Tema 1 Introduccion a la Biotecnologia Microbiana PDF

Tema 1 Introducción a la Biotecnología Microbiana 1.1. Concepto 1.2. Desarrollo histórico 1.3. Microorganismos y su importancia industrial 1.4. Esquema general de los procesos de fermentación 9k= 1.1. Concepto BIOTECNOLOGÍA “uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para los seres humanos” BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL INGENIERÍA GENÉTICA (TÉCNICAS ADN RECOMBINANTE) 1.1. Concepto 1.2. Desarrollo histórico Sumerios y Babilonios (6.000 a.c.): cerveza Egipcios (4.000 a.c.): pan Biblia: vino Iliada (700 a.c.): queso 1.2. Desarrollo histórico Exposición Momias de Egipto 1.2. Desarrollo histórico Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) 1.2. Desarrollo histórico Louis Pasteur (1822-1895) 1.2. Desarrollo histórico Alexander Fleming (1881-1955) 1.2. Desarrollo histórico James Watson y Francis Crick (1953) Herbert Boyer y Stanley Cohen (1975) Tecnología del ADN recombinante: transferencia de las propiedades de un gen de un organismo a otro 1.2. Desarrollo histórico Kary B. Mullis 1995 (1986) PCR (polymerase chain reaction) Genoma de Saccharomyces cerevisiae 1996 1.2. Desarrollo histórico CRISPR Cas Acrónimo en inglés de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, o Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas Francis Mojica Salinas de Santa Pola (Alicante) Haloferax mediterranei 2020 1.3. Microorganismos y su importancia industrial ¿Qué cualidades debe tener un microorganismo para que pueda ser usado en la industria? 1. Inocuo y no productor de toxinas 2. Fácil de cultivar 3. Rápido crecimiento en materia prima barata 4. Capaz de producir gran cantidad de enzimas 5. Capaz de transformar el sustrato con alto rendimiento y poco gasto de energía 6. Sus propiedades deben ser estables con el tiempo 1.3. Microorganismos y su importancia industrial ¿Por qué son importantes para la industria? Su pequeño tamaño Alta relación Superficie/Volumen Versatilidad metabólica Manipulación genética 1.3. Microorganismos y su importancia industrial ¿Qué tipo de microorganismos se utilizan habitualmente en la industria? Bacterias (Actinobacterias) Hongos (Levaduras) 1.3. Microorganismos y su importancia industrial BACTERIAS Escherichia coli Bacillus licheniformis Colonias bacterianas 1.3. Microorganismos y su importancia industrial ACTINOBACTERIAS Streptomyces sp. 1.3. Microorganismos y su importancia industrial HONGOS Aspergillus sp. Penicillium sp. 1.3. Microorganismos y su importancia industrial LEVADURAS Candida sp. Saccharomyces sp. 1.3. Microorganismos y su importancia industrial Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - yogur Corynebacterium glutamicum - L-lisina Leuconostoc mesenteroides - dextrano Bacillus licheniformis - bacitracina Bacterias B. polymyxa - polimixina B B. thuringiensis - bioinsecticidas Escherichia coli - insulina, interferón Streptomyces spp. - estreptomicinas, (Actinobacterias) tetraciclinas, kanamicinas, neomicina, anfotericina B, etc. 1.3. Microorganismos y su importancia industrial Penicillium chrysogenum - penicilinas Cephalosporium acremonium – cefalosporinas Rhizopus nigricans - transformación esteriodes Hongos Aspergillus oryzae - amilasas Aspergillus niger - ac. cítrico, glucoamilasa Penicillium roquefortii - queso Penicillium camembertii - queso Saccharomyces cerevisiae - pan, vino, cerveza, etc. (Levaduras) Candida utilis - biomasa Saccharomycopsis lipolytica - biomasa, lipasa 1.3. Microorganismos y su importancia industrial Aplicaciones ✓Células microbianas Obtención de biomasa ✓Procesos en los que participan microorganismos: Conversiones Producciones fermentativas biológicas Transformaciones fermentativas Enzimas (alto Pm) Producciones Metabolitos primarios fermentativas Metabolitos secundarios Vino Transformaciones Cerveza fermentativa Derivados lácteos Tratamiento aguas residuales 1.3. Microorganismos y su importancia industrial Productos de interés comercial ❑ Biomasa ❑ Enzimas (alto Pm) ❑ Metabolitos primarios ❑ Metabolitos secundarios 1.4. Esquema general de los procesos de fermentación MICROORGANISMO MATERIA PRIMA Propagación del inóculo Preparación de la M.P. Inoculación del microorganismo en la materia prima preparada FERMENTACIÓN PRINCIPAL TRANSFORMACIONES [FERMENTACIONES SECUNDARIAS O FINALES] PRODUCCIONES [EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO] ESTABILIZACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO Tema 2 Microorganismos empleados en la industria 2.1. Aislamiento y selección de microorganismos empleados en la industria 2.2. Técnicas de screening primario y secundario 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales 2.4. Patentes 2.1. Aislamiento y selección de microorganismos empleados en la industria ¿de dónde? Colecciones de cultivo Manipulados genéticamente Aislados de ambientes naturales ¿1 gramo de suelo??? 106-108 bacterias 104-106 esporas de actinobacterias 102-104 esporas de hongos Metagenómica 2.1. Aislamiento y selección de microorganismos empleados en la industria 2.1. Aislamiento y selección de microorganismos empleados en la industria ¿de dónde? Otros ambientes: Marinos Ambientes extremos 2.1. Aislamiento y selección de microorganismos empleados en la industria ¿cómo? Primario Screening Secundario Screening primario Screening secundario Muy sencillo Complejo Selectivo Muchos pasos Pocos pasos Valor real Valor potencial 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Screening primario  Enriquecimiento continuo en medio líquido Ej: degradadores de ácidos orgánicos…  Medios sólidos Ej: productores de enzimas…  Método de la doble capa Ej: productores de antibióticos, vitaminas… 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Screening primario  Enriquecimiento continuo en medio líquido Muestra Ej: degradadores de ácidos problema orgánicos, compuestos xenobióticos, herbicidas, compuestos aromáticos, fenoles… 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Screening primario  Medios sólidos Ej: productores de enzimas Amilasa Lipasa Proteasa DNAsa 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Screening primario Método de la doble capa: Ej: productores de antibióticos, vitaminas, etc https://youtu.be/TtiomCqPYUY 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Screening primario 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Screening primario 2.2. Técnicas de screening primario y secundario Complejo Screening secundario Muchos pasos Valor real Selección de microorganismos con un valor real para procesos industriales: - Cualitativo - Cuantitativo  Evaluación del verdadero potencial de un microorganismo para su uso en la industria: -Caracterización química y fisicoquímica del producto -Estabilidad del producto -Condiciones de cultivo para producción óptima -Estabilidad genética del cultivo -Ensayos fisicoquímicos, biológicos… -Identificación del microorganismo -Patente 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales ¿dónde se conservan? Colecciones de cultivo (Centros de Recursos Biológicos) DSM PCM CCM CIP ATCC JCM CECT Colecciones particulares 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales ¿cómo se conservan? Métodos Nitrógeno líquido ( - 196 ºC) Congelación a - 80 ºC Liofilización 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales ¿cómo se conservan? Nitrógeno líquido ( - 196 ºC) 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales ¿cómo se conservan? Nitrógeno líquido ( - 196 ºC) 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales ¿cómo se conservan? Congelación ( - 80 ºC) Criotubos 2.3. Mantenimiento y conservación de microorganismos industriales ¿cómo se conservan? Liofilización 2.4. Patentes INVENTO  PATENTE  ¿Qué ES UNA PATENTE? Derecho concedido por un estado a un inventor o a su cesionario, por un periodo limitado de tiempo a cambio de la divulgación de una invención  REQUISITOS PARA QUE ALGO SE PUEDA PATENTAR - NOVEDAD - NO OBVIEDAD - UTILIDAD 2.4. Patentes INVENTO  PATENTE  SOLICITUD DE PATENTE: - Información para reproducir los resultados - Descripción detallada de la invención - Si está involucrado un microorganismo, depósito del mismo en una colección de cultivo  BENEFICIOS DE UNA PATENTE - Motiva la creatividad del inventor - Si tiene éxito comercial, el inventor se beneficia con la licencia de explotación que otorgue a terceras personas - Evita el plagio de su invento - Se hace público y se explica el beneficio que tiene dicho invento - Se promueve la transferencia de tecnología 2.4. Patentes  TIPOS DE PATENTES: -NACIONAL (Oficina Española de Patentes y Marcas) -EUROPEA (Oficina Europea de Patentes) -INTERNACIONAL (Organización Mundial de la Propiedad Intelectual)  DOCUMENTO DE PATENTE -IMPRESO DE SOLICITUD (Datos de los inventores, título de la invención, documentos adjuntos, resumen de la invención, fecha de recepción, etc…) -DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN -REIVINDICACIONES -DIBUJOS, FIGURAS, ETC.  SE PUEDEN PATENTAR: INVENCIONES QUE PROTEGEN UN PRODUCTO INVENCIONES QUE PROTEGEN EL PROCESO DE OBTENCIÓN DE UN PRODUCTO INVENCIONES QUE PROTEGEN EL USO DE UN PRODUCTO Y SI LO PRODUCE UN MICROORGANISMO, ¿SE PUEDE PATENTAR EL MICROORGANISMO? 2.4. Patentes Tratado de Budapest (1977) Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con la finalidad de patentes “Autoridad Depositaria Internacional” Requisitos: - Existencia continua - Imparciales y objetivos - Examinar viabilidad del microorganismo - Mantenerlo sin contaminación al menos 30 años - Mecanismo de seguridad - Secreto - Suministro de muestras 2.4. Patentes Caso Diamond vs Chakrabarty (Tribunal Supremo, 1980) Tema 3 Genética microbiana 3.1. Genética de los microorganismos 3.2. Obtención de mutantes 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genéticos 3.1. Genética de los microorganismos Biotecnología Ingeniería genética (Tecnología de ADN recombinante) GMOs: Organismos modificados genéticamente Incrementa el rendimiento 3.1. Genética de los microorganismos Razones que justifican los procesos de mejora genética Aumentar la producción  Adecuar las características del microorganismo a las condiciones de fermentación Eliminar la síntesis de compuestos colaterales  Obtener microorganismos capaces de sintetizar productos de interés que NO sean de origen microbiano 3.1. Genética de los microorganismos Transformación Asociadas a transferencia Conjugación de material genético Transducción Variaciones genéticas No asociadas a transferencia de Mutaciones espontáneas Agentes mutagénicos material genético 3.1. Genética de los microorganismos Transformación Asociadas a transferencia Conjugación de material genético Transducción Variaciones genéticas No asociadas a transferencia de Mutaciones espontáneas Agentes mutagénicos material genético 3.1. Genética de los microorganismos Se realiza contacto físico entre la célula donante y la célula receptora, transfiriéndose un plásmido La célula receptora capta del medio ADN libre procedente de otra célula El vector de transferencia genética es un bacteriófago 6 3.2. Obtención de mutantes Transformación Asociadas a transferencia Conjugación de material genético Transducción Variaciones genéticas No asociadas a transferencia de Mutaciones espontáneas Agentes mutagénicos material genético 3.2. Obtención de mutantes Mutación Alteración o cambio producido en la información genética (genotipo) de un ser vivo Tipos de mutaciones 3.2. Obtención de mutantes Se producen de forma natural alterando la estructura de las bases del ADN Consecuencia de errores durante el proceso de replicación del ADN o por lesiones espontáneas del ADN Mutaciones espontáneas Mutaciones génicas, Mutaciones moleculares o inducidas puntuales Se producen como consecuencia de la exposición del ADN a distintos factores, llamados agentes mutagénicos o mutágenos, aumentando la frecuencia de mutación por encima de la tasa normal Cambios que alteran la secuencia de Físicos nucleótidos del ADN Químicos Biológicos 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Mutágenos físicos Radiaciones Radiaciones Radiaciones no ionizantes: rayos ionizantes: X o rayos γ radiación UV (pueden provocar (producen la roturas de la doble formación de cadena o del dímeros de dos enlace glucosídico timinas adyacentes del ADN) del ADN) 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Mutágenos químicos Son compuestos químicos capaces de alterar las estructuras del ADN de forma brusca Tipos: Análogos de bases Agentes que reaccionan con el ADN Agentes intercalantes 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Mutágenos químicos Análogos de bases  Tienen similitud estructural con las bases nitrogenadas  Cuando se introducen en el ADN, la replicación ocurre normalmente, aunque se pueden producir errores de lectura que resultan en la incorporación de bases erróneas en la copia de ADN 5-bromouracilo 2-aminopurina Análogo de Timina, aparea con Análogo de Adenina, aparea Adenina o con Guanina con Timina o con Citosina 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Mutágenos químicos Agentes que reaccionan con el ADN Transición Transversión Base púrica por base púrica Base púrica por pirimidínica Pirimidínica por pirimidínica Ejemplos: ácido nitroso, la hidroxilamina  Moléculas que reaccionan directamente con el ADN, el cual no está replicándose, ocasionando cambios químicos en las bases lo que provoca apareamientos incorrectos. Agentes desaminantes o hidroxilantes  Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos letales y mutagénicos. Ejemplos: gas mostaza, nitrosoguanidina, etil etano sulfonato (EES), etil metano sulfonato (EMS) 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Mutágenos químicos Agentes intercalantes  Son moléculas planas que se insertan entre dos pares de bases del ADN, separándolas entre sí  Durante la replicación, esta conformación anormal puede conducir a inserciones o deleciones en el ADN, originando mutaciones por corrimiento de lectura  Las sustancias más características de este grupo son las acridinas (naranja de acridina), bromuro de etidio y proflavina Bromuro de etidio 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Mutágenos biológicos Ciertos virus (retrovirus, los adenovirus o el virus de la hepatitis B) que pueden producir cambios en la expresión de algunos genes Transposones, segmentos móviles de ADN que pueden cambiar de posición, trasladándose de un lugar a otro lugar distinto del genoma de una célula Producen mutaciones: deleciones o inserciones de bases (pérdida o recuperación de la función de un gen) 3.3. Mutagénesis física, química y dirigida Reversión Los fenotipos Proceso mutagénico que origina un cambio mutantes de un fenotipo mutante a uno salvaje pueden ser restablecidos Supresión Mutación en un sitio diferente al que se produjo la primera mutación (original) que enmascara o compensa los efectos de la mutación original 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Técnicas de genética bacteriana in vitro Ingeniería genética Plásmidos Enzimas de restricción Clonación molecular o genética ADN sintético Producción de proteínas de mamíferos por microorganismos Mutagénesis dirigida 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Plásmidos Moléculas circulares de ADN de doble cadena que pueden existir y replicarse de manera independiente del cromosoma o pueden estar integrados en él Vectores de clonación Gen de resistencia a antibiótico Gen de resistencia Origen de a antibiótico replicación 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Enzimas de restricción Moléculas que reconocen una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortan el ADN en ese punto o en un sitio no muy alejado (sitio o diana de restricción) El corte del ADN se realiza por la rotura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA (romos o cohesivos) Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Clonación molecular o genética Obtención de grandes cantidades de genes específicos o fragmentos cromosómicos de forma pura  Etapas de la clonación molecular 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético ADN sintético  Son pequeños segmentos de ADN de cadena sencilla cuya síntesis se realiza generalmente de forma automatizada  Es necesario conocer la secuencia del ADN que se desea sintetizar  El ADN se sintetiza en un proceso en fase sólida en el que el primer nucleótido de la cadena se sujeta a un soporte sólido insoluble  Múltiples aplicaciones en ingeniería genética 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Mutagénesis dirigida Son mutaciones producidas en sitios determinados de los genes, con total precisión Se realizan in vitro Permiten obtener microorganismos productores de proteínas diferentes a las de las cepas silvestres y además, en muchos casos, las propiedades de dichas proteínas son predecibles 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético CRISPR Cas Acrónimo en inglés de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, o Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas Francis Mojica Salinas de Santa Pola (Alicante) Haloferax mediterranei 2020 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Producción de proteínas de mamíferos por microorganismos Introducción en un ADN eucariota microorganismo Producción en fermentadores de la ¡¡NO es posible!! proteína deseada ADN eucariotas: intrones y exones ADN procariotas: exones 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Exones Intrones Exones Intrones Exones ADN eucariotas ARN polimerasa ARNm precursor Perdida de intrones ARNm maduro ADN célula procariota (NO contiene intrones) ADN célula eucariota (SI contiene intrones) 3.4. Tecnología de genes y utilización de métodos genético Producción de proteínas de mamíferos por microorganismos  Dos alternativas: 1. Obtener genes sintéticos in vitro 2. Aislar el ARNm maduro de la célula eucariota y utilizarlo para fabricar ADN sin intrones: ARNm maduro eucariota Transcriptasa inversa Híbrido ARN-ADN  El ADN resultante, Transcriptasa inversa llamado ADN ADNc complementario o ADNc puede ser clonado en una célula bacteriana Corte con enzimas de restricción y unión ADN con el gen que Vector (plásmido) con ADN ligasa codifica la proteína a Gen R ampicilina producir Plásmido conteniendo el ADN deseado (plásmido recombinante) Cromosoma Introducción del plásmido en un sistema bacteriano de expresión mediante transformación Sistema de expresión Célula huésped (E. coli) Medio cultivo + ampicilina Solo crecen bacterias conteniendo ADN recombinante Producción de la proteína en fermentadores Tema 4 Materias primas 4.1. Nutrición de los microorganismos 4.2. Materias primas utilizadas en la industria 4.1. Nutrición de los microorganismos Nutrientes ✓CO2 ✓Compuestos orgánicos: Agua: 80-90 % Azúcares C (50 %) Alcoholes Ac. orgánicos Composición O (20 %) Comp. nitrogenados elemental de una N (14 %) Comp. aromáticos célula microbiana (E. coli) H (8 %) P (3 %) S, K, Na, Ca, Mg, Cl, Fe, Elementos Otros (Co, Cu, traza Mo, Zn) 4.1. Nutrición de los microorganismos Nutrientes Agua: 80-90 % C (50 %) ✓Forma inorgánica: nitratos, Composición O (20 %) sales amónicas elemental de una N (14 %) ✓Forma orgánica: aminoácidos y célula microbiana peptonas (E. coli) H (8 %) ✓N2: fijadores de N2 P (3 %) S, K, Na, Ca, Mg, Cl, Fe, Elementos Otros (Co, Cu, traza Mo, Zn) 4.1. Nutrición de los microorganismos Factores de crecimiento 1. Aminoácidos: proteínas 2. Purinas y pirimidinas: ácidos nucleicos 3. Vitaminas: enzimas 4.1. Nutrición de los microorganismos Fuente Fuente de Categoría nutricional Ejemplos de E. Carbono Bacterias FOTOAUTOTROFOS LUZ CO2 fotosintéticas Compuestos Bacterias FOTOHETEROTROFOS LUZ orgánicos púrpuras Energía Solo algunas QUIMIOAUTOTROFOS CO2 química bacterias Energía Compuestos La mayoría de QUIMIOHETEROTROFOS química orgánicos bacterias 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Pequeña escala Medios de laboratorio Materias primas Gran escala Barata Requisitos Gran disponibilidad Normalizada De origen natural Tipos Medios sintéticos 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Materias primas naturales ▪ Melazas ▪ Líquido maceración del maíz ▪ Harina de soja ▪ Sustancias solubles de las destilerías ▪ Aceites vegetales ▪ Suero de leche ▪ Cebada ▪ Mosto de uva ▪ Otros: alpechín ? 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Melazas “Subproductos de la industria de producción de azúcar a partir de caña de azúcar o remolacha” 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Melazas Tipos: 1. Melazas de caña: 52% azúcares: 30% sacarosa 22% glucosa + fructosa (azúcares invertidos) 2. Melazas invertidas: 75% azúcares: 55% glucosa + fructosa 20% sacarosa 3. Melazas de remolacha: limitadas en biotina 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Melazas Composición: Fuente de Carbono: Sacarosa, az. invertidos, polisacáridos complejos Ac. orgánicos (málico, aconítico, cítrico, láctico,...) Fuente de Nitrógeno: Comp. nitrogenados poliméricos, Aa (Asp, Glu) Otros componentes: Iones inorgánicos (Ca, K, etc) Vitaminas: ac. pantoténico, niacina, riboflavina, biotina 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Líquido de maceración del maíz “Subproducto de la obtención industrial del almidón” 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Líquido de maceración del maíz Composición: Fuente de Nitrógeno: 4% N (Aa: Ala, Arg, Glu, Ile, Phe,....) Fuente de Carbono: Ácido láctico (50%) Debido a actividad microbiana Glucosa y otros azúcares Otros componentes: Sales minerales (Ca, P, K.....) Vitaminas (riboflavina, ac. nicotínico, biotina..) Precursores (fenil etil amina) Obtención de Empleo penicilina G 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Harina de soja “Residuo sólido obtenido a partir de la semilla de soja una vez extraido el aceite” Composición: Proteínas: 50% Azúcares (sacarosa, rafinosa, polisacáridos) Aceite residual: 1% Usos: Obtención de antibióticos (fuente de N: 8%) Pienso para animales y fertilizantes 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Sustancias solubles de las destilerías “Residuo de la obtención del alcohol a partir de cereales fermentados” Fuente de N y factores de crecimiento (complejo B) Aceites vegetales Fuente de C y antiespumantes Suero de leche Lactosa y compuestos nitrogenados 4.2. Materias primas utilizadas en la industria Cebada Uva Vino Cerveza Tema 5 Cultivos de microorganismos en la industria 5.1. Cultivo continuo de los microorganismos 5.2. Quimiostatos y turbidostatos 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos 5.4. Aplicaciones 5.1. Cultivo continuo de los microorganismos Crecimiento discontinuo 1. Fase de latencia 2. Fase exponencial 3. Fase estacionaria 4. Fase de muerte Agotamiento algún nutriente (Nutriente limitante) Acumulación de productos de desecho 5.1. Cultivo continuo de los microorganismos Crecimiento discontinuo 1. Fase de latencia 2. Fase exponencial 3. Fase estacionaria 4. Fase de muerte Fermentación discontinua (en “batch”, en lotes) - F. alimentada (feed-batch): obtención penicilinas 5.1. Cultivo continuo de los microorganismos Cultivo continuo (fermentación continua) Quimiostato Turbidostato Reservorio Reservorio Fermentador Fermentador Colector Colector 5.2. Quimiostatos y turbidostatos Quimiostato Reservorio Fermentador Colector 5.2. Quimiostatos y turbidostatos Turbidostato Reservorio Fermentador Colector 5.2. Quimiostatos y turbidostatos Modificaciones del quimiostato básico Reservorio a) Dos etapas b) En serie c) En serie con alimentación en cada etapa Fermentador d) Con retroalimentación Colector 5.2. Quimiostatos y turbidostatos a) Quimiostato en dos etapas Reservorio Colector F1 F2 b) Quimiostato en serie Reservorio Colector F1 F2 F3 F4 5.2. Quimiostatos y turbidostatos c) Quimiostato en serie con alimentación en cada etapa R2 R3 R4 R1 Colector F1 F2 F3 F4 5.2. Quimiostatos y turbidostatos c) Quimiostato en serie con alimentación en cada etapa R2 R3 R4 R1 Colector F1 F2 F3 F4 d) Quimiostato con retroalimentación Reservorio Nutrientes F Colector Células 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos Fermentadores no homogéneos:  Lecho fijo o de relleno  Lecho fluido  Reactores tubulares o tabicados  Cultivo continuo en diálisis  Microencapsulación  Células inmovilizadas 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos Lecho de relleno 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos Lecho fluido Nutrientes 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos Reactores tubulares o tabicados Tubulares Tabicados Nutrientes + células Nutrientes + células 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos Cultivo en diálisis Medio Microorganismo 5.3. Otros sistemas de cultivo continuo: Fermentadores no homogéneos Inmovilización y microencapsulación Inclusión de las células en microcápsulas 5.4. Aplicaciones 1.- Fermentación discontinua (en lotes) Aplicaciones 1a.- Fermentación alimentada 2.- Fermentación continua 2a.- en fermentadores mezclados homogéneamente - Quimiostato: - 2 etapas - en serie - en serie con alimentación - con retroalimentación - Turbidostato 2b.- en fermentadores no homogéneos - Lecho relleno - Lecho fluido - Reactores tubulares o tabicados - Cultivo en diálisis - Microencapsulación Tema 6 Fermentadores I 6.1. Diseño de fermentadores 6.2. Tipos de fermentadores 6.3. Fermentadores de laboratorio y piloto aire salida nutrientes nutrientes toma de muestras agua 6.1. Diseño de fermentadores Esterilidad Temperatura pH Parámetros Entrada y salida de nutrientes a controlar Agitación Gases disueltos Espuma 6.2. Tipos de fermentadores Tipos de fermentadores En base a su tamaño En base a su utilización Fermentadores de laboratorio (0,5-50 litros) Fermentadores piloto (50-1000 litros) Fermentadores industriales (>1000 litros) 6.3. Fermentadores de laboratorio y piloto Fermentadores de laboratorio aire toma de muestras Material nutrientes salida nutrientes Esterilidad Entrada y salida de nutrientes (cultivos continuos) Homogeneidad: aireación y mezcla Temperatura: regulación externa o interna Gases disueltos pH agua Espuma: sustancias antiespumantes 6.3. Fermentadores de laboratorio y piloto Fermentadores de laboratorio Material Esterilidad Entrada y salida de nutrientes (cultivos continuos) Homogeneidad: aireación y mezcla Temperatura: regulación externa o interna Gases disueltos pH Espuma: sustancias antiespumantes 6.3. Fermentadores de laboratorio y piloto Fermentadores de laboratorio 6.3. Fermentadores de laboratorio y piloto Fermentadores piloto Usos: Preparación del inóculo para fermentaciones industriales Producción en pequeña escala Estudio del proceso para aplicación industrial: Escalado 6.3. Fermentadores de laboratorio y piloto Escalado Tema 7 Fermentadores II 7.1. Fermentadores industriales. Tipos 7.2. Control de parámetros 7.3. Inoculación y toma de muestras 7.4. Instrumentación y control 7.5. Recuperación de los productos de fermentación 7.1. Fermentadores industriales. Tipos Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma 7.1. Fermentadores industriales. Tipos Fermentadores industriales Verticales Horizontales 7.1. Fermentadores industriales. Tipos Fermentadores industriales 7.2. Control de parámetros Esterilidad: Se requiere un alto grado de limpieza y asepsia El medio Posibles El inóculo y el proceso de inoculación elementos de contaminación El suministro de aire en un proceso La adición de nutrientes, antiespumantes, etc. fermentativo durante el proceso El fermentador en sí 7.2. Control de parámetros Esterilización del medio de cultivo:  Inyectar vapor directamente al fermentador Estático o “batch”  Resistencia eléctrica dentro del fermentador Esterilización por calor  Inyección de vapor Continua  Intercambiadores de placas Centrifugación Métodos Intercambio iónico mecánicos Filtración 7.2. Control de parámetros  Esterilización por calor estático o “batch” VVVV VVVV Inyección de vapor directamente en el Resistencia eléctrica dentro del fermentador fermentador 7.2. Control de parámetros  Esterilización por calor continua Inyección de vapor Vapor de agua 140 ºC (30-120’’) Entrada Salida Medio cultivo Agua fría Agua fría no estéril enfriamiento precalentamiento contenedor Salida del medio cultivo estéril 7.2. Control de parámetros Intercambiadores de placas (intercambiadores de calor) Medio estéril 120 °C (20-30’’) Vapor 140 °C (30-120’’) Agua fría 3er intercambiador 1er intercambiador 2º intercambiador Preenfriamiento enfriamiento 7.2. Control de parámetros Intercambiadores de placas (intercambiadores de calor) 7.2. Control de parámetros Intercambiadores de placas (intercambiadores de calor) 7.2. Control de parámetros Esterilización del aire: Filtración Algodón Fibra vidrio Resinas Filtros 7.2. Control de parámetros Esterilización de fermentador: 7.2. Control de parámetros Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma 7.2. Control de parámetros Temperatura: Camisa externa Resistencia externa Resistencia interna Varias camisas externas 7.2. Control de parámetros Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura  pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma 7.2. Control de parámetros pH: Ácido Base pHmetro Electrodo 7.2. Control de parámetros Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma 7.2. Control de parámetros Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma 7.2. Control de parámetros Agitación: Fase líquida: sales disueltas, sustratos y metabolitos Fase sólida: células, sustratos insolubles, metabolitos precipitados Fase gaseosa: oxígeno, dióxido carbono, etc. 7.2. Control de parámetros Agitación: Efectos: Dispersión del aire en solución de nutrientes Dispersión de líquidos no miscibles Suspensión de los microorganismos y nutrientes sólidos Homogeneización para igualar Tª, pH, concentración nutrientes 7.2. Control de parámetros Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma Difusor de aire 7.2. Control de parámetros Aireación: Fermentador Filtro Prefiltro Medidor de flujo Intercambiador temperatura Humidificador Separador Compresor Corona aceite aceite difusora 7.2. Control de parámetros Fermentadores industriales Control de los parámetros: Esterilidad Temperatura pH Entrada y salida de nutrientes Agitación Aireación Formación de espuma 7.2. Control de parámetros Formación de espuma: 7.3. Inoculación y toma de muestra 1. Conservación Proceso de 2. Crecimiento fermentación 3. Propagación 4. Fermentación Bacterias 0,1-3 % Actinobacterias 5-10 % Hongos 5-10 % Esporas 1-5 x 105 x litro 7.3. Inoculación y toma de muestra Propagación del inóculo 7.3. Inoculación y toma de muestra Propagación del inóculo 7.3. Inoculación y toma de muestra Fermentación Tamaños de fermentadores Tamaño del Producto fermentador (en litros) Enzimas para diagnóstico, sustancias para 1.000-20.000 biología molecular Algunos enzimas, antibióticos 40.000-80.000 Penicilina, antibióticos aminoglucósidos, 100.000-150.000 proteasas, amilasas, transformación de esteroides, aminoácidos, vino, cerveza 200.000-500.000 Aminoácidos (ácido glutámico), vino, cerveza 7.4. Instrumentación y control  Sensores Parámetros físicos Parámetros químicos Parámetros biológicos Temperatura pH Productos biológicamente activos Presión Oxígeno disuelto Actividad enzimática Consumo de potencia O2 y CO2 en los gases Contenido en DNA y de salida RNA Viscosidad Potencial redox Contenido en NADH2 y ATP Velocidad de flujo Concentración de Contenido en proteína (aire y líquido) sustrato Turbidez Concentración de producto Peso del fermentador Fuerza iónica Ordenadores 7.5. Recuperación de los productos de fermentación Naturaleza del producto final Concentración Recuperación Estabilidad del producto Grado de purificación necesario Localización extra o intracelular Aminoácidos Vitaminas Ácido cítrico Ácidos nucleicos Enzimas extracelulares Enzimas intracelulares Alcohol Sisomicina Penicilina Griseofulvina Estreptomicina 7.5. Recuperación de los productos de fermentación Producto de fermentación Centrifugación Filtración Separación Floculación y coagulación Precipitación Extracción mediante solventes Células Medio libre de células Rotura Extracción Purificación del Purificación del producto producto Tema 8 Producción industrial de biomasa 8.1. Producción industrial de biomasa 8.2. Producción de biomasa por cianobacterias 8.3. Producción de biomasa por hongos 8.4. Producción de biomasa por levaduras 8.5. Producción de biomasa por bacterias 8.1. Producción industrial de biomasa Biomasa Masa celular obtenida a partir del tratamiento de subproductos agrícolas e industriales con microorganismos USOS: Sustrato para la obtención de biocombustibles (ej.: bioetanol) Alimentación humana y animal 8.1. Producción industrial de biomasa Pequeña cantidad: -queso -cerveza -yogur -pan, etc. Microorganismos Suplemento para alimentos convencionales Elevado contenido proteico Biomasa Conjunto de microorganismos que se cultivan y se usan para la nutrición de otros seres vivos 8.1. Producción industrial de biomasa La idea surgió…. Proteína unicelular o proteína Wilson (1966) alimento (SCP) MIT Biomasa microbiana usada como alimento y aditivo para piensos Cianobacterias Microorganismos Hongos útiles Levaduras Bacterias 8.1. Producción industrial de biomasa Ventajas del uso de microorganismos como alimento 1. Elevado contenido proteico : Bacterias : 60-70% Carne: 20% Levaduras: 50% Plantas (soja): 35% 2. Rápida obtención del producto Bacterias Met y levaduras 3. Contienen todos los aa esenciales y vitaminas Cianobacterias Gly/Met 4. Contiene lípidos, azúcares, sales minerales Levaduras Lys/Arg 5. Procesos industriales baratos e independientes de la climatología a partir de materias primas como: hidrocarburos, melazas, líquido de maceración del maíz, líquidos sulfíticos… 8.1. Producción industrial de biomasa Calidad del producto Valor nutritivo Seguridad del producto: * Bajo contenido en ácidos nucleicos No> 3g día * No contener sustancias tóxicas o carcinogénicas procedentes de los sustratos o producidas por microorganismos * Fácilmente digeribles Funcionalidad 8.1. Producción industrial de biomasa 8.2. Producción de biomasa por cianobacterias Cianobacterias Alto porcentaje en proteínas Bajo porcentaje en ácidos nucleicos Fáciles de cultivar Especie más usada para consumo humano y alimento de animales: Arthrospira maxima (Spirulina maxima) Arthrospira maxima 8.2. Producción de biomasa por cianobacterias Cianobacterias Alimento de peces Arthrospira maxima 8.2. Producción de biomasa por cianobacterias Cianobacterias Dietas de adelgazamiento Contenido: Arthrospira maxima Fucus vesiculosus Rica en: Proteínas (60-70 % del peso seco) Vitaminas Minerales Oligoelementos Ácido algínico, 65 % Sensación de saciedad Arthrospira maxima https://www.youtube.com/watch?v=yFRMKdyoSFA 8.2. Producción de biomasa por cianobacterias Spirulina, "super alimento" del Cianobacterias futuro El alga Spirulina es probablemente el alimento sobre el que más investigación se ha llevado a cabo en el último medio siglo. Y todo para que, al final, la ciencia reconociera lo que ya sabían los pobladores de las zonas del planeta donde llevan siglos consumiéndola: que se trata de un alimento no sólo seguro para el consumo humano, sino que, además, es muy adecuado por su gran cantidad de nutrientes esenciales, proteínas, vitaminas, sales minerales y oligoelementos. Ventajas de su cultivo Si se tiene en cuenta que aproximadamente el 95% del agua del planeta es salada y que Spirulina crece bien en ella, este alga podría convertirse en un alimento que aliviara la situación de hambruna de millones de personas. Además, una explotación de Spirulina es una máquina productora de alimento vegetal que no deteriora el medio ambiente. Cultivada en estanques de poco fondo, el alga puede duplicar su biomasa en periodos de dos a cinco días. Esta extraordinaria productividad supone un rendimiento en proteínas que supera en 20, 40 y 400 veces el que se obtendría dedicando la misma superficie a producir soja, maíz o vacuno, respectivamente. Por otro lado, Spirulina se desarrolla en estanques de agua salobre o alcalina construidos en suelos estériles. De ese modo permite incrementar la producción de alimentos sin necesidad de talar árboles. “Discovery Salud” 8.3. Producción de biomasa por hongos Hongos Fermentación continua Glucosa, sales minerales, biotina, amonio pH 6,0 Fusarium Tª 30 ºC venenatum 1 Kg Glucosa 1 Kg peso húmedo de micelio fúngico 136 g proteína 8.3. Producción de biomasa por hongos Hongos Proteína desecada + saborizante 8.3. Producción de biomasa por hongos Marlow Foods, Ltd (1985) https://www.dailymotion.com/video/x49020y 8.4. Producción de biomasa por levaduras Levaduras Saccharomyces cerevisiae Candida utilis Saccharomycopsis lipolytica 8.4. Producción de biomasa por levaduras Levaduras Melazas Ácido fosfórico Sulfato amónico 8.5. Producción de biomasa por bacterias Bacterias Corto tiempo de generación Ventajas Versatilidad de sustratos Sustratos 1) Muy soluble en agua Metanol 2) No explosivo 3) Fácil eliminación de los productos celulares Pseudomonas methylotrophus PRUTEEN® “Imperial Chemical Industries “ Tema 9 Introducción a la producción de antibióticos 9.1. Producción industrial de antibióticos 9.2. Microorganismos productores de antibióticos 9.3. Métodos generales de obtención de antibióticos 9.4. Importancia económica 9.5. Antibióticos semisintéticos 9.6. Antibióticos híbridos 9.1. Producción industrial de antibióticos Antibióticos Productos del metabolismo secundario de microorganismos que inhiben el crecimiento de otros organismos, incluso a bajas concentraciones Historia Louis Pasteur Sir Alexander 2ª Guerra Mundial (1887) Fleming (1929) 9.1. Producción industrial de antibióticos Aplicaciones: Agentes antimicrobianos Antitumorales Enfermedades de plantas Selectivos a bajas concentraciones Poco tóxicos animales sangre caliente Degradados por microorganismos del suelo 9.1. Producción industrial de antibióticos Aplicaciones: Conservantes de alimentos Piramicina Tilosina Nisina Clortetraciclina Estimulantes crecimiento animal (1-10 mg/kg peso) Medicina veterinaria Herramientas en Bioquímica y Biología Molecular 9.2. Microorganismos productores de antibióticos Microorganismos productores: Hongos Bacterias Actinobacterias Penicillium Bacillus Streptomyces Cephalosporium 9.3. Métodos generales de obtención de antibióticos Diferencias entre la producción de metabolitos primarios y secundarios 9.3. Métodos generales de obtención de antibióticos Características comunes a todos los procesos: Fermentaciones aerobias Procesos bien conocidos, protegidos por patentes Importante controlar la esterilidad Coste añadido de purificación del antibiótico 9.4. Importancia económica Importancia económica de los antibióticos Muy importante a nivel industrial Genera ventas de billones de dólares Comercializados ≈ 150 9.5. Antibióticos semisintéticos ¡¡¡Búsqueda de nuevos antibióticos!!! Resistencias Enfermedades nuevas sin solución Mejores propiedades Menos tóxicos Otras vías administración Más activos Más selectivos… ANTIBIÓTICOS 2 pasos: SEMISINTÉTICOS Estructura general: Biosíntesis Posterior modificación química 9.6. Antibióticos híbridos ANTIBIÓTICOS HÍBRIDOS Técnicas de recombinación Introducir en una cepa microbiana los genes biosintéticos de antibióticos de varios organismos Distintos radicales o radicales en distinta orientación Mayor efectividad terapéutica 9.6. Antibióticos híbridos Tema 10 Producción de penicilinas y cefalosporinas 10.1. Producción industrial de antibióticos β- lactámicos 10.2. Penicilinas 10.3. Cefalosporinas 10.1. Producción industrial de antibióticos β-lactámicos Antibióticos β- lactámicos 10.2. Penicilinas PENICILINA Sir Alexander Fleming (1881-1955) 10.2. Penicilinas 1929 Penicillium notatum 10.2. Penicilinas 1940 Ernest Chain Howard Florey 10.2. Penicilinas 10.2. Penicilinas 10.2. Penicilinas 10.2. Penicilinas The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1945 "for the discovery of penicillin and its curative effect in various infectious diseases" 10.2. Penicilinas Cultivo en superficie Frascos Roux 10.2. Penicilinas Cultivo sumergido (fermentadores) Penicillium notatum Penicillium chrysogenum 10.2. Penicilinas Estructura química de las penicilinas 6 R Cadena lateral Anillo β- Anillo Resto acilo lactámico tiazolidínico Ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) 10.2. Penicilinas Penicilinas naturales Estructuras básicas Ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) Bencilpenicilina Penicilina G 10.2. Penicilinas Penicilinas naturales Estructuras básicas 10.2. Penicilinas Penicilinas naturales Propiedades: Efectivas contra numerosas bacterias Gram-positivas Lábiles en medio ácido Pueden ser inactivadas por hidrólisis del anillo β- lactámico por las penicilinasas Baja toxicidad (grandes dosis) Solo un pequeño porcentaje de pacientes desarrollan alergias (0,5-2 %) 10.2. Penicilinas Penicilinas Cadena lateral: biosintéticas Bencilpenicilina (Penicilina G) Ácido lábil, sensible a β-lactamasas, baja Ácido fenilacético actividad contra G (-) Fenoximetilpenicilina (Penicilina V) Resistente a los ácidos, las demás propiedades Ácido fenoxiacético como la penicilina G, relativamente inactiva frente a gonococos y Haemophilus  Alilmercaptometilpenicilina H2C=CH-CH2-S-CH2-COOH (Penicilina O) Ácido alilmercaptoacético Propiedades alérgicas reducidas 10.2. Penicilinas Penicilinas semisintéticas Amoxiciclina p-hidroxifenilglicina 10.2. Penicilinas Penicilinas semisintéticas Propiedades: Espectro de acción más amplio Estabilidad a la acidez Resistencia a las β-lactamasas Mayor efectividad antimicrobiana 38 % medicina humana Penicilinas 12 % medicina veterinaria 43 % m. partida P. semisintéticas 10.2. Penicilinas Biosíntesis de penicilina en Penicillium chrysogenum ACV Sintetasa IPN Sintetasa Penicilina Ácido fenilacético activado transcetilasa 10.2. Penicilinas 120 UI/ml NRRL-1951 (1943) Desarrollo del proceso y mejora de cepas 250 UI/ml NRRL-1951-B25 R-X 1. Aislamiento de un hongo que inhibe 500 UI/ml X-1612 el crecimiento microbiano UV 900 UI/ml WIS Q-176 2. Identificación del hongo como UV Penicillium notatum 3. Identificación (penicilina) y Mstz Ng cuantificación (2 UI/ml) de la sustancia WIS 51-20 producida UV 4. Desarrollo de un medio de cultivo E-1 selectivo y un medio enriquecido para Mstz Ng el crecimiento de Penicillium E-3 5. Usando los medios enriquecidos y selectivos se aisla un hongo identificado como Penicillium Mstz Ng chrysogenum que produce hasta 120 UI/ml de penicilina 6. Tras diferentes rondas de mutagénesis y selección se consigue 12.000 UI/ml E-15.1 una cepa hiperproductora con un rendimiento de 12.000 UI/ml 10.2. Penicilinas Penicillium chrysogenum Desarrollo de (1943) cepas 2 UI/ml 85.000 UI/ml Objetivos Mayor rendimiento Mejora en la fermentación Mejora en recuperación del producto 10.2. Penicilinas Regulación de la biosíntesis de penicilina Homocitrato sintasa -Lisina Ácido L-α-aminoadípico -Fosfato (-) -Glucosa Penicilina [Lisina] 10.2. Penicilinas Métodos de producción Adición de sustratos (líquido Oxígeno (aireación) maceración del maíz, harina soja, glucosa, fosfatos, ac. fenilacético) Tª 25-27 ºC pH 6’5 Penicilina G 5-103/ml (40.000-200.000 l) sódica 10.2. Penicilinas 10.2. Penicilinas Resumiendo… Naturales: la fermentación se realiza sin adición de precursores Biosintéticas: la fermentación se controla Tipos de añadiendo precursores de la cadena lateral penicilinas Semisintéticas: núcleo central de las penicilinas (6-APA) acilado químicamente con distintos compuestos 10.2. Penicilinas Obtención de penicilinas semisintéticas 6 Cadena lateral (6-APA) Penicilina acilasa 6 C6H5-CH2-COOH + 2 Ácido fenilacético 10.2. Penicilinas Obtención de penicilinas semisintéticas Penicilina 6-APA + cadena lateral GóV Penicilina acilasa Adición por síntesis química de cadena lateral Penicilina semisintética Escherichia coli (G) Alcaligenes faecalis (G) Penicillium chrysogenum (V) Streptomyces lavendulae (V) 10.2. Penicilinas 10.3. Cefalosporinas Cefalosporinas Cephalosporium acremonium Giuseppe Brotzu 1945 10.3. Cefalosporinas Cefalosporina C 1953 Cephalosporium acremonium Cefalosporina C Cefalosporina D Penicilina N 1971 Cefamicinas (7-metoxi-cefalosporinas) Streptomyces sp. Nocardia lactamdurans 10.3. Cefalosporinas Estructura química de las cefalosporinas 10.3. Cefalosporinas Cefalosporinas naturales y semisintéticas Propiedades: Poco tóxicas Amplio espectro 29% mercado Usos terapéuticos: derivados semisintéticos 10.3. Cefalosporinas 10.3. Cefalosporinas Núcleo cefalosporínico 10.3. Cefalosporinas Núcleo cefalosporínico 10.3. Cefalosporinas Biosíntesis de cefalosporina C por Cephalosporium acremonium Expandasa Acetiltransferasa 10.3. Cefalosporinas Regulación de la biosíntesis de cefalosporinas -Glucosa y maltosa -Fosfato -Lisina -Nitrógeno 10.3. Cefalosporinas Métodos de producción de Nutrientes: cefalosporinas - líquido maceración del maiz - extracto de carne - sacarosa - glucosa - acetato amónico pH: 7 Tª: 24-28 ºC Fase crecimiento: 90 h (gran aporte O2) Fase producción: 90-160 h 10.3. Cefalosporinas Obtención de cefalosporinas Fusarium semisintéticas Rhodotorula Trigonopsis 7-ACA + adición química de radicales Pseudomonas Cefalosporinas Acinetobacter semisintéticas Tema 11 Producción de tetraciclinas 11.1. Producción industrial de antibióticos derivados del acetato. Tetraciclinas 11.2. Biosíntesis de tetraciclinas 11.3. Producción industrial de clortetraciclina 11.4. Producción industrial de tetraciclina 11.1. Producción industrial de antibióticos derivados del acetato. Tetraciclinas Clortetraciclina 1945 Benjamin M. Duggar Streptomyces aureofaciens 11.1. Producción industrial de antibióticos derivados del acetato. Tetraciclinas Streptomyces spp. productores de tetraciclinas 11.1. Producción industrial de antibióticos derivados del acetato. Tetraciclinas Estructura química de las tetraciclinas Propiedades: Amplio espectro de acción Inhiben la síntesis proteica Sistema de anillos naftaceno 11.1 Producción industrial de antibióticos derivados del acetato. Tetraciclinas Estructura de tetraciclinas de importancia clínica Medicina humana y veterinaria Piensos para aves y cerdos Conservación de pescados y carnes 11.2. Biosíntesis de tetraciclinas Glucosa E: Antraceno sintetasa Biosíntesis de Malonamoil Co A tetraciclinas por S. aureofaciens Regulación: -Fosfatos -Glucosa y otros Clortetraciclina 11.2. Biosíntesis de tetraciclinas Desarrollo de cepas 11.3. Producción industrial de clortetraciclina Esquema de producción de clortetraciclina por S. aureofaciens 11.4. Producción industrial de tetraciclina Métodos de obtención de tetraciclina Mediante un proceso químico a partir de clortetraciclina Fermentación en medios de cultivos libres de cloro Por fermentación añadiendo al medio inhibidores de la reacción de cloración Utilizando mutantes bloqueados en la reacción de cloración Tema 12 Producción de bacitracinas 12.1. Producción industrial de antibióticos peptídicos. Bacitracinas 12.2. Biosíntesis de bacitracina 12.3. Producción industrial de bacitracina A 12.1. Producción industrial de antibióticos peptídicos. Bacitracinas Historia 1943 Margaret Tracy Bacillus licheniformis 12.1. Producción industrial de antibióticos peptídicos. Bacitracinas Antibióticos peptídicos producidos comercialmente 12.1. Producción industrial de antibióticos peptídicos. Bacitracinas Estructura química de la bacitracina 12.2. Biosíntesis de bacitracina Biosíntesis de bacitracina “Modelo del tiomolde” 12.2. Biosíntesis de bacitracina Sintetasa de bacitracina Activación de los Aa ATP, Mg2+ Aminoacil adenilatos Unión a grupo tiol específico 12.2. Biosíntesis de bacitracina Transferencia del primer aa al siguiente Alargamiento de la cadena peptídica (NH2 COOH) 12.2. Biosíntesis de bacitracina Ciclación de la cadena peptídica (complejo multienzimático) ¿¿Formación del anillo tiazolidínico?? 12.3. Producción industrial de bacitracina A Método de producción industrial Desarrollo de cepas y optimización del proceso 13 mg/L 9 g/L Tema 13 Producción de metabolitos primarios 13.1. Producción industrial de metabolitos primarios 13.2. Ácidos orgánicos 13.3. Aminoácidos 13.4. Vitaminas 13.5. Nucleótidos y nucleósidos 12.6. Exopolisacáridos 13.1. Producción industrial de metabolitos primarios Metabolitos primarios de interés industrial Ácidos orgánicos Aminoácidos Vitaminas Nucleótidos y nucleósidos Polisacáridos Alcoholes y cetonas Metabolitos primarios Aquellos productos que se producen como consecuencia del metabolismo primario de las bacterias Mayoritariamente intracelulares 13.2. Ácidos orgánicos Ácidos orgánicos Aditivos en Ia industria de alimentos Aplicaciones Piensos para animales Ácido cítrico Ejemplos Ácido acético Ácido láctico 13.2. Ácidos orgánicos Ácidos orgánicos Ácido cítrico Historia Siglo XIX: sustancia natural de las plantas 1893: producido por hongos filamentosos 1923: primera fermentación en superficie 1930: fermentación en cultivos sumergidos 13.2. Ácidos orgánicos Ácidos orgánicos Ácido cítrico Cepa productora Aspergillus niger Fermentación sumergida, aerobia Proceso Melazas industrial Baja concentración de fosfatos pH: 2,0 o inferior Alimentos y bebidas (65%) Aplicaciones Farmacéutica (10%) Química (25%) 13.2. Ácidos orgánicos SECTOR USO Usos del ácido cítrico en la Bebidas Saborizante y regulador de pH; incrementa la efectividad de los conservantes microbianos. Industria de los alimentos Dulces y conservas Acidulante y regulador de pH para lograr una óptima gelificación. Caramelos Acidulante y regulador de pH con el objetivo de alcanzar la máxima dureza de los geles. Verduras procesadas En combinación con ácido ascórbico, previene la oxidación. Alimentos congelados Ayuda a la acción de los antioxidantes, inhibe el deterioro del sabor y el color. Frutas y hortalizas enlatadas Disminuye el pH, al actuar como quelante; previene la oxidación enzimática y la degradación del color, resalta el sabor. Aceites y grasas Previene la oxidación. Confitería y repostería Se utiliza como acidulante, resaltador de sabores y para optimizar las características de los geles Quesos pasteurizados y En forma de sal, como emulsificante y texturizante procesados Productos de la pesca Para bajar el pH en presencia de otros conservantes o antioxidantes. Carnes Se utiliza como auxiliar del procesado y modificador de textura. Lácteos Estabilizante en cremas batidas 13.2. Ácidos orgánicos Ácidos orgánicos Ácido láctico Cepa productora Lactobacillus bulgaricus Primera producción microbiana de un ácido Proceso orgánico en 1880 industrial Sustrato: suero de la leche Actualmente los métodos químicos son muy competitivos Industria alimentaria Aplicaciones la acidez de los alimentos y bebidas Industria cosmética 13.2. Ácidos orgánicos En pro- Rendi- Acido Usos del Organismo ducción Sustrato Proceso miento orgánico producto comercial % Acido fumárico Rhizopus sp., Glucosa 3 días, 65 Resina Candida Si N-Alcanos 33ºC 84 7 días, 30ºC Acido propiónico Propioni- Lactosa 8-12 días 60 Perfumes bacterium Si Glucosa 30ºC Fungicida Almidón Acido Leuconostoc Acido 24 h 99 Alimentos málico brevis, No fumárico Candida N-Alcanos 72 Acido α-ceto- Candida N-Alcanos 40 h 67 glutárico Aerobacter No Acido 46 glutámico Acido 5-ceto- Acetobacter glucónico suboxydans Si Glucosa 5-6 días 85 Acido L-tartárico Acido 2-ceto- Serratia Acido glucónico marcescens Si Glucosa 16 h 95-100 isoascórbico 13.3. Aminoácidos Aminoácidos  Extracción de aa de hidrolizados de Métodos de proteínas producción de  Síntesis química aminoácidos Fermentación directa  Producción microbiológica Transformación microbiana Enzimas o células inmovilizadas L-cisteina Glicocola L-cistina D,L-metionina L-leucina D,L alanina L-asparagina D,L-triptófano L-tirosina 13.3. Aminoácidos Aminoácidos Aminoácidos utilizados en la industria Aminoácido Usos en alimentación de alimentos Refuerzan el sabor L-Glutamato Ablandan la carne Mejoran sabor de zumos de L-Aspartato y D,L-Ala fruta Mejora calidad del pan durante la cocción L-cisteína Actúa como antioxidante en los jugos de fruta Antioxidante L-Triptófano + L-Histidina Evita que la leche en polvo se enrancie Edulcorante bajo en calorías en Aspartamo (L-Phe + L-Asp) bebidas refrescantes no alcohólicas  Usos en medicina  Usos en cosmética 13.3. Aminoácidos  Producción microbiológica Fermentación directa Umami 13.3. Aminoácidos Ácido glutámico Historia Japón (1908) Cepa productora Corynebacterium glutamicum (1957) Aplicaciones Industria alimentos (65%) Aditivos piensos (31%) Medicina, cosmética e Industria química (4%) 13.3. Aminoácidos Aminoácidos Cepas para la producción de aminoácidos Corynebacterium Cepas silvestres: Microbacterium Produción de ácido glutámico: Brevibacterium Arthrobacter Cepas mutantes: Produción de lisina: Brevibacterium flavum 13.3. Aminoácidos Cepas para la Aminoácidos producción de aminoácidos Cepas mutantes: Metionina Produción de lisina: Treonina Isoleucina Brevibacterium flavum Aspartato Aspartil-P Aspartato semialdehído Aspartatoquinasa Diaminopimelato (-) Lisina Inhibición por retroalimentación 13.3. Aminoácidos Aminoácidos  Producción microbiológica Fermentación directa Transformación microbiana de productos intermediarios baratos Glicina + HCHO L-Serina Serina hidroximetil transferasa Klebsiella aerogenes Uso de enzimas o células inmovilizadas 13.3. Aminoácidos Aminoácidos  Producción microbiológica Uso de enzimas o células inmovilizadas Usando aminoacilasas específicas: Producción de: L-Ala L-Met L-Phe L-Trp L-Val 13.3. Aminoácidos Aminoácidos  Producción microbiológica Uso de enzimas o células inmovilizadas Usando aminoácido deshidrogenasas específicas: Producción de L-aminoácidos: NH3 + α-cetoácido L-aminoácido L-aminoácido deshidrogenasa 13.3. Aminoácidos Aminoácidos  Producción microbiológica Uso de enzimas o células inmovilizadas Utilizando hidantoinas para obtener D o L-aminoácidos Residuo carbamoilo D,L-hidantoína D o L carbamoilAa + D-L-hidantoinasa D-L-carbamoilasa D o L- aa L-hidantoinasas: Unas pocas bacterias Usos: Ejemplo: Corynebacterium ammoniagenes  Producción: D-hidantoinasas: Numerosos microorganismos -L-aa -D-L-carbamoilAa Ejemplo: - actinobacteria -D-aa - levaduras - Aspergillus 13.3. Aminoácidos Aminoácidos  Producción microbiológica Uso de enzimas o células inmovilizadas Mezcla Ejemplo: racémica L-5-hidroxifenilhidantoína D-5-hidroxifenilhidantoína D-hidantoinasa Proceso químico y enzimático para la producción de D-p-hidroxifenilglicina a partir de DL-5-p- hidroxifenilhidantoina D-carbamoilasa D-p-hidroxifenilglicina 13.3. Aminoácidos Penicilinas Aminoácidos semisintéticas Amoxicilina p-hidroxifenilglicina 13.3. Aminoácidos Obtención de penicilinas Aminoácidos semisintéticas Penicilina 6-APA + cadena lateral GóV Penicilina acilasa Adición por síntesis química de p-hidroxifenilglicina AMOXICILINA (Penicilina semisintética) 13.4. Vitaminas Vitaminas Métodos microbiológicos β-caroteno (Provitamina A) Vitamina B12 Riboflavina (B2) Tiamina (B1)

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