Marcadors genètics PDF

TEMA 7. Marcadors genètics Genòmica i millora genètica Genòmica i millora genètica Tema 7. Marcadors genètics 1 Marcadors genètics, conceptes generals Un marcador genètic és un locus ma...

TEMA 7. Marcadors genètics Genòmica i millora genètica Genòmica i millora genètica Tema 7. Marcadors genètics 1 Marcadors genètics, conceptes generals Un marcador genètic és un locus marcador que s’utilitza per indicar- nos la presència de l’al·lel que controla la diferència fenotípica que Què és un marcador busquem o per marcar un altre locus pròxim al que controla el genètic? caràcter d’interès. El marcador genètic generalment no representa el gen diana, sinó que actua com a “bandera” o “etiqueta” (marcador lligat). El marcador genètic ha de co-segregar, amb la mínima recombinació possible, amb el gen que volem seguir, , el gen diana, i per tant, ha de estar localitzat molt pròxim a aquest gen (estretament lligats) Els marcadors en sí no afecten el fenotip del caràcter d’interès, són fenotípicament neutres, només estan a prop o “lligats al gen que controla el caràcter d’interès Característiques: Conceptes: Polimòrfics Marcador genètic Heretables mendelianament Co-segregar Co-dominants (distingir AA, Aa, aa) millor que dominants (no Co-dominància permeten distingir AA de Aa) No influenciats per l’ambient Fàcils de detectar en etapes primerenques de l’individu Genòmica i millora genètica Tema 7. Marcadors genètics 2 Marcadors genètics, un exemple d’un locus marcador El rovell (Puccinia graminis) és un dels principals patògens que afecten al cultiu del blat (Triticum aestivum). La resistència a Puccinia graminis està codificada pel gen mendelià Yr10. El color vermell de la gluma (bràctea de l’espiga) en el blat està determinat pel gen Rg-B1, que es troba lligat amb el gen Yr10 (2cM) (Metzger et al. (1970) DOI: 10.2135/cropsci1970.0011183X001000050035x). El fenotipat del blat per la resistència al rovell és molt costós, doncs requereix inoculació del patògen i monitorar les condicions climàtiques. El fenotipat del color de la gluma és Figura. Color de la gluma en el blat. El gen Rg-B1 barat i no influenciat per l’ambient. codifica per color vermell (Abrouk et al. (2021) DOI: 10.1038/s42003-021-01908-6) Si tenim una varietat resistent al rovell + gluma vermella i una sensible + gluma blanca, podem fer servir el color de la gluma per seguir en la descendència el gen de resistència? Nota: evidentment, per emprar el color de la gluma com a marcador de resistència a Puccinia, necessitem que hi hagi polimorfisme en ambdós caràcters en la població de millora i conèixer l’associació que tenim en els nostres materials. Figura. Simptomatologia del rovell del blat, causat per Puccinia graminis. Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 3 Marcadors genètics Marcadors Genètics Marcadors Marcadors Morfològics Moleculars Color/forma fruit/fulla Marcadors Marcadors de DNA Bioquímics Proteïnes reserva Isoenzims No basats Basats en PCR en PCR RFLP Seqüència Seqüència coneguda desconeguda SSRs, SNPs, CAPs RAPD, AFLP, S-SAP SCAR, STS Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 4 Marcadors genètics Morfològics Tipus de marcadors Els marcadors morfològics són característiques fenotípiques fàcilment detectables genètics Els marcadors morfològics controlats per un sol locus poden ser emprats com a marcadors genètics si la seva expressió és primerenca, reproduïble en qualsevol (a) Morfològics ambient i estan estretament lligats amb un caràcter d’interès econòmic. (b) Bioquímics Avantatges: fàcil identificació sense necessitats laboratori (c) Moleculars (DNA) Desavantatges: poc polimòrfics / escassos / en molts casos influïts per l’ambient Genòmica i millora genètica Tema 7. Marcadors genètics 5 Marcadors genètics Bioquímics Tipus de marcadors Són els primers marcadors químics que es van detectar. genètics S’observen quan un extracte de proteïna d’un teixit es sotmet a electroforesi. Si existeix algun canvi en la composició dels aminoàcids o en l’estructura de la proteïna apareixen (a) Morfològics bandes a diferent altura del gel, degut a la seva diferent mobilitat electroforètica. (b) Bioquímics Són marcadors co-dominants. (c) Moleculars (DNA) Avantatges: extracció i anàlisi de proteïnes relativament senzill / baix cost / Desavantatges: Limitat en nombre: no permeten cobrir tots els loci del regne vegetal. Tipus: Proteïnes d'emmagatzematge en les llavors (albúmines, faseolines,...) Isoenzims: variants d’un enzim (= expressió directa d’una sèrie al·lèlica) Figura. Variació isoenzimàtica en les alcohol deshidrogenases de Drosophila (Batterham et al. (1983) DOI: 10.1016/0012- 1606(83)90172-0 ) Genòmica i millora genètica Tema 7. Marcadors genètics 6 Marcadors bioquímics: proteïnes de la llavor Un exemple de l’ús de les proteïnes de reserva de la llavor com a marcadors en estudis filogenètics el trobem en l’origen de les varietats tradicionals de mongeta de la Península Ibèrica. Península Ibèrica: origen majoritari andí (faseolina T). Faseolina S Catalunya: origen majoritari mesoamericà (faseolina S). Faseolina T Figura. Diversitat en la forma i el color de la llavor en les varietats tradicionals de mongeta espanyoles (Rivera et al. (2018) DOI: 10.3389/fpls.2018.01642). Figura. Centres de domesticació de Phaseolus vulgaris al continent americà: centre-Amèrica i regió Andina Perú-Equador (Rendón-Anaya et al. (2017) DOI: 10.1186/s13059-017-1190-6). Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 7 Marcadors bioquímics: isoenzims Els isoenzims es defineixen com proteïnes que tenen la mateixa funció catalítica (i.e. actuen sobre el mateix substrat) però que difereixen en la seqüència d’aminoàcids. Es poden separar mitjançant electroforesi, doncs la seva migració és diferent segons la càrrega (+ -) i el pes molecular. Figura. El locus que controla la resistència a nematodes (Mi) està lligat al locus Aps- 1 de fosfatasa àcida. Per tant els gens de resistència a nematodes i el Aps-1 co- segreguen i poden fer-se servir per fer millora assistida per marcadors moleculars (Cap et al. (1992) DOI: 10.1002/elps.1150130161). Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 8 Marcadors genètics Moleculars de DNA Tipus de marcadors Són marcadors basats en la seqüència de nucleòtids del DNA, és a dir que són sensibles als polimorfismes del DNA. Van suposar una revolució en la genètica i la millora. genètics Actualment permeten tenir marcadors directes del polimorfisme responsable del (a) Morfològics fenotip que estem seleccionant. Anteriorment els marcadors eren aproximacions als loci (b) Bioquímics d’interès per lligament. (c) Moleculars (DNA) Característiques: Presents en gran nombre, en teoria sense límit Polimòrfics (presenta variación en la secuencia de nucleótidos entre diferentes individuos o poblaciones) No depenen del teixit (cada cèl·lula conté el mateix DNA) Són neutres (Lliures d’efectes ambientals i de l’estat de desenvolupament) Fàcils i econòmics de detectar El DNA es pot extreure d’una petita mostra de teixit El DNA es pot emmagatzemar durant anys Els marcadors moleculars estan basat en (a) enzims de restricció i/o (b) PCR. Els marcadors moleculars es visualitzen amb diferents tècniques: Electroforesi DNA, Seqüenciació, Real-Time PCR (HRM, High Resolution melting), etc... Genòmica i millora genètica Tema 7. Marcadors genètics 9  Marcadors moleculars de DNA: Tècniques de Detecció Enzims de Restricció PCR Enzims produïdes per bactèries que reconeixen una Mètode de biologia molecular per obtenir un gran seqüència específica de nucleòtids del DNA (diana número de còpies (amplicons) d’un fragment de de restricció/seqüència de reconeixement) i DNA particular. produeixen talls en el DNA (fragments de restricció). Figura. Enzims de restricció més comuns, amb les seves seqüències de reconeixement, els patrons de tall i el seu origen (Klug et al. (2006) Conceptos de genética, 8ª ed.). https://www.genome.gov/genetics-glossary/Polymerase-Chain-Reaction Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 10  Marcadors moleculars de DNA: Tècniques de Detecció Electroforesi: tècnica que permet Seqüenciació clàssica: tècnica clàssica que permet separar el DNA en base a la seva mida obtenir seqüència de DNA i detectar polimorfismes i càrrega elèctrica > genera un patró > s’analitza un cromatograma de bandes de mida diferent Mètode Sanger (Cromatograma) Analitzadors genètics (ABIPRISM, LI-COR): Dispositius Seqüenciació massiva (NGS, Next Generation que utilitzen tecnologies com l'electroforesi capil·lar Sequencing): tècnica moderna que permet analitzar per a la seqüenciació i l'anàlisi de fragments de tot el genoma o regions específiques amb molta DNA, permetent la detecció de polimorfismes i profunditat, detectant múltiples polimorfismes altres variacions genètiques. simultàniament Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 11 Marcadors moleculars: tipus MARCADORS CODOMINANTS I DOMINANTS Marcador codominant: Marcador dominant: o pot diferenciar entre o no pot diferenciar entre homozigots i heterozigots. homozigots i heterozigots o Indica diferències en funció de o Indica la diferència en funció de la la mida presència o absència Mina, Usha & Kumar, Pranav. (2014). Biotechnology A problem approach. Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 12 Marcadors moleculars: tipus Molta quantitat de DNA Consumeix molt de temps PCR/Enzim Tipus de marcador molecular Amplificació Co-dominància restricció Restriction Fragment Length Seqüencia Enzim Sí No PCR Polymorphism (RFLPs) coneguda restricció Cleaved amplified polymorphic PCR + Ez Sí sequences (CAPs) restricció Short Sequence Repeat o microsatèl·lits Seqüència Sí PCR (SSRs) coneguda (amplificació Sí Single-nucleotide polymorphism (SNPs) específica) PCR Sequence Characterized Amplified PCR Sí PCR Region (SCAR) Random Amplification of Polymorphic Seqüencia no No PCR DNA (RAPDs) coneguda Amplified Fragment Length (amplificació a Ez restricció l’atzar) No Polymorphism (AFLPs) + PCR Nota: amb el progrés de les tècniques de seqüenciació massiva (-òmiques) tots els marcadors han quedat obsolets, i actualment es fan servir principalment els SNPs. I SSRs Poca quantitat DNA Resultats ràpids de moltes mostres Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 13 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) Publicat per primera vegada el 1982 (Hamada et al. 1982) Seqüències d'1 a 6 nucleòtids repetides en tandem S’amplifiquen per PCR utilitzant cebadors específics que flanquegen la seqüència SSR Els microsatèl·lits muten a una taxa elevada guanyant o perdent unitats repetides (⇒ altament polimòrfics) Codominant: permeten detectar i diferenciar entre els dos al·lels presents en un individu heterozigot. Multi-al·lèlic: poden tenir múltiples formes (al·lels) en una població. Molt específics I robustos Es poden detector per Electroforesi, Seqüenciació I flourescència. Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 14 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Exemple de detecció de SSR per Electroforesi en gel: Les diferències en la longitud dels fragments d'ADN corresponen al nombre de repeticions, que es poden visualitzar com bandes separades al gel. Marcador BSAT1.024 (AG)25 Marcador MSAT3.1 (GA)28 Marcador MSAT5.22 (TA)16 Polymorphism obtained with three SSR markers visualized using agarose gel. Agarose electrophoresis of the corresponding PCR products is shown for the thirty accessions (indicated at the bottom of the picture). (A) BSAT1.024; (B) MSAT3.1; (C) MSAT5.22. Cosson, P., Decroocq, V. & Revers, F. Development and characterization of 96 microsatellite markers suitable for QTL mapping and accession control in an Arabidopsis core collection. Plant Methods 10, 2 (2014). https://doi.org/10.1186/1746-4811-10-2 Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 15 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Exemple de detecció de SSR per Seqüenciació: permet determinar el nombre exacte de repeticions en una regió de SSR. Proporciona informació precisa sobre la seqüència de nucleòtids i el nombre de repeticions. (AAAG)n (AC)n Gen associat a trastorn genètic Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 16 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Exemple de detecció de SSR per Fluorescència: En la detecció de SSR mitjançant PCR, el mètode habitual consisteix a marcar directament un dels encebadors amb un fluorocrom (com FAM). Això permet identificar amb precisió la mida dels fragments amplificats gràcies a la detecció làser en un seqüenciador. Versió més econòmica de la detecció: L’esquema mostra una versió més econòmica i eficient, on la marca no es fa directament sobre els encebadors específics, sinó sobre un primer universal (M13(-21)). Per tant, és necessari incloure aquesta seqüència universal en l'encebador específic. Figure 1. Amplification scheme for the one-tube, single-reaction nested PCR method. (A,B) The hatched boxes indicate the microsatellite-specific primers, (C) the undulating gray box the universal M13(-21) sequence, and the star the fluorescent FAM label. (D) In the first PCR cycles, the forward primer with the M13(-21) tail is incorporated into the PCR products. (E) These products are then the target for the FAM-labeled universal M13(- 21) primer, which is incorporated during subsequent cycles at a lower annealing temperature of 53°C. (F) The final labeled product can be analyzed on a laser detection system Schuelke, M. (2000). An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnology , 18, 233-234. Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 10.56093/ijas.v92i3.122730 17 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Exemple de detecció de SSR per Fluorescència: un dels primers utilitzats per amplificar per PCR els SSR es marca amb un fluorocrom (FAM, 6-carboxy-fluorescine; ROX, 6-carboxy-X-rhodamine) i es detecten mitjançant un seqüenciador i detecció per laser que identificar la mida dels fragments amb gran precisió. Mida de la banda Parent 1 amplificada Parent 2 Progeny FAM labelled SSR marker (STM0003) Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 10.56093/ijas.v92i3.122730 18 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Cas pràctic: Anàlisi de la variabilitat genètica de l’all de Belltall amb SSRs Objectiu de l'exercici: Identificar la variabilitat genètica a l'all de Belltall i altres varietats d'all utilitzant marcadors SSR. Context: L'all de Belltall és una varietat tradicional catalana d’all cultivat en secà, molt preuada. A través dels marcadors SSR, volem determinar si presenta al·lels únics que la diferencien genèticament d'altres varietats d’all comercials (testimonis). Interpretació de dades: 1. Quina és la mida dels al·lels més comuna per al locus EAS9953 entre les mostres de Belltall? 2. Quines diferències observes entre les mostres de Belltall i els testimonis en el locus EAS3105? 3. Hi ha alguna mostra que no mostri tots els al·lels esperats en algun dels locus analitzats? Com podria afectar això la seva identificació genètica? 4. Quin testimoni té una variació única en el locus ASAli1 en comparació amb les mostres de Belltall? Quina és la mida dels al·lels diferents? 5. Observant els pics del locus EAS3105, hi ha alguna diferència en l'alçada dels pics entre les mostres de Belltall i els testimonis? Com podríem interpretar aquesta variació? Reflexió: 6. Observant la informació general dels cinc locus, podríem dir que l’all de Belltall és genèticament homogeni? O hi ha variabilitat significativa entre les mostres? 7. Com podrien aquestes dades ajudar a establir una base genètica per a una denominació d'origen o una marca de qualitat per l'all de Belltall? 8. Quins loci semblen ser més informatius a l'hora de diferenciar l’all de Belltall dels testimonis? 9. Són tots els locus polimòrfics en les mostres analitzades? Si no és així, quins locus mostren polimorfisme i quins no? 10.Per què s'observen més de dos al·lels en alguns locus, tot i que l'all de Belltall és una espècie diploide? Què podria explicar la presència de múltiples al·lels en una mateixa mostra? Allium sativum (all) Reproducció vegetativa Genòmica i millora genètica Diploide (2n) 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics Mida genoma = 16Gb 19 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SSR Cas pràctic: Anàlisi d'SSR en l'all de Belltall (Resultats) Informació marcadors SSR Locus Motif Nº Al·lels Mida Al·lels EAS9953 (T)22 6 175/172/171/170/165/163 Belltall_3 EAS8947 (TATG)3 4 227/223/222/219 EAS3105 (AAG)6 3 230/239/254 EAS6607 (GGTTT)3 2 231/146 Testimoni 1 ASAli1 (T)12 5 206/208/212/216/218 Mostra EAS9953 EAS8947 EAS3105 EAS6607 ASAli1 Belltall 1 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 2 175/171/170/165 227/222/219 239 231/146 212/216/218 Belltall 3 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 4 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 5 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 6 175/171/170/165 227/222/219 239 231/146 212/216/218 Belltall 7 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 8 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 9 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 10 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 11 175/171/170/165 227/222/219 239 231/146 212/216/218 Belltall 13 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Belltall 14 175/171/170/165 - 239 231/146 212/216/218 Belltall 15 175/171/170/165 - 239 231/146 212/216/218 Belltall 16 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Testimoni 1 175/171/170/165 - 239 231/146 - Testimoni 2 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Testimoni 3 175/171/170/165 227/222/219 239/254 231/146 212/216/218 Testimoni 4 175/171/170/165 227/222/223 239/254 231/146 206/208 Testimoni 5 175/172/170/165/163 227/222/219 239/254 231/146 - Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 20  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) Els SNPs són polimorfismes que afecten a un únic nucleòtid, i es diferencien de la resta de marcadors en que en aquest cas coneixem exactament el canvi. En el cas que el canvi sigui absència/presència d’una o més bases ho denominem INDEL (inserció/deleció), tot i que a petits INDELS sovint se’ls anomena SNPs Són les variacions més abundants Existeixen tecnologies per analitzar gran quantitat d’SNPs (fins a 106 SNPs) Codominant: permeten detectar i diferenciar entre els dos al·lels presents en un individu heterozigot. Es poden detectar per diversos mètodes: Secuenciació Sanger PCR específica d’al·lels* CAPs* SNaPshot HRM (High Resolution Melting) Etc... * Fàcil de realitzar de manera rutinària (no instruments cars) Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 21  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Detecció de SNPs (o INDELs) per Seqüenciació Sanger (Cromatograma) SNPs INDEL Ho Ho Ho Hz Hz Ho T deletion A/G https://www.codoncode.com/aligner/quicktour/indel_process.htm Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 22  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Detecció de SNPs (o INDELs) per Seqüenciació Sanger (Cromatograma) SNPs INDEL Ho Ho Ho Hz Hz Ho T deletion A/G https://www.codoncode.com/aligner/quicktour/indel_process.htm Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 22 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Detecció de SNPs (o INDELs) per SNaPshot (single-base extension genotyping method) Tècnica per detectar SNPs basada en l'extensió d'encebadors. o Primer s'amplifica la regió d'interès per PCR amb cebador específics que amplifiquen la regió diana o Després, uns sonda (Anneal Primer) s'uneix just al DNA complementari just abans del SNP en presència de ddNTPs marcats fluorescentment i de la polimerasa. o La polimerasa extèn la sonda afegint un sol ddNTP a l'extrem 3’ (els ddNTPs manquen d'un grup hidroxil en l'extrem 3’, no es poden afegir nucleòtids addicionals). o Es possible fer multiplexacions per detectar diversos SNPs en una única reacció (10-20 SNPs) PCR ddNTPs Separació dels pics es realitza en un instrument ABI Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 23  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Exemple de detecció de SNPs (o INDELs) per SNaPshot (single-base extension genotyping method) Exemple Hearing loss is a congenital disease. Mutations on the GJB2, MT-RNR1, and SLC26A4 genes are causative of hearing loss in the Korean population. MT-RNR1: m.1555A>G GJB2: c.235delC SLC26A4: c.439A>G, c.919-2A>G, c.1149+3A>G, c.1229C>T, c.2168A>G Objective: Detect simultaneously 7 mutations on these 3 genes by SNapShot (Diagnòstic genetic) Electropherograms of Genescan Analysis of the SNaPshot multiplex minisequencing. On the top, a control DNA sample with the position and nucleotide of the wild type allele indicated. Following, electropherograms for the most frequent hearing loss mutations in homozygote, compound heterozygote forms on GJB2 , SLC26A4 genes, and homoplasmy in the MT-RNR1 gene. doi:10.1371/journal.pone.0057237.g002 Genòmica i millora genètica Sagon et al (2013) A Rapid Method for Simultaneous Screening of Multi-Gene Mutations 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics Associated with Hearing Loss in the Korean Population. PLoS ONE 8(3): e57237. 24 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Detecció de SNPs (o INDELs) per High Resolution Melting (HRM) Mètode d’anàlisi post-PCR L'HRM es basa en que cada producte de PCR té una estabilitat tèrmica diferent que depèn de la seva seqüència dsDNA ssDNA Com funciona? 1. Amplificació per PCR la regió d'interès, en presència d'un colorant que s’intercala al dsDNA (p.ex Sybr Green) 2. El colorant té una alta fluorescència quan està unit a al dsDNA una baixa fluorescència en estat lliure 3. Increment gradual de la temperatura (fins a 95ºC- 100ºC) al final de la PCR. 4. A mesura que augmenta la temperatura, el dsDNA es dissocia (“melts”) en ssDNA, el colorant s’allibera I la fluorescència disminueix 5. El resultat es una corba de fusió (o corba de dissociació, “melting curve”) característica de cada amplicó 6. Cada amplicó té una temperatura de fusió (Tm) diferent, que és el punt on el 50% del DNA és dsDNA i l'altre 50% és ssDNA (dissociat), coincidint amb el 50% de la VIDEO fluorescència original. https://www.youtube.com/watch?app =desktop&v=7hsPQ8Smckg Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 25 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SNPs Detecció de SNPs (o INDELs) per High Resolution Melting (HRM) Codominant https://www.gene-quantification.de/hrm-beginners-guide.pdf Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 26 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants PCR específica d’al·lels Codominant Amplificació selectiva per PCR dels al·lels per detectar polimorfismes de nucleòtid únic (SNP) L’amplificació selectiva s’aconsegueix generalment dissenyant un primer de manera que el primer coincideixi o no amb un dels al·lels a l’extrem 3’ del primer. Codominant i Dominant (Segons el disseny) Diagrammatic presentation of the tetra-primer ARMS-PCR method for SNP identification. Two allele-specific amplicons are generated using two pairs of primers, one pair (P1 and P4) producing an amplicon representing the G allele and the other pair (P2 and P3) producing an amplicon representing the A allele. By positioning the two outer primers (P1 and P2) at different distances from the polymorphic nucleotide, the two allelespecific Genòmica i millora genètica amplicons differ in length, allowing them to be discriminated by gel 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics electrophoresis. 27  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: KASP Marcadors KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) o Tècnica basada en PCR específica d'al·lels o Detecta SNPs/InDEL o Competència entre 2 primers específics d’al·lel que amplifiquen un al·lel o un altre segons complementarietat a l’extrem 3’ o Utilitza fluoròfors com FAM i HEX associats als al·lels específics, per a la detecció mitjançant fluorescència. o Quenching: La fluorescència del fluoròfor està inicialment apagada fins que s'estableix la unió específica amb l'ADN, activant la fluorescència quan l’al·lel corresponent és present. o Codominant Video https://www.youtu be.com/watch?ap p=desktop&v=lHW Y0gqq5yQ Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 28 Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: KASP KASP vs Sanger sequencing FAM HEX Fig. 4 Results of KASP genotyping and Sanger sequencing. a KASP genotyping of Pita; b the sequencing peak of the G/G allele; c the sequencing peak of the G/T allele; d the sequencing peak of the T/T allele (Yang et al. Development of a core SNP arrays based on the KASP method for molecular breeding of riceRice (2019) 12:21 https://doi.org/10.1186/s12284-019-0272-3) Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 29  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: KASP La imatge mostra el genotipat amb 3 marcadors KASP (A, B i C) en 372 genotips de bròcoli. Quin és un bon marcador i per què? FIGURE 3 | Representative results of KASP genotyping assay. (A) KASP marker with good polymorphism that was successfully developed. (B) KASP marker with no polymorphism that should be discarded. (C) KASP marker with more than 10% missing values or had ambiguous SNP-calling that should be discarded Shen et al., 2021. Development of GBTS and KASP Panels for Genetic Diversity, Population Structure, and Fingerprinting of a Large Collection of Broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) in China. Front. Plant Sci., Volume 1. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.655254 Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 30  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: CAPs Cleaved amplified polymorphic sequences (CAPs) El CAP es basa en el polimorfisme de seqüència que crea o elimina una seqüència reconeguda per un enzim de restricció Fàcil interpretació i fàcil de compartir entre laboratoris Codominant: permeten detectar i diferenciar entre els dos al·lels presents en un individu heterozigot. Limitació: només detecta SNPs que alteren lloc de reconeixement d’enzims de restricció CAPS marker assisted selection of Genotypes I, II and III based on (T/A) single nucleotide substitution polymorphism. The nucleotide substitution T/A in the EcoRV cut site are shown in red. (A). PCR produces only the A allele (in blue) in Genotype I, only the T allele (in green) in Genotype III, but produces both the T and A alleles in Genotype II. The T allele has EcoRV cut site (GATATC) but not the A allele. (B). The T allele in Genotype II or Genotype III gives rise to two fragments of size 330 bps and 350 bps after EcoRV restriction digestion. (C). Gel electrophoresis of EcoRV restriction digested products, therefore, produces one band in Genotype I (PCR fragment not cut, 680 bps), two bands in Genotype III (PCR fragment cut into 330 and 350 bps) and three bands in Genotype II (one PCR fragment not cut 680 bps, other fragment cut into two, 330 and 350 bps fragments). Genòmica i millora genètica https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e08093 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 31  Marcadors moleculars de DNA basats en PCR i codominants: SCAR Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) amplified polymorphic sequences (CAPs) o Fragments de DNA de seqüència coneguda derivats de marcadors moleculars menys específics, com els RAPD o AFLP. o Es dissenyen primers específics per aquestes seqüències per amplificar la regió d’interès. o Amplificació per PCR: S’amplifica l’al·lel polimòrfic: Dominants: Presència o absència de banda. Codominants: Fragments de diferent mida. o Són altament reproduïbles i molt específics. o Limitacions: Temps de desenvolupament elevat. Relativament pocs marcadors Exemple de Marcador Molecular SCAR Tm22 Codominant, que confereix resistència al virus del mosaic del tomàquet Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 32  Aplicacions del Marcadors Moleculars IDENTIFICACIÓ DE GENOTIPS Fingerprinting (o emprenta genètica): permet identificar individus o varietats basant-se en les seqüències úniques del seu AND (empremtes moleculars: patrons genètics exclusius de cada individu)/ control de qualitat en producció de llavor o planta certificada) SEMILLAS FITÓ, empresa de investigación, producción y comercialización de AGROMILLORA, empresa de selecció i producció de planter d’arbres semillas para el cultivo profesional de diversas especies de plantas agrícolas fruiters, empra els marcadors moleculars com a mecanisme de control y hortícolas.: Todos estos marcadores los utiliza la empresa para varios de qualitat abans de distribuir els planters d’arbres fruiters. Cal recordar aspectos del departamento de control de calidad: Pureza híbrida: hay que que en un fruiter la fructificació pot no produir-se fins als 2-3 anys del comprobar que la semilla híbrida que se ha producido para la trasplantament, per la qual cosa no observarem el fenotip fins al cap de comercialización es realmente producto de la hibridación entre los padres molt temps. Els marcadors moleculars ens poden permetre certificar que forman este híbrido y excluir un posible error a la hora de la que no hem tingut errors en la manipulació de les plantes en vivers. hibridación. Antes se tenía que dejar crecer la planta híbrida y observar el fruto para poder confirmar fenotípicamente que el híbrido era el que se había vendido, por lo que actualmente el ahorro de tiempo es significativo y Protecció de varietats vegetals el marcador es más preciso. Identificación varietal: se comprueban las líneas según su perfil genético (huella genética). (protegir la propietat intellectual) Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 33  Aplicacions del Marcadors Moleculars GESTIÓ DE RECURSOS FITOGENÈTICS I BANCS DE GERMOPLASM Les col·leccions de germoplasma poden acollir un gran número d’accessions (entitats genètiques). Els marcadors moleculars són una eina molt potent per quantificar la diversitat de la nostra col·lecció, així com identificar possibles duplicats. Figura. En un estudi recent d’una col·lecció de 10.038 accessions de pebrot (Capsicum annum) enmagatzemats en bancs de germoplasma de tot el món, emprant marcadors moleculars es va descobrir que el 10% dels materials eren duplicats entre bancs (Tripodi et al. (2021) DOI: 10.1073/pnas.2104315118). Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 34  Aplicacions del Marcadors Moleculars MAPATGE GENÈTIC Posició dels marcadors en els diferents grups de lligament. Essencial per estudiar els trets genètics, els patrons d'herència i la funció gènica Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 35  Aplicacions del Marcadors Moleculars PREDICCIÓ GENÒMICA o Tècnica que utilitza informació genètica (de marcadors moleculars) per predir el valor genètic d'un individu per a determinats trets quantitatius (p.ex rendiment). o Útil en la millora genètica de cultius o animals per seleccionar individus d'alt rendiment o amb característiques desitjades sense haver d'esperar a avaluar el seu fenotip complet. o Permet reduir el temps i cost associats amb l'avaluació fenotípica tradicional. Figura. Exemple de la fiabilitat de la predicció del rendiment en base a dades genòmiques en la mongeta (Phaseolus vulgaris) (Keller et al. (2020) DOI: 10.3389/fpls.2020.01001). Els gràfics de la imatge mostren la relació entre el nombre de marcadors moleculars utilitzats i la capacitat predictiva per al tret de rendiment (Yield) en diferents poblacions (MAGIC i VEF) i amb diferents freqüències al·lèliques (MAF). Els resultats mostren que, a mesura que augmenta el nombre de marcadors moleculars utilitzats (eix X), la capacitat predictiva (eix Y) tendeix a estabilitzar-se en un cert punt, Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 36  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MAS SELECCIÓ ASSISTIDA PER MARCADORS (MAS, Marker-Assisted Selection) Mètode de selecció d'individus desitjables en un programa de millora genètica basat en patrons de marcadors moleculars de DNA en lloc de, o a més de, les seves característiques fenotípiques. MILLORA GENÈTICA TRADICIONAL (CONVENTIONAL PLANT BREEDING) Creuaments: Es creuen plantes amb trets desitjables per combinar els gens d’interès. P1 X P2 Selecció basada en el fenotip: Es seleccionen individus en funció de les característiques F1 observables (fenotip), com el rendiment, la resistència a malalties o la qualitat del fruit. Poblacions grans de milers d’individus F2 Cicles de selecció llargs: Cal esperar que les plantes creixin completament per avaluar els trets fenotípics, Selecció fenotípica Factors ambientals: El fenotip observat pot Tolerància Deficiència Salinitat nutricional estar afectat per condicions ambientals > selecció no precisa. Resistència Rendiment Limitacions genètiques: Els trets complexos, plagues frutals controlats per múltiples gens, poden ser difícils de seleccionar amb mètodes convencionals hivernacle Camp Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 37  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MAS SELECCIÓ ASSISTIDA PER MARCADORS (MAS, Marker-Assisted Selection) Mètode de selecció d'individus desitjables en un programa de millora genètica basat en patrons de marcadors moleculars de DNA en lloc de, o a més de, les seves característiques fenotípiques. SELECCIÓ ASSISTIDA PER MARCADORS (MAS) L'objectiu del la MAS és reduir el temps necessari per a determinar si la P1 X P2 progènie té el caràcter desitjat Susceptible Resistent El segon objectiu del SAM és reduir el F1 cost associat a la selecció dels Poblacions grans de caràcters desitjables milers d’individus F2 Si podem detectar el caràcter distintiu a nivell d'ADN, podem realitzar la selecció molt aviat i amb menys cost. Selecció assistida per marcadors (la selección fenotípica es basa en marcadors de DNA) Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 38  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MAS SELECCIÓ ASSISTIDA PER MARCADORS (MAS, Marker-Assisted Selection) Què necessitem?? Marcador intragènic (polimorfisme causal): o Absència de recombinació o Exportable a qualsevol material Marcadors lligats: o Dos marcadors flanquejants (5cM) Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 39  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MABC RETROCREUAMENT ASSISTIT PER MARCADORS (MABC, Marker-Assisted Backcrossing) El MABC és una forma més específica de MAS utilitzada en programes de retrocreuament per introduir un gen desitjable (o diversos) d'un progenitor donant en el fons genètic d'un progenitor elit (recurrent). En el MABC, es fan servir marcadors moleculars per: o Seleccionar el(s) gen(s) objectiu del progenitor donant utilitzant un marcador molecular (Foreground selection) o Accelerar la recuperació del fons genètic del progenitor elit utilitzant marcadors repartits pel genoma per assegurar que la major part del genoma de la descendència provingui del progenitor elit (Background selection), i no del donant MABC està orientat específicament a 6-8 generacions per 3-4 generacions per incorporar eficientment un o pocs gens recuperar el màxim Fons recuperar el màxim Fons d'interès en una línia elit, reduint el nombre genètic de la línia recurrent genètic de la línia recurrent de generacions necessàries per recuperar el (BC6 a BC8) (BC3 a BC4) fons genètic del progenitor recurrent. Salgotra, et al (2017). Strategies for Breeding Cereal Crops to Attain Sustainability with Major Emphasis on Rice. 10.1201/9781315365930-16. Genòmica i millora genètica Tema 7. 7. Marcadors genètics genètics 40  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MABC Cas pràctic MABC = Varietats d’arròs resistents a la salinitat (Marè et al. 2023) o L’arròs és molt sensible a la salinitat Marcadors utilizats per la o Existeixen varietats d’arròs tolerant > el QTL Saltol confereix tolerància Foreground selection (2 marcadors SSRo KASP o Algunes varietats d’èlit italianes (Onice i Vialone nano) són flanquejant Saltol QTL) sensibles a la sal o Els investigadors volen millorar la tolerància a la salinitat en QTL Saltol varietats d’èlit incorporant el QTL Saltol o Es vol mantenir el màxim fons genètic de les varietats d’èlit o Comencen un programa de millora amb MABC o Utilitzen 2 marcadors flanquejant el locus d’interès per la Foreground selection o Utilitzen 96 marcadors KASP repartits pels 12 cromosomes (27 al cromosoma 1), per la Background selection Marcadors utilizats per la Background selection (27 marcadors KASP localitzats al cromosma 1) SalTol es localitza al cromosoma 1 del genoma de l’arròs Genòmica i millora genètica Marè et al. Marker-Assiste Marè et al. Marker-Assisted Introgression of the Introgression Salinity Tolerance of the Salinity Locus Saltol Tolerance in Temperate Locus Saltol Japonica in Temperate Rice. 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics Rice (N Y). 2023Japonica Jan 12;16(1):2. Rice. Rice doi:(N10.1186/s12284-023-00619-2. Y). 2023 Jan 12;16(1):2. doi: 10.1186/s12284-023-00619-2. 41  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MABC Cas pràctic MABC = Varietats d’arròs resistents a la salinitat (Marè et al. 2023) RPGR (Percentatge de Recuperació del Genoma Recurrent) : % del genoma recurrent (línia èlit) que s'ha recuperat en una generació de retrocreuament, excloent la regió d’interés (prove del donant) Nº plantes Nº plantes seleccionades analitzades RPGR Foreground selection 76 330 46-72% + Background selection 12 Foreground selection 56 166 75-90% + Background selection 17 Foreground selection 63 242 89-98% + Background selection 14 Foreground selection + Homozygous selection 119 500 92-100% + Background selection 21 Background selection 14 133 93-100% Genòmica i millora genètica Marè et al. Marker-Assisted Introgression of the Salinity Tolerance Locus Saltol in Temperate 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics Japonica Rice. Rice (N Y). 2023 Jan 12;16(1):2. doi: 10.1186/s12284-023-00619-2. 42  Aplicacions del Marcadors Moleculars: MABC Cas pràctic MABC = Varietats d’arròs resistents a la salinitat (Marè et al. 2023) Seleccionada en base a avaluació en camp i %RPGR Avaluació fenotípica de tolerància a salinitat en línia obtinguda O1 En procés per a la seva Graphical representation based on the 96 KASP marker alleles of Onice “Best alliberació per a la introgression BC3F4 lines” (O1 to O12) carrying HKT 1;5 Saltol QTL, depicting the extent producció comercial. of recovery of the carrier chromosome 1 Genòmica i millora genètica Marè et al. Marker-Assisted Introgression of the Salinity Tolerance Locus Saltol in Temperate 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics Japonica Rice. Rice (N Y). 2023 Jan 12;16(1):2. doi: 10.1186/s12284-023-00619-2. 43 Cas pràctic Projecte: “Cap a l’obtenció de varietats tradicionals de tomàquet resistents a virosis (TMV, TYLCV, TSWV), bactèries (P. syringae), fongs (F. oxysporum) i nematodes (Meloidogyne sp.)” El problema: Les varietats tradicionals de tomàquet catalanes són susceptibles a malalties (no tenen gens de resistència) Solució: Introduir gens de resistència a les varietats tradicionals Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 44  Cas pràctic La majoria de gens de resistència a malalties s’han trobat en espècies silvestres. Per aquest motiu és molt important conservar els hàbitats i el material vegetal a les zones d’origen de les espècies cultivades. Diversitat en les espècies silvestres emparentades amb el tomàquet S. pimpinellifolium S. peruvianum S. chilense I-2 Ve Mi Tm-2a Sw-5 Ty-3 Locus Chr11 Chr9 Chr6 Chr9 Chr9 Chr6 Cromosoma Fusarium Verticillium oxysporum dahlie Meloidogyne TMV TSWV TYLCV Malaltia FONG FONG NEMATODE VIRUS VIRUS VIRUS Genòmica i millora genètica https://www.genresj.org/index.php/grj/article/download/genresj.PSES6766/137 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 45 Cas pràctic Com ho fem per traslladar les resistències d’una varietat a una altra? Sw-5 I-2 Tm-2a Varietat resistent (RR) a Ty-3 diferents malaties Mi Ve Varietat tradicional catalana susceptible (rr) a malalties Resistent: R Susceptible: r Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 46 Cas pràctic Programa de millora Com ho fem per traslladar les resistències d’una varietat a una altra? per retroencreuament Sw-5 I-2 Tm-2a Varietat resistent (RR) a Ty-3 diferents malaties Mi Ve Sw-5 I-2 Varietat tradicional catalana resistent (RR) Tm-2a a malalties Ty-3 Mi Ve Resistent: R Susceptible: r Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 47  Cas pràctic Programa de millora Com ho fem per traslladar les resistències d’una varietat a una altra? per retroencreuament x RR rr BC1 x Selecció d’individus Rr Rr rr Se seleccionen primer en base als marcadors moleculars (en BC2 x planter), després es planten en camp els individus seleccionats Rr rr Rr, i se seleccionen després pel següent retroencreuament en BC3 x base al fenotip observat en camp (avaluació agronòmica) Rr rr Pregunta: Pensa en com utilitzem els marcadors moleculars per seleccionar les plantes. 99,2% igual a la Aquest procés encaixa més varietat original BC6 en MAS o MABC? Rr Selecció d’individus RR Seleccionem els individus que tinguin els gens de resistència en homzigosi RR i s’avaluan Resistent: R agronòmicament en camp Susceptible: r RR Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 48  Cas pràctic Programa de millora Com ho fem per traslladar les resistències d’una varietat a una altra? per retroencreuament x RR rr BC1 x Selecció d’individus Rr Rr rr Se seleccionen primer en base als marcadors moleculars (en BC2 x planter), després es planten en camp els individus seleccionats Rr rr Rr, i se seleccionen després pel següent retroencreuament en BC3 x base al fenotip observat en camp (avaluació agronòmica) Rr rr Pregunta: Pensa en com utilitzem els marcadors moleculars per seleccionar les plantes. 99,2% igual a la Aquest procés encaixa més varietat original BC6 en MAS o MABC? Rr Selecció d’individus RR Seleccionem els individus que tinguin els gens de resistència en homzigosi RR i s’avaluan Resistent: R agronòmicament en camp Susceptible: r RR Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 48  Cas pràctic Durant el programa de millora, hem obtingut la línia 9, que ha incorporat el locus Sw-5, el qual proporciona resistència al Virus del bronzejat del tomàquet (TSWV). Estem analitzant la seva descendència amb marcadors moleculars, i per això examinem 16 plantes individuals (1 a 16) en estat juvenil. Aquest marcador proporciona els següents al·lels Al·lel Resistent (R) dona una banda de PCR de 575bp Al·lel Susceptible (r) dona una banda per PCR de 464bp 575 bp 464 bp Preguntes 1. Quin és el genotip de cada individu basant-te en el gel? [heterozigots (Rr) o homozigots (RR, rr)] 2. Quina(s) planta(es) seleccionaries per continuar el programa de millora i per què? 3. Creus que aquesta descendència és el resultat d'un retroencreuament? Com ho podries saber observant els resultats del gel? 4. El marcador Sw5, quin tipus de marcador molecular és? Genòmica i millora genètica 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 49  Cas pràctic Durant el programa de millora, hem obtingut les línies 3 i 4 que han incorporat els locus Sw-5 i Tm-2a (línia 3) i Ty-3 i Tm-2a (línia 4). Estem analitzant la descendència d’aquestes dos línies amb marcadors molecular. Es mostra el resultat de 12 plantes per la línia 3 i 16 per la línia 4. P, és al parental recurrent. Aquest marcador proporciona els següents al·lels Al·lel Resistent (R) Al·lel Susceptible (r) Sw-5 PCR: 575 bp PCR: 464 bp Ty-3 PCR: 519 bp PCR: 269 bp Tm-2a PCR+HaeIII: 600 + 260 bp PCR+HaeIII: 880 bp Línia 3 Línia 4 10 11 12 13 14 15 16 10 11 12 P P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Sw5 Ty-3 Tm-2a Tm-2a Preguntes 1. Quin és el genotip de cada individu basant-te en el gel? [heterozigots (Rr) o homozigots (RR, rr)] 2. Algún individu té la resistència fixada genèticament? Quins? 3. Hi ha individus sense cap resistència? Quins són i quina seria la seva utilitat en un programa de millora? 4. Els marcador utilitzats, quin tipus de marcador molecular són? Reflexiona sobre el tipus d’anàlisis realitzat (PCR, enzims de restricció, etc.) 5. Com asseguraries que els individus seleccionats són realment resistents al camp? Quins assajos faries després Genòmica de lagenètica i millora selecció molecular? 7. Marcadors genètics Tema 7. genètics 50