Nutrition, Cultivation and Isolation of Microorganism PDF

NUTRITION, CULTIVATION AND ISOLATION OF MICROORGANISM Kafli 5 Jóhann Örlygsson EFNI FYRIRLESTURS • • • • Fundamental Aspects of Diversity Uptake of Nutrients into Cells Cultivation of Microorganisms Isolation of Selected Microbes by Enrichment Culture 2 FUNDAMENTAL ASPECTS OF DIVERSITY • • •...

NUTRITION, CULTIVATION AND ISOLATION OF MICROORGANISM Kafli 5 Jóhann Örlygsson EFNI FYRIRLESTURS • • • • Fundamental Aspects of Diversity Uptake of Nutrients into Cells Cultivation of Microorganisms Isolation of Selected Microbes by Enrichment Culture 2 FUNDAMENTAL ASPECTS OF DIVERSITY • • • • Gríðarlegur fjölbreytileiki örvera Örverur fyrirfinnast nánast alls staðar Margbreytileg efnaskipti – geta brotið niður nær öll efni Sumar örverur geta brotið niður fá efni önnur er sérhæfð og brjóta niður eitt eða fá • Lífræn efni → CO2 (= mineralization) → Lífræn efni (hringrás) • Niðurbrotshæfileiki → þróun örvera 3 FUNDAMENTAL ASPECTS OF DIVERSITY Einstakt á meðal örvera: • Geta bundið köfnunarefni (N2) • Framleiða vítamín B12 • Ljóstillífun án blaðgrænu (chlorophyll) • Nota H2S, H2, eða lífræn efni sem elektrónugjafa í ljóstillífun • Nota ólífræna orkugjafa (t.d. H2S) sem elektrónugjafa • Geta vaxið við loftfirrtar aðstæður • Nota ólífræn efnasambönd sem lokaelektrónuþega í staðinn fyrir súrefni • Geta vaxið við hærra en 80°C 4 NUTRITIONAL TYPES OF MICROORGANISMS Allar örverur þurfa á kolefni og orku að halda Uppruni kolefna: • Ólífrænn – (t.d. CO2) örveran er frumbjarga (autotroph) • Lífrænn – örveran er ófrumbjarga (heterotroph) Uppruni orku: • Orka frá ljósi – örveran er ljóstillífandi (phototroph) • Orka frá ólífrænum eða lífrænum efnum – örveran er efnatillífandi (chemotroph) 5 NUTRITIONAL TYPES OF MICROORGANISMS Fjórir megin hópar: Photoautotrophs – orkan úr ljósi • • • CO2 sem kolefnagjafi Afoxa CO2 í lífræn efni (frumur) (CH2O) Elektrónugjafar eru H2O, H2, eða H2S Photoheterotrophs – orkan úr ljósi • • • Lífræn efni úr umhverfi eru kolefnagjafar H2 eða lífræn efnasambönd eru elektrónugjafar Þurfa oft vaxtarþætti eins og B vítamín 6 NUTRITIONAL TYPES OF MICROORGANISMS Chemoautotrophs – ólífræn efni eru bæði C og orkugjafar • Orkan kemur við oxun á H2, NH3, NO2–, H2S, eða Fe2+ • Loftháðir “chemoautotrophs” nota O2 sem lokae Chemoheterotrophs – lífræn efnasambönd eru bæði C og orkugjafar • Sumir nota eingöngu glúkósa (sem dæmi) sem bæi C og orkugjafa, önnur nota eitt efni sem C gjafa en annað sem orkugjafa 7 NUTRITIONAL TYPES OF MICROORGANISMS • A) Anabaena sp. – photoautotroph • B) Rhodomicrobium sp. – photoheterotroph • C) Thiombacillus perometabolis – chemoautotroph • D) Micrococcus luteus – chemoheterotroph 8 NUTRITIONAL REQUIREMENTS FOR CELL GROWTH • Obligate: Nauðháð: getur eingöngu notað ákveðin efnaskipti, t.d. obligate photoautotroph. • Facultative: Valháð: getur skipt um efnaskipti eftir aðstæðum, t.d. geta margir photoautotrophs og chemoautotrophs einnig vaxið chemoheterotrópískt. • Næringarþarfir örvera geta verið einfaldar eða flóknar • Til þess að rækta örvera á rannsóknastofu þarf að líkja eftir aðstæðum í umhverfi m.t.t. eðlisfræðilegra og næringarlega þarfa • Ætil þarf að innihalda alla næringu sem örverur þurfa. 9 COMPOSITION OF MICROBIAL CELLS • Frumefnasamsetning baktería er svipuð (í grófum dráttum) milli tegunda og vaxtarskilyrða – Takmarkað rúm til sveigjanleika – Ef skortur er á ttk. frumefni er vöxtur hindraður • Allnokkur munur á snefilefnasamsetningu milli tegunda – Flest snefilefni eru kóensím 10 • Bakteríur eru misjafnlega kostavandar (fastidious) • Sumar þurfa aðeins C-gjafa og sölt • Aðrar þurfa mikinn fjölda vítamína, amínósýra, o.fl. • Bakteríur má flokka/greina eftir þeim sykrum, sýrum og öðrum C-gjöfum sem þær ráða við að nota • • – Dæmi: Staphylococcus arlettae getur vaxið á arabínósa sem eina C-gjafa, en S. xylosus ekki. C-gjafar eru afar breytilegir, allt frá einföldum efnum eins og CO2 og CH4 til náttúrulegra lífrænna efnasambanda sem til eru. Sumar örverur geta brotið niður efnafræðilega framleidd efnasambönd → lífhreinsun 11 OXYGEN AND NITROGEN • Súrefni er hægt að fá úr vatni, lofti eða úr lífrænum efnum • O2 er eitrað fyrir loftfirrtar örverur, þær nota hvarfefni (substrate) sem eru jafn oxuð eða oxaðri en frumurnar • Loftháðar örverur geta vaxið á mun afoxaðri hvarfefnum (t.d. metan) ef súrefni er til staðar • Nitur er hluti af amínósýrum, núkleótíðum og í mörgum frumulíffærum • Flestar örverur taka inn ammóníak eða nítrat sem er þá afoxað í ammóníak. • Lífverur sem þurfa lífrænt nitur (amínósýrur, þvagefni, t.d. mjólkursýrubakteríur) hafa þróast í næringarríku umhverfi • Sumar örverur geta bundið N2 í ammóníak 12 NITROGEN 13 HYDROGEN AND MORE Vetni er í öllum lífrænum efnum; H = H+ +eH+ → ATP framleiðsla Loftfirrtar örverur fá orku með því að flytja elektrónur frá hvarfefni á elektrónuþega Loftháðar örverur flytja elektrónur á O2, mynda PMF → ATP framleiðsla 14 BRENNISTEINN, FOSFAT, KATJÓNIR, JÁRN • • • • • • • S er hluti af tveimur amínósýrum: cysteine og methionine Einnig í B vítamínunum biotin og thiamine Er oftast bætt út í æti í formi salta eins og MgSO4 Margar bakteríur afoxa súlfat í súlfíð (HS–) Gerseyði (YE) eða peptón gefa oftast afoxuð S efni Slík efni eru oft orkugjafar fyrir t.d. thiobacilli Brennisteinn (S0) getur verið lokaelektrónu þegi fyrir sumar örverur • • • • • • • Fosfat er hluti af kjarnsýrum, phospholípíðum og orkuefna samböndum Adenosine triphosphate (ATP) Ólífræn fosföt geta einnig virkað sem bufferar í ætum Katjónir: kalíum, natríum, magnesíum, kalsíum Skipta máli í ensímvirkni og sem mótjónir (counter-ions) á móti neikvæðri hleðslu próteina Járn – hluti af elektrónukeðjunni einnig í mörgum ensíumum Snefilefni – þörf í mjög litlum mæli 15 VAXTARÞÆTTIR • Vaxtarþættir – sérhæf, lítil mólekúl sem frumur geta ekki búið til sjálf – Vítamín – “prosthetic” hópar margra ensíma – Amínósýrur – Púrin og pýrmídin 16 UPTAKE OF NUTRIENTS IN CELLS • • • • • • Yfirleitt er styrkur næringarefna lágur í náttúrunni Örverur hafa þróað aðferðir til að auka styrk inn í frumum Frumuhimnan – valgegndræp Næringarefni valin inn, öðrum haldið úti Lipid bilayer er vatnsfælin → sérhæft val Skautuð efni (t.d. amínósýrur) geta ekki farið inn án hjálpar • 17 DIFFUSION Nokkrar gerðir flutninga: • Facilitated diffusion (flæði) • Active transport (virkur flutningur) • Group translocation (flutningur hópa) • Flæði (diffusion) – mólekúl flæða yfir frumuhimnu frá háum styrk að lágum styrk uns jafnvægi er náð • Hlutlaust flæði (passive diffustion) – engin himnubundin prótein þarf fyrir gas, vatn og fituleysanleg efni 18 DIFFUSION • Facilitated diffusion – himnubundin prótein (permeases) flytja efnin yfir frumuhimnuna • Ekki þarf orku. Efnið bindst við ysta hluta permeasans, breyting verður á byggingu þess og efnið flyst inn. • Oft er efnið brotið strax niður við flutning inn þannnig að styrkur þess er ávallt lágur inn í frumunni 19 ACTIVE TRANSPORT • Virkur flutningur (active transport) notar orku til að flytja efni á móti styrk • Sérhæf flutningsprótein eru notuð • Flest lífræn og ólífræn næringarefni eru flutt inn með virkum flutningi • Orkan kemur í formi ATP eða prótónu stiguls (PMF) 20 ACTIVE TRANSPORT: ATP-BINDING CASSETTE Þrjú prótein: • Vatnsfælin himnuprótein (hydrotrophic transmembrane protein) • ATP hydrolyzing prótein – fest við innri hluta himnupróteinsins • Hvarfefnis bindandi (substrate biding) prótein í “periplasmic space” eða fest við himnuna • Efnin flæða í gegnum frumuvegg (gram jákvæðar) eða porin (gram neikvæðar) til að tengjast bindipróteinum sínum • Breyting á útliti flutningspróteinsins verður möguleg með orku frá ATP vatnsrofi 21 ACITVE TRANSPORT: SECONDARY TRANSPORTERS • Ef prótein nota hleðsluorku (PMF) til að flytja efni = secondary transporters • Þrjár gerðir: uniporters, symporters, og antiporters. • Uniporters flytja eitt efni í eina átt – T.d. K+ vegna hleðslumunar 22 ACITVE TRANSPORT: SECONDARY TRANSPORTERS • Symporters flytja amínósýrur, sykrur eða anjónir inn í frumur ásamt H+ eða Na+ • Binding prótóna við flutningspróteinið veldur breytingum á þrívíddar strúktúr → efnið kemst inn 23 ACITVE TRANSPORT: SECONDARY TRANSPORTERS • Antiporters – orkan frá PMF er notuð til að flytja H+ inn og katjónir (t.d. Na+) út → mynda styrkmun á Na+ • Styrkmunurinn er notaður til að flytja amínósýrur eða önnur efni inn • Oftast er notaður prótónur til að flytja efni inn/út annað hvort beint eða óbeint • Kallst PMF (proton motive force), – Ljóstillífun og öndunarkeðjan – Einnig ATP myndun 24 ACITVE TRANSPORT: GROUP TRANSLOCATION • Group translocation – efnið sem er flutt inn er breytt um leið og það kemur inn í frumuna • Phosphotransferase system (PTS) kemur við sögu í flutningi sykra inn í frumur • Notar orku frá phosphoenolpyruvate (PEP) og 5 mismunandi ensímum 25 ACITVE TRANSPORT: GROUP TRANSLOCATION • Enzyme I og próteinið HPr eru uppleyst í frymi • Enzyme IIa og IIb eru fest við yfirborð innri hliðar frumuhimnunnar • Enzyme IIc er himnuprótein • Það myndar göng í gegnum himnuna og háorku fosfatið er flutt á glúkósa → glúkósi 6-P 26 CULTIVATION OF MICROORGANISMS • Örverufræðingar hafa þróað aðferðir til þess að einangra hreinræktir úr umhverfissýnum • Þá er hægt að rækta bakteríuna sem hreinrækt (pure culture) eða án annarra örvera (axenic culture; without strangers) • Vökvaæti, fast æti, hálf-fast æti (liquid/solid/semisolid medium) – hleypiefni langoftast agar, en einnig til kísilgel o.fl. • Næringaræti/Complex æti – æti sem innihalda „óskilgreinda“ þætti eins og blóð, ger-extract, peptón (niðurbrotið prótín), o.fl. • Skilgreint/synþetískt æti (defined/synthetic medium) – æti þar sem allir þættir eru skilgreindir og magn hvers efnis um sig þekkt • Lágmarksæti (minimal medium) – æti sem fullnægir lágmarks næringarþörfum bakteríunnar og inniheldur ekkert annað. Alltaf skilgreint. 27 ISOLATION OF MICROORGANSISM • Algeng aðferð er að strjúka vökvarækt út þ.a. stakar kóloníur fáist • Hver kólonía inniheldur margar frumur sem allar eru klón •  Getum fengið hreinrækt 28 ISOLATION OF MICROORGANSISM - AUÐGANIR • Auðgun = enrichment • Auðgunaræti (selection media) líkir eftir sessi (niche) þeirra örvera sem verið er að reyna að einangra • Fýsískir þættir (hitastig, sýrustig, selta, ...) • Næringarfræðilegir þættir • Bakteríur sem ekki þola auðgunarskilyrðin vaxa ekki 29 ISOLATION OF MICROORGANSISM - AÐFERÐIR • Getum einangrað úr auðgunarætinu með strikun, áhellingu eða þynningum • Strikun (streak plate) • Áhelling (spread plate) • Áhelling í mjúkan agar (pour plate) 30 Figure 5.10 Streaking procedure • Sumar bakteríur vaxa ekki á agar • pH eða aðrar aðstæður hindra vöxt örvera – eða þurrkur gæti verið vandamál • Sumar bakteríur vaxa ekki nema í samlífi við aðrar örverur – samlífis (symbiotic) bakteríur • Þær þurfa ákveðinn vaxtarþátt (oft vítamín) sem önnur örvera framleiðir ISOLATION OF MICROORGANSISM - AÐFERÐIR Súrefni • Loftfirrtar örverur vaxa vel í s.k. “glove box” þar sem allt súrefni er fjarlægt • Hægt að rækta bæði í vökva og á agarskálum • Einnig í s.k. “anaerobic jar” Table 5.8 Enrichment conditions for chemoheterotrophic aerobic or facultative aerobic organisms 35 36 37