti rhizoidům ▪ sporangia šedočerná ▪ kolumely téměř kulovité až kuželovité, šedavé ▪ sporangiospory angulární (hranaté) a široce elipsoidní, na povrchu zřetelně podélně rýhované. ▪ zygospory se tvoří nejlépe při 30° C na mediu YEA, jsou červenohnědé, na povrchu s hvězdicovitou ornamentací; suspenzory nestejné, proti sobě postavené o Rhizopus oryzae ▪ od R. microsporus se liší delšími sporangiofory, ▪ většími rhizoidy a neschopností růstu při 50 °C Mucor o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae o M. circinelloides, M. indicus, M. ramosissimus a M. amphibiorum o rhinocerebrální mukoromykózy, infekce těžkých popálenin, otomykózy zevního zvukovodu o sporangiofory větvené nebo nevětvené bez rhizoidů a stolonů mnohosporová sporangia s kolumelou o Mucor circinelloides ▪ sporangiofory opakovaně sympodiálně větvené; větve různé délky, často circinátní (silně zahnuté) ▪ max. růstová teplota 37°C Absidia o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Cunninghamellaceae o kontaminanta klinického materiálu o Absidia coerulea ▪ kolonie s fialovým až modrofialovým odstínem ▪ neroste při 37 °C ▪ stolony, rhizoidy, svazečky sporangioforů ▪ kolumely s větším zaobleným výběžkem a typickou apofýzou Lichtheimia o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Lichtheimiaceae o Lichtheimia corymbifera (syn. Absidia corymbifera, Mycocladus corymbifer) ▪ infekce vzácné, zejména u hematoonkologických pacientů ▪ kolonie rychle rostoucí, vysoké, světle šedé ▪ termotolerantní, max. 45-50°C ▪ stolony a rhizoidy nezřetelné ▪ sporangiofory jednoduché i rozvětvené; tvořící přeslen ▪ kolumely typicky kuželovité, s jedním nebo s několika krátkými výběžky na vrcholku  ▪ obří buňky („giant cells“) různého tvaru a velikosti, hojné ve vzdušném myceliu ▪ od rodu Absidia se liší umístěním přehrádky pod apofýzou ve větší vzdálenosti a růstem při 37 °C Rhizomucor o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Lichtheimiaceae o Rhizomucor pusillus ▪ kolonie nízké, modrošedé, později šedohnědé ▪ termofilní druh, max. 55°C ▪ od rodu Rhizopus se liší tvorbou větvených sporangioforů a méně vyvinutými rhizoidy ▪ od rodu Mucor se liší především tvorbou rhizoidů ▪ hnědavé rhizoidy ▪ sporangiofory větvené monopodiálně nebo sympodiálně většinou pod vrcholkem Apophysomyces o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae o Apophysomyces elegans ▪ kolonie rychle rostoucí, žluté až hnědošedé sporangiofory větvené monopodiálně nebo sympodiálně většinou pod vrcholkem ▪ rostou i na médiích s cykloheximidem ▪ na běžných médiích nesporuluje ▪ rhizoidy ▪ sporangiofory nevětvené, vyrůstají jednotlivě z hyfového segmentu připomínajícího „foot cells“ u rodu Aspergillus ▪ apofýza nálevkovitého nebo zvoncovitého tvaru ▪ kolumela půlkulatá ▪ sporangia hruškovitého tvaru ▪ sporangiospory hladké, podlouhlé, světle hnědé Saksenaea vasiformis o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Saksenaeaceae o kolonie šedé, na běžných médiích nesporuluje o sporangiofory jednotlivě, nevětvené o dichotomicky větvené rhizoidy o terminální sporangia lahvicovitého tvaru s kolumelou Laboratorní identifikace Apophysomyces elegans a Saksenaea vasiformis o Metoda indukující sporulaci zygomycet (Padhey a Ajello, 1988): ▪ kultivace kultury na SDA (Sabouraud Dextrose Agar) při 26°C, 1 týden ▪ vyříznutí malého agarového bloku (1cm2) s kulturou ▪ transfer bloku do středu Petriho misky s obsahem 20 ml sterilní destilované vody a 0,2 ml sterilního 10% kvasničního extraktu ▪ inkubace ve vodním roztoku při 35-37°C ▪ po 5 dnech kultivace se na povrchu vody vytvoří tenký film ▪ zhotovení preparátu (bavlníková modř v laktofenolu) z části tenkého filmu po 5, 10 a 15 dnech inkubace Cunninghamella o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Cunninghamellaceae o Cunninghamella bertholletiae ▪ infekce osob s poruchami imunity ▪ původce nemocničních nákaz ▪ kolonie bílé, později šedé ▪ termofilní druh, max. 45°C ▪ rhizoidy vyvinuté, stolony chybí ▪ sporangiofory vzpřímené, větvené, zakončené sporogenními hlavicemi (vezikuly) ▪ sporogenní hlavice pokryté krátkými stopkami nesoucími sporangioly (jednosporová sporangia) na povrchu ostnité Syncephalastrum o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Syncephalastraceae  o Syncephalastrum racemosum ▪ kontaminanta klinického materiálu ▪ kolonie rychle rostoucí, zprvu bílé, později tmavošedé ▪ max. růstová teplota 40°C, rhizoidy vyvinuté ▪ sporangiofory jednoduché, později nepravidelně větvené, vzpřímené nebo poléhavé, často podobné stolonům, nepravidelně přehrádkované, zakončené kulovitými sporogenními hlavicemi (vezikuly) ▪ merosporangia na povrchu vezikuly; obsahují jednu řadu sporangiospor Cokeromyces recurvatus o Fungi, Mucoromycota, Mucoromycotina, Mucorales, Thamnidiaceae o koprofilní, z trusu hlodavců a ještěrek, také z půdy o příležitostný patogen člověka o kolonie nízké, s nepravidelným okrajem, hnědé až černé barvy o stolony nejsou vyvinuty o sporangiofory jednoduché, terminálně vytvářejí kulovité zduřeniny, nesoucí několikasporové sporangioly na stočených sekundárních sporoforech o sporangioly mají kolumelu a obsahují 10-25 sporangiospor Basidiobolus o Fungi, Fungi, Zoopagomycota, Entomophthoromycotina, Basidiobolomycete, Basidiobolales, Basidiobolaceae o Basidiobolus ranarum ▪ běžnou součástí mikroflóry zažívacího traktu zvířat, na odumřelých rostlinách, exkrementy plazů a obojživelníků ▪ původce podkožní infekce, méně často gastrointestinální infekce ▪ výskyt v tropických oblastech ▪ kolonie krémově šedé, radiálně zvrásněné ▪ satelitní kolonie se tvoří klíčením konidie odmrštěné z primární kolonie ▪ hyfy veget. mycelia septované, složeny z krátkých 1jaderných segmentů ▪ dva typy nepohlavních spor ▪ sporangiofory subterminálně zduřelé odmršťují primární kulovité sporangioly ▪ sekundární hruškovité sporangioly se pasivně oddělují od krátkých úzkých sporangioforů ▪ přenos do hostitelského organizmu: trávicím traktem obojživelníků (komenzál) => hmyz => hostitel Conidiobolus o Fungi, Zoopagomycota, Entomophthoromycotina, Entomophthoromycetes, Entomophthorales, Ancylistaceae o C. coronatus, C. incongruus , C. lamprauges o saprotrofní houby, vyskytující se v půdě, na opadu a na trusu o mohou být příčinou mykóz u lidí, koní nebo jiných savců (např. rhinoentomophthoromykózy) o tropické oblasti Afriky o mnohojaderné primární a sekundární sporangioly na vrcholu nevětvených sporangioforů o primární sporangiola často vyklíčí a vytvoří menší sekundární sporangiolu (exogenní konidii), která je znovu odmrštěna o morfologicky i způsobem odstřelení jsou sekundární sporangioly podobné primárním sporangiolám o stěna mezi sporangiolou a sporangioforem je ve zralosti složená ze tří vrstev; střední lamela se rozpustí a spora je papilárním vyklenutím prudce odmrštěna; papila zůstává patrná i po odmrštění o ve starší kultuře se tvoří spory (chlamydospory) s vlasovými přívěsky na povrchu Mukormykózy – diagnostika o možnosti diagnostiky značně omezené  o komerčně dostupné, jednoduché a spolehlivé metody nejsou k dispozici o soubor klinických, radiologických, histologických a mikrobiologických metod o kultivační průkaz stojí až na druhém místě, umožní bližší identifikaci o přímý mikroskopický průkaz hyf typických pro zygomycety v postižené tkáni o PCR (od roku 2008) o nepodkročitelné minimum laboratorní diagnostiky – identifikace na úroveň rodu Mucor spp., Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Lichtheimia spp. o klinický materiál: stěry z kožních lézí , biopsie plicních lézí , stěry a aspiráty z nosních dutin, biopsie o upozornění: coenocytické hyfy bývají často při odběru a zpracování klinického materiálu (homogenizace) poškozené a stávají se neživotaschopnými a tudíž obtížně kultivovatelnými o pro kultivační průkaz je zapotřebí se vyhnout nadměrnému poškození tkáně při odběru a laboratorním zpracování vzorků o prokazatelné přímou mikroskopií: stěry, sputum a exudát – louhový preparát (MycoInk, Calcofluor) o tkáňové řezy se barví pomocí HE, PAS, a stříbření dle Grocotta o vzorky se vyznačují přítomností širokých (6-15 μm), tenkostěnných, zřídka septovaných hyf, nepravidelně větvených v odstupu 90° Hyalohyfomykózy obecný termín používaný pro skupinu mykotických infekcí, jejichž původci jsou zástupci hyalinních hyfomycet (nepigmentované), které nejsou původci jinak pojmenovaných infekcí, např. aspergilózy k původcům patří Penicillium, Paecilomyces, Acremonium, Beauveria, Fusarium a Scopulariopsis tyto houby žijí jako saprofyté na rozkládající se organické hmotě a jejich konidie se šíří vzduchem klinické projevy hyalohyfomykózy mohou být neškodné saprofytické kolonizace až akutní invazivní onemocnění vyvolávají onemocnění u imunokompromitovaných pacientů, zejména u pacientů s leukémií nebo po transplantaci kostní dřeně, léčbě kortikosteroidy, cytotoxické chemoterapie a v menší míře u pacientů s AIDS Fusarium o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales, Nectriaceae o výskyt na substrátech rostlinného původu, kontaminant krmiv, obilí, významný producent mykotoxinů (fumonisiny, zearalenon,moniliformin aj.), fytopatogenní druhy a oportunní patogeni člověka (Fusarium oxysporum a Fusarium solani) o charakteristický tvorbou vícebuněčných zakřivených makrokonidií (česky srpatka) o při porušení povrchových bariér – karatokonjuktivitidu (při poškození rohovky) a onychomykózu (již narušených nehtů) o u osob s vážně oslabeným imunitním systémem může dojít k rozvoji invazivní infekce o využití: Fusarium venenatum – Quorn (masová náhražka) o Média doporučená pro identifikaci: ▪ makroznaky kolonií - bramboro-dextrózový agar (PDA) a bramboro-sacharózový agar (PSA), 25°C, tma ▪ mikroznaky - Synthetic Nutrient-Poor Agar (SNA), 25°C, 12 hod. světlo blízké UV/12 hod. tma ▪ Makroznaky barva kolonie zbarvení spodní strany kolonií rychlost růstu vůně ▪ Mikroznaky mikrokonidie – tvar, velikost, tvorba řetízků nebo shluků makrokonidie – tvar, velikost, tvar nožní a apikální buňky typ fialid – monofialidy, polyfialidy, tvar chlamydospory – schopnost tvorby (terminální, interkalární, jednotlivě, ve shlucích, v řetízcích sporodochium – polštářkovitý útvar hyf s palisádovitě uspořádanými konidiofory na povrchu hostitele o Fusarium solani Penicillium o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae o cca 225 druhů  o výskyt: půda, ovzduší, častý kontaminant potravin a krmiv o producent mykotoxinů a mnoha dalších extrolitů o alergenní o v laboratoři kontaminanta klinického materiálu o využití: startovací kultury k výrobě sýrů (P. camemberti, P. roqueforti), výroba antibiotika penicilínu, P. nalgiovense – fermentované uzeniny o Makroskopické znaky ▪ kolonie pestře pigmentované ▪ rychlý růst ▪ standardní živná média: CYA, MEA ▪ kultivační teplota: 25°C, 37°C ▪ Nejvýznamnější makroskopické znaky: rychlost růstu (velikost kolonií) zbarvení kolonií, reverz kolonií, povrchová struktura kolonií produkce exudátu o Mikroskopické znaky o nepohlavní stádium – štětičkovité konidiofory, konidie o pohlavní stádium - Eupenicillium, Talaromyces, charakteristické tvorbou drobných plodnic o hodnotí se stavba konidioforu o 4 typy konidioforů: ▪ monoverticilátní (podrod Aspergilloides) ▪ terverticilátní (podrod Penicillium) ▪ biverticilátně symetrický (podrod Biverticillium) ▪ divarikátní (podrod Furcatum) o Fyziologické znaky (podrod Penicillium) ▪ médium CREA - agar s kreatinem a indikátorem pH (bromkresolový purpur), který je při výchozím pH 8 fialový ▪ schopnost využívat kreatin jako zdroj N (růst) ▪ schopnost tvorby kyselých l. (žluté zbarvení) ▪ schopnost tvorby zásaditých látek (fialové zbarvení agaru) o Biochemické znaky (podrod Penicillium) ▪ detekce mykotoxinů povahy alkaloidů pomocí Ehrlichova činidla (dimethylaminobenzaldehyd, ethanol, HCl) ▪ produkce kyseliny cyklopiazonové ▪ pozitivní reakce: světle fialové „haló“ o Penicillium marneffei ▪ jediný pro člověka prokazatelně patogenní druh ▪ endemické onemocnění v jihovýchodní Asii a Číně ▪ rezervoárem infekce je zažívací trakt místních hlodavců ▪ vstupní branou infekce je gastrointestinální trakt nebo dýchací cesty ▪ u imunokompromitovaných osob se rozvíjejí těžké infekce postihující plíce, játra a kůži ▪ případy laboratorní infekce, biohazard 3 (některé země) ▪ dimorfní – v postižené tkáni tvoří protáhlé jednobuněčné útvary podobné kvasinkám ▪ kolonie pomalu rostoucí, sametové, produkující oranžový až červený pigment, roste při 37°C ▪ konidiofory terminálně větvené (biverticilátní) ▪ fialidy ampuliformní až acerózní ▪ konidie elipsoidní Paecilomyces o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae o Paecilomyces variotii - prokázána účast na vzniku endokarditidy, endoftalmitidy a kožních infekcí o Paecilomyces lilacinus – infekce oka  o podobná stavbu konidioforu jako u rodu Penicillium, ale konidiofory jsou méně pravidelně větvené a fialidy jsou protáhlé v dlouhý krček o standardních živná média :CZ, CYA, MEA o Paecilomyces lilacinus ▪ kolonie sametové až lanózní, světle růžovošedé, reverz nezbarven ▪ půdní saprofyt, častější v teplých oblastech ▪ konidiofory jemně bradavčité a nevýrazně pigmentované, terminálně větvené, s přesleny přitisklých metul a fialid ▪ konidie v řetízcích, elipsoidní, jemně bradavčité o Paecilomyces variotii ▪ kolonie rychle rostoucí, sametové, sytě okrové, často aromaticky vonící ▪ termofilní, roste i při 50°C ▪ izolován zejména z potravin, krmiva a vnitřního prostředí budov, producent patulinu a viriditoxinu ▪ konidiofory různě dlouhé, hladké, s přesleny 2-7 fialid ▪ konidie v řetízcích, elipsoidní až fusiformní, hladké, velmi variabilní ve velikosti ▪ často se tvoří hnědé jednobuněčné chlamydospory Scopulariopsis o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Microascales, Microascaceae o Scopulariopsis brevicaulis, teleomorfa Microascus brevicaulis o systémové mykózy – plícní forma o povrchové mykózy – dermatomykózy či onychomykózy o problém s léčbou – rezistentní k většině používaných antimykotik o kolonie béžové, schopné růst při 37°C o kosmopolitní houba, velmi často izolována z půdy, dřeva, rostlinných zbytků a také potravin o Scopulariopsis brevicaulis ▪ konidiofory nepravidelně větvené, konidiogenní buňky (anelidy) – enteroblastická annelidická konidiogeneze ▪ konidie kulovité až vejčité, s uťatou bazí, mladé hladké, později bradavčité ▪ ENTEROBLASTICKÁ ANNELIDICKÁ KONIDIOGENEZE konidiogenní buňka - anelida, modifikace fialidy kumulace límečků - okraje protržené buněčné stěny bazální buňky Acremonium o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales o izolováni z postižené kůže, nehtů, oka bo z podkožního mycetomu (A. falciforme, A. potronii, A. strictum) o kolonie v bílých, žlutých nebo růžových odstínech o tvorba synnemat, fialidy většinou jednotlivé, k vrcholu se zužující (jehlicovité), septum na bázi o konidie jednobuněčné, hladké, hyalinní, kulovité, v řetízcích nebo shlucích o Acremonium potronii Pseudallescheria o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Microascales, Microascaceae o teleomorfa Pseudallescheria boydii (anamorfa Scedosporium) o v přírodě – zemědělská půda, odpadní vody, stoky o povrchové mykózy – infekce ran a popálenin, keratitidy, abscesy rohovky, otomykózy o mykózy jednotlivých orgánů - pneumonie, endokarditidy, meningitidy, artritidy aj. o původce eumykotického mycetomu – granulomatózní infekce kůže a podkoží v tropech o vstupní branou je poranění nebo dýchací cesty o Pseudallescheria boydii  ▪ kolonie rychle rostoucí, zpočátku bílé až tmavě šedé, reverz je světlý s hnědočernými zónami ▪ teleomorfa - zanořená kleistothecia, světle hnědá až černá, vřecka kulatá nebo téměř kulatá, 8 jednobuněčných askospor citrónového tvaru (zřídka u klinických kmenů – nutná kultivace 2 – 3 týdny) ▪ anamorfa Scedosporium:1b. konidie, hladké ve shlucích, světle hnědé ▪ Diagnostika klinický materiál: sputum, bronchiální laváž od pacientů s plicním onemocněním a tkáňové biopsie u pacientů se subkutánním a diseminovaným onemocněním mikroskopie: sputum, bronchiální laváž, aspiráty – louhový preparát (MycoInk, Calcofluor) tkáňové řezy se barví pomocí HE, PAS, a stříbření dle Grocotta kultivační průkaz – morfologie zejména konidiového stádia Emmonsia o Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Ajellomycetaceae o Emmonsia crescens – celosvětově rozšířená o chronické plícní onemocnění zvané adiaspiromykóza o inhalace konidií obsažených v prachu o konidie v plicních alveolech zvětšují svůj objem – adiaspory (100 μm velké kulovité útvary se silnou stěnou) o adiaspory neklíčí, houba se nemnoží a infekce tak zůstává lokalizovaná v plicích Hyalohyfomykózy – diagnostika o klinický materiál: stěry kůže a nehtů, sputum a bronchiální laváž> louhový preparát (MycoInk, Calcofluor); moč, mozkomíšní mok, pleurální tekutina a krev>centrifugace a poté louhový preparát sedimentu (MycoInk, Calcofluor); biopsie o tkáňové řezy se barví pomocí PAS, stříbření dle Grocotta, HE o kultivační průkaz, Sabouraudův glukózový agar o hemokultura – invazivní fusarióza Dimorfní mikromycety o postihují jinak zdravé jedince v určitých oblastech, v kterých jsou příznivé klimatické podmínky a složení půdy pro jejich rozvoj o histoplazmóza o blastomykóza o kokcidiomykóza o parakokcidiomykóza o původci dimorfní mikromycety, biohazard 3 o schopnost růstu ve dvou formách - obě formy mohou být příčinou infekce o forma vláknitá (do 30 °C) – inhalační cestou, přes sliznice či kůži o forma kvasinkovitá ( 35 – 37 °C) – může vyvolat systémové infekce tkání a orgánů o růst není blokován cykloheximidem o Histoplazmóza ▪ původcem Histoplasma capsulatum ▪ rezervoárem je půda znečištěná trusem ptáků a netopýrů ▪ k nákaze dochází vdechováním konidií ▪ původně endemickou oblastí je Severní Amerika, nyní i ve Střední Americe, Evropě ▪ 1. asymptomatická primární histoplazmóza - zhojí se v regionálních lymfatických uzlinách ▪ 2. akutní symptomatická pulmonární histoplazmóza - infekce je provázena horečnatým stavem různé závažnosti, od příznaků připomínajících chřipkové onemocnění až po život ohrožující rozsáhlou oboustrannou pneumonii ▪ 3. chronická plicní histoplazmóza se vyskytuje hlavně u pacientů s emfyzémem (rozedma plic), projevy a průběh jsou podobné tuberkulóze ▪ 4. diseminovaná (mimoplicní) histoplazmóza je s výjimkou imunokompromitovaných jedinců vzácná ▪ Histoplazmóza – diagnostika sérologický průkaz protilátek proti Histoplasma capsulatum (komplementfixační reakce, latexová aglutinace s histoplasminem, imunodifuze) kultivace Sabouraudův glukózový agar, 4 týdny u hemokultur histologicky z bioptického materiálu komplementfixační reakce (KFR)  o smísí se naředěné pacientovo sérum s příslušným antigenem a se známým množstvím komplementu (vícesložkový rozpustný systém krevní plazmy) o pokud je v séru přítomna hledaná protilátka, váže se