Enzimas de Restricción y Clonación Molecular

Enzimas de restricción

• Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de nucleótidos en el ADN y cortan la molécula en ese punto (sitio de restricción).
• El corte se realiza por la ruptura de enlaces fosfodiéster en las dos hebras del ADN.
• Existen dos tipos de extremos generados: romos (de doble cadena) y cohesivos (de una sola cadena).
• Los fragmentos de ADN generados se pueden unir mediante enzimas llamadas ligasas.

Clonación molecular

• Permite la obtención de grandes cantidades de genes específicos o fragmentos cromosómicos de forma pura.
• Las etapas de la clonación molecular incluyen:
  • Aislamiento del fragmento de ADN de interés.
  • Inserción del fragmento en un vector (plásmido o virus).
  • Introducción del vector en una célula huésped.
  • Selección de células huésped que contienen el fragmento de ADN.
  • Multiplicación de las células huésped y obtención del fragmento de ADN clonado.

ADN Sintético

• Segmentos de ADN de cadena sencilla que se sintetizan de forma automatizada.
• Se requiere el conocimiento de la secuencia del ADN que se va a sintetizar.
• La síntesis del ADN se realiza en fase sólida, donde el primer nucleótido se fija a un soporte sólido.
• El ADN sintético tiene múltiples aplicaciones en ingeniería genética.

Mutagénesis dirigida

• Inducción de mutaciones precisas en sitios específicos de los genes.
• Se realiza in vitro.
• Permite obtener microorganismos que producen proteínas diferentes a las cepas silvestres, con propiedades predecibles.

Sistema CRISPR-Cas

• Acrónimo de "Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas" (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats).
• Descubierto por Francis Mojica en la bacteria Haloferax mediterranei.
• Una herramienta de edición genética que permite modificar secuencias de ADN de forma precisa y eficiente.

Producción de proteínas de mamíferos por microorganismos

• Las células procariotas no pueden procesar el ARN premensajero (ARNm) de eucariotas, debido a la presencia de intrones (secuencias no codificantes).
• Para producir proteínas de mamíferos en organismos procariotas, se necesitan dos alternativas:
  • Obtener genes sintéticos sin intrones.
  • Eliminar los intrones del ARNm mediante técnicas de ingeniería genética.

Producción de penicilina

• La penicilina se produce por el hongo Penicillium chrysogenum.
• Se ha desarrollado y mejorado la producción de penicilina mediante técnicas de mejora de cepas y optimización del proceso de fermentación.

Tipos de penicilinas

• Penicilinas naturales: se producen sin la adición de precursores.
• Penicilinas biosintéticas: se producen controlando la adición de precursores de la cadena lateral.
• Penicilinas semisintéticas: se obtienen modificando químicamente el núcleo central de la penicilina (6-APA) con diferentes compuestos.

Obtención de penicilinas semisintéticas

• Se utiliza la enzima penicilina acilasa para obtener 6-APA (ácido 6-aminopenicilánico).
• Se acopla químicamente la cadena lateral deseada al 6-APA para obtener diferentes penicilinas semisintéticas.

Cefalosporinas

• Descubiertas por Giuseppe Brotzu en Cephalosporium acremonium en 1945.
• Se han desarrollado diferentes tipos de cefalosporinas, las naturales y las semisintéticas.
• Poseen un amplio espectro de acción antibacteriana y son poco tóxicas.
• Se utilizan ampliamente en el tratamiento de infecciones.

Aminoácidos

• Se pueden producir mediante la utilización de enzimas o células inmovilizadas.
• La producción de L-aminoácidos se realiza con aminoácido deshidrogenasas específicas.
• La producción de D o L-aminoácidos se puede realizar utilizando hidantoinas, por medio de D-L-hidantoinasa o D-L-carbamoilasa.

Producción de D-p-hidroxifenilglicina (D-PHG)

• La D-PHG es un aminoácido que se utiliza en la síntesis de medicamentos.
• Se puede producir mediante un proceso químico y enzimático a partir de DL-5-p-hidroxifenilhidantoína.
• Se emplean D-hidantoinasa y D-carbamoilasa para obtener D-PHG.