HESC 207 LAB: Microbiología para Ciencias de la Salud - Presentación 2 - AGOSTO 2023 PDF

HESC 207 LAB: Lab. Microbiología para Ciencias de la Salud PROF. ARMANDO ALBINO PRESENTACIÓN 2 AGOSTO, 2023 Técnicas Microbiológicas de Laboratorio Diferencias entre las paredes de las bacterias Gram-positivas y Gram- negativas...

HESC 207 LAB: Lab. Microbiología para Ciencias de la Salud PROF. ARMANDO ALBINO PRESENTACIÓN 2 AGOSTO, 2023 Técnicas Microbiológicas de Laboratorio Diferencias entre las paredes de las bacterias Gram-positivas y Gram- negativas Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Bacterias Gram positivas y Gram negativas  La pared celular de las bacterias se encuentra inmediatamente debajo el glicocálix, rodeando la membrana plasmática.  Su función es mantener la forma de la bacteria y protegerla de daño físico o químico, incluyendo el sistema inmune.  La dureza de la pared celular se debe a la presencia de peptidoglucano, una mezcla de polímeros de hexosas (N-acetil-glucosamina y N-acetil-acido murámico) unidos por pequeños fragmentos de péptidos.  La cantidad y composición del peptidoglucano entre los mayores grupos de bacterias gram positivas y gram negativas, son la base de la diferenciación de la tinción Gram.  Diferencias en la composición de la pared celular es una importante consideración al momento de asignar un tratamiento medicamentos antimicrobianos. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Bacterias Gram positivas  La pared de las bacterias gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglucano entre 20 a 80nm.  En adición, contiene polisacáridos ácidos como el acido teicoico y acido lipoteicoico, que ayudan en el mantenimiento de la pared celular y contribuyen a una superficie celular acida.  El pequeño espacio entre la pared celular y la membrana celular se conoce como espacio periplásmico el cual puede ser mínimo en las bacterias gram positivas. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Bacterias Gram negativas  La pared de las bacterias gram negativas tienen una fina capa de peptidoglucano entre 5 a 10nm.  Es mas compleja que la de las gram positivas por tener una membrana externa que provee una cubierta anclada a las moléculas de lipoproteínas de la capa de peptidoglucano.  La membrana externa es similar en estructura a la membrana plasmática, pero contiene extensiones de lipopolisacáridos en la superficie.  Estos lipopolisacáridos trabajan como receptores o como antígenos.  En adición, la membrana contiene porinas que permiten la entrada de pequeñas moléculas, creando una barrera de defensa contra moléculas grandes como antibióticos.  El espacio periplásmico es mayor pudiendo constituir hasta 40% de la bacteria total.  Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Comparación estructural bacterias Gram negativas y Gram positivas Bacteria Bacteria Gram- Gram- positiva negativa Técnicas Microbiológicas de Laboratorio Lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas  Esta molécula, conocida también como endotoxina, es el mayor componente de las membrana externa de las bacterias gram negativas.  Es una toxina termoestable que resiste la esterilización.  Es el antígeno superficial mas importante de las bacterias gram negativas y es de suma importancia en la activación del sistema inmunológico.  Se divide en 2 porciones:  Porción glucolípida llamado Lípido A o endotoxina responsable de desencadenar a respuesta inmune incluyendo la fiebre  Porción de heteropolisacáridos llamado núcleo.  Algunas bacterias tienen una porción llamada Antígeno O que permite su clasificación en serogrupos. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio Membrana plasmática y el transporte de moléculas Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Membrana plasmática  Procariotas y eucariotas están rodeados de la membrana plasmática.  Esta crea un ambiente acuoso intracelular y extracelular.  Esta compuesta primordialmente de fosfolípidos y proteínas.  Los fosfolípidos están compuestos por un extremo polar (hidrofílico) y un extremo no-polar (hidrofóbico).  Dado que está rodeada de ambientes acuosos internos y externos, se forma una doble capa de fosfolípidos donde los extremos hidrofóbicos se miran mientras que los extremos hidrofílicos están expuestos al ambiente acuoso.  Dentro de esta bicapa de fosfolípidos, se encuentran moléculas de proteínas, carbohidratos y colesterol (periferales e integrales) y de glicolípidos que se proyectan extracelularmente.  Estas moléculas proveen apoyo estructural, transportan moléculas de un lado a otro de la membrana, actúan como enzimas reguladoras, receptores y antígenos superficiales. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Mecanismos de transporte de moléculas a través de la membrana  Transporte pasivo  Las moléculas se mueven de un área de alta concentración a baja concentración sin necesidad de consumir energía (ATP).  La fuerza motriz del transporte pasivo es movimiento atómico y molecular (Movimiento Browniano).  El movimiento Browniano es la tendencia natural de átomos y moléculas de mantenerse en movimiento.  Dentro de transporte pasivo tenemos:  Difusión: utiliza el gradiente de concentración para mover moléculas de un área de alta concentración a uno de menor concentración. Es un mecanismo importante en la obtención de O2 y la liberación de CO2.  Difusión facilitada: es necesario para moléculas que no se difunden a teves de la membrana celular y que requieren moléculas especificas de transporte de la membrana o canales transmembrana.  Osmosis: es la difusión de agua a través de una membrana permeable. La membrana plasmática es de permeabilidad selectiva a las moléculas de agua, permitiendo que se difundan pero no las substancias disueltas en ella.  Filtración: es el movimiento de moléculas a través de la membrana plasmática desde un área de mayor presión hidrostática a un área de menor presión hidrostática. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Transporte pasivo Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Mecanismos de transporte de moléculas a través de la membrana  Transporte activo  Requiere la utilización de energía (ATP) para mover las moléculas en contra de un gradiente de concentración.  Es requerido cuando se necesita mover moléculas rápidamente.  Dentro de transporte activo tenemos:  Bomba de transporte: este movimiento de iones y moléculas requiere energía que se obtiene de la hidrolisis de ATP. Los carreros son proteínas transmembranosas. Conlleva:  Adhesión del ion o molécula a ser transportada a un área especifica de reconocimiento o receptor en la proteína de transporte.  Inicio de la hidrolisis dela molécula de ATP que fosforila la proteína de transporte.  Cambio de forma de la proteína de transporte lo que activa su función de transporte.  Transporte de ion o la molécula al otro lado de la membrana y su liberación. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Bomba de transporte Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Mecanismos de transporte de moléculas a través de la membrana  Transporte activo  Endocitosis: es el movimiento de material extracelular al interior utilizando vesículas. La célula rodea la partícula y la encierra en su membrana plasmática formando al vesícula endocítica.  Si se trata de una partícula grande o materia solida se conoce como fagocitosis.  Cuando se trata de líquidos se conoce como pinocitosis.  Cuando la molécula necesita unirse a un receptor en la membrana se conoce como endocitosis mediada por receptores.  Exocitosis: es la expulsión de moléculas grandes como polipéptidos, proteínas y otras, fuera de la célula. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio Tinción Gram Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Preparación de la muestra  Para la inspección de un microorganismo bajo el microscopio, este tiene que ser preparado especialmente.  Algunos pueden ser observados vivos (protozoarios), pero la mayoría están muertos por el efecto de químicos (bacterias, hongos).  Muestras que se han secado en una laminilla se le llama frotis.  El frotis es fijado a la laminilla por químicos o calor. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram  Técnica desarrollada por el bacteriólogo holandés Hans Christian Hans en 1884.  Conlleva 4 pasos para diferenciar bacterias entre gram- negativas y gram-positivas  La técnica esta basada en la reacción de los compuestos con la pared celular bacteriana. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram  Tinción del frotis fijado con cristal violeta por 1 minuto  El tinte cristal violeta es un compuesto con carga positiva con afinidad a moléculas de carga negativa como lo es la pared celular bacteriana.  Por esta razón, se tiñe de color violeta las bacterias gram positivas y gram negativas al inicio del proceso.  Enjuague con agua. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram  Tinción con iodo por 1 minuto  El iodo actúa como mordante incrementando la fijación del cristal violeta por la pared celular, formando un complejo insoluble en agua que no se afecta durante el enjuague con agua.  En adición, los ácidos teicoicos tienen gran afinidad por agentes oxidantes como el iodo.  Enjuague con agua. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram  Decoloración con etanol 95% o etanol-acetona  El etanol 95% o etanol-acetona actúa como un disolvente orgánico que decolora la parde celular de la bacteria al disolver el complejo creado entre el cristal violeta y el iodo.  Las bacterias gram negativas se ven más afectadas por la decoloración ya que su capa de peptidoglucano es más fina que la capa de las bacterias gram positivas que retienen más del cristal violeta.  Enjuague con agua. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram  Tinción con Safranina por 1 minuto  El tinte de contraste safranina también tiene carga positiva y tiñe las paredes bacterianas ya que tienen carga negativa.  En este paso, las bacterias gram negativas se tiñen de color rosado mientras que las gram positivas no absorben la safranina por estar su pared celular saturada de cristal violeta.  Enjuague con agua y secado. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram Staphylocccus spp. Streptocccus spp. Micrococcus luteus Bacillus spp. Candida spp. Técnicas Microbiológicas de Laboratorio  Tinción Gram Escherichia coli Vibrio cholerae Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Técnicas Microbiológicas de Laboratorio Referencias  VanMeter, K., & Hubert, R. J. (2016). Microbiology for the healthcare professional (2nd ed.). St. Louis, MO: Elsevier.