Determinarea Hemoglobinei prin Metoda Colorimetrică PDF

Dozarea hemoglobinei prin metoda colorimetrică 29 DOZAREA HEMOGLOBINEI PRIN METODA COLORIMETRICĂ Hemoglobina, o proteină conjugată, este principala componentă a hematiilor. O moleculă de hemoglobină este formată din două perechi de lanţuri polipeptidice...

Dozarea hemoglobinei prin metoda colorimetrică 29 DOZAREA HEMOGLOBINEI PRIN METODA COLORIMETRICĂ Hemoglobina, o proteină conjugată, este principala componentă a hematiilor. O moleculă de hemoglobină este formată din două perechi de lanţuri polipeptidice (globina) şi patru grupuri prostetice hem, fiecare conţinând câte un ion feros. O moleculă de hemoglobină poate lega reversibil patru molecule de oxigen prin intermediul grupărilor hem. Prin urmare, cu cât numărul de hematii este mai mare, cu atât se va transporta mai mult oxigen. Determinarea concentraţiei de hemoglobină este unul dintre testele diagnostice cel mai frecvent efectuate, de regulă concomitent cu hemoleucograma. s. PRINCIPIU zi er nt ti ric Dozarea hemoglobinei prin metoda colorimetrică presupune utilizarea unui dispozitiv st e special, numit hemometrul Sahli, care cuprinde două baghete de sticlă cu colorație st le standard, dispuse lateral, şi o eprubetă de sticlă. Hemoglobina este transformată în ria e at clorhemină prin reacţia cu acidul clorhidric. Soluţia de clorhemină este de culoare maro, im tu intensitatea culorii fiind proporţională cu concentraţia hemoglobinei. Se adaugă apă es ac distilată la proba astfel obţinută până când culoarea soluţiei este identică celei standard a a din hemometrul Sahli. Cu cât concentraţia hemoglobinei este mai mare, cu atât va fi at iz or necesară mai multă apă distilată pentru a dilua soluţia de clorhemină până când t au culoarea probei este aceeaşi cu cea a standardului. Valorile hemoglobinei sunt ne re. ui rn rib te a determinate în funcţie de nivelul de lichid din eprubeta gradată. st in di uz si u a tr re n ie i pe op a MATERIALE NECESARE C um N – trusă hemometru Sahli conţinând suport de plastic sau lemn care susţine două baghete fixe cu colorație standard şi o eprubetă gradată cu două scale – în procente şi grame % (g/100 ml), respectiv baghetă de sticlă pentru omogenizare; – pipetă capilară cu piesă bucală de cauciuc şi o singură gradaţie, 20 µl (Figura 4) – soluţie HCl 0,1 N; – pipetă de sticlă gradată; – apă distilată; – materialele necesare pentru colectarea mostrei de sânge (vată, alcool sanitar, ace sterile, mănuşi de unică folosinţă) 30 Lucrări practice de fiziologie s. zi er nt ti ric st e st le ria Figura 4. Eprubeta de sticlă gradată şi pipeta capilară de sticlă e at utilizate pentru determinarea concentraţiei de hemoglobină. im tu es ac a a METODA DE LUCRU at iz or t au ne re. Pregătiţi hemometrul: cu o pipetă de sticlă gradată, puneţi soluţie HCl 0,1 N în eprubeta ui rn rib te a st in gradată până la diviziunea 10%. di uz si u a tr re n ie i pe Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun op a C um înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați N probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele folosite în recipientele speciale, destinate acestui scop. Dezinfectaţi pulpa degetului cu vată şi alcool sanitar. Lăsaţi degetul să se usuce liber. Ţineţi degetul ferm între degetul mare şi arătător şi puncţionaţi pulpa degetului cu un ac steril, suficient de profund ca sângele să curgă liber. Ştergeţi prima picătură de sânge cu o bucată de vată. Aşteptaţi să se acumuleze o a doua picătură suficient de mare, introduceţi vârful pipetei în picătură şi aspiraţi o coloană continuă de sânge în pipeta capilară până la diviziunea de 20 µl. Dacă picătura de sânge nu este suficient de mare, puteţi aspira bule de aer; lumenul pipetei fiind foarte îngust, riscaţi ca sângele să se coaguleze foarte repede. Nu stoarceţi degetul! Dozarea hemoglobinei prin metoda colorimetrică 31 Ştergeţi sângele de la exteriorul pipetei. Evitaţi să atingeţi vârful acesteia. Introduceţi apoi vârful pipetei în soluţia de acid clorhidric din pipeta gradată şi expulzaţi sângele. Clătiţi pipeta de două ori, aspirând şi expulzând conţinutul pipetei în eprubetă. Puneţi eprubeta în suport şi adăugaţi apă distilată picătură cu picătură până când culoarea soluţiei din eprubetă este identică cu cea a standardului. Omogenizaţi conţinutul eprubetei cu bagheta de sticlă destinată acestui scop după fiecare cantitate de apă distilată adăugată. Citiţi gradaţia la care ajunge meniscul lichidului pe cele două scale. INTERPRETAREA REZULTATELOR s. zi Valori normale: er nt – bărbaţi: 15 – 17 g% (100%), ti ric – femei: 13,5 – 14,5 g% (aproximativ 90%), st e st – nou‐născuţi şi copii mici: 17 – 20 g% (110‐115%). le ria e at Creşterea şi scăderea concentraţiei de hemoglobină sunt de regulă (nu întotdeauna!) im tu asociate cu creşterea sau scăderea numărului de hematii. Pe lângă anomaliile cantitative es ac ale hemoglobinei există şi anomalii calitative ale hemoglobinei care poartă numele de a a at hemoglobinopatii. iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N  N C um op a ie i pe re n a tr si u di uz st in rib te ui rn re. a ne au t or iz at a a ac es tu im at eria le st e st ric ti nt er zi s. Grupe sanguine 33 GRUPE SANGUINE Grupele sanguine reprezintă sisteme de clasificare a tipurilor de sânge în funcţie de prezenţa sau absenţa pe suprafaţa hematiilor a unor structuri cu proprietăţi antigenice. Determinarea grupului sanguin are relevanţă clinică pentru stabilirea compatibilităţii de grup (de exemplu, între donator şi primitor, în situaţiile în care sunt necesare transfuzii). În prezent, sunt descrise peste 30 de sisteme de clasificare a grupelor sanguine, cele mai importante fiind sistemele ABO şi Rh. Antigenele localizate pe suprafaţa hematiilor poartă denumirea de aglutinogene. Expresia lor pe suprafaţa hematiilor este determinată genetic prin gene provenite de la ambii părinţi. În funcţie de aglutinogenele de pe suprafaţa hematiilor, în plasmă se formează anticorpi specifici care nu sunt codaţi genetic şi care se numesc aglutinine. s. Nu toate grupele sanguine sunt compatibile. Combinarea unor probe de sânge zi er incompatibile duce la formarea de conglomerate de hematii (aglutinare în condiții in nt ti ric vitro respectiv hemoliză în condiții in vivo). Din acest motiv, transfuziile se fac cu sânge st e din acelaşi grup ABO şi Rh. În situaţii extreme, se pot face transfuzii cu sânge de grup st le compatibil (care nu conţine antigene străine), cu condiţia să nu se administreze mai mult ria e at de 500 ml şi să se respecte principiul diluţiei anticorpilor. im tu es ac a a SISTEMUL AB0 at iz or t au ne re. ui rn rib te a Sistemul ABO a fost descris de medicul şi biologul austriac Karl st in di uz Landsteiner în 1901. Pentru această realizare, Karl Landsteiner a primit si u a tr premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie în 1930. re n ie i pe op a C um N Sistemul ABO este cel mai important sistem de clasificare a grupelor sanguine. Include 4 grupe sanguine (0, A, B, AB), apartenenţa la unul dintre acestea fiind determinată de prezenţa pe suprafaţa hematiilor a unor glicoproteine cu proprietăţi antigenice (A, B). Prezenţa acestor gene pe suprafaţa hematiilor este determinată de o pereche de gene, fiecare moştenită de la câte un părinte. Fenotip Genotip 0 00 A AA sau A0 B BB sau B0 AB AB 34 Lucrări practice de fiziologie Aglutininele (anticorpii) anti‐A (α) şi/sau anti‐B (β) sunt de tip IgM şi apar plasmă în primii ani de viaţă ca urmare a sensibilizării la alimente, bacterii şi virusuri. Grup sanguin Antigen Anticorp 0 ‐‐ α, β A A β B B α AB A, B ‐‐ PRINCIPIUL METODEI Probele de sânge se amestecă cu seruri standard care conţin anticorpi cunoscuţi. Se s. zi urmăreşte apariţia reacţiei de aglutinare ca urmare a interacţiunii antigen‐anticorp. er nt ti ric st e st MATERIALE NECESARE ria le e at im – seruri specifice: ser care conţine anticorpi anti‐A şi anti‐B, ser care conține tu es doar anticorpi anti‐B şi ser care conţine doar anticorpi anti‐A; ac a – lame de microscop; a at – pentru recoltarea sângelui: vată, alcool sanitar, ace sterile sau lanțete, mănuşi iz or t au de unică folosinţă. ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr METODA DE LUCRU re n ie i pe op a C um Se curăţă două lame de microscop. Pe una dintre lame se aplică câte o picătură din N fiecare ser standard. Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele/lanțetele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Dezinfectaţi pulpa degetului cu vată şi alcool sanitar. Lăsaţi degetul să se usuce liber. Ţineţi degetul ferm între degetul mare şi arătător şi puncţionaţi pulpa degetului cu un ac steril sau cu o lanțetă, suficient de profund ca sângele să curgă liber. Colectaţi o picătură de sânge cu un colţ al unei lame de microscop şi amestecaţi‐o cu prima picătură de ser Grupe sanguine 35 cu anticorpi specifici. Repetaţi procedura pentru celelalte două de picături. Schimbaţi de fiecare dată colţul lamei de miscroscop pentru ca serurile să nu se amestece. Aşteptaţi 2‐3 minute pentru ca reacţia antigen‐anticorp să se producă. Urmăriţi apariţia aglutinării (formarea de conglomerate de hematii) în cazul în care sângele conţine antigene care reacţionează cu anticorpii din serul specific. REZULTATE, INTERPRETARE Determinaţi grupul sauguin pe baza reacţiei de aglutinare (Figura 5). s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Figura 5. Aglutinarea în cazul diferitelor grupe sanguine. 36 Lucrări practice de fiziologie SISTEMUL RH Sistemul Rh include mai multe antigene, cele mai importante fiind antigenele C, c, D, E, e. Antigenele C, D, E sunt codate de gene dominante, iar antigenele c, e de gene recesive. Termenul de factor Rh şi încadrarea unui individ ca Rh pozitiv sau negativ se referă exclusiv la prezenţa pe suprafaţa hematiilor a antigenului D. Aproximativ 85% din populaţie este Rh pozitivă (antigen D prezent), restul de 15% fiind Rh negativi (antigen D absent). Deşi antigenul D este cel mai imunogen, şi prezenţa celorlalte antigene poate cauza incompatibilitate. Anticorpii anti‐D sunt de tip IgG şi apar în plasmă numai după imunizare prin transfuzii s. cu sânge incompatibil sau prin expunere peripartum. zi er nt ti ric st e MATERIALE NECESARE st le ria e at – ser specific Rh (conţine anticorpi anti‐D) im tu – lame de microscop es ac – pentru recoltarea sângelui: vată, alcool sanitar, ace sterile sau lanțete, mănuşi a a de unică folosinţă. at iz or t au ne re. ui rn rib te a METODA DE LUCRU st in di uz si u a tr re n Se curăţă două lame de microscop. Pe una dintre lame se aplică o picătură de ser ie i pe op a specific cu anticorpi anti‐D. C um N Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele/lanțetele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Dezinfectaţi pulpa degetului cu vată şi alcool sanitar. Lăsaţi degetul să se usuce liber. Ţineţi degetul ferm între degetul mare şi arătător şi puncţionaţi pulpa degetului cu un ac steril sau cu o lanțetă, suficient de profund ca sângele să curgă liber. Colectaţi o picătură de sânge cu un colţ al unei lame de microscop şi amestecaţi‐o cu picătura de ser cu anticorpi specifici. Aşteptaţi 2‐3 minute pentru ca reacţia antigen‐anticorp să se Grupe sanguine 37 producă. Urmăriţi apariţia aglutinării (formarea de conglomerate de hematii) în cazul în care sângele conţine antigene care reacţionează cu serul specific. REZULTATE, INTERPRETARE Determinaţi grupul sauguin pe baza reacţiei de aglutinare (Figura 6). s. zi er nt Figura 6. Aglutinarea în cazul diferitelor grupe sanguine. ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N  N C um op a ie i pe re n a tr si u di uz st in rib te ui rn re. a ne au t or iz at a a ac es tu im at eria le st e st ric ti nt er zi s. Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor 39 DETERMINAREA VITEZEI DE SEDIMENTARE A HEMATIILOR (VSH) Hematiile dintr‐o probă de sânge sedimentează lent deoarece sarcinile negative de pe suprafața acestora face ca celulele adiacente să se respingă când distanţa intercelulară scade sub un nivel minim. VSH‐ul reprezintă rata de sedimentare a hematiilor dintr‐o probă de sânge anticoagulat. Cu cât hematiile sedimentează mai repede, cu atât VSH‐ul este mai mare. MATERIALE NECESARE s. zi er nt – tuburi capilare heparinate ti ric st – ceară sigilare tuburi capilare e st – riglă le ria – cronometru e at im – pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile sau lanțete, tu es mănuși de unică folosință. ac a a at iz or METODA DE LUCRU t au ne re. ui rn rib te a st in Asigurați‐vă că mâinile subiectului sunt calde. Curățați vârful degetului cu vată îmbibată di uz si u cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind un ac steril sau o lanțetă, de unică a tr re n ie i pe folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului pregătit prealabil (țineți‐l ferm op a C um între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu N vată uscată prima picătură de sânge. Recoltarea se efectuază din a doua picătură. Nu începeți recoltarea până când nu s‐a format o picătură suficient de mare. Nu stoarceţi degetul! Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele/lanțetele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Atingeți capătul tubului capilar heparinat de picătura de sânge și lăsați să se umple prin capilaritate până la jumătate. 40 Lucrări practice de fiziologie Sigilați tubul apăsându‐l în ceara de etanșare. După 60 de minute, măsurați cu o riglă înălțimea zonei cu plasmă clară din partea superioară a coloanei și notați rezultatul. Lanțeta și tubul capilar se aruncă în cutia galbenă din plastic pentru materiale contaminate tăietoare‐înțepătoare. Suportul pentru capilare se pune în soluție dezinfectantă și se poate refolosi după sterilizare. REZULTATE Rezultatele se exprimă sub forma: mm/h. s. Notați în tabel rezultatele obținute pentru toți colegii la care s‐a făcut zi er determinarea și apoi creați o histogramă pe baza acestor valori. nt ti ric st e st Tabelul 4. le ria Student VSH (mm/oră) e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor 41 s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac Figura 7. Hârtie milimetrică pentru histogramă. a a at iz or t au ne re. INTERPRETARE ui rn rib te a st in di uz Valorile normale sunt dependente de vârstă și se pot aproxima prin formula: si u a tr re n ie i pe Vârsta (ani)  10 (doar la femei) op a C um VSH (mm / h)  N 2 Valori normale medii: – bărbaţi: 3‐6 mm/h (< 20 mm/h), – femei: 6‐11 mm/h (< 30 mm/h). VSH se modifică de exemplu în cazul creșterii sau scăderii numărului de hematii respectiv în modificarea structurii membranei celulare. VSH crește în faza acută a inflamațiilor, în infecții și boli autoimune. 42 Lucrări practice de fiziologie Câți dintre studenți au avut valori crescute ale VSH? Ce ar putea indica valorile crescute ale VSH specific la acești studenți? s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Determinarea hematocritului 43 DETERMINAREA HEMATOCRITULUI Hematocritul reprezintă procentul de hematii din sânge. MATERIALE NECESARE – tuburi capilare heparinate – ceară sigilare tuburi capilare – microcentrifugă și cititor rezultat s. – pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile sau lanțete, zi er nt mănuși de unică folosință. ti ric st e st le ria METODA DE LUCRU e at im tu Asigurați‐vă că mâinile subiectului sunt calde. Curățați vârful degetului cu vată îmbibată es ac cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind un ac steril sau o lanțetă, de unică a a folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului pregătit prealabil (țineți‐l ferm at iz or între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu t au ne re. vată uscată prima picătură de sânge. Recoltarea se efectuază din a doua picătură. Nu ui rn rib te a st in începeți recoltarea până când nu s‐a format o picătură suficient de. Nu stoarceţi di uz degetul! si u a tr re n ie i pe op a C um Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun N înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele/lanțetele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Atingeți capătul tubului capilar heparinat de picătura de sânge și lăsați să se umple prin capilaritate până la 1 cm de la capătul superior. Sigilați tubul apăsându‐l în ceara de etanșare. Tubul capilar etanșat se așează în centrifugă și se pornește centrifuga la 12000 rpm timp de 5 minute. După centrifugare tubul capilar se așează cu grijă în dreptul cititorului pentru microhematocrit astfel încât coloana de hematii din partea inferioară a tubului să fie aliniată cu linia orizontală de zero. Glisați tubul până când linia de 1 trece prin dreptul 44 Lucrări practice de fiziologie părții superioare a coloanei de plasmă. Linia care trece prin dreptul părții superioare a coloanei de hematii reprezintă hematocritul. Lanțeta și tubul capilar se aruncă în cutia galbenă din plastic pentru materiale contaminate tăietoare‐înțepătoare. Suportul pentru capilare nu se aruncă, se depune separat și se se poate refolosi după dezinfectare. REZULTATE Rezultatele se exprimă sub forma de procente (%). s. zi er Notați în tabel rezultatele obținute pentru toți colegii la care s‐a făcut nt ti ric determinarea și apoi creați o histogramă pe baza acestor valori. st e st le ria Tabelul 5. e at im Student Hematocrit (%) tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Determinarea hematocritului 45 s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac Figura 8. Hârtie milimetrică pentru histogramă. a a at iz or t au ne re. INTERPRETARE ui rn rib te a st in di uz Valori normale: si u a tr re n ie i pe – bărbați: 42‐52% op a C um – femei: 37‐47% N Valori crescute: policitemie. Valori scăzute: anemie. Calculați media valorilor hematocritului la colegii din grupă de sex feminin și separat la cei de sex masculin. Comparați valorile. Sunt similare sau sunt semnificativ diferite? Ce factori ar putea explica eventualele diferențe ale valorilor hematocritului între cele două sexe? Câți dintre studenți au valori crescute ale hematocritului? Ce ar putea indica valorile crescute ale hematocritului, specific la acești studenți?  N C um op a ie i pe re n a tr si u di uz st in rib te ui rn re. a ne au t or iz at a a ac es tu im at eria le st e st ric ti nt er zi s. Determinarea indicilor eritrocitari secundari 47 DETERMINAREA INDICILOR ERITROCITARI SECUNDARI Indicii eritrocitari secundari se pot calcula pe baza numărului de eritrocite, hematocrit și valoarea hemoglobinei, determinate anterior. Acești indici permit o apreciere mai bună a funcționării eritrocitelor. VOLUMUL ERITROCITAR MEDIU Volumul eritrocitar mediu (mean corpuscular volume, MCV) reprezintă volumul mediu ocupat de un eritrocit. Valoarea se modifică în funcție de dimensiunea eritrocitelor. s. zi er Parametrul se uilizează pentru detectarea precoce a proceselor ce cauzează anemie nt ti respectiv pentru clasificarea (inclusiv fiziopatologică) a anemiilor. ric st e st le ria e MODALITATE DE CALCUL, INTERPRETARE at im tu es Htc (%) / 100 ac MCV  a hematii (nr / L) a at iz or Rezultatele se exprimă în fL (10‐15 L). Valorile de referință, atât pentru bărbați cât și t au ne re. ui rn pentru femei sunt între 80‐100 fL. rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe HEMOGLOBINA ERITROCITARĂ MEDIE op a C um N Hemoglobina eritrocitară medie (mean corpuscular hemoglobin, MCH) reprezintă masa (greutatea) medie a hemoglobinei din eritrocite și este utilizat pentru diagnosticul diferitelor tipuri de anemii. MODALITATE DE CALCUL, INTERPRETARE Hb ( g / L) MCH  hematii (nr / L) 48 Lucrări practice de fiziologie Rezultatele se exprimă în pg (10‐12 g). Valorile de referință, atât pentru bărbați cât și pentru femei sunt între 27‐31 pg/celulă. CONCENTRATIA ERITROCITARĂ MEDIE DE HEMOGLOBINĂ Concentrația eritrocitară medie de hemoglobină (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) reprezintă concentrația medie a hemoglobinei dintr‐un volum de masă eritrocitară. Parametrul este utilizat pentru diagnosticul diferitelor tipuri de anemii. s. MODALITATE DE CALCUL, INTERPRETARE zi er nt ti ric st e Hb ( g / dl ) st MCHC  ria le Htc (%) / 100 e at im tu es Rezultatele se exprimă în g/dl. Valorile de referință, atât pentru bărbați cât și pentru ac a femei sunt între 32‐36 g/dl. a at iz or t au ne re. ui rn rib te a Calculați indicii eritrocitari secundari pe baza valorilor de hematocrit, st in di uz hemoglobină și număr hematii, determinate la lucrări practice si u a tr anterioare și interpretați rezultatele! re n ie i pe op a C um N Cum putem determina cu ajutorul indicilor eritrocitari secundari tipul de anemie de care suferă un pacient? Cum ar arăta valorile indicilor eritrocitari în cazul unei anemii microcitare? Care sunt cauzele posibile ale unei astfel de anemii? Cum ar arăta valorile indicilor eritrocitari în cazul unei anemii macrocitare? Care sunt cauzele posibile ale unei astfel de anemii? Cum ar arăta valorile indicilor eritrocitari în cazul unei anemii normocitare? Care sunt cauzele posibile ale unei astfel de anemii? Principii de numărare a elementelor figurate sanguine 49 PRINCIPII DE NUMĂRARE A ELEMENTELOR FIGURATE SANGUINE METODA AUTOMATĂ Hemoleucograma completă poate fi efectuată cu un analizator automat care determină numărul și tipul diferitelor celule din sânge. O probă foarte mică de sânge este aspirată printr‐un sistem subțire de tuburi. În interiorul acesui sistem există senzori care numără celulele și care pot identifica diferitele tipuri de celule; această metodă se numește citometrie în flux. Pentru detecție pot fi folosiți senzori optici și/sau se măsoară impedanțe electrice. Unul dintre criteriile prin care aparatul poate discrimina tipurile de s. zi celule este dimensiunea acestora. Alte aparate pot determina diferite caracteristici ale er nt celulelor pentru a le clasifica. ti ric st e st le ria METODA MANUALĂ e at im tu es Această metodă utilizează microscopul și o cameră specială de numărare ac (hemocitometru), determinarea făcându‐se din sânge diluat. a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Figura 9. Hemocitometrul – vedere laterală și de sus. Hemocitometrul este o lamă groasă de sticlă pe care, prin șanțuri, este delimitată o cameră dreptunghiulară. Pe această cameră este gravată o rețea de linii perpendiculare. Dispozitivul este precis gravat astfel încât ariile suprafețelor delimitate de linii și adâncimea camerei sunt cunoscute. Astfel, este posibilă numărarea celulelor sau particulelor dintr‐un anumit volum de lichid, putându‐se apoi calcula numărul de celule din volumul întreg. Se folosesc diferite tipuri de hemocitometre, în laboratorul de 50 Lucrări practice de fiziologie Fiziologie se utilizează camera de numărare Burker‐Türk, respectiv Neubeuer improved. Acestea sunt gravate cu două șanțuri adânci paralele și unul transversal, în formă de “H”, care asigură suportul pentru fixarea lamelei de sticlă și separă cele două zone gravate (vezi Figura 9). s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or Figura 10. Rețeaua camerei Bürker‐Türk. t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Figura 11. Rețeaua camerei Neubeuer improved. Principii de numărare a elementelor figurate sanguine 51 Fiecare suprafață de numărare are o arie totală de 9 mm2. Adâncimea dintre lamelă și suprafața lamei este 1/10 mm. Rețeaua camerei de numărare este formată din linii perpendiculare aflate la o distanță de 1/5 mm, respectiv 1/20 mm (vezi Figura 10 respectiv Figura 11). Liniile perpendiculare delimitează pătrate și dreptunghiuri pentru numărarea celulele sanguine: – pătrate mici cu aria de 1/400 mm2 pentru numărarea globulelor roșii (hematii), – pătrate mari cu aria de 1/25 mm2 pentru numărarea globulelor albe (leucocite), – dreptunghiuri cu aria de 1/100 mm2 pentru numărarea trombocitelor. s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N  N C um op a ie i pe re n a tr si u di uz st in rib te ui rn re. a ne au t or iz at a a ac es tu im at eria le st e st ric ti nt er zi s. Numărarea hematiilor 53 NUMĂRAREA HEMATIILOR MATERIALE NECESARE – hemocitometru, – kit pentru eritrocite Ery‐TIC®: conține capilar pentru recoltare (5 µl), tub Eppendorf cu soluție de diluție preparată (EryCount®, conține soluție Hayem, volum 995 µl) și capilar de umplere a hemocitometrului, – suport capilare de recoltare, – capilare suplimentare pentru numărarea eritrocitelor, – microscop optic, s. – pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile sau lanțetă, zi er nt mănuși de unică folosință. ti ric st e st le ria METODA DE LUCRU e at im tu Curățați hemocitometrul și lamela de sticlă cu o bucată de vată îmbibată cu alcool și es ac lăsați să se usuce. Pregătiți hemocitometrul prin așezarea lamelei pe lamă. a a at iz or Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun t au ne re. ui rn înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați rib te a st in probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. di uz Aruncaţi acele/lanțetele folosite în recipientele special destinate acestui si u a tr re n scop. ie i pe op a C um N Curățați vârful degetului cu vată îmbibată cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind un ac steril sau o lanțetă, de unică folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului curățat (țineți‐l ferm între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu vată uscată prima picătură de sânge. Recoltarea se efectuază din a doua picătură. Nu începeți până când nu s‐a format o picătură suficient de mare deoarece capilarele de recoltare au un lumen foarte îngust și sângele coagulează extrem de repede în interior. Nu stoarceţi degetul! Pașii necesari pentru recoltarea sângelui și pregătirea probei (Figura 12): – se așează capilarul de recoltare în suportul de capilar din plastic, – se atinge vârful capilarului de recoltare de picătura de sânge de pe deget și se așteaptă până când aceasta este plin cu sânge de la un capăt la altul, – se așează capilarul de recoltare în tubul Eppendorf, – se închide tubul și se agită, diluția obținută prin aceast metodă este de 1:200 54 Lucrări practice de fiziologie – se pregătește hemocitometrul, înainte de încărcarea camerei de numărare se agită din nou tubul Eppendorf, – se deschide tubul Eppendorf și se introduce în soluție capilarul de umplere a hemocitometrului care se va umple prin capilaritate (în timpul transferului un capăt al capilarului se blochează cu degetul), – capilarul de umplere se atinge de marginea unui șanț ce creează H‐ul central și rețeaua de numărare se va umple prin capilaritate. s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz Figura 12. Pașii necesari pentru recoltarea sângelui și pregătirea si u a tr probei. re n ie i pe op a C um N În caz de eroare la recoltare sau la transferarea soluției din tubul Eppendorf pe camera de numărare se utilizează capilarele suplimentare. Lanțeta și capilarul de umplere a hemocitometrului se aruncă în cutia galbenă din plastic pentru materiale contaminate tăietoare‐înțepătoare. Tubul Eppendorf închis (ce conține în continuare capilarul de recoltare) se aruncă în cutia galbenă de carton pentru materiale contaminate. Suportul pentru capilare nu se aruncă, se depune separat și se se poate refolosi după dezinfectare. Așezați hemocitometrul la microscopul optic și examinați proba folosind obiectivul cu putere mică (10x sau 40x) și luminozitate scăzută. Numărarea hematiilor 55 În cazul utilizării hemocitometrului Bürker‐Türk (Figura 10) numărați hematiile în 80 de pătrate mici consecutive, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratelor și pe două din laturile alăturate ale acestora. În cazul utilizării hemocitometrului Neubeuer improved (Figura 11) se numără hematiile în 80 de pătrate mici conform modalității marcate pe Figura 13, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratelor și pe două din laturile alăturate ale acestora. s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz ort au Figura 13. Numărarea eritrocitelor cu ajutorul hemocitometrului ne re. ui rn Neubeuer improved. Eritrocitele se numără în zonele hașurate de pe rib te a st in rețea. di uz si u a tr re n ie i pe REZULTATE op a C um N Rezultatul se exprimă sub forma celule/mm3. Mai întâi se calculează numărul mediu de hematii într‐un pătrat mic: N (numărul total de hematii numărate)/80 (numărul de pătrate ‐ NrP). Acesta trebuie raportat la volumul (V) corespunzător unui pătrat mic: aria*înălțimea camerei (A*Î). În final, rezultatele trebuie corectate pentru diluția sângelui (D). N N Nr. Hematii   NrP  V  D NrP  A  Î  D N N Nr. Hematii    400  10  200  N  10000 1 1 1 80 80    400 10 200 56 Lucrări practice de fiziologie INTERPRETAREA REZULTATELOR Valori normale: – bărbați: 4.7–5.2*106/mm3 – femei: 4.2–4.7*106/mm3 – nou‐născuți, copii mici: 5.5‐6*106/mm3 Valori crescute – policitemie, poliglobulie: – fiziologic: sex, vârstă, altitudine înaltă, efort, etc. – patologic: boală cronică cardiacă, pulmonară sau a măduvei osoase Valori scăzute – anemie – sângerare – scădere a producerii de hematii s. zi – distrugere crescută a hematiilor er nt ti ric st e st le ria e at im tu es ac a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Numărarea leucocitelor 57 NUMĂRAREA LEUCOCITELOR MATERIALE NECESARE – hemocitometru, – kit pentru leucocite Leuko‐TIC blue®: conține capilar pentru recoltare (20 µl), tub Eppendorf cu soluție de diluție preparată (conține violet de gențiană în soluție de tampon, volum 380 µl) și capilar de umplere a hemocitometrului, – suport capilare de recoltare, – capilare suplimentare pentru numărarea leucocitelor, – microscop optic, – pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile sau lanțetă, s. mănuși de unică folosință. zi er nt ti ric st e METODA DE LUCRU st le ria e at Curățați hemocitometrul și lamela de sticlă cu o bucată de vată îmbibată cu alcool și im tu lăsați să se usuce. Pregătiți hemocitometrul prin așezarea lamelei pe lamă. es ac a a at Pentru a evita riscul de infecție, spălați‐vă mâinile cu apă și săpun iz or înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați t au ne re. probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. ui rn rib te a st in Aruncaţi acele/lanțetele folosite în recipientele special destinate acestui di uz scop. si u a tr re n ie i pe op a C um Curățați vârful degetului cu vată îmbibată cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind N un ac steril sau o lanțetă, de unică folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului curățat (țineți‐l ferm între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu vată uscată prima picătură de sânge. Recoltarea se efectuază din a doua picătură. Nu începeți până când nu s‐a format o picătură suficient de mare deoarece capilarele de recoltare au un lumen foarte îngust și sângele coagulează extrem de repede în interior. Nu stoarceţi degetul! Pașii necesari pentru recoltarea sângelui și pregătirea probei (Figura 12): – se așează capilarul de recoltare în suportul de capilar din plastic, – se atinge vârful capilarului de recoltare de picătura de sânge de pe deget și se așteaptă până când aceasta este plin cu sânge de la un capăt la altul, – se așează capilarul de recoltare în tubul Eppendorf, – se închide tubul și se agită și se așteaptă cel puțin 30 de secunde; diluția obținută prin aceast metodă este de 1:20 58 Lucrări practice de fiziologie – se pregătește hemocitometrul, înainte de încărcarea camerei de numărare se agită din nou tubul Eppendorf, – se deschide tubul Eppendorf și se introduce în soluție capilarul de umplere a hemocitometrului care se va umple prin capilaritate (în timpul transferului un capăt al capilarului se blochează cu degetul), – capilarul de umplere se atinge de marginea unui șanț ce creează H‐ul central și rețeaua de numărare se va umple prin capilaritate. În caz de eroare la recoltare sau la transferarea soluției din tubul Eppendorf pe camera de numărare se utilizează capilarele suplimentare. Lanțeta și capilarul de umplere a hemocitometrului se aruncă în cutia s. galbenă din plastic pentru materiale contaminate tăietoare‐înțepătoare. zi er nt Tubul Eppendorf închis (ce conține în continuare capilarul de recoltare) ti ric se aruncă în cutia galbenă de carton pentru materiale contaminate. st e Suportul pentru capilare nu se aruncă, se depune separat și se se poate st refolosi după dezinfectare. le ria e at im tu Așezați hemocitometrul la microscopul optic și examinați proba folosind obiectivul cu es ac putere mică (10x sau 40x) și luminozitate scăzută. a a at iz or t au ne re. ui rn rib te a st in di uz si u a tr re n ie i pe op a C um N Figura 14. Numărarea leucocitelor cu ajutorul hemocitometrului Neubeuer improved. Leucocitele se numără în zonele hașurate de pe rețea. Numărarea leucocitelor 59 În cazul utilizării hemocitometrului Bürker‐Türk (Figura 10) numărați leucocitele în 25 de pătrate mari consecutive, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratelor și pe două din laturile alăturate ale acestora. În cazul utilizării hemocitometrului Neubeuer improved (Figura 11) se numără leucocitele în 64 de pătrate mari, conform modalității marcate pe Figura 14, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratelor și pe două din laturile alăturate ale acestora. REZULTATE Rezultatul se exprimă sub forma: celule/mm3. În cazul utilizării hemocitometrului Bürker‐Türk: s. zi Mai întâi trebuie calculat numărul mediu de leucocite într‐un pătrat mare: N (numărul er nt total de leucocite numărate)/25 (numărul de pătrate ‐ NrP). Acesta trebuie raportat la ti ric volumul (V) corespunzător unui pătrat mare: aria*înălțimea camerei (A*Î). În final, st e st rezultatele trebuie corectate pentru diluția sângelui (D). le ria e at N N im Nr. Leucocite   tu NrP  V  D NrP  A  Î  D es ac a a at N N iz Nr. Leucocite    25  10  20  N  200 or t au 1 1 1 25 25    ne re. ui rn rib te 25 10 20 a st in di uz si u a tr re n ie i pe În cazul utilizării hemocitometrului Neubeuer improved în formula de mai sus se va op a schimba NrP, cu modificarea consecutivă a formulei finale. C um N N N Nr. Leucocite   NrP  V  D NrP  A  Î  D N N Nr. Leucocite    16  10  20  N  50 1 1 1 64 64    16 10 20 INTERPRETAREA REZULTATELOR 60 Lucrări practice de fiziologie Valori normale: – adulți: 6000‐8000/mm3 – nou‐născuți, copii mici: 14000‐20000/mm3 Valori crescute – leucocitoză: – fiziologic: după efort, post‐prandial, la femei: menstruație, sarcină, lăuzie – patologic: infecție, inflamație, otrăvire Valori scăzute – leucopenie: șoc anafilactic, infecții virale, expunere la radiații X, etc. s. zi er nt ti ric st e st le ria e at im