Kontrola lekova II - Parcijalna II – prez PDF

Kontrola lijekova II – parcijala II ANALIZA BIOLOŠKIH LIJEKOVA - prez Biološki lijek je lijek koji sadrži jednu, ili više aktivnih supstanci koje su napravljene, ili su izvedene iz biološkog materijala. Biosličan lijek (biosimilar) je biološki lijek za koji je dokazana sličnost u pogledu kvaliteta,...

Kontrola lijekova II – parcijala II ANALIZA BIOLOŠKIH LIJEKOVA - prez Biološki lijek je lijek koji sadrži jednu, ili više aktivnih supstanci koje su napravljene, ili su izvedene iz biološkog materijala. Biosličan lijek (biosimilar) je biološki lijek za koji je dokazana sličnost u pogledu kvaliteta, biološke aktivnosti, sigurnosti primjene i djelotvornosti s odobrenim izvornim biološkim lijekom. Aktivne supstance bioloških lijekova su biološki aktivne supstance. One su veće i kompleksnije u odnosu na aktivne supstance u konvencionalnim (ne- biološkim) lijekovima. Biološki aktivne supstance mogu biti: ugljikohidrati, proteini, nukleinske kiseline, kompleksne kombinacije navedenih supstanci ili živi entiteti (ćelije ili tkiva). Biološki aktivne supstance mogu se dobiti: ekstrakcijom iz biološkog izvora; primjenom rekombinantne tehnologije; sintetskim putem. Biološki lijekovi su karakteristična grupa lijekova zbog svoje strukture, proizvodnog procesa i upotrebe. 1. BIOLOŠKI LIJEKOVI Proteinski ili ugljikohidratni proizvodi Ekstrahovani iz živih organizama Kompleksne strukture  Slabije definisane fizičko-hemijske karakteristike Makromolekule (> 500 kD) Tercijarna struktura Osjetljivi na toplotu i mehanički stres 1. KONVENCIONALNI LIJEKOVI Sintetski Organska jedinjenja Hemijska sinteza Definisane strukture i fizičko-hemijskih karakteristika Mikromolekule Stabilni Parametar Hemijski lijek Biološki lijek Veličina Mala mol. masa (100-1000 Velika mol. masa (10000-150000 Da) Da) Struktura Jednostavna Kompleksna molekule Proizvodnja Hemijska sinteza Biotehnološka proizvodnja iz (jednostavna procesna živih org. Ili kultura stanica kontrola i prečišćavanje) (složena procesna kontrola i dugotrajno i kompleksno prečišćavanje) Karakterizacija Potpuna karakterizacija Nije moguća potpuna neovisna o proizvodnom karakterizacija postupku (ovisna o proizvodnom postupku) Stabilnost Većinom stabilni Nestabilni/osjetljivi na vanjske uslove Imunogenost Većinom nisu imunogeni Imunogeni Putevi primjene Različiti putevi primjene Parenteralna primjena 2. Razlike između hemijskih (konvencionalnih) i bioloških lijekova u veličini molekula Lijek Molekulska masa (kDal) Broj atoma Paracetamol 0,151 20 Aspirin 0,180 21 Eritropoetin 30,4 ~ 4000 IgG antitijelo 150 ~ 25000 3. Regulativa u kontroli kvaliteta bioloških lijekova Regulativu u oblasti kvaliteta lijekova definišu zakoni, direktive i smjernice. Zakoni Evropske Unije (EU) su iznad nacionalnih zakona. Direktive imaju težinu zakona i implementiraju se u nacionalne zakone. Smjernice nisu zakoni ali sadrže najnovije informacije vezane za ispitivano područje, a izrađene su u skladu sa dobrim praksama. Odobrenje za stavljanje u promet u EU daje Evropska komisija nakon stručno- naučne ocjene dokumentacije o lijeku u Centraliziranom postupku davanja odobrenja (CP) u skladu sa odredbama uredbe br. 726/2004 Evropskog parlamenta i Vijeća a koju provodi Evropska agencija za lijekove (EMA). Centralizirani postupak je obavezan za: Lijekove koji se dobijaju biotehnološkim postupcima (tehnologija rRNK), Lijekove za naprednu terapiju, Lijekove koji sadrže novu aktivnu supstancu indiciranu za liječenje HIV/AIDS-a, tumora, dijabetesa, neurodegenarativnih bolesti, virusnih bolesti, autoimunih bolesti i drugih imunoloških poremećaja, Lijekove za liječenje rijetkih i teških bolesti. 4. Odobravanje biosličnih lijekova Biološki sličan lijek stavlja se u promet po principu “step by step, case by case”. Svi biološki slični lijekovi koje se nalaze na tržištu EU i u BiH prošli su centralizirani postupak za stavljanje lijeka u promet što znači da je za njih Komisija za humane lijekove i Komisija za ocjenu rizika na području farmakovigilance dala pozitivnu ocjenu o kvaliteti/efikasnosti/sigurnosti odnosno pozitivnu ocjenu korist/rizik. Evropska agencija za lijekove izdala je brojne naučne smjernice kojima se osiguravaju standardi kvaliteta, sigurnosti i djelotvornosti primjene biosličnih lijekova koje su dostupne pod poveznicom European Medicines Agency's scientific guidelines on biosimilar medicines. Podaci o svim centralizirano odobrenim biosličnim lijekovima, uključujući sažetak znanstvene ocjene dokumentacije o lijeku, mogu se pronaći pod poveznicom Human Medicines - Biosimilars. 5. Evropska farmakopeja (Ph.Eur.) Ph.Eur. monografije koje se odnose na biološke lijekove. Neke od tih monografija su opšte monografije, a neke posebne kao što su: monografije za hormone, citokine, enzime, faktore koagulacije i vakcine. Opšte monografije se odnose na: produkte proizvedene tehnikom rekombinantne DNK, monoklonalna antitijela za humanu upotebu supstance za farmaceutsku upotrebu. Neke od posebnih monografija su: Hepatitis B vakcina rDNK (i kombinovana cjepiva koje sadrže ovu komponentu); Humani papilloma virus vakcina rDNK; Eritropoetin koncentrovani rastvor; Glukagon, humani; Humani koagulacijski faktor VIII (rDNK);  6. Dobra proizvođačka praksa (Good Manifacturing Practice, GMP) Zadatak Dobre proizvođačke prakse jeste da osigura kvalitet proizvoda osiguranjem kvaliteta procesa proizvodnje. Dokument GMP imaju skoro sve zemlje, neke imaju sopstvene verzije, a neke su prihvatile originalni dokument dat od strane evropskih regulatornih organa ili Svjetske zdravstvene organizacije. Međunarodna konferencija za harmonizaciju (Internacional Conference for Harmonisation, ICH). ICH smjernice su sadrže: Smjernice za kvalitet Smjernice za sigurnost Smjernice za efikasnost Multidisciplinarne smjernice Dio ICH smjernica koji se odnosi na biotehnološke lijekove je Q5A-Q5E: Q5A - procjena prisustva virusa kod bioloških lijekova. Q5B - kvalitet biotehnoloških produkata: analiza ekspresije konstruktora u stanicama koje su se koristile za proizvodnju r-DNK izvedenih proteinskih proizvoda; Q5C - testiranje stabilnosti biotehnoloških/bioloških lijekova; Q5D - izvođenje i karakterizacija ćelijskih supstrata koji se koriste u proizvodnji biotehnoloških i bioloških proizvoda Q5E - upoređivanje biotehnoloških/ bioloških proizvoda koji su predmet promjena pri proizvodnji Pri određivanju kvaliteta biotehnoloških lijekova primjenjuju se i druge smjernice koje nisu specifične za biotehnološke lijekove, a u kojima je navedeno da se odnose i na biotehnološke lijekove (Q3D, Q11). Analitičke metode koje se koriste kod bioloških lijekova dijele se na: skrining metode, metode za praćenje oslobađanja, metode za ispitivanje stabilnosti, metode karakterizacije. Bioanalitičke metode - koriste ze za kvantitativno određivanje lijekova, metabolita i fizioloških uzoraka dobivenih iz čovjeka ili životinja. Za biološke lijekove - specifične imunološke metode. Bioeseji - specifični testovi koji se koriste za određivanje aktivnosti, jačine i biološkog integriteta lijekova a zasnivaju se na specifičnom odgovoru. Mogu biti in vitro (esej kulture stanica, antivirusni, infektivni), in vivo (uključuju korištenje životinja). Biomolekularne metode- koriste se za određivanje fizičko-hemijskih karakteristika bioloških lijekova - hromatografija, elektroforeza, spektrofotometrija, kolorimetrija, gravimetrija. Osobina Metoda Primarna struktura Analiza sastava aminokiselina, MS, N/C- terminalni slijed, TPM/MS Sekundarna i tercijarna CD, NMR, imunoreaktivnost, TPM/MS, biološka struktura aktivnost Veličina/mol.masa AUC, FFF, MALDI-TOF MS, LC-ESI, SDS-PAGE,SEC- HPLC Naboj CE, IEC, IEF Hidrofobnost HIC-HPLC, RP-HPLC Imunoreaktivnost Imunoprecipitacija, WB Vrsta glikolizacije CE, HPAEC-PAD, LC-ESI,MALDI-TOF MS, RP-HPLC Mjesto glikolizacije TPM/MS AUC– analitičko ultracentrifugiranje; CE– kapilarna elektroforeza; ESI– masena spektroskopija sa elektrosprej jonizacijom; FFF – frakcioniranje u protočnom polju; HPAEC-PAD-anionska hromatografija visoke pH sa pulsirajućim amperometrijskim detektorom; HIC – hromatografija hidrofobnom interakcijom; IEC– jonoizmjenjivačka hromatografija, MALDI-TOF-MS– masena spektrometrija sa matricom potpomognutom laserskom desorpcijom; NMR–protonska nuklearna magnetna rezonanca; RP-HPLC– hromatografija na obrnutim fazama; SEC – hromatografija isključenjem; TPM – mapiranje peptida tripsinom; WB – Western Blot, jednodimenzionalna poliakrilamid gel elektroforeza 7. Kontrola kvaliteta bioloških lijekova prema ICH smjernicama Prema ICH smjernicama, kontrola kvaliteta bioloških lijekova podrazumjeva ispitivanje: stabilnosti– fizičke, hemijske, mikrobiološke prisustva virusa karakterizaciju fizičko-hemijskih osobina, biološke aktivnosti, imuno-hemijskih osobina, čistoće, nečistoća. Karakterizacija bioloških lijekova se vrši korištenjem odgovarajućih biofizičkih, biohemijskih i bioloških analitičkih tehnika. Za aktivnu supstancu ispituje se primarna, sekundarna, tercijarna, kvarterna struktura; posttranslacijske modifikacije; biološka aktivnost; čistoća; nečistoće; imunohemijske osobine. Fizičko-hemijske osobine podrazumjevaju određivanje primarne i viših nivoa strukture - metode spektrometrija masa (MS) ili nuklearne magnetne rezonance (NMR). Analiza bioloških lijekova uključuje različite tehnike i metode za obezbjeđivanje njihove kvalitete, sigurnosti i efikasnosti. Najvažnije metode koje se koriste u analizi bioloških lijekova: 1. Peptidno mapiranje Peptidno mapiranje je tehnika koja se koristi za analizu strukture proteina, uključujući identifikaciju i kvantifikaciju njihovih peptidnih fragmenta. Ključna je metoda za karakterizaciju bioloških lijekova, jer omogućava identifikaciju posttranslacijske modifikacije sekvenci aminokiselina i verifikaciju cjelovitosti proteina. Princip peptidnog mapiranja a) Digestija proteina Protein se najprije podvrgava enzimskom ili hemijskom razlaganju na peptide. Najčešće se koriste proteolitički enzimi poput tripsina, koji specifično sječe protein na mjestima gde se nalaze aminikiseline lizin (Lys) ili arginin (Arg). b) Razdvajanje peptida Dobijeni peptidi se razdvajaju pomoću tehnika kao što su: HPLC UPLC Razdvajanje se temelji na fizičko-hemijskim osobinama peptida - veličine, naelektrisanja ili hidrofobnosti. c) Identifikacija peptida Razdvojeni peptidi se dalje analiziraju kako bi se potvrdila njihova sekvenca. Najčešće se koristi: Masa spektrometrija (MS) - Tehnike poput MALDI-TOF, ESI-MS ili tandem MS (MS/MS) omogućavaju identifikaciju molekulske mase i strukture peptida. Sekvenciranje peptida - Kombinacija podataka iz MS analize i softverskih alata omogućava rekonstrukciju sekvence peptida. d) Poređenje sa referentnim podacima Dobijene peptidne sekvence poredie se sa teoretskim ili referentnim mapama proteina, koje su zasnovane na poznatoj sekvenci. Ovo omogućava otkrivanje eventualnih mutacija, modifikacija ili degradacijskih produkata. Aplikacije peptidnog mapiranja Kontrola kvaliteta biotehnoloških lijekova (monoklonalna antitijela, inzulini, vakcine); Identifikacija posttranslacionih modifikacija (glikozilacija, fosforilacija, acetilacija); Potvrda identiteta proteina i detekcija nečistoća; Razumijevanje mehanizama degradacije proteina ili promjena tokom skladištenja. Peptidno mapiranje je ključni alat u biofarmaceutskoj industriji i proteomici, jer pruža detaljan uvid u strukturu i integritet proteina. 2. Aminokiselinska analiza Omogućava detaljno ispitivanje sastava proteina, odnosno sekvencu aminokiselina i njihovu raspodjelu u strukturi proteina. Korisna je za identifikaciju svih aminokiselina prisutnih u proteinu i za detekciju eventualnih modifikacija ili nepoželjnih supstanci. Obično se koristi HPLC ili kapilarna elektroforeza za razdvajanje aminokiselinskih ostataka. Analizom se određuje koncentracija svake aminokiseline u uzorku. Primjena: Aminokiselinska analiza je važna za potvrdu kvaliteta proteina, kako bi se osigurao da biološki lijek sadrži samo očekivane aminokiseline i da ne sadrži nepoželjne modifikacije. 3. Osnovne imunohemijske metode Enzimski povezani imunosorbentni test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) Princip: Koristi antitijelo vezano za enzim koji proizvodi signal (boju,…) kada dođe do reakcije sa specifičnim supstratom. Primjena: Kvantifikacija specifičnih proteina (npr. monoklonalnih antitijela, citokina). Vrste ELISA: Direktna ELISA: Antigen je direktno vezan za ploču. Indirektna ELISA: Koristi sekundarno antitijelo za detekciju. Sandwich ELISA: Dva različita antitijela "hvataju" antigen. Kompetitivna ELISA: Koristi se za detekciju male količine antigena u prisustvu konkurentskog analita. 8. Western blott (imunoblot) Western blott omogućava identifikaciju proteina na osnovu njihove veličine i specifičnosti vezivanja za antitijela. Proteini se prvo razdvajaju elektroforezom prema veličini (SDS-PAGE), a zatim se prenose na membranu i detektuju specifičnim antitijelima. Primjena: Identifikacija proteina i detekcija nečistoća u biološkim lijekovima. 9. Radioimunoesej (RIA) Princip: Koristi radioaktivno označene antitijela ili antigene za kvantifikaciju. Prednosti: Visoka osjetljivost. Nedostaci: Korištenje radioaktivnih materijala zahtijeva posebne uslove rada. 10. Imunofluorescentne metode Princip: Koriste antitijela označena fluorescentnim bojama za detekciju antigena. Aplikacije: Lokalizacija biomolekula unutar ćelija ili tkiva (npr. imunohistohemija). Imunoprecipitacija i koimunoprecipitacija Princip: Kompleksi antigen-antitijelo se talože i odvajaju centrifugiranjem. Aplikacije: Ispitivanje interakcija proteina. Protočna citometrija Princip: Detekcija i analiza biomolekula na nivou pojedinačnih ćelija koristeći antitijela označena fluorescentnim bojama. Aplikacija: Analiza ćelijske heterogenosti, praćenje efekata terapije. Površinska plazmonska rezonancija (Surface Plasmon Resonance, SPR): Princip: Mjerenje interakcija antigena i antitijela u realnom vremenu na zlatnoj površini bez potrebe za označavanjem. Aplikacija: Analiza kinetike i afiniteta interakcija biomolekula. Primjena imunohemijskih metoda u analizi bioloških lijekova 1. Kvantifikacija lijekova ELISA i RIA se koriste za mjerenje koncentracije bioloških lijekova u plazmi ili serumima tokom farmakokinetičkih studija. 2. Karakterizacija lijekova Western blot i SPR omogućavaju potvrdu strukture i interakcija biomolekula. 3. Detekcija nečistoća Imunohemijske metode identifikuju nečistoće poput rezidualnih proteina domaćina (engl. host cell proteins). 4. Stabilnost i degradacija Proučavanje stabilnosti lijekova i detekcija degradacijskih produkata. 5. Praćenje imunogenosti Imunohemijske metode se koriste za detekciju antitijela koja pacijentov organizam može proizvesti kao odgovor na terapiju. 11. Primjena u kontroli lijekova 1. Biosimilari Imunohemijske metode se koriste za potvrdu da biosimilar lijek ima identičnu strukturu i funkciju kao referentni proizvod. 2. Vakcine Kvantifikacija antigena; Provjera imunogenosti vaccine; 3. Proteinski lijekovi Detekcija agregata ili degradacijskih produkata, Analiza posttranslacionih modifikacija (npr. glikozilacija); Prednosti imunohemijskih metoda Visoka specifičnost i osjetljivost; Brzina i relativna jednostavnost analize; Širok spektar primjena od kvantifikacije do strukturne analize; Ograničenja imunohemijskih metoda Zavisnost od kvaliteta korištenih antitijela; Složeni uzorci mogu izazvati nespecifične reakcije; Nekim metodama (npr. RIA) potrebna je posebna infrastruktura; 12. Ispitivanje sterilnosti i pirogenih supstanci Ispitivanje sterilnosti Sterilnost je ključna za biološke lijekove koji se primjenjuju u injekcionoj formi, jer kontaminacija mikroorganizmima može izazvati ozbiljne infekcije. Ispitivanje sterilnosti osigurava da biološki lijekovi ne sadrže živu bakterijsku ili gljivičnu kontaminaciju. Evropska farmakopeja (Ph. Eur. 2.6.1) i slični regulatorni standardi pružaju smjernice za metode ispitivanja sterilnosti. Sterilnost se obično testira metodom filtracije i inkubacije. Filtraciona metoda (Membrane Filtration Method) Princip: Uzorak lijeka se filtrira kroz sterilnu membranu sa porama veličine ≤ 0.45 µm. Membrana zadržava mikroorganizme, dok tečnost prolazi. Membrana se zatim prenosi u hranljive podloge i inkubira u odgovarajućim uslovima. Prednosti: Pogodno za veće zapremine uzoraka i proizvode sa baktericidnim supstancama (filtracija uklanja te supstance); Veća osjetljivost u poređenju sa direktnim inokulacijama; Manja mogućnost inhibicije rasta mikroorganizama; Nedostaci: Složenija procedura u poređenju sa direktnim inokulacijama; Rizik od mehaničkih grešaka tokom filtracije; Klasična metoda kultivacije (Direct Inoculation Method) Princip: Uzorak lijeka se inokulira direktno u odgovarajuće hranljive podloge koje podržavaju rast širokog spektra mikroorganizama; Kulture se inkubiraju u strogo kontrolisanim uslovima (temperatura, vrijeme) kako bi se omogućio rast prisutnih mikroorganizama; Prednosti: Široka primjena, detekcija većine bakterija i gljivica; Relativno jednostavna procedura; Nedostaci: Dužina ispitivanja (do 14 dana); Podložnost kontaminaciji tokom rukovanja; Ograničena detekcija mikroorganizama koji ne rastu u standardnim uslovima; Regulatorni zahtjevi za sterilnost Evropska farmakopeja (Ph. Eur. 2.6.1): Propisuje standardne metode i uslove ispitivanja; Specificira vrste hranljivih podloga i temperature inkubacije; Američka farmakopeja (USP ) Slični standardi kao u Ph. Eur. ICH smjernice: Usklađenost sa međunarodnim regulatornim zahtjevima za biološke lijekove; Odabir metode: Ispitivanje bakterijskih endotoksina u biološkim lijekovima je kritičan dio kontrole kvaliteta, jer prisustvo endotoksina može izazvati ozbiljne imunološke reakcije, uključujući groznicu, šok ili smrt pacijenta. Endotoksini su komponente vanjskog omotača Gram-negativnih bakterija, koje se mogu unijeti tokom procesa proizvodnje ili pakovanja bioloških lijekova. Metode za ispitivanje bakterijskih endotoksina: Evropska farmakopeja (Ph. Eur.) i druge regulatorne smjernice koje propisuje FDA ili ICH, propisuju metode za ispitivanje bakterijskih endotoksina. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test Referenca: Ph. Eur. 2.6.14 Princip: LAL test koristi lizate amebocita (vodeni ekstrakt pokretnih krvnih stanica, amebocita) podkovastog raka (Limulus polyphemus ili Tachypleus tridentatus). Lizat reaguje specifično sa endotoksinima bakterija, što rezultira: koagulacijom (stvaranjem gela) – gel clot test; ✓ Kvalitativna metoda - prisustvo endotoksina dovodi do stvaranja čvrstog gela. ✓ Rezultat: prisustvo/odsustvo endotoksina; ✓ Test je visoko osjetljiv za detekciju endotoksina (lipopolisaharida) iz Gram- negativnih bakterija. zamućenjem (turbidimetrijski test); ✓ Kvantitativna metoda promjenom boje– kolorimetrijski test. ✓ Kvantitativna metoda Prednosti: Visoka osjetljivost (detekcija u pikogramskom rasponu). Relativno brz (rezultati za 1-2 sata). Standardizovan i široko prihvaćen. Nedostaci: Specifičan samo za endotoksine (ne detektuje druge pirogene). Interferencija uzoraka (npr. visoke koncentracije proteina, soli ili jona metala) može uticati na rezultate. Zavisi od ekstrakcije lizata iz podkovastih rakova, što izaziva ekološke i etičke dileme. Rekombinantna tehnologija za endotoksine (rFC test) Princip: Koristi rekombinantni oblik faktora C, ključnog proteina iz LAL testa, proizvedenog biotehnološkim metodama. rFC se aktivira samo endotoksinima, uzrokujući mjerljive promjene (boja ili zamućenje). Prednosti: Ekološki prihvatljiv test (ne koristi životinjske resurse). Slična osjetljivost i specifičnost kao LAL test. Kompatibilan sa postojećim instrumentima za LAL. Nedostaci: Još uvijek nije univerzalno prihvaćen u svim regulatornim okvirima. Test aktivacije monocita (Monocyte Activation Test, MAT) (Alternativni test prema Ph. Eur.) Referenca: Ph. Eur. 2.6.30 Princip  MAT koristi ljudske monocite ili mononuklearne ćelije perifernog krvotoka (PBMC), koje reaguju na endotoksine i druge pirogene lučeći citokine, poput IL- 1β; Kvantifikacija citokina se vrši ELISA metodom ili drugim biohemijskim tehnikama. Prednosti: Detektuje endotoksine i ne-endotoksinske pirogene. Relevantan za ljudsku fiziologiju. Alternativa testovima na životinjama. Nedostaci Skuplji i tehnički složeniji od LAL testa. Zahtijeva pažljivo rukovanje i validaciju za specifične uzorke. Test na kunićima (Rabbit Pyrogen Test, RPT) Referenca: Ph. Eur. 2.6.8 Princip Uzorak lijeka se ubrizgava intravenozno zdravim kunićima,a tjelesna temperatura se mjeri prije i nakon primjene. Povećanje tjelesne temperature ukazuje na prisustvo pirogena, uključujući endotoksine. Broj životinja i prag za prihvatljive vrijednosti definisani su u monografiji. Ukupno povećanje temperature ne smije prelaziti propisane granice. Prednosti: Širok spektar detekcije pirogena (endotoksinskih i ne-endotoksinskih); Pogodan kada uzorci interferiraju sa LAL testom; Standardiziran test sa dugom istorijom upotrebe. Nedostaci: Koristi životinje (etički principi); Spor i manje specifičan u poređenju sa LAL testom. Regulatorni zahtjevi: Evropska farmakopeja (Ph. Eur. 2.6.14) i slični vodiči definišu metodologiju i kriterijume za prihvatljivost. Kriterijumi za prihvatljivost: Količina endotoksina ne smije prelaziti specificirani limit endotoksina (BET) izražen u EU/mL ili EU/mg, koji zavisi od terapijske doze lijeka i načina primjene; Odabir metode LAL test je zlatni standard za detekciju endotoksina, ali se sve više istražuju alternative poput rekombinantnih faktora koji ne zavise od životinjskih izvora. Rekombinantne metode i MAT postaju sve relevantnije zbog etičkih i ekoloških prednosti. Test na kunićima koristi se samo u posebnim slučajevima, kada nisu prikladne moderne metode. Poređenje metoda: Ispitivanje stabilnosti: Stabilnost bioloških lijekova se dijeli na: hemijsku, fizičku, mikrobiološku. Na hemijsku stabilnost utiču: pH, temperatura, svjetlost, vrsta rastvarača, prisustvo oksigena,joni teških metala, prisustvo oksidirajućih sredstava i dr. faktori. Od stabilnosti zavisi i terapijska efikasnost proteina, pa je važno odrediti i poboljšati stabilnost proteina koji se koriste u terapijske svrhe. Biološka aktivnost je specifična sposobnost ili kapacitet proizvoda za postizanje definisanog biološkog djelovanja. Biološki test je mjera funkcionisanja rekombinantnog proizvoda, proteina i koristi se za utvrđivanje da li neki proizvod ima odgovarajući nivo aktivnosti (supstanca vezana za proizvod) ili je neaktivan (nečistoće). Biološki test upotpunjuje fizičko-hemijsku analizu i potvrđuje ispravnost strukture proizvoda (primarna, sekundarna, terijarna, kvarterna). Važna je upotreba relevantnih bioloških testova sa odgovarajućom preciznošću i tačnošću. Ako određeni proteini posjeduju više funkcionalnih nivoa koji posjeduju enzimske i receptor-ovisne aktivnosti, svi ti funkcionalni nivoi se moraju provjeriti od strane proizvođača. Ispituje se potentnost, potencija - kvantitativna mjera biološke aktivnosti. Rezultati testa potencije se izražavaju u jedinicama aktivnosti npr. testovi enzima se izražavaju kao jedinica/mg proteina. Biološki testovi imaju veliki značaj i za utvrđivanje da li antitijela koja su se razvila kao odgovor na proizvod utiču na biološku aktivnost proizvoda. Imunohemijske osobine se kontrolišu kod onih lijekova koji sadrže antitijela ili su vezani za njih kao što su imunoglobulini i monoklonalna antitijela. Ispituje se specifičnost, afinitet vezivanja, kinetika vezivanja i funkcionalna aktivnost. Imunogenost je česta pojava koja je uzrokovana veličinom molekule bioloških lijekova. Na osnovu pretkliničkih ispitivanja nije moguća potpuna procjena imunogenosti. Klinička procjena obuhvata: testiranje na antitijela (At) (optimalna metoda za određivanje At treba da bude osjetljiva, specifična i validirana), dugotrajno praćenje imunološke reakcije zbog nepredvidivosti. Kao pokazatelj imunogenosti može biti pojava reakcije preosetljivosti, autoimunost ili gubitak efikasnosti. Faktori koji utječu na imunogenost: priroda aktivne supstance, proizvodni proces, nečistoće, pomoćne supstance, stabilnost proizvoda,  put primjene i doziranja. Faktori u vezi sa pacijentom: genetskog porijekla, npr. nedostatak tolerancije na normalne endogene proteine, stečeni npr. kao imunosupresija zbog bolesti ili istovremene primjene lijekova. Tri osnovna pristupa koja kontrolišu potencijalnu virusnu kontaminaciju biotehnoloških proizvoda su: odabir i testiranje ćelijskih linija i drugih sirovina (uključujući komponente medija), na odsustvo nepoželjnih virusa koji mogu biti zarazni i/ili patogeni za ljude; procjena kapaciteta proizvodnih procesa na prisustvo zaraznih virusa; testiranje proizvoda na odsustvo zaraznih virusa; Standardna pretklinička ispitivanja nisu uvijek pogodna za biološke lijekove. Ispituje se biološka aktivnost koja je specifična za vrstu, te imunogenost kod eksperimentalnih životinja. Standardna ispitivanja genotoksičnosti i karcinogenosti od malog su značaja. Klinička dokumentacija za biološke lijekove treba da sadrži podatke o: cilju, razvoju i rezultatima kliničkih ispitivanja, toleranciji, imunogenosti farmakokinetici. Klinička ispitivanja zavise više od vrste bolesti i indikacija, nego od vrste lijeka i njegovog porijekla. Specifičnosti koje susreću se pri ovim ispitivanjima su: pojava imunogenosti, određivanje optimalne doze, farmakokinetika ne korelira sa famakodinamikom. Kontrola kvaliteta hormona na primjeru rekombinantnog humanog inzulina: Naziv testa Tip testa metode Identifikacija Identifikacija vrste HPLC- obrnute faze Jačina Jačina u rastvoru HPLC- obrnute faze Jačina u supernatantu Čistoća Povezani proteini HPLC- obrnute faze Nečistoća Procjena Zn jona Atomska apsorpciona spektroskopija Sigurnost Bakterijski endotoksini Gel klot/ kinetička hromogena metoda Mikrobiološka kontaminacija: bakterije, Sterilnost: membranska gljivice filtracija/ inokulacija medija Fizičke Boja, bistrina, pojava Hemijsko i organoleptičko karakteristike Analiza partikula ispitivanje kvaliteta Potenciometrija Mikroskopsko posmatranje  Određivanje pH vrijednosti Kontrola kvaliteta krvnih derivata: Ispitivani Metoda ispitivanja Zahtjev kvaliteta parametar kvaliteta Izgled Vizuelno Bistra, slabo viskozna tekućina, bezbojna, žuta, zelena ili boje čilibara pH potenciometrija 6,7-7,3 Osmolalnost Osmometar 200-275 mosmol/kg Bakterijski Kinetička ≤ 1.0 e.j./ml endotoksini turbidimetrija Sterilnost Metoda membranske sterilno filtracije Kontrola kvaliteta monoklonalnih antitijela Monoklonalna antitijela su specifična antitijela koja su međusobno identična, jer potiču iz identičnih stanica koje su klonovi jedne stanice roditelja i vezuju se za isto vezivno mjesto na antigenu. Proizvode se tehnologijom rekombinantne DNK, tehnologijom hibridoma ili nekim drugim biotehnološkim metodama upotreba im je široko zastupljena u medicini i farmaciji, a koriste se u terapiji karcinoma, autoimunih oboljenja, infekcija. Parametri i test metode koji se koriste u kontroli monoklonalnih antitijela: Ispitivani parametar Naziv test metode kontrole Izgled Boja, opalescencija, bistrina Identitet HPLC na obrnutim fazama MALDI masena spektroskopija UV spektroskopija Čistoća HPLC na obrnutim fazama Ekskluziona hromatografija Kapilarna elektroforeza (sa dodecil sulfatom) Jonoizmjenjivačka hromatografija Jačina/Moć ELISA imunohemijski esej Jačina UV spektroskopija Opšti testovi Ispitivanje: osmolarnosti pH koncentracije proteina i surfaktanata Sigurnost Testiranje sterilnosti-membranskom filtracijom Testiranje bakterijskih endotoksina Kontrola kvaliteta vakcina Rekombinantne vakcine dobivene su tehnikom rekombinatne DNK. Ovom tehnikom proizvode se specifični proteinski antigeni iz patogenih mikroorganizama u rekombinantnim organizmima kao što su E. coli, stanice kvasca. Prednosti rekombinantnih vakcina su: klinički sigurne, mogućnost dobijanja velikih količina, definisanost proizvoda, jednostavne su i lake za primjenu. Zahtjevi kojima moraju odgovarati rekombinantne vakcine: Odsustvo kontaminacije; Identifikacija – prisustvo acido-alkoholno rezistentnih bacila; Ukupan broj kulturabilnih partikula: 1.6- 16 × 106 CFU/mg; Neškodljivost; Pozitivna kožna reaktivnost; Odsustvo virulentnih mikobakterija; pH 5.0- 8,0; Sadržaj vode ≤3,0%; Bez obzira da li se radi o biološkom ili biološki sličnom lijeku postupak razvoja i kontrole kvaliteta je vrlo opsežan, skup i dugotrajan. Zahvaljujući centraliziranim postupku odobravanja, nakon provedene ocjene i donošenja odluke o davanju odobrenja za stavljanje u promet, biološki i biološki slični lijekovi postaju dostupni za primjenu na čitavom području EU pa i na području Bosne i Hercegovine. Svi biološki slični lijekovi trenutno odobreni u Bosni i Hercegovini odobreni su centralizovanim postupkom davanja dozvole za stavljanje lijeka u promet, što znači da je njihovu naučnu i regulatornu ocjenu za kakvoću/efikasnost/sigurnost provela Evropska agencija za lijekove (EMA), a dozvolu za stavljanje u promet dala Evropska komisija. TITRIMETRIJSKE METODE - prez 1. Alkalimetrija - određuje se: jake kiseline– hloridna, nitratna, sulfatna slabe kiseline– boratna, fosfatna, sirćetna soli nastale iz slabih baza i jakih kiselina UZORAK TITRANT INDIKATOR VRSTA POSTUPAK TITRACIJE Borna 0,1 M fenolftalein indirektna U prisustvu polihidroksilnog kiselina NaOH alkohola - glicerola ili manitola, pri čemu nastaje ester dovoljnog aciditeta da se može titrirati jakom bazom uz indikator fenolftalein Metil HCl fenolftalein retitracija Ester metilsalicilata salicilat prethodno se saponificira alkoholnim rastvorom KOH i višak dodane baze retitrira sa HCl uz fenolftalein. Saponifikacijom metilsalicilata stvara se salicilat i fenolat. Kalijum vezan kao fenolat može se retitrirati sa kiselinama i nakon retitracije nastaje salicilna kiselina u obliku K-soli. Aspirin je i ester i kiselina. Saponifikacijom nastaje salicilna i sićetna kiselina sa kojima može biti onečišćen. UZORAK TITRANT INDIKATOR VRSTA POSTUPAK TITRACIJE Aspirin 1.0,1 M 1.fenolftalein 1.direktna 1. Preparat se rastvori u KOH 2.fenolftalein 2.retitracija alkoholu i titrira sa 0,1 M 2.0,1 M KOH, uz fenolftalein kao HCl indikator. Iz utroška baze izračuna se postotak kiseline. 2. Titriranoj otopini doda se 25 ml 0.1M KOH rastvora, zagrije uz povratno hladilo i višak baze retitrira sa 0.1M HCl. Iz utroška baze izračuna se postotak preparata aspirina UZORAK TITRANT INDIKATOR VRSTA POSTUPAK TITRACIJE Formaldehid 0.1M HCl Fenolftalein Retitracija U erlenmajer tikvicu stavi se određena količina 0.1M NaOH, doda 3% H2O2 i ispitivani aldehid ili preparat zagrijava 15 min. na vodenom kupatilu uz povratno hladilo.  Nakon reakcije sa amino grupom, titrira se Formaldehid 0,1 M fenolftalein indirektna karboksilna grupa NaOH aminokiseline sa 0.1M bazom. 2. Acidmetrijska titracija Direktna titracija jakih baza sa standardnim rastvorima kiselina npr. ▪ KOH, Ca(OH)2 ▪ titracija slabih baza kao što je amonijum-hidroksid, magnezijum oksid i organske baze ▪ indirektna titracija soli i oksida HgNH2Cl, HgO ▪ titracija soli nastalih iz jakih baza i slabih kiselina npr. Na2CO3, K2CO3, KHCO3, Na2B4O7, kalcijum laktata, natrijum citrata ACIDIMETRIJSKE TITRACIJE UZORAK TITRANT INDIKATOR VRSTA POSTUPAK TITRACIJE Živa (II) 0,1 M HCl metiloranž indirektna Živa (II) aminohlorid aminohlorid je teško rastvorljiv u vodi, ali dodatkom KJ ili Na-tiosulfata dolazi do rastvaranja, pri čemu nastaje rastvorljiva kompleksna so žive uz izdvajanje ekvivalenta baze KOH i amonijum hidroksida. Količina živa(II)aminohlorida izračuna se iz direktnog utroška kiseline pri titraciji. 3. Titracija alkaloida Alkaloidi se u farmaceutskim oblicima pobično nalaze u obliku soli, a rjeđe kao slobodne baze u tabletama i drugim farmaceutskim oblicima. Mogu se naću u ekstraktima droga ili u drogama kao heterogene smjese. Alkaloidi koji su slabo bazni i ne mogu se titrirati, određuju se gravimetrijski i drugim metodama. Soli alkaloida se određuju tako da se rastvore u pogodnom rastvaraču, obično alkoholu i titriraju direktno ili indirektno. Indikatori: Slabe organske kiseline ili njihove soli, koje mijenjaju boju pri određenim pH vrijednostima. Prema hemijskoj strukturi se dijele: 1. azo boje (metiloranž, metilcrveno, dimetilžuto) 2. ftaleinske (fenolftalein, timolftalein) 3. sulfoftaleinske (bromfenolplavo, bromtimolplavo, fenolcrveno) Promjena boje u zavisnosti od pH 4. KOMPLEKSOMETRIJSKE TITRACIJE Volumetrijska metoda kod koje kompleksirajući agens stvara kompleks sa metalnim jonom. U analitici lijekova se upotrebljava za određivanje jona Al3+, Bi3+, Ca2+, Cu2+, Hg2+, Mg2+, Zn2+ i dr. Kompleksirajući agensi su elektrondonori joni ili molekule koji su u stanju da grade jednu ili više kovalentnih veza sa metalnim jonom. Metalni jon se zove centralni atom a vezani moleluli ili joni - ligandi. Ako je nastali kompleks prstenaste strukture naziva se helatni kompleks ili helat. Helacioni agensi grade: Komplekse rastvorljive u vodi: 1,2-diamino-etan etilendiamino tetrasirćetna kiselina (komplekson II, titriplex II, chelaplex II, idranal II) etilendiamino tetrasirćetna kiselina – dinatrijumova so (EDTA; komplekson III; titriplex III, chelaplex III) cikloheksan diamin-1,2-tetrasirćetna kiselina (komplekson IV) Helacioni agensi koji grade komplekse nerastvorljive u vodi, a rastvorljive u organskim rastvaračima: EDTA reaguje u neutralnoj i baznoj sredini i stvara komplekse odnosa 1:1 bez obzira na valentnost kationa sa kojim se kompleksira. Kompleksi su ciklične strukture. Dvovalentni kationi grade tri ciklusa, trovalentni četiri itd. Kompleks EDTA sa dvovalentnim metalom Kompleks EDTA sa trovalentnim metalom Kompleks EDTA sa četverovalentnim metalom Završna tačka titracije 1. indikatori 2. elektrohemijski ili spektroskopski Indikatori– sa metalnim jonom daju obojene komplekse odnosa 1:1 koji mora biti manje stabilan od kompleksa metal-helacioni agens, ali dovoljno stabilan da daje odgovarajuću promjenu boje pri završnoj tački. Najčešće upotrebljavani indikatori: eriohromcrno T mureksid difenilkarbazon metilcrveno metiltimolplavo  kateholviolet Eriohromcrno T ima u baznoj sredini oko pH 10 plavu boju, a u većini kompleksa je crvene boje. Fenolne grupe indikatora eriohromcrno T se protoniraju i dolazi do vezivanja metala. Uz eriohromcrno T se direktno se titriraju: Mg2+, Ca2+, Hg2+, Pb2+, Zn2+, Mn2+, Cd2+ Ne mogu se titrirati Al3+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Ag+ jer sa eriohromcrno T grade stabilnije komplekse nego sa EDTA. Za određivanje Ba2+ doda se EDTA u višku pa izvrši retitracija sa poznatim rastvorom magnezijum(III) hlorida. Vizueno praćenje završne tačke titracije može se postići primjenom alkaloacidimetrijskih indikatora. Kada se dvovalentni metalni jon doda u rastvor EDTA dolazi do oslobađanja hidrogen jona, koji se mogu titrirati bazom. Boja metalnog kompleksa se mijenja sa promjenom pH vrijednosti, zato je neophodno obezbijediti u toku kompleksometrijske titracije stalnu pH vrijednost upotrebom pufera. Stabilnost kompleksa izražava se konstantom stabilnosti koja predstavlja odnos nejonizovanog i jonizovanog oblika. M = metal X = helacioni agens 5. VRSTE KOMPLEKSOMETRIJSKE TITRACIJE Direktna: cink, kalcijum, magnezijum uz eriohromcrno T u amonijakalnom puferu pH oko 10 dvovalentno željezo se prvo oksidira u trovalentno i određuje pri pH 2-3, uz sulfosalicilnu ili salicilnu kiselinu kao indikator DIREKTNA Joni Indikator Medij Titrant cink, kalcijum, magnezijum Eriohrom crno T Amonijačni EDTA pufer pH 10 dvovalentno željezo se prvo sulfosalicilna ili pH 2-3 EDTA oksidira u trovalentno salicilna kiselina RETITRACIJA- helacioni agens se dodaje u višku Joni Indikator Medij joni metala koji su u obliku Eriohrom crno T Mg i Zn hidroksida, supstance koje soli sporo reaguju sa EDTA soli bizmuta – bizmut nitrat, Pirokatehol pH 2- EDTA bizmut karbonat violet 3 Ksilenol oranž Joni Indikator Medij Titrant soli žive , živin Eriohromcrno amonijakalni pufer, magnezijum aminohlorid, živin oksid, T pH oko 10 ili cink sulfat sublimat fenobarbiton Eriohromcrno taloži se Denigesovim retitracija sa T reagensom u filtrat cink sulfatom koji sadrži živa(II) jone, doda se komplekson III INDIREKTNA TITRACIJA- određivanje aniona koji ne reaguju sa helacionim agensima Barbiturati se mogu Eriohromcrno Rastvor soli kvantitativno istaložiti u T cinka baznoj sredini sa živa(II) jonom, stavarajući kompleks 1:1. Stvoreni talog se odvoji i rastvori u višku EDTA koji nagradi kompleks sa živa (II) jonom. Količina barbiturata se odredi indirektno, pošto je ekvivalentna količini žive. Titracija zamjene- kada direktna titracija i retitracija ne daju oštru završnu tačku Na metal – EDTA kompleks dodaje se rastvor soli metala koji sadrži metal jačeg afiniteta pa se veže na kompleksirajući agens i dolazi do istiskivanja vezanog metala iz kompleksa. Oslobođeni jon metala se direktno titrira sa standardnim rastvorom EDTA. Primjer: određivanje mangan (II) jona Anioni: Određuju se dodatkom metala u višku i titracijom viška metala standardnim rastvorom EDTA. Sulfati dodatkom barijum jona i retitracijom viška barijum jona. 6. TITRACIJE U NEVODENOJ SREDINI Određuju se: slabe baze i kiseline supstance nerastvorne u vodi Disocijacija slabih kiselina povećava se rastvaranjem u rastvaračima koji su bazičniji od vode– jače privlače protone. Disocijacija slabih baza – rastvaranjem u rastvaračima kiselih osobina. NIVELIRAJUĆI EFEKAT Nivelirajući efekat rastvarača zavisi od protoniranja rastvarača i stabilnosti nastalog jona. Jonizaciona sposobnost određena je dielektričnom konstantom i efektom solvatacije rastvarača. Kiseline su proton donori, baze proton akceptori. Acetatni jon - konjugirana baza sirćetne kiseline Sirćetna kiselina – konjugirana kiselina acetatnog jona Rastvarači se dijele na: 1. protofilne - piridin, aceton, eter, dioksan, amini, amonijak 2. protogene - sirćetna, mravlja, sulfatna, fluoridna, hloridna kiselina 3. aprotonske - hloroform, benzen, zasićeni i aromatski ugljikovodonici 4. amfiprotonske – glacijalna sirćetna kiselina, alkohol, voda Protofilni– akceptiraju protone – stvaraju se konjugovane baze odgovarajuće kiseline Amfiprotonski – protofilni + protogeni Primjer protogenog djelovanja: Primjer protofilnog djelovanja: 7. Uticaj temperature Pri titraciji u nevodenoj sredini koeficijent temperaturnog širenja organskog rastvarača veći je nego kod vode što može dovesti do grešaka ako se razlikuje temperatura na kojoj je rastvor standardiziran i temperatura na kojoj se vrši titracija. Indikatori: Timolplavo (kisele supstance) Kristalviolet (bazne supstance) Naftol-benzen Malahitzeleno Potenciometrija – kalomel i staklena elektroda 8. Titracija baznih supstanci U titraciji u nevodenoj sredini rastvarač može biti kiseli ili neutralni u zavisnosti od supstance koja se titrira. Primjer: rastvarač sirćetna kiselina – titrant perhlorna kiselina. a) sirćetna kiselina reaguje sa bazom dajući acetatni jon b) Sa sirćetnom kiselinom reaguje i titrant, perhlorna kiselina U ovoj reakciji sirćetna kiselina reaguje kao baza. c) Reakcija acetatnog i acetonijum jona Reakcija baze sa titrantom:  9. Titracija efedrina sa perhlornom kiselinom 1. Reakcija titranta sa rastvaračem 2. Protoniranje efedrina pri rastvaranju u sirćetnoj kiselini Zbirna reakcija:  10. Titracija efedrina u dioksanu sa perhlornom kiselinom 1. Reakcija titranta sa rastvaračem 2. Protoniranje efedrina Zbirna reakcija: 11. Titracija halogenih soli efedrina sa perhlornom kiselinom Titracija je moguća tek nakon dodatka merkuri acetata 1. Tok reakcije: 2. Zbirna reakcija Primjeri - određivanja kodein fosfata, strihnin nitrata i atropin sulfata Perhlorna kiselina standardizira se kalijum hidrogen ftalatom. Perhlornom kiselinom u sirćetnoj kiselini mogu se titrirati: Kvarterne amonijumove soli Soli alkalnih metala Atropin sulfat Kodein fosfat Pilokarpin nitrat Adrenelin tartarat Natrijum benzoat Natrijum citrat Kofein Rezerpin itd. U glacijalnoj acetatnoj kiselini nakon dodatka živa(II)acetata mogu se perhlornom kiselinom titrirati: Kinin hlorid Kokain hlorid Morfin hlorid Noradrenalin hlorid Papaverin hlorid Piridoksin hlorid Neostigminijum bromid Aminofenazon se titrira sa perhlornom kiselinom rastvoren u benzenu. 12. Titracije slabih organskih kiselina Rastvarači Indikatori Titranti Dimetilformamid Timolplavo Natrijum, kalijim, litijum metanolat ili etanolat Etilendiamin o – nitroanilin Tetrabutilamonijum hidroksid Aceton p- hidroksiazobenzen Tributilamonijum hidroksid Hloroform Kalijum hidroksid u metanolu Standardizacija KOH u metanolu provodi se sa benzojevom kiselinom uz indikator timolplavo. UZORAK RASTVARAČ TITRANT INDIKATOR Sulfonamidi Dimetilformamid Na-metanolat Timolplavo Fenoli sa Dimetilformamid K-metanolat u Timolplavo supstituiranim smjesi benzen- elektronprivlačećim metanol grupama u o- i p- položaju Soli nastale iz slabih Na-metanolat u Timolplavo baza i jakih kiselina - dimetilformamidu ili benzoati, sulfati, jodidi, 0,1 M K-metanolat u citrati, pikrati i soli benzen - metanolu. alkaloida Spojevi sa imino grupom kao barbiton, fenobarbiton, hidantoin, tiouracil rastvore se u dimetilformamidu i titriraju sa litijum metanolatom uz indikator timolplavo. 13. TITRACIJE OKSIDO - REDUKCIJE Oksidirajući agensi – jod, brom, kalijum permanganat, kalijum dihromat, kalijum jodat, cer (IV) sulfat. Reducirajući agens – titan (III)-hlorid. Oksidirajući agensi Jod Uzorak Titrant Indikator Napomena Glukoza Direktna Indirektna Škrob Standardizacija - Fluorescein Natrijum Jod Rastvor joda Određivanje tiosulfatom Kalijum služi kao titrant viška joda permanganat provodi se Antibiotici rastvorom Fenol natrijum Vitamini tiosulfata Brom Anilin Standardni Škrob Titrant se Fenoli rastvor za standardizira tako Sulfonamidi titracije sadrži da se oslobođeni  ekvivalentnu jod titrira sa količinu kalijum- natrijum bromata i u tiosulfatom suvišku kalijum- bromid. U kiseloj sredini iz ove smjese oslobađa se brom. Oslobođeni brom se oksidira uz oslobađanje ekvivalentne količine joda. Iz utrošene količine tiosulfata poznatog normaliteta, izračuna se normalitet rastvora broma. Titracija cer (IV) sulfatom Uzorak Titrant Indikator Napomena Preparati sa rastvor cer Difenilamin Prednosti cer (IV) dvovalentnim (IV)- sulfata kao željezom, nitrata i 2,2’-dipiridil oksidacionog sredstva amonijum u odnosu na kalijum Nitriti sulfata permanganat: difenilamin sulfonat Stabilniji Neke organske rastvor cer Nije fotosenzibilan supstance (IV)-nitrata Nije intenzivno i amonijum obojen nitrata Titracija kalijum dihromatom Preparati sa Kalijum Difenilamin rastvoren u Kao redukcioni dvovalentnim dihromat koncentrovanoj sulfatnoj proizvod javljaju se željezom kiselini, koji se oksidira hrom (III) soli u višku kalijum zelene boje  dihromata uz stvaranje koje maskiraju višak intenzivne plave boje. kalijum dihromata. Prije pripreme rastvora kalijum dihromat se žari radi odstranjivanja vode. Titracija sa tiocijanatnim jonima Uzorak Titrant Indikator Napomena Soli žive kalijum ili soli trovalentnog Reakcija se odvija u amonijum željeza – kiseloj sredini, jer u tiocijanat željezo(III) neutralnoj sredini soli amonijum sulfat. željeza hidroliziraju Titracija natrijum nitritom Preparati iz grupe Rastvor Završna tačka Bitno je dodati višak sulfonamida, natrijum određuje se kiseline koja će fenacetin, nitrita indikator obezbjediti oslobađanje paracetamol papirom koji se nitritne kiseline iz sastoji od škroba i natrijum nitrita, Sukcinilsulfatiazol ili kalijum jodida, a stvaranje diazonijum- ftalilsulfatiazol ako bazira na hlorida i stabilizaciju se prethodno izvrši određivanju viška nagrađene diazonijum n-dealkiliranje. nitritne kiseline. soli. Višak nitritne kiseline oksidira Standardizacija - jodid do joda koji sulfanilnom kiselinom u dodiru sa ili sulfanilamidom. skrobom daje plavo obojenje. Titracija srebro- nitratom Uzorak Titrant Indikator Napomena Hloridi ili bromida Rastvor Završna tačka u koji sa jonima srebra AgCl neutralnim stvaraju slabo rastvorima se rastvorljive soli određuje pomoću kalijum- bihromata Titracija sa kalijum jodatom Spojevi sa jodom i Kalijum Jod se u prisustvu jodidima jodat koncentrovane hloridne kiseline i kalijum jodata oksidira u jod kation, a u prisustvu hloridnih jona stvara se jod-monohlorid. Standardizacija-kalijum jodidom u kiseloj sredini. Oslobođeni jod se titrira se natrijum - tiosulfatom REDUCIRAJUĆI AGENSI Titracija sa titan (III)-hloridom i titan (III)-sulfatom Uzorak Titrant Indikator Napomena Željezo (II) soli Titan Amonijum Rastvori ovih soli su (III)- tiocijanat fotosenzibilni pa se moraju Nitro i nitrozo spojevi hlorid Metilen čuvati u atmosferi nitrogena ili Titan plavo CO2, u tamnim bocama. Kinoni (III)- sulfat Standardizacija – željezo (III)-amonijum sulfatom uz amonijum rodanid kao indikator. 14. Određivanje askorbinske kiseline Određuje se titracijom jodom u kiseloj sredini uz skrob kao indikator.  15. Određivanje benzil-penicilina Hidrolizira se i sa natrijum hidroksidom prevede u odgovarajuću penicilinsku kiselinu. Djelovanjem kiseline dobije se D-penicilinamin koji se u prisustvu joda oksidira do odgovarajućeg disulfida. Višak joda se retitrira sa rastvorom natrijum tiosulfata. 16. Određivanje salicilne kiseline Reakcija salicilne kiseline sa bromom se odvija u kiseloj sredini tako da u isto vrijeme nastaje dekarboksilacija i elektrofilna supstitucija.