Informe de Laboratorio Caseina2 PDF

BIOQUÍMICA INFORME DE LABORATORIO PRESENTADO POR: LUIS GARCÉS JUAN ARIÑO LAURA ZAPATA GERALDINE CRUZ SERGIO CAUSIL LIC. ARNULFO ALEMÁN UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE ME...

BIOQUÍMICA INFORME DE LABORATORIO PRESENTADO POR: LUIS GARCÉS JUAN ARIÑO LAURA ZAPATA GERALDINE CRUZ SERGIO CAUSIL LIC. ARNULFO ALEMÁN UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ABRIL/2024 Introducción Los aminoácidos son los componentes básicos de las proteínas, moléculas esenciales para la vida y presentes en todos los seres vivos. Estas moléculas orgánicas están formadas por un grupo amino (NH2) y un grupo carboxilo (COOH), unidos a un carbono central. De los aminoácidos presentes en la naturaleza, sólo 20 de ellos aparecen en las proteínas de todas las formas de vida, vegetal, animal o microbiana. Los aminoácidos intervienen en la transmisión de impulsos en el sistema nervioso. Los aminoácidos esenciales deben ser suministrados en la alimentación, ya que nuestros cuerpos no pueden sintetizarlos en cantidades adecuadas para respaldar el crecimiento. Las proteínas, a su vez, son macromoléculas formadas por la unión de aminoácidos a través de enlaces peptídicos. Son fundamentales para el mantenimiento y funcionamiento de los seres vivos, ya que desempeñan numerosos roles biológicos, como catalizar reacciones químicas, transportar moléculas, actuar como elementos estructurales y participar en la defensa del organismo. Uno de los conceptos clave en este campo es el punto isoeléctrico (pI) que juega un papel crucial en la caracterización y comprensión de estas biomoléculas. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido. De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados. Es un concepto fundamental que se refiere al pH en el que una molécula tiene carga neta igual a cero. En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas, por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada. Comprender este punto es esencial para el estudio de diversas macromoléculas, como las proteínas, y su interacción con el entorno. La caseína es una fosfoproteína, lo cual significa que esta químicamente unida a una sustancia que contiene ácido fosfórico, la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica como caseinato cálcico, junto con las albúminas y globulinas conforman la fracción proteica de los sólidos de la leche en la mayoría de los mamíferos, la caseína es un agregado de macromoléculas de proteínas y minerales, la cantidad de caseína en la leche varía según la especie animal pudiendo ir de 10 hasta 100 g/L. La composición de la caseína de la leche varía ampliamente según la especie animal, en la actualidad se conocen cuatro tipos de caseína α , α s2, β y κ; esta última es de gran interés para la industria láctea ya que define la formación del cuajo para la elaboración de los derivados lácteos; para la kappa caseína se propuso su clasificación en dos grupos según la especie animal, en el grupo I (vacas, ovejas, cabras y búfalos de agua) y en el grupo II (ratas, ratones, cerdos y humanos), la diferencia entre estas radica en las bases hidrofóbicas, el contenido de carbohidratos, la composición de aminoácidos y sitio de clivaje proteolítico. De las 4 caseínas conocidas, la α y β no son solubles en leche y se precipitan en presencia de los iones de calcio, la Kappa caseína es la única caseína soluble en presencia de iones de calcio, también presenta pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares. La otra parte de su superficie se une fácilmente a las α y β caseínas insolubles, lo que da lugar a la formación y estabilización de la micela. La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. OBJETIVOS 1. Aprender el proceso de aislamiento de la caseína a partir de la leche, lo que implica comprender el concepto de precipitación y separación de proteínas. 2. Familiarizarse con técnicas de laboratorio como la filtración, lavado y secado de precipitados. 3. Determinar el punto isoeléctrico (pI) de la caseína, que es el pH en el cual la proteína tiene carga neta cero, mediante la observación de su comportamiento en diferentes condiciones de pH. Estos objetivos buscan proporcionar una comprensión práctica y experimental de los procesos involucrados en el aislamiento y manipulación de la caseína, así como en la determinación de sus propiedades químicas. MATERIALES Y MÉTODOS. Materiales y equipos Un vaso de precipitado de 250ml Un vaso de precipitado de 100ml Calentador de laboratorio Termómetro de vidrio Pinzas de laboratorio Varilla agitadora de vidrio de laboratorio Papel filtro Balanza analítica Embudo de vidrio Pipetas graduadas de 10 ml Tubos Falcon graduados. Gradillas Espectrofotómetro Potenciómetro (pH-metro) Reactivos Agua destilada Leche entera Acetato sódico 0,1 N Ácido acético 0,01 N Ácido acético 0,1 N Ácido acético 1 M Ácido acético 1,0 N NaOH 1N Éter etílico Etanol al 70% NaOH 1N Aislamiento de la Caseína. Procedimiento. En un vaso se precipitado de 250 ml se adicionó 150 ml de agua destilada la cual se calentó a 38°C. Se agregaron 50 ml de leche entera. A la anterior solución se agrega gota a gota ácido acético al 1M, hasta observar que se forma un precipitado (La leche se corta). Se deja sedimentar. Se transvasa el contenido del vaso de precipitado a otro recipiente y se filtra con papel filtro y la ayuda de un embudo. El precipitado se lava con 20 ml de etanol sobre el mismo filtro. Luego se seca con otras láminas de papel filtro. El precipitado se lleva a otro vaso de precipitado más pequeño (100ml). Se pesa el vaso solo y con el precipitado. Se agregan 5ml de éter etílico. Se pasa nuevamente por papel filtro para que quede el precipitado blanco que es la caseína. Preparación de la solución de caseína. Se colocaron 250 mg de caseína en u recipiente, se agregan 20 ml de agua destilada y 5ml de NaOH 1N y se agita hasta que se disolviera la caseína. Se pasa a un matraz y se adiciona 5 ml de ácido acético 1N. Se completa el volumen con agua destilada hasta los 50 ml y se agita nuevamente hasta obtener una mezcla homogénea. Determinación del potencial isoeléctrico (pI) de la caseína: Se toman 10 tubos falcón de 15 ml se colocan en una gradilla y se agregan 10 ml de una solución de ácido acético y acetato de sodio, según se describe en la siguiente tabla:  Acetado Ácido acético Ácido acético Volumen Id Tubo pH sódico 0.1N 0.1 N 0.01N (ml) 1 0,5 9,5 0 3,2 10 2 1 9 0 3,6 10 3 1,5 8,5 0 3,8 10 4 2 8 0 4,0 10 5 3 7 0 4,2 10 6 4 6 0 4,5 10 7 6 4 0 4,7 10 8 8 2 0 5,1 10 9 6 0 4 5,5 10 10 8 0 2 6,1 10 caseína obtenida en el paso anterior. Se agitan suavemente para homogeneizar la solución y se espera 3 minutos. Se hace la medición por Se midió el pH en cada uno de los tubos. Luego a cada bubo se agrega 1ml de solución de espectrofotometría de cada muestra, en nivel de absorbancia 640 nm. Se homogeniza las muestras de los tubos y se deposita 1 ml de la solución anterior en las cubetas de colorimetría para la medición. MARCO TEÓRICO 1. Aminoácidos: o Los aminoácidos son los bloques fundamentales de las proteínas. o Cada aminoácido consta de un grupo amino (-NH2), un grupo carboxilo (-COOH) y una cadena lateral única ®. o Se clasifican en esenciales (que debemos obtener de la dieta) y no esenciales (que el cuerpo puede sintetizar). 2. Propiedades de los aminoácidos: o Tienen características químicas que les permiten actuar como ácidos o bases.  o Su carga eléctrica varía según el pH del entorno (positiva, negativa o neutra). o La mayoría de los aminoácidos en las proteínas son de la forma L. 3. Proteínas: o Las proteínas son cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. o Su estructura se divide en cuatro niveles: primaria (secuencia de aminoácidos), secundaria (hélices alfa o láminas beta), terciaria (conformación tridimensional) y cuaternaria (asociación de múltiples cadenas polipeptídicas) 4. Punto Isoeléctrico (pI): El punto isoeléctrico es el pH en el cual la carga neta de un aminoácido o proteína es cero. Algunos puntos clave relacionados con el pI son: Cálculo del pI: o Se determina a partir de los valores de pKa de los grupos funcionales del aminoácido o proteína. o Es crucial para comprender la solubilidad y movilidad de las proteínas, lo que afecta su función biológica y su manipulación en el laboratorio. 5. Aplicaciones del pI: o Electroforesis: Una técnica que separa proteínas según sus cargas a diferentes pH. o Purificación de proteínas: El conocimiento del pI es esencial para aislar y purificar proteínas. o Estudios de solubilidad: La carga neta de una proteína influye en su solubilidad, relevante para investigaciones bioquímicas y de ingeniería de proteínas. Comprender los aminoácidos, las proteínas y el punto isoeléctrico es fundamental para desentrañar la estructura y función de las proteínas en sistemas biológicos, así como para aplicaciones en biotecnología y medicina. CUESTIONARIO O ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS.. a) Identifique los grupos químicos que caracterizan a los aminoácidos utilizados en la práctica. Dibujar la estructura de los aminoácidos empleados en la práctica. Da un ejemplo (usando fórmulas químicas) de la reacción que se lleva a cabo entre uno de los aminoácidos (cualquiera) que usaste y los reactivos que usaste para identificarlos (Prueba de Millón, Reacción de la ninhidrina, etc.). b) Representar A640 frente al pH de cada tubo en el apartado 3. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia? ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI? Para representar A640 frente al pH de cada tubo en el apartado 3, primero tenemos que recopilar los datos de absorbancia a 640 nm para cada muestra en diferentes valores de pH. Luego, podrías utilizar un software de gráficos como Excel o Python (con bibliotecas como Matplotlib o Seaborn) para graficar estos datos con absorbancia en el eje y y pH en el eje x. Si en lugar de absorbancia se representara la transmitancia frente al pH, verías una relación inversa en el gráfico. A medida que el pH cambia, la transmitancia también cambiará, pero en dirección opuesta a la absorbancia. Es decir, cuando la absorbancia aumenta, la transmitancia disminuirá, y viceversa. El punto isoeléctrico de la caseína, la principal proteína de la leche varía dependiendo de la fuente, pero suele estar en torno a un pH de 4.6 a 4.8. Las proteínas tienen solubilidad mínima en su punto isoeléctrico (pI) debido a que en este punto tienen carga neta cero. Esto significa que las interacciones electrostáticas entre las diferentes partes de la proteína se ven minimizadas, lo que reduce su capacidad para interactuar con el solvente y disolverse. ANALISIS DE RESULTADOS. Teóricamente el punto isoeléctrico de la caseína es de 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. El cambio de pH de la solución en que se encuentra la proteína promueve cambio en las cargas de los residuos y un cambio de carga total de la proteína. Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico (Punto isoeléctrico) y presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas. El pH isoeléctrico permite una aglutinación de las moléculas de la proteína, con lo cual las partículas de caseína adquieren mayor peso y se precipitan, produciéndose una separación entre la fase solida proteica y la fase liquida del solvente. Si se da el suficiente tiempo para que ocurra la precipitación y la muestra se lleva al espectrofotómetro se debe registrar un valor bajo de absorbancia ya que la luz puede pasar con más facilidad a través de la muestra, por la precipitación de la caseína. Esto teniendo en cuenta que la absorbancia (A) está dada por la relación logarítmica entre la luz incidente (lo)y la luz que traspasa la muestra (l). (𝐴 = log10 𝑙𝑜 ⁄𝑙 ) a determinada longitud de onda (λ). En ese caso al precipitarse la caseína, mas cantidad de luz podrá pasar a través de la muestra, lo cual significa menor absorbancia y mayor transmitancia. No obstante, en la leche de vaca, el punto isoeléctrico puede variar ligeramente dependiendo de la proporción de α_Caseínas, β-Caseínas y k-caseínas que la componen, lo cual varia también con la raza del animal. La siguiente tabla presenta el punto isoeléctrico para los diferentes tipos de caseínas. Como se puede observar, varía entre 4.44 a 4.76 para la α_Caseínas αs1 y αs2 cuya composición en la leche oscila entre el 47% y 56% de la caseína total. Para el caso de la β- Caseínas, el punto isoeléctrico está entre 4,83 y 5,07. La proporción de este tipo de caseína está entre el 25% al 35% de la caseína total. Por Ultimo la k-caseína (kappa caseínas), su punto isoeléctrico está entre 5,3 a 5,8. La proporción de k-caseína en la leche está entre 8% a 15% de la caseína total. (Farrel jr et al, 2006); Barbosa et al, 2012). La tabla 1 muestra los valores de absorbancia de 10 muestras con diferentes niveles de acidez a los que se agregaron 1 ml de solución de caseína y los valores de absorbancia arrojados por el espectrofotómetro. Además, el valor de pH medido en las diferentes soluciones. Tabla 1. Valor de absorbancia en 10 soluciones de caseína a diferentes niveles de pH Tubo pH Absorbancia 1 3,2 0,57 2 3,6 0,70 3 3,8 0,61 4 4 0,70 5 4,2 0,71 6 4,5 0,76 7 4,7 0,78 8 5,1 0,58 9 5,5 0,60 10 6,1 0,64 Grafica 1. Absorbancia vs pH en 10 soluciones acidas de caseína. Valores de absorbancia de una solución de caseina a diferentes valores de acidez 0.80 0.75 Absorvancia (640 nm) 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 3,8 4 4,2 4,5 4,7 5,1 5,5 6,1 3 4 5 6 7 8 9 10 No del Tubo (pH) Los resultados muestran el mínimo valor de absorbancia (punto isoeléctrico) cuando el pH está entre 4,7 a 5,1. Este valor se ubica ligeramente por encima del valor esperado de 4.6, lo cual puede estar influido en función de un mayor contenido de β-caseínas y k-caseínas en la muestra u otro aditivo, al tratarse de leche comercial. Así mismo puede ser efecto del error experimental, por ejemplo, que no se haya trascurrido el suficiente tiempo para la aglutinación y precipitación de la caseína, entre la adición de esta en los tubos de ensayo y la lectura con el espectrofotómetro. CONCLUSIÓN 1. A partir de nuestro primer objetivo, logramos aprender hacer el aislamiento de la caseína en leche, lo cual nos resultó un proceso fácil. Teniendo en cuenta que primero utilizamos una leche comercial con la cual no logramos obtener el resultado requerido ya que este tipo de leche no es lo suficientemente pura. 2. Pusimos en prácticas conocimientos previos de filtración, lavado y secado de precipitados. 3. Se aprendió que dependiendo el nivel de pureza de la caseína nos arroja mayor o menor absorbancia. BIBLIOGRAFIA 1. Padilla Doval J, Zambrano Arteaga JC. Estructura, propiedades y genética de las caseínas de la leche: una revisión. CES Med. Zootec. 2021; 16(3): 62-95. 2. Lábaque, M. C., & Massoni, M. (2010). La caseína como vehículo de liberación controlada. Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias, 42(2), 51-63. 3. García, M. R. (2000). Fundamentos de Bioquímica Estructural. Reverte. 4. Corredor, M., & Perea, A. (2011). Caseína: una revisión sobre su estructura, propiedades y aplicaciones. Revista Chilena de Nutrición, 38(4), 453-461. 5. Jiménez, J. (2009). Química Analítica Cualitativa. Limusa 6. Chong, S., & Flores, M. (2005). Introducción a la Espectroscopia. Pearson Educación.