Komprimeret motherfucker (1) PDF - Pensum i Præcisionsmedicin

Pensum i Præcisionsmedicin Efterår 2023 Indholdsfortegnelse F1: CAR-T terapi og cancer 2 F2: Next generation sequencing 9 F3: Cancer 1 (genetik) 13 F4: RNA world...

Pensum i Præcisionsmedicin Efterår 2023 Indholdsfortegnelse F1: CAR-T terapi og cancer 2 F2: Next generation sequencing 9 F3: Cancer 1 (genetik) 13 F4: RNA world 18 F5: Cancer 2 23 F6: CRISPR gene editing 29 F7: Mutation detektion teknikker 36 F8: Spinal Muscular Atrophy 47 F9: Genetic counseling, prenatal diagnose circulating DNA og etik 52 F10: Parkinsons disease 60 Side 1 af 45 F1: CAR-T terapi og cancer CAR-T behandling er immunterapi, hvor kroppens egne hvide blodlegemer (T-celler) bliver genmodificeret/programmeret til specifikt at angribe og ødelægge de syge celler. Høst af T-celler Først høster man en type immunceller fra patienten selv (ofte T-cellerne), da de er fordelagtige, da man gerne vil udnytte deres evne til at slå andre celler ihjel. Omprogrammering af T-celler Man omprogrammerer T-cellerne genetisk og sætter en kunstig ‘kimærisk antigen receptor (CAR)’ ind → CAR T-celler. CAR’en gør, at T-celler kan binde til andre celler, der udtrykker et bestemt overflade-molekyle (target) = T-celler bliver dirigeret hen mod kræftcellerne og kan slå dem ihjel. T-cellerne angriber kun lige præcis de celler, som CAR’en kan binde til; og altså ikke et helt organ eller hele kroppen, sådan som andre typer kræftmedicin nogle gange gør. Dette gør også at terapien er enormt specifik. Behandling Efter omprogrammeringen af T-cellerne opformeres de i stort antal og gives tilbage til patienten – og fordi terapien består af levende celler, der aktivt bevæger sig rundt i kroppen, er de i stand til at infiltrere, finde og angribe kræftceller på tværs af organer, og ideelt set blive i kroppen mange måneder og år fremover. Fordele ved brugen af cellulære terapier Immunceller er dynamiske celler og kan bevæge sig gennem forskellige væv. De kan trænge ind forskellige steder, der ellers ikke er tilgængelige for normale drugs. CAR T-celler vil være til stede i kroppen resten af livet, hvis først de er induceret. ○ Derfor skal dette overvejes omhyggeligt, i forhold til risk/benefit, hvis man lider af andre sygdomme. De er gode, hvis man har cancer. Side 2 af 45 Konstruktion af en CAR, hvordan man bruger den T-celler udtrykker en receptor med potentiale for at genkende forskellige antigener fra patogener og tumorer. Derudover er de også med til at opretholde immunologisk hukommelse og selvtolerance. Interaktion mellem T-celle og cancercelle Cancer er en heterogen sygdom, hvorfor T-celler ikke altid virker. Der skal dannes en god immunologisk synapse mellem T-cellen og cancercellen, før at T-cellen kan angribe. T-cellerne binder til en specifik peptid i cancercellen og dræber dem derigennem. Hvis der er flere cancerceller tilbage, vil de blot formere sig og danne en ny population, hvilket kan medføre, at der opstår en cancertype, som CAR T-cellerne ikke kan binde til grundet deres specificitet. Design af CAR T-celler Formålet er at kopiere TCR og derefter designe den til et specifikt target. Den aktiverende del er den del, der aktiverer T-cellerne. Her har man brugt samme intracellulære proteiner, som findes i TCR. Den bindende del er den del, der skal binde til target (antistofbindende domæne). TCR kan kun genkende fremmede antigener, der er præsenteret på MHC. Den reagerer ikke på selv-antigener. Den designede CAR-receptor kan genkende egne proteiner, men kun dem, der findes på cellemembranen. Side 3 af 45 Modulering af CAR-receptor Det er relativt nemt at modulere ens CAR-receptor. Det er muligt at erstatte forskellige dele af CAR-receptoren, fx bindingsdomænet, transmembrane domæne og det intracellulære domæne. Et stort aktiverende stimuli → T-cellerne bliver gode dræbere, men de dør også hurtigt igen. Også muligt at rekruttere andre immunceller, så de kan hjælpe med at eliminere targetcellerne. Gode cancer targets for CAR T-cellerne Man ønsker at finde et target, der er højt udtrykt på cancerceller, og lavt udtrykt i raskt væv, da det ellers også vil eliminere alle raske celler. Øjeblikkelige effekter af CAR aktivering 1. Binding af CART til target (CD19) = dannelse af immunologisk synapse. 2. Phosphorylering af signaleringsdomænet. 3. Sekretion af toksiske granuler og cytokiner fra CAR T-cellen. 4. Cancercellerne dræbes. 5. Videre aktivering og proliferering af CAR T-celler → immunologisk hukommelse. Udfordringer ved behandling med CAR T-celler Side 4 af 45 Poor transduction Lavt antal af T-celler Hvis man anvender et dårligt virus, så får man en dårlig transduktion af CAR. Quality of donor T celler ​Kvaliteten af T-cellerne kan være dårlig, da man i forvejen får behandling, der påvirker immunforsvaret. Kan få dysfunktionelle T-celler eller også bare have et lavt antal T-celler. Man kan også være nervøs for, at man rammer en onkogen, når man inducerer CAR i T-cellerne. Hvis dette sker, får patienten flere cancerceller. Ikke alle patienter vil have den samme proliferation af CAR T-celler - virker bedre i nogen end i andre. Lang manufacturing tid (tager lang tid at lave CAR T-celler): Needle-to-needle time: Fra når man høster cellerne til de er inde i patienten igen. Adverse effects Cytokinstorm Hvis man har en tumor og indsprøjter aktiveret T-celler, vil de gå amok og eliminere cancercellerne. Dette producerer en stor mængde af affaldsstoffer og cytokiner fx IL-6→ cytokinfrigivelsessyndrom/cytokinstorm, som kan føre til hæmodynamisk ustabilitet, organdysfunktion og neurotoksicitet. Off target effekter Hvis markøren som CAR-T cellen er designet til også er udtrykt på andre celler, vil disse også blive dræbt. Lack of effect Cancercellerne kan ændre udtryk af overfladeproteiner, så de kan undslippe T-cellerne. Hvis man bliver ved med at stimulere T-cellerne, bliver de udmattet. ○ T-celle udmattelse er en tilstand af T-celledysfunktion, som er defineret ved dårlig effektorfunktion og vedvarende ekspression af inhiberende receptorer. ○ I starten er CAR T-cellerne gode til at dræbe, men de mister deres effekt over tid. Side 5 af 45 Future → vil lave bedre sikkerhed Passive control: Man kan justere på affiniteten. Inducible control: Spilt CART, hvor et drug inducerer sammenkobling af CART igen. On/off → drug er nødvendigt for at CAR bliver transskriberet i T-cellen. Autonomous control: SynNotch aktiveret ved binding af antigen A → det aktiverer en TF der promoverer transskription af CAR, som kan binde antigen B. De binder til hver deres target. Etime: Laver CAR mod B-celler, der laver autoantistoffer mod kroppen selv (autoimmune sygdomme). Side 6 af 45 F2: Next generation sequencing Platform Princip Fordele/Ulemper/Brug Illumina Se nedenfor. Kort read længde: (150 bp). Fordele Meget dyb sekventering (op til 20 billioner reads) Høj præcision Laver paired end Ulemper Dyr maskine + kemi Ion torrent Når der sættes et nukleotid på, så Lang read længde: (200-400 bp) frigives der H+. Man prøver med 1 Fordele nukleotid ad gangen → recorder Billig maskine signal og vasker væk. Prøver igen. Billig kemi + H detekteres via ændringer i pH. Hurtig sekventering Ser man en pH-ændring, så er det Ulemper den rigtige nukleotid. Man kan ikke lave paired end (både forfra og bagfra) Syntetiserer komplementær streng. Færre reads/dybde end illumina (mindre coverage) Side 7 af 45 Pacific Nukleotider har en fluorofor på Bruges mindre end de andre. Biosciences phosphatgruppen. Ved binding af nukleotidet til strengen, så spaltes Lang read længde: (20.000 bp og op til phosphatgruppen fra og fluoroforen 50.000 bp) kan detekteres. På den måde kan man se, hvilket Fordele nukleotid, der inkorporeres alt efter, Ingen PCR bias (ikke afhængig hvilken farve der opfanges. af amplificering af sekvens) Ulemper Dyr maskine Meget dyr kemi Lavere dybde ift illumina (færre reads) Lange sekvenser har lavere nøjagtighed Nanopore De andre metoder er afhængige af en Lang read længde: (op til 2Mb) → polymerase, det er nanopore ikke. gennemsnitlige read: 10.000 DNA strengen trækkes igennem poren hvilket skaber en strøm som Fordele kan måles. Mønsteret i fluktueringer Ingen PCR bias (ikke afhængig i strømmen afslører sekvensen. af amplifikation) Strømmen for samme slags Direkte RNA sekventering nukleotid er ikke ens hver gang, det (behøves ikke konverteres til kommer også an på hvilke cDNA først) nukleotider der er ved siden af. Ulemper Lavere dybde ift illumina Lavere nøjagtighed Side 8 af 45 Exom sekventering (sekventering af exons på DNA niveau) Proces: Man fragmenterer DNA Ligerer adaptorer på Bruger prober som kun binder til exons → vasker dem væk som ikke binder Så eluerer man dem som har været bundet (altså dem som indeholder exons) Amplificerer med PCR Sekventerer Genererer mindre data og har et mindre target space, men map rate og total coverage er bedre. Illumina proces Side 9 af 45 F3: Cancer 1 (genetik) Man opdeler typisk cancer i to kategorier: Arvelig cancer Sporadisk cancer (de fleste cases) Årsag til cancer Cancer skyldes mutationer i gener, der står for celleregulering = øget proliferation. Hovedparten af mutationerne er somatiske (nyopstået). Nyopstået mutationer kan ske tilfældigt (random mutationer), grundet miljøpåvirkning eller karcinogener (kræftfremkaldende stoffer). Alle har somatiske mutationer, og man får flere med årene. Der udvikles cancer, hvis disse mutationer er aggressive. De arvelige mutationer kan være: monogene og polygene komplekse. Den hyppigste årsag til cancer er tilfældig. Cancerprogression Der skal en kaskade af mutationer til, før at cancer kan udvikle sig. Cancer starter oftest med en mutation i en celle, som giver cellen en overlevelses-/vækstfordel (ofte i epithelcellerne). ​Den muteret celle får nogle efterkommere. En af disse kan have endnu en yderligere mutation → har også vækstfordele. Herfra sker der ukontrolleret vækst af muterede celler = cancerceller → tumor. Metastase Metastaser kan opstå, når cancerceller fra en tumor bliver ført rundt til andre steder i kroppen med blodet eller lymfe → sekundær tumor. En metastase består af den samme slags cancercelle som den oprindelige tumor. Der sker ofte metastaser i ​lungerne, leveren eller knogle, men det ses også i hjernen eller huden. Side 10 af 45  Cancergener Onkogener ​Et gen, der kan ændre en celle til en cancercelle. Et proto-onkogen skal opreguleres → onkogen → udvikling af cancer. Her skal blot én af allelerne rammes af en mutation for at det kan føre til udvikling af cancer. Tumorsuppressorgener Tumorsuppressorgener koder for proteiner, der forhindrer celler i at forandres til cancerceller. Et tumorsuppressorgen skal nedreguleres for, at det kan føre til udvikling af cancer. Generelt aktiveres tumorsuppressorgener, når der er stress i cellen, når der er ødelagt DNA og når homeostasen skal opretholdes. Her skal begge alleler rammes af mutationer, for at det kan føre til udvikling af cancer. En rask allel kan kompensere for den syge allel. Aktivering af onkogener Aktiveringen af onkogener involverer genetiske ændringer af cellulære proto-onkogener. Særligt tre genetiske mekanismer aktiverer onkogener: Mutationer i den kodende sekvens → hyperaktiv Genamplifikation → flere gener Kromosom rearrangement Demethylering af promotorer fører til aktive onkogener. Side 11 af 45 Tumorsuppressorgener Tab af heterozygositet (LOH) LOH defineres som tabet af den ene forælders allel. Det er en almindelig form for allel ubalance, hvorved heterozygote somatiske celler bliver homozygote, fordi en af de to alleler går tabt. Loss-of-function i tumorsuppressorgener Mutationer i den kodende region. Deletioner. Methyleringer i promotoren kan slukke for tumorsuppressorgenet. DNA repair Der sker DNA-skader på daglig basis, hvorfor der hele tiden sker DNA repair, så disse skader kan genoprettes. Hvis DNA-skaderne ikke repareres, kan det ende med at ramme nogle af cancergenerne → udvikling af en anden patologisk tilstand. Dette vil højst sandsynligt medføre udvikling af cancer. Side 12 af 45 F4: RNA world Splicing Splicing er den proces hvorved intron bliver klippet ud af pre-mRNA og exons sættes sammen til at danne mRNA, som derefter bliver translateret til protein. Splicing processen er multifaktoriel og afhænger derfor af et samspil mellem mange forskellige elementer. Mutationer i de mange forskellige elementer kan lede til forskellige sygdomme alt efter hvilken faktor som er påvirket. Et meget vigtigt element i processen er skelnen mellem, hvilke sekvenser der er exons og hvilke der er introns. Denne adskillelse sker ved hjælp af sekvenser kaldet splice sites, som er en kort sekvens i starten og slutningen af et exon/intron. Eftersom disse sekvenser er korte opstår de mange steder i genomet, men hvorvidt de genkendes afhænger af, hvor godt de matcher konsensus sekvensen (den optimale sekvens). Splice site score = hvor godt det matcher konsensus sekvensen (højere score → stærkere binding). Side 13 af 45 Alternativ splicing Splicing er en fleksibel proces og alt efter, hvilket væv der er tale om, kan et gen være forskelligt splicet = alternativ splicing. Hvilken isoform der dannes, er afhængigt af, hvilke regulatoriske faktorer, der er til stede i vævet. Regulering af splicing Splicing reguleres af splicing regulatoriske elementer, som kan være med til enten at fremme (enhancers) eller hæmme (silencers) splicing af et exon. Disse elementer er særligt vigtige når et exon har svage splice sites, da splice sitet i det tilfælde ikke er nok til at kunne lede til splicing af exon. I disse tilfælde er det balancen mellem enhancer og silencer elementer som i sidste ende bestemmer, hvorvidt exon bliver inkluderet eller ej. Ligesom splicing faktorerne, så binder de regulatoriske elementer også til specifikke sekvenser - dvs SR (splicing fremmende protein) og hnRNP (splicing hæmmende proteiner) proteiner har bestemte sekvenser som de binder til, og disse kan være med til at forudsige den regulatoriske aktivitet baseret på sekvensen i genet. Konsekvenser af mutationer En mutation kan være en neutral missense/silent ift. den genetiske kode, altså aminosyrer, men kan godt være skadelig, hvis den forstyrrer en sekvens som normalt er en enhancer eller silencer (splicing code). Dette kan forstyrre bindingen af enten SR eller hnRNP proteiner og derved ændre på splicingen. Vigtigt at pointere, at mutationer i regulatoriske elementer kun er skadelige, når splicing af exon er afhængig af disse elementer, kan være svært at forudsige - dette sker når splice sites er svage. Mutationerne indenfor splice sites sekvenser kan være lettere at forudsige effekten af, da man kan kigge på om dette giver et bedre eller dårligere match med konsensus sekvensen. Side 14 af 45 Mutationer både i og udenfor splice sites kan også være meget vanskelige at forudsige effekten af, da effekten i høj grad kan være afhængig af hvilke baser der er omkring mutationen. Fx kan en mutation give problemer med splicing i en person men ikke i en anden, fordi den første person har en anden kombination af nukleotider i sekvensen som gør, at mutationen er sygdomsskabende. Dette betyder også, at haplotypen er vigtig, da SNPs på en allel kan have betydning for, hvilke effekter mutationer på samme allel har på patienten. Korrektion af unormal splicing med SSO Splice switching oligonukleotider (SSO) blokerer binding af regulatoriske faktorer til elementer i en sekvens og kan dermed være med til at skifte balancen af faktorer og påvirke splicing. Fordele De kan blive modificeret for at forbedre stabilitet, binding og levering De er ikke afhængige af biologiske systemer (ligesom siRNA), de blokerer bare Lavt niveau af toxicitet De kan designes til at være allel specifikke, hvilket reducerer bivirkninger Det kan være svært at forudsige præcis hvor SSO’en skal designes til at binde, men tre forskellige strategier kan give en ide om, hvor SSO’en skal binde: Patient mutationer ○ Mutationen som giver splicing defekt kan give et peg om, hvorhenne SSO’en skal binde, da sekvensen omkring mutationen må være vigtig. Deletion/SSO walk ○ Kan deletere forskellige sekvenser for at se, hvilken der er afgørende for splicing. ○ Kan designe SSO’er som dækker forskellige positioner i sekvenser og se hvilken der virker bedst (SSO walk). NGS/CLIP ○ CLIP: cross linking and immunoprecipitation Man får regulatoriske proteiner til at binde til RNA sekvensen → så kan man oprense det RNA, som er bundet til proteiner → skille protein og RNA ad → sekventere RNA (NGS). På den måde kan man finde ud af, hvilke sekvenser, som er bundet af regulatoriske proteiner og dermed, hvor man skal placere sin SSO. ○ Software kaldet DeepCLIP kan være med til at forudsige effekten af mutationen på binding af regulatoriske faktorer. Small molecule drugs kan også bruges til at korrigere splicing ved at ændre på RNA struktur. Side 15 af 45 Pseudoexons (PE) PE ligger i introns og ligner exons, men bliver ikke normalt inkluderet i mRNA grundet: Svage splice sites Hæmmet af splicing silencers eller mangel på enhancers Inklusionen af PE kan derfor fremmes, hvis man får en mutation der gør at (1) der sker en stigning i styrken af splice sites, (2) der tabes en silencer eller (3) der dannes en enhancer. Hvis PE bliver inkluderet, kan dette forstyrre eller ændre genekspressionen. Når et PE inkluderes opstår der ofte præmature stop codon (PTC), enten fordi (1) PE indeholder et stop-codon, eller (2) pga. frameshift som danner et downstream stop-codon. Når der opstår et PTC aktiveres en mekanisme kaldet nonsense mediated decay (NMD), som sørger for at nedbryde det mRNA, der indeholder et PTC. Dette PTC skal ligge 50 nukleotider upstream for den sidste exon-exon junction for at blive genkendt af NMD. Redirigering af uproduktiv splicing Nogle gener har normalt en lav grad af PE inklusion, hvilket leder til nedbrydning via NMD eller ikke-funktionelle proteiner. Hvis man så har en mutation der giver fuld PE inklusion, så ville SSO kunne hjælpe med at hæmme inklusionen af PE. Hos normale mennesker vil SSO hæmme den lave grad af PE inklusion, som der normalt er og lave den uproduktive splicing til produktiv. Altså, så kan patienter også have en mindre effektivt protein, hvorved SSO vil hæmme den “normale” lave grad af PE inklusion, der så ville kunne bidrage til proteinet er mere effektivt. Side 16 af 45 F5: Cancer 2 (brystkræft) Omkring 1/9 kvinder udvikler brystkræft. Det er ofte epitelceller i mælkekanalerne der transformeres til cancerceller (80% af tilfældene) og dette kaldes for duktal brystkræft. De resterende 20% skyldes transformering af celler i kirtelvævet og dette kaldes for lobulær brystkræft. 90% af brystkræfttilfælde skyldes sporadiske mutationer, mens 10% skyldes arvelige mutationer. BRCA1 og BRCA2 BRCA1/2 er tumorsuppressorgener, som er involveret i DNA repair. Ved dobbeltstrenget brud på DNA’et rekrutteres bl.a. BRCA1 og BRCA2, som er med til at reparere DNA-bruddet. Mutationer i BRCA1/2 → DNA bliver ikke repareret. Normalt ville andre mekanismer stoppe cellen i at dele sig, fx p53. Cancer kan kun opstå, hvis der også er andre mutationer fx i p53, så G2-M checkpoint aktiveres selvom DNA’et er beskadiget → cancerceller. Reparation af dobbeltstrenget brud via andre mekanismer kan medføre akkumulering af nye mutationer → øger risiko for udvikling af cancer. Vigtigt: to mutationer i BRCA1/2 er nødvendigt for at det har en effekt (den ene af mutationerne kommer fra moderen eller faderen). Risiko for udvikling af brystkræft Der er væsentlig højere risiko for udvikling af brystkræft ved mutationer i BRCA1/2 (80%) sammenlignet med uden mutationer (11%). Mutationer i BRCA1/2 øger ikke kun risikoen for udvikling af brystkræft, men også andre kræfttyper. Derudover udvikles brystkræft tidligere hos kvinder med mutationer i BRCA1/2. Side 17 af 45 Genetisk rådgivning og test Man kigger ofte på stamtavler for at vurdere, om det giver mening at teste for mutationer i BRCA1/2. Penetransen hos mænd er meget lavere end hos kvinder. Samme mutation kan give forskellig risiko for udvikling af cancer afhængigt af om der er høj penetrans i familien eller ej. Dette må betyde, at andre faktorer, som gør, at nogle familier er mere udsatte end andre → modifier gener. Modifier gener → gener som påvirker udtrykket af andre gener. Der er identificeret forskellige modifier gener, som er associeret med højere penetrans. Forskellige varianter/SNPs kan øge risikoen for udvikling af brystkræft - nogle påvirker risikoen mere end andre. Ofte er en enkelt variant ikke tilstrækkelig, men derimod kan summen af dem øge risikoen betydeligt. Personlig behandling af brystkræft Der er flere forskellige typer af behandling mod brystkræft - medicinsk og operativ. Her er der lagt fokus på den medicinske behandling. Overordnet er der 5 typer af medicinsk behandling. Kemoterapi Der er forskellige typer af kemoterapi: Cytotoksiske drugs Alkylerende midler. Molekyler der sættes ind i DNA’et. Inhibitorer af nukleotidsyntese. Cross linking af DNA. Inhibitorer af mitose. Generelt er kemoterapi ret dyrt og medfører mange bivirkninger. Ikke særlig specifik behandling (bruges også til andre kræfttyper). Skelner ikke mellem cancerceller og almindelige celler. Målrettet behandling Østrogenreceptoren (ER) Baseret på hvor Brystkræftceller udtrykker ER. Binding af østrogen til receptor → mutationerne ligger stimulerer cellevækst. To strategier, der hæmmer cellevækst: (1) Inhiberer receptoren (blokerer for binding af østrogen). (2) Inhiberer syntesen af østrogen. Side 18 af 45 HER2 Amplifikation af HER2 medfører aktivering af onkogenet. Behandling: antistoffer mod HER2 → blokerer signaleringen. CDK4/6 CDK4/6 er downstream for ER. Er involveret i cellecyklus. Behandling: inhibering af CDK4/6 → inhiberer cellecyklus → hæmmer udviklingen af cancer. BRCA1/2 Celler der ikke har mutationer i BRCA1/2: PARP er et enzym, der reparerer enkelt-strenget DNA-brud. Inhiberes PARP → enkelt-strenget DNA-brud bliver til dobbelt-strenget DNA-brud → BRCA reparerer dobbelt-strenget brud. Celler der har mutationer i BRCA1/2: Behandling med PARP inhibitor → de enkelt-strenget DNA-brud der bliver lavet til dobbelt-strenget DNA-brud bliver ikke repareret af BRCA → de mange dobbelt-strenget DNA medfører at cellen undergår apoptose. Side 19 af 45 Molekylær subtyper - Man kan via gensekventering lave et katalog over somatiske genudtryk mutationer, som kan inddeles i mutationssignaturer. Disse kan bruges til at bestemme, hvilken behandlingsmetode der er den bedste ud fra sammensætningen af mutationer. Hvert subtype af brystkræft har sin egen genekspression profil. Forskellige subtyper responderer forskelligt på behandlinger. ctDNA Alle har cellefrit DNA cirkulerende i blodet. Har man cancer, kan ctDNA = cirkulerende det cellefrie DNA stamme fra cancercellerne. Dette kan man skelne tumor DNA. imellem. ctDNA er ofte under 250 bp langt. Blodprøve (ctDNA) Fordele Ulemper Hurtig og ikke særlig Høje niveauer af ctDNA er invasiv. nødvendigt fordi ctDNA Repræsentativ for alle fra cancerceller ikke kan kloner (ikke afhængig af måles i tidlige stadier. hvor tumoren sidder). Erstatter ikke histologi vurdering Vævsbiopsi (standard) Fordele Ulemper Man får vigtige Ret invasiv metode. informationer ved Man får kun et specifikt tidspunktet for stykke af tumoren (derfor diagnosen. ikke repræsentativt for Kan finde biomarkører forskellige subtyper i der ikke involverer tumoren). DNA-ændringer. ctDNA analyse kan bl.a. bruges til: Side 20 af 45  Tidlig diagnosticering. Måling af minimal residual disease (MRD) → beskriver antallet af cancerceller efter behandling. Identifikation af metastase. Prognose. Måling af tilbagefald. Guide til den mest optimale behandling. Klonal evolution Cancervæv kan have forskellige subkloner, der er forskellige fra hinanden baseret på mutationer og genudtryk. Forskellige subkloner har forskellige evner til at metastasere og responderer forskelligt på forskellige behandlinger. Ved at sekventere cancervæv kan man bestemme de forskellige subkloner, og dermed hvilken behandling der muligvis er mest optimale. Både driver- og passenger mutationer driver den klonale evolution. Fx viser nedenstående figur at den gule subklon var tilstede både i starten og efter behandling. Den grå subklon er resistent over for behandling, og den lilla subklon er sensitiv over for behandling. OBS: En specifik mutation kan forsvinde hvis behandlingen dræber den specifikke subklon. Side 21 af 45 F6: CRISPR gene editing CRISPR-Cas9 fungerer som en DNA-saks til at klippe DNA ud. Cas9 proteinet/enzymet (caspase) kan lave dobbeltstrenget break i DNA. Kan lave specifik kløvning. Der er en single guide sekvens (sgRNA) tilkoblet, som styrer Cas9 derhen, hvor man gerne vil. Denne guide sekvens kan let ændres. Kommer fra bakterier, som har brugt det til en forsvarsmekanisme. Man kan bruge CRISPR til mange ting Aktiverer transskription/undertrykke transskription (transient ændring). Kan både bruges til at lave knock-in og knock-out (permanent): ○ Knock-in: Indsætte repair skabelon som kan korrigere for en sygdom, hvor der er blevet lavet brud på DNA ○ Knock-out: Insertions/deletions så genet ikke udtrykkes til protein. Korrigere for sygdomsmutationer PASTE ○ Tagge et gen eller indsætte nyt gen Mange sygdomme, hvor man allerede genkender en genetisk ændring, er nemme at lave med CRISPR til forskning. Især punktmutationer. Større ændringer er mere vanskeligt med CRISPR. Side 22 af 45 Forskellige metoder til delivery af CRISPR Transfektere komponenter direkte ind i cellerne → ikke kontinuerligt udtrykt. Indkode komponenter i plasmid og transfektere det ind i cellerne - kontinuerligt udtrykt. Komme det i en viral vektor og bruge en virus til at få det ind i cellerne (designe til specifikke celler). Outcome af CRISPR kan varierer Homozygot editing vil man helst opnå via CRISPR, som kan bruges til genterapi. Kan lave ex vivo hvor man isolerer celler til fx CART behandling. Ved in vivo har man ikke disse muligheder. Outcome kan dog variere, da mange forskellige ting kan “gå galt”, hvilket er en udfordring. Fx trunkering, apoptose, INDELS, off-target editing, knockout, heterozygot editing. Man bør heller ikke kun bruge knock-out/-in i CRISPR til sygdomme, da der er andre systemer, som er mere udviklet til det man nu vil gøre. Fx base editing, prime editing og PASTE. Side 23 af 45 Der er 4 primære ting, som man kan bruge CRISPR til: 1. Homology directed repair DNA har reparationssystemer, som kan bruges/udnyttes ved skade. NHEJ (nonhomologous end-joining) → bruges til at lave knockout. Efter Cas9 med gRNA har lavet brud, så forsøges enderne at sættes sammen igen. Sker ofte med fejl - mutationer, som kan lede til PTC → NMD → trunkering → knock-out. Skal gøre det så tidligt som muligt i genet (tidlige exons). HDR (homology-directed repair) → vil gerne lave knockin, men sker ikke så tit. Efter Cas9 med gRNA har lavet brud, så kan man give donor repair template (plasmid), som den forsøger at reparere ud fra. Mere præcis og ender ikke så ofte med knock-in. Virker kun i S og G2 fasen i cellecyklus. Forbedringer: Kan designe sgRNA, så Cas9 kommer derhen, hvor man gerne vil have, den laver brud. PAM er et motiv på DNA, som kan hjælpe med at binde Cas9 til genom-site. Eksempel på hvordan man bruge CRISPR til at rette en sygdomsmutation in vivo: Mutation i CEP290 → man bliver blind. Mutationen ligger i intron region (A→G). Udnytter NHEJ til at klippe mutationen ud. Dette gøres ved at designe to sgRNA derhen, så Cas9 kan klippe det stykke ud, hvor mutationen sidder. NHEJ reparere efterfølgende strengene. Kan ske der kommer deletioner/insertions, fordi det gør der ofte ved NHEJ, men gør ikke så meget, fordi det er i en intronregion. Side 24 af 45  2. Base editing Bruges til at ændre ét nukleotid. Er generelt mere præcist og ofte ender man op med HDR. Idé: I stedet for at skære DNA i stykker med Cas9, har man fjernet nucleaseaktiviteten (død Cas9) og i stedet kobler man en deaminase på (base editor - ændre én base). Man kan levere en cytidin deaminase til cellen sammen med en sgRNA, som skal deaminere C, der nu minder mere om et U. Herfra kan basen gendannes til C eller den kan lave G om til et A, som kan dannes med T. Cytidine deaminase: C → U → T Adenine deaminase: A → I → G Udfordringen: Sørge for at man kan få det skubbet over imod at danne AT, da det er dette som vil give redigering af base. Man kan skubbe i den rigtige retning på flere måde: Man kan lave nick (single stranded break via nickase) af den modsatte streng længere nede, som mutationen sidder på. Vil trigge mismatch repair hen imod AT frem for GC. ○ Påvirker man den ikke, er der lige så stor sandsynlighed for, at den vil gå tilbage til GC, hvilket vi ikke er interesseret i. Man kan bruge en inhibitor (UGI), som skubber den i den rigtige retning. Side 25 af 45  3. Prime editing Baseret på idéen om knock-in, men dette er mere kompliceret at udføre i virkeligheden. Bruges til at sætte lidt større ting ind og ikke bare punktmutationer via direkte donor template sammen med Cas9/sgRNA. Idé: Ved enkeltstrenget brud skal man levere en direkte donor template med en primer sekvens, der skal binde til en af flapsene. Mutation på donorsekvens, som er muligt at få inkorporeret. Dette kan bruges til at rette en sygdomsfremkaldende mutation. Hvad gør man: Enkeltstrenget brud via Cas9n giver to “flaps”. Primerdelen af donor template fra pegRNA binder til den ene flap, hvorved revers transcriptase vil transskribere donor template. pegRNA = sgRNA + donor template + primer DNA repair skal nu gøre resten af processen med flaps reparation. Kan skubbe i den rigtige retning ved at lave second nick med ekstra guide længere nede - dette fremmer inklusion af donor template. For at skubbe yderligere i den rigtige retning og undgå mismatch, har man inhiberet mismatch repair system. Kan håndtere flere punktmutationer. Fordi den har donorsekvens kan man korrigere en deletion eller lave en insertion (op til 40 baser). Prime editing har den fordel at aktiviteten af NHEJ er lav, så det er en mere sikker metode. Side 26 af 45  4. Integraser Bruges til at sætte større insertioner ind, som man normalt ikke rigtig gør med CRISPR. Det er en mere sikker måde at sætte noget stort ind i ens genom. Processen: attB (et landing pad) fra bakterier indsættes i vores genom vha. prime editing eller HDR. attP fra plasmidet binder til attB på genomet. Integrase kan flippe den større insertion (GFP på figur) ind i vores genom ved at genkende attachment sites på genomet. Kan kun virke i én retning → irreversibelt. Udfordring med integraser ift HDR kan dog være, at det kræver flere komponenter: Cas9, integrase, reverse transkriptase, prime editing guide, gen vi vil sætte ind. Udfordringer ved CRISPR Permanente ændringer i cellerne ○ Insertions/deletions kan lede til knockout, så ikke godt hvis man kommer til at gøre det forkert sted, da det er permanent Off-target redigering (kan komme til at redigere et sted, man ikke er interesseret i) Afhængig af cellecyklus Opsummering Metode Komponenter Knock-out Cas9 sgRNA = NHEJ → knock-out. Cuttet skal gerne ligge tidligt i genet, så chancen for et PTC øges. Side 27 af 45 Knock-in Cas9 sgRNA Repair template = HDR → knock-in (↓chance) Base editing Ændrer kun én base (én mutation). Version 1 Version 1 dCas9 sgRNA Deaminase Version 2: Øget effektivitet her. Version 2 Cas9n sgRNA Deaminase (base editor) UGI (inhibitor) Prime editing Insertions op til 40 bp. Cas9n pegRNA (sgRNA, primer, donor template) Revers transcriptase Integrase Leveres sammen med et plasmid, Den nyeste metode. der indeholder den store insertion, man gerne vil indsætte. Cas9n pegRNA (med attB) Revers transkriptase Integrase Side 28 af 45 F7: Mutation detektion teknikker Faktorer man skal overveje når man vælger metode 1. Patientmateriale Celler: gDNA + mRNA/cDNA Blod: gDNA Blodspots: gDNA (kvalitet og mængde) 2. Karakteristika af genet Størrelse: 400 bp-80.000 bp kodende region Opbygning: 1-150 exons Ekspression: Alt væv/celler eller ét væv/celle 3. Mutation spektrum Få, hyppige mutationer: Specifik metode Mange, individuelle mutationer: Scanning metode Bruges ofte en kombination 4. Antallet af prøver 5. Eksisterende teknologi Principper for diskriminering Amplifikation/Extension Diskriminerer mellem varianter afhængigt af om polymerasen kan forlænge eller ej. Polymerasen kan IKKE forlænge primeren hvis der er et mismatch. Kan designe til at passe til mutationen, hvis man kender den, så vil der komme amplificering. Fx. ARMS PCR (specifik metode) Restriktionsenzymer Diskriminerer mellem varianterne, ift. om der er et restriktionssite eller ej, hvor der kan klippes af et restriktionsenzym. Der kan både være et restriktionssite i WT og i mutant - uanset kan man skelne WT fra mutant og se hvor der er klippet - kan ses på en gel, hvor langt produktet er. Fx. AIRS (specifik metode) Hybridisering (binding) Hvis der er en probe, der binder (og bliver siddende), så får man et signal. Udnytter at proben er ustabil ved et mismatch → øger Side 29 af 45  temperaturen, så falder proben af. Derved er det kun den probe som er perfekt match som sidder tilbage. Kan designe en probe der matcher til en mutation, den sidder tilbage og kan detekteres, hvis mutationen er til stede. Fx. ASO, Lightcycler assay (specifik metode) Ligation Diskriminerer mellem varianter afhængigt af om to oligoer kan ligeres sammen (side om side) eller ej. Hvis mutation i strengen kan enderne fra de to oligoer ikke ligeres sammen. Kan kun ske amplificering hvis de er blevet ligeret. Fx. LCR, MLPA (specifik metode) Konformation Diskriminerer mellem varianter afhængigt af foldningen af DNA, eftersom en mutation ændrer foldning strukturen af DNA fragmenter (hvor store fragmenterne er). De vil dermed løbe forskelligt i gel. Fx. SSCP (scanning metode) Der er 2 forskellige metoder at detektere mutationer på: Mutation-specifik metode Her kigger man efter en bestemt mutation, hvis man tror personen har den. Her ved man, hvad man leder efter. ASO hybridisering AIRS ASA ARMS PEX LCR MLPA Mutation-scanning metode Sekventering - ved ikke hvor mutationen er eller hvilken slags der er tale om. SSCP HA HRM DGGE WGA Side 30 af 45 Faldgruber ved brug af PCR-baseret diagnostik Der vil altid være kontaminering. Manglende amplifikation af en af allelerne → falsk homozygositet ("allele drop out"). Årsager til falsk homozygositet (→ primer kan ikke binde): 1. Deletion/insertion i det område hvor primer skal binde. 2. Punktmutationer (SNP) som man ikke ved patienten har. 3. PTC mutation i den ene allel → NMD (får ikke noget cDNA fra den ene allel). Løsninger på årsagerne kan være: Brug af andre primersæt Teste forældre/andre familiemedlemmer PCR på genomisk DNA vs cDNA Southern Blotting/MLPA Side 31 af 45 F8: Spinal Muscular Atrophy (SMA) SMA er en neuromuskulær sygdom → muskelsvind. Den er autosomal recessiv og kan ramme både mænd og kvinder. Der findes 3 typer af SMA SMA er en monogen sygdom (skyldes nedarvning af ét enkelt muteret gen) - så genetisk er de tre typer ens, men den er variabel fænotypisk, så de varierer lidt i klinisk udtryk. Type I: Mest alvorlige, som flest rammes af. Symptomer starter fra spæd, og mange dør. Type II: Denne type lever de fleste med. Symptomerne opstår indenfor 0,5-2 år. Type III: Progressiv udvikling. Årsag → tab af motorneuroner SMA skyldes, at man taber alfa-motorneuroner i spinal cord → muskler bliver ikke innerveret → motorneuroner svinder ind og dør. Genetik SMA skyldes mutation i SMN1 genet. SMN1 genet SMN2 genet Sidder på kromosom 5. Proteinet SMN2 er en kopi af SMN1 (99,9% findes i alle celler og er meget identisk), og sidder også på essentielt, uden dette vil ens celler kromosom 5 (genduplikering). ikke vokse længere. Dette gen har alle mennesker også - SMA skyldes homozygot inkl SMA patienter - men det fejl deletion/tab af SMN1, hvorfor disse splices → ikke funktionelt protein og patienter har lave mængder af SMN kan derfor ikke tage over, når SMN1 proteinet (gennem SMN2 genet). genet er fjernet i SMA patienter. Lidt protein dannes stadig men ikke nok og man vil som SMA patient stadig ende i kørestol. SMN2 er ikke-funktionelt fordi exon 7 ikke inkluderes Alle mennesker har SMN1 og SMN2 genet, men i SMN2 er der en silent mutation, som gør, at exon 7 ikke inkluderes, hvorfor proteinet ikke er funktionelt. C (SMN1) udskiftes med T (SMN2), Side 32 af 45 som gør, at splicingen bliver påvirket. T varianten gør, at kun 10% af exon 7 inkluderes, fordi en exonic splicing silencer (ESS) dannes og hnRNP protein (A1) binder. Samtidig kan SR-protein heller ikke binde (fjerner enhancer). Dette gør normalt ikke noget, da SMN1 stadig virker. Hos SMA patienter er det et problem, at SMN2 ikke virker, da disse patienter slet ikke har SMN1. I behandling har man forsøgt at inkludere exon 7 i SMN2 via SSO’er, så dette gen kan blive funktionelt og varetage de funktioner, som SMN1 normalt står for. Fordeling af SMN1 og SMN2 i populationen Som rask person (ikke bærer) har man SMN1 på begge alleler. Som bærer har man deletion af SMN1 på den ene allel, men kan stadig have flere kopier på den anden Som SMA patient har man ingen kopier af SMN1, men kun SMN2. Der kan opstå steder, hvor en funktion går helt tabt - og derfor er sygdommen så fænotypisk variabel. Generelt: Jo højere copy number af SMN2 man har som SMA patient, jo mere funktionelt SMN protein har man også, hvilket vil give færre symptomer på sygdommen. Kan dog afvige. Side 33 af 45 Behandling af SMA med SSO’er ASO = antisense oligonucleotides SSO = splice switching oligonucleotides Dette er blot en kort Dette er en ASO som er specifikt nukleotidsekvens, der er designet til rettet mod splicing. at binde et specifikt sted. Paraplybegreb Kan modificeres med fx sukker, fosfat, methyleringer mm. Oligowalk Bruges til at finde den SSO der virker bedst på at få inklusion af exon 7 i SMN2. Designer forskellige SSO’er der dækker hele intron 6 (før exon 7) og intron 7 (efter exon 7) → ser så hvilken, der virker bedst. Hvor får vi inklusion af exon 7? FL = i denne linje har man inklusion af exon 7 Δ7 = i denne linje har man skipped produkt, ikke inklusion af exon 7 Kan se, at der ikke er noget bånd uden exon 7 ved +11 til +25 i intron 7, hvilket man går videre med, da det virker bedst og kan inkludere exon 7. Specifik SSO man går videre = Nusinersen. Nusinersen (grøn sekvens) virker ved, at den kan binde til A1 motiver (rød sekvens, som er en del af intron 7 sekvensen). Når den gør dette, bliver det røde stykke “optaget” og her kan A1 ikke længere binde til, som den normalt gør, fordi den godt kan lide at binde til AG nukleotider. A1 er en repressor som gør, at vi ikke få inkluderet exon 7, men når vi forhindrer A1 i at binde via nusinersen, så kan vi godt få inkluderet exon 7 nu. Side 34 af 45 Behandlingsmetoder Spinraza (inklusion af exon 7 i SMN2) = Nusinersen. ○ SSO, der forhindrer A1 i at binde og undertrykke exon 7 → inklusion af exon 7. ○ Injicering i rygmarven. Risdiplam (inklusion af exon 7 i SMN2) = Evrysdi ○ Small molecule drug der binder til 5’ splice site og forstærker binding mellem U1 (spliceosom) og RNA, så spliceosom bedre kan genkende 5’ splice site af exon 7, der derfor inkluderes. ○ Oral administration. Genterapi til nyfødte = Zolgensma ○ SMN1 gentransfer via adenovirus vektor → giver SMN1 genet. ○ Injektion én gang. Man laver screening af nyfødte for SMA i nogle lande - ikke DK vidst - det er vigtigt redskab for tidlig identificering, behandling på længere sigt og evt genterapi. Side 35 af 45 F9: Genetic counseling, prenatal diagnose, circulating DNA og etik Genetiske variationer diagnosticeres ofte via de følgende metoder: Ændringer i Sanger sekventering → et gen af gangen. sekvensen NGS → panels og exom/genom sekventering. Førhen sekventerede man kun et specifikt gen baseret på patientens fænotype, men nu sekventerer man hele genomet for at finde det specifikke gen, som gør patienten syg. Kromosomale Her undersøger man, om der er det antal kromosomer, som der skal abnormiteter være, eller om translokation af kromosomer er fundet sted. Deletion af noget af et kromosom kan ses ved kromosomal microarray ○ Kromosomal microarray er mere sensitiv end kromosomal analyse. Kopinummer Her kigger man på, om hele DNA-strengen er der, eller om varianter deletioner eller insertioner er forekommet. Trio genom sekventering Her sekventeres flere familiemedlemmers genom (børn og forældre) for at kunne se, om der er tale om en arvelig sygdom eller en de novo mutation. Trio-analyse = ingen hypotese forinden. Man starter med at lede efter den genetiske variation. Forskellen mellem panel-analyse og trio-analyse: Panel-analyse Trio-analyse Man ved, hvilke gener man skal undersøge Man har ingen hypotese fra starten, men (hvilke gener der hører til hvilke sygdomme). leder efter genomiske varianter. Side 36 af 45 Genetisk rådgivning De er to centrale koncepter indenfor genetisk rådgivning: Non-directive rådgivning Fælles beslutningstagning Information og rådgivning gives neutralt Information og rådgivning gives baseret på (unbiased) og man lader patienten tage beviser og fagpersonens egne holdninger. beslutningen selv baseret på informationer. Patienten kender til alle risici, fordele og konsekvenser ved forskellige valg. Etiske dilemmaer Genetiske diagnoser kan påvirke andre familiemedlemmer end den, som oprindeligt blev testet. Fortrolighed - skal andre familiemedlemmer informeres? Genetisk test af børn - generelle dilemmaer når det indebærer børn. Faderskabstest. Prædiktiv test - tester for en sygdom med sen start, som hverken kan behandles eller kureres, fx Huntington disease. Tilfældige fund - sekundære fund, som ikke var det man oprindeligt ledte efter. Skal patienten informeres eller ej. ○ Når man får udført en test, så kan man vælge informationsniveau: Familiær historie - arvemønstre Autosomal dominant (dominerende mønstre eller de novo). Autosomal recessiv. X-bundet recessiv. Mitokondriel (gives kun videre hvis kvinden er syg). To, der ikke er syge, kan få syge børn. Det er både mænd og kvinder, der får sygdommen. = autosomal recessiv. Side 37 af 45  Syge individer i alle generationer og både mænd og kvinder. = autosomal dominant. To mænd der er syge men imellem er der to raske kvinder, som er bærer af sygdommen. = X-bundet recessiv. Syge individer i alle generationer og både mænd og kvinder. Mitokondrielle DNA er altid mors. Hvis mor er syg, så er alle hendes børn syge. Hvis manden er syg, er ingen af børnene syge. = mitokondrielt. Typer af genetisk test Diagnostisk test Genetisk test for at verificere en mistænkt genetisk diagnose. Personen er syg ved test. Bærer test Ofte en autosomal recessiv eller X-bundet recessiv sygdom. Personen, der bliver testet, har ikke nogen risiko for at udvikle sygdommen. Kan være vigtigt for at vurdere risikoen for at få børn med en given sygdom. Prædiktiv test Genetisk test af en rask person for en genetisk sygdom, der er til stede i familien. Ofte en dominant arvelig sygdom, som man højst sandsynligt kommer til at udvikle. Test af Huntington disease (HD) hvor man hverken kan behandle eller kurere. Side 38 af 45  Foretager ikke prædiktive test i børn. Skal selv have muligheden for at bestemme om de vil lade sig teste, når de bliver voksne. For børn i alderen mellem 15 og 17 år tages beslutningen om test sammen med forældre. Fosterdiagnostik Der findes flere forskellige screening test under graviditeten som kan blive foretaget på forskellige tidspunkter. 1. trimester = risikovurdering ift. kromosomfejl, 2. trimester = misdannelser. Forskellige typer af test: Moderkagebiopsi Fostervandsprøve NIPT: Analyse af frit føtalt DNA i maternelt blod (moderkagen lækker DNA til moderens blod). Side 39 af 45 F10: Parkinsons disease Parkinson disease (PD) er en neurodegenerativ sygdom, hvor der primært sker nedbrydning af dopaminerge neuroner i den øvre hjernestamme = giver reduktion i motor output (overall). Der ses også nedbrydning af andre neuroner i hjernestammen. Findes både sporadiske (hyppigste form) og familieformer af PD. Symptomer Hoved motor symptomer Non-motor symptomer Bradykinesi (langsomme bevægelser) Træthed og smerte Rest tremor (rystelser når man Hyposmia (reduceret lugtesans) slapper af) Automon dysfunktion Rigidity (Stivhed) Søvnsygdom Postural instabilitet (tab af balance) Neuropsykiske lidelser (angst osv) Mild kognitiv forringelse og demens Etiology af PD Findes to typer af PD, hvor der er forskel i fænotypen, men de kliniske præsentationer er ens. Familiære former af PD Sporadisk PD Subtyper der rammer nogle familier Størstedelen af tilfældene (95%) Mutationer i specifikke gener der nedarves. Kender ikke årsagen, dog er der en hypotese om, at miljøtoksiner i kombi med påvirkelige Autosomal-dominant: SNCA gener. (alpha-synuclein), LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2). Risiko alleler: Mutationer i GBA genet → større risiko for PD. Autosomal-recessive: PARK2 (hyppigste), PARK6, PARK7. Forekommer ofte tidligere end sporadisk PD. Side 40 af 45 Patogenese af PD Kompleks sygdom, der påvirker flere cellulære funktioner. Mitokondriel dysfunktion og oxidativ stress Defekter i proteinnedbrydning Forringet Ca2+ homeostasis Synaptisk/cytoskelet ændringer Alpha-synuclein aggregation ○ Toksinet synuclein kan aggregere og sprede sig fra celle til celle. ○ Hypotese om, at det kommer fra mikrobiomet i maven og spreder sig til hjernen. Celledød Neuroinflammation Behandlingsstrategier Behandlingsstrategier Symptomatisk behandling Eksperimentel behandling L-dopa og dopamin agonister → Antisense oligonukleotider (fx erstatte dopaminen LRRK2) Cell grafting (stamceller) Genterapi Immunoterapi/vacciner Mutation selective kinase inhibitor (small molecule drug) Side 41 af 45 Parkinson Disease → LRRK2 og HTT Mutationer Loss of function mutationer (LOF) Gain of function mutationer (GOF) Involver tab af normal biologisk funktion af et Ændrer proteinets aktivitet/funktion: protein → INGEN produktion af funktionelt Hypermorphic = øger proteinets protein. aktivitet. Amorphic = helt tab af funktion Neomorphic = introducerer en ny Hypomorphic = partiel tab af protein funktion. funktion Dominant negative mutationer: Involverer muteret protein, der direkte/indirekte blokere den normale funktion af WT protein. Kan give loss of function selvom kun halvdelen af proteinet er muteret. LRRK2 i PD LRRK2 koder for leucine rich kinase 2 Mutationer i LRRK2 er den mest almindelige genetiske risikofaktor for PD og forekommer både i sporadiske og nedarvet PD. Mutationer giver hyperaktivering af LRRK2 (GOF, autosomal dominant) ○ Kinasedomæner der giver hyperphosphorylering i downstream targets Eksisterende behandlingsstrategier LRRK2 kinase inhibitor vha. LRRK2 mRNA down LRRK2 down regulation med small molecule drug regulation med Gapmers splice switching (exon skipping) Man kan ikke bare nedregulere LRRK2, da det påvirker andre ting i kroppen. Op til 50% reduktion af LRRK2 protein i mennesker er fint. Side 42 af 45  Drugs in clinical trials for LRRK2 down-regulation Small molecule drug Hæmmer kinaseaktivitet af LRRK2. → targeterer LRRK2s Administreres oralt. kinase aktivitet Kan krydse blod-hjerne-barrieren (BBB). Ikke sekvensspecifik → targeterer både WT og mutant allel. Man ved ikke, om det KUN er den øget kinase aktivitet, der giver PD, da LRRK2 også har et GTPase domæne. Ions/Biogen GAPmer Introducerer GAPmer (oligo) der binder til LRRK2 mRNA → LRRK2 nedregulering RNaseH1 nedbryder det. Afhænger af hvor godt RNaseH1 virker. Injiceres direkte i hjernen. Ikke mutations-/allelspecifik → targeterer begge alleler. Exon skipping (Splice Bruger ASO der binder til exon 41 i pre-mRNA → ingen Switching) inklusion af exon 41 under splicing → dannet PTC → nedbrydning vha. NMD og trunkeret protein (uden kinase domæne). Risiko for at ASO binder konserveret splice site sekvenser (off-target) → nedregulering af andre proteiner. Ikke allel-specifik → targeterer begge alleler. Pseudoexon inclusion 4 pseudoexons i LRRK2 kan inkluderes med SSO. (Splice Switching) SSO binder i intronic sekvens = pseudoexon inklusion → PTC → nedbrydning via NMD og translation af trunkeret protein. Allel-specifik PE1 (3/5) aktivering Inklusion af PE i intron 47 (på begge alleler). Skal være heterozygot før behandling kan hjælpe. Side 43 af 45 SSO kan designes efter at targetere en allel og ikke en anden allel: Der er en SNP lokaliseret i SSO bindings regionen i intron 47. Der er en C SNP og T SNP → 24% af alle er heterozygote. Designe SSO til om den skal binde C eller T varianten, altså den ene eller den anden allel. = Dette gør, at man beholder noget af funktionen og ikke “slukker” for al aktivitet, men kun 50%. Allel-specifik PE2/10 aktivering Bruger SNP lokaliseret i PE2/PE10 (lab). PE der ligger i intron 37, hvor man har en SNP der enten er G eller A (+5 fra PE). ○ G allel = funktionelt splice site. ○ A allel = non-funktionelt splice site. SSO binder til begge SNP’s (er ikke specifik), men den kan kun manipulere G allelen til at få PE inklusion, derfor kræver det mutationen ligger på den allel der har G. Reduceret aktiviteten til 50% hvilket er det man gerne vil opnå! Side 44 af 45 Huntington disease (HD) Progressiv tab af neuroner → bevægelse, hukommelse og intellektuelle funktioner påvirkes. HD forårsages af CAG repeat i exon 1 af HTT genet. CAG koder for glutamin → får et protein med mange glutaminer efter hinanden → aggregation → skade af neuroner. ○ Jo flere repeats, jo mere alvorlig sygdom. ○ Hvis man har mindre end 26 repeats, får man ikke sygdom, men hvis man har 40 repeats eller derover, vil det medføre sygdom. Autosomal dominant nedarvet → Homozygote og heterozygote er lige slemt påvirket. Anticipation: Antallet af repeats kan øges i den næste generation → øget alvorlighed af sygdommen som den nedarves og sygdommen starter tidligere. ○ Kommer grundet slipped misparring. ○ Expansion af repeats sker enten i maternal eller paternal meiose (større risiko for flere repeats hvis det nedarves fra faren). Mekanisme Slipped misparring under gametogenesis (dannelsen af haploide gameter/kønsceller). Polymerase er forvirret fordi der er så mange repeats og kan gå for langt tilbage og transskribere stykket igen, som den allerede har gjort. Sker mere i far i forhold til mor. Behandling (under udvikling) Allel-specifik behandling med siRNA, så man prøver at få nedreguleret det dominante negative mutant protein (HTT). Targeterer en specifik SNP. Designer en siRNA der binder C allelen → siRNA rekrutterer RISK komplekse → mRNA bliver nedbrudt. E-time: Kan behandle med Small molecule drugs, der vil øge bindingen mellem U1 og splice site for PE → inklusion af PE → nedbrydning af NMD. Den er ikke allelspecifik. Side 45 af 45