Gentherapie.pdf

3 GENTHERAPIE 3.1 INLEIDING 3.2 GENETISCHE AANDOENINGEN 3.2.1 IMMUUNDEFICIËNTIES 3.2.2 BORSTKANKER 3.2.3 COLONKANKER 3.2.4 MELANOMA 3.2.5 MUCOVISCIDOSE 3.2.6 HEMOFILIE 3.2.7 LEVERAANDOENINGEN 3.2.8 HART-EN VAATZIEKTEN 3.2.9 SPIERDYSTROFIE 3.2.10 DE ZIEKTE VAN HUNTINGTON 3.3 BELANGRIJKE PUNTEN BIJ GE...

3 GENTHERAPIE 3.1 INLEIDING 3.2 GENETISCHE AANDOENINGEN 3.2.1 IMMUUNDEFICIËNTIES 3.2.2 BORSTKANKER 3.2.3 COLONKANKER 3.2.4 MELANOMA 3.2.5 MUCOVISCIDOSE 3.2.6 HEMOFILIE 3.2.7 LEVERAANDOENINGEN 3.2.8 HART-EN VAATZIEKTEN 3.2.9 SPIERDYSTROFIE 3.2.10 DE ZIEKTE VAN HUNTINGTON 3.3 BELANGRIJKE PUNTEN BIJ GENTHERAPIE 3.4 VIRUSSEN 3.4.1 VOORBEELDEN 3.4.2 NON-VIRALE VECTOREN 3.5 BEHANDELMETHODEN 3.5.1 EX VIVO 3.5.2 IN VIVO 3.6 VOORBEELDEN VAN ENIGSZINS GESLAAGDE GENTHERAPIE 3.7 RNA INTERFERENTIE 3.7.1 RISC 3.7.2 TOEPASSINGEN 3.8 CRISPR-CAS 9 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 5 6 6 7 9 10 10 10 11 11 13 13 14 1 3 Gentherapie 3.1 Inleiding De mens kan ziek worden door verschillende oorzaken. Vaak gaat het over infectieuze aandoeningen, veroorzaakt door micro-organismen. Voor de behandeling van deze ziektes bestaan verschillende geneesmiddelen. Meestal gaat het echter om niet – infectieuze ziekten. Hiervoor beschikt men lang niet altijd over afdoende geneesmiddelen. Het gaat om erfelijke ziekten zoals kanker, dementie, diabetes, astma… Om deze ziekten te behandelen kan men beroep doen op gentherapie. Voor een aantal ziekten is dit de enige optie. Men zal dus het “slechte” of afwijkende gen trachten te vervangen door een “goed” of normaal gen. Omwille van de risico’s die hieraan verbonden zijn, zijn er zeer strenge procedures en regelgevingen opgesteld. Het eerste klinische onderzoek met gentherapie werd uitgevoerd in 1991 en had betrekking op de behandeling van ‘adenosine deaminase deficiëntie’ (ADA). Deze ziekte zorgt voor een verzwakte immuniteit, zodat patiënten vatbaar worden voor de meest banale infecties. In deze trial werden slechts 2 patiënten getest en beide patiënten vertoonden een verbetering van hun gezondheidstoestand. Dit was een aanmoediging voor wetenschappers om verder te gaan met onderzoek naar gentherapie. Sindsdien heeft men verschillende andere klinische testen uitgevoerd, maar zonder de verhoopte resultaten. Integendeel; in 1998 leidde een klinische test tot de dood van een patiënt. Dit had ernstige gevolgen voor de gehele medische wetenschappelijke research. Sinds de ontwikkeling van de recombinant DNA technologie begin jaren ’70, droomden wetenschappers ervan om deze technologieën te gebruiken om erfelijke ziekten te behandelen. Het realiseren van deze droom is echter niet eenvoudig. Men is namelijk aangewezen op virussen om het goede gen binnen te brengen in menselijke cellen. Er bestaan immers grote problemen en risico’s bij het gebruik van virussen als vector. Meestal zal men het virus injecteren in de bloedsomloop waar het in contact komt met de immuunafweer. Het afweersysteem zal de meeste virussen vernietigen vooraleer zij hun doel bereikt hebben. Als de virussen de cellen hebben bereikt en geïnfecteerd, zal het afweersysteem deze geïnfecteerde cellen aanvallen en vernietigen. Als het aantal geïnfecteerde cellen dat wordt aangevallen hoog is, kan het volledige orgaan vernietigd worden met de mogelijke dood van de patiënt als gevolg. Ondanks deze problemen is het aantal ziekten die men probeert te behandelen met gentherapie gestegen van een handvol in 1990 tot meer dan 600 in 2004. 3.2 Genetische aandoeningen Een fout in gen is meestal veroorzaakt door een puntmutatie. Een voorbeeld hiervan is sikkelcelanemie. Dit is een erfelijke ziekte waarbij de rode bloedcellen een abnormale vorm hebben door een verandering in het hemoglobine. De puntmutatie vindt plaats in het gen dat codeert voor de beta-keten van hemoglobine: GAG  GTG. Dit resulteert in een eiwit met valine in plaats van glutaminezuur. Deze verandering is voldoende om het hemoglobine te misvormen. Sikkelcelanemie is een erfelijke ziekte waarbij slechts één gen getroffen is: monogeen. Vele andere erfelijke ziekten worden veroorzaakt door afwijkingen in verschillende genen tegelijk: polygeen. Ook voor deze ziekten bestaan gentherapieën. 2 3.2.1 Immuundeficiënties Alle dieren hebben een immuunsysteem. Als dit niet functioneert, zal de mens of het dier ten onder gaan aan allerlei opportunistische infecties. Ons immuunsysteem bestaat uit een enorme populatie witte bloedcellen;B- en T-lymfocyten, macrofagen… Een ernstige erfelijke ziekte van het immuunsysteem is SCID-X1: ‘Severe Combined Immuno Deficiency – X1’. Dit is de verzamelnaam van een groep zeldzame, meestal fatale aandoeningen die het immuunsysteem vernietigen. De patiëntjes overlijden vaak binnen het eerste levensjaar. Degenen die het overleven, hebben te kampen met steeds weerkerende aanvallen van longontsteking, meningitis en wijnpokken. Het is dus een erfelijke ziekte, meestal X-gebonden. De overdracht gebeurt via de moeder, omdat de mannelijke dragers meestal sterven op zeer jonge leeftijd. De oorzaak is een mutatie in de receptor voor interleukine-2. Het IL-2 receptor eiwit activeert een belangrijk signaalmolecule , dat men ‘Janus kinase 3’ (JAK3) noemt. Een mutatie in het JAK3 gen, kan resulteren in een tweede vorm van SCID. Het gevolg van deze niet-functionerende receptoren en de signaal-pathways die hierop volgen, is dat de T-lymfocyten zich niet normaal kunnen ontwikkelen. Een derde vorm van SCID, is te wijten aan een mutatie in het adenosine deaminase (ADA) gen. Dit gen is actief in T-lymfocyten en een mutatie leidt tot een toxische ophoping van adenosine in de cel. De normale behandeling is een beenmergtransplantatie. Deze behandeling kan veel levens redden, maar het is moeilijk en soms onmogelijk om voor iedereen een geschikte donor te vinden. SCID is een ideale kandidaat voor gentherapie omdat de T-lymfocyten van de patiënt uit het lichaam verzameld kunnen worden en in cultuur gebracht worden. Men kan dan in deze gecultiveerde Tcellen het gezonde gen inbrengen. Als de T-cellen het gezonde gen succesvol opnemen en tot expressie brengen, kan men ze terug in het bloed van de patiënt brengen. Het is dan ook deze ziekte die men als eerste heeft getest op behandeling met gentherapie (zie hoger). 3.2.2 Borstkanker Borstkanker wordt, zoals alle kankers, veroorzaakt door mutaties in één of meerdere genen. De oorzaak van deze mutaties kunnen virussen zijn of natuurlijke mutaties. Borstkanker is de tweede belangrijkste vorm van kanker en doodsoorzaak bij vrouwen wereldwijd. In 1994 werden twee genen geïdentificeerd: BRCA 1 (Breast Cancer 1) op chromosoom 17, en BRCA 2 op chromosoom 13. Mutaties in deze genen worden geassocieerd met borstkanker en kanker van de eileiders. De eiwitten die door deze genen gecodeerd worden, spelen een rol bij het herstel van DNAbeschadigingen. Als zij hun functie verliezen, kan dit leiden tot een opstapeling van fouten tijdens DNA-replicatie en dus kanker. Momenteel lopen er verschillende genetische trials om de gemuteerde genen te vervangen door of aan te vullen met gezonde genen. Een andere piste is het inbrengen van tumorsuppressor-genen in de cellen om de ontwikkeling van de tumor te blokkeren. Wat zijn tumorsuppressorgenen? 3.2.3 Colonkanker Kanker van de dikke darm of colon is ook een veel voorkomende vorm van kanker. De darm is een gevoelig orgaan voor kanker omdat het bestaat uit actief delende cellen. Bij elke celdeling is er 3 immers een risico dat er fouten optreden tijdens de DNA replicatie. De oorzaak van darmkanker is vaak roken of eetgewoonten, maar er zijn ook twee genen geïdentificeerd: MSH2 en MLH1. Patiënten met mutaties in deze genen krijgen meestal darmkanker voor de leeftijd van 50 jaar. MLH1 en MSH 2 coderen voor eiwitten die instaan voor mismatch repair van DNA. Als deze eiwitten niet meer functioneren, leidt dit tot een opeenstapeling van puntmutaties, waardoor de kans op het ontwikkelen van kanker groot wordt. In de toekomst zullen ook hiervoor verschillende gentherapietrials opgestart worden. 3.2.4 Melanoma Melanoma is een agressieve vorm van huidkanker en wordt veroorzaakt door een te hoge blootstelling aan zonlicht. Een mutatie in het cycline-dependent kinase N2 (CDKN2), maakt de drager vatbaarder voor deze vorm van kanker. CDKN2 codeert voor een eiwit, p16, dat een belangrijke regulator is van de celdeling. Verlies van de functie van p16, is een verlies van controle van de celdeling en dit is typisch voor kanker. Preventie van zonnebrand is uiteraard de belangrijkste ‘behandeling’, maar ook gentherapie kan misschien een uitweg bieden. Men zal proberen het defecte gen te vervangen door of aan te vullen met een gezond gen. Men probeert ook nietspecifieke anti-tumor genen te introduceren die het imuunsysteem stimuleren om tumorcellen aan te vallen. 3.2.5 Mucoviscidose Mucoviscidose of ‘taaislijmziekte’ is een erfelijke ziekte waarbij er een taai slijm wordt geproduceerd in de longen die het ademhalen bemoeilijkt. Deze patiënten zijn bovendien zeer vatbaar voor allerlei bacteriële infecties van de luchtwegen. Muco wordt verooraakt door een mutatie in het gen dat codeert voor een NaCl-transport-eiwit (CFTR), dat zich bevindt aan de oppervlakte van epitheelcellen in de long en andere organen. Er zijn reeds 100den verschillende mutaties in dit gen teruggevonden. Het resultaat is steeds een falend transport van Na en Cl door de epitheelcellen. De ernst van de ziekte is afhankelijk van de plaats van de mutatie. Verlies van de functie van CFTR doet de hoeveelheid water aan het celoppervlak dalen. Hierdoor wordt er een taaier en dikker slijm geproduceerd en zal de zuurtegraad in de cel toenemen. De glycocalyx is niet meer normaal en niet meer in staat om bacteriën te weren (oa. P.aeruginosa). in 1990 heeft men het CFTR-gen gekloneerd en aangetoond dat het op chromosoom 7 ligt. Dit is een aandoening met goede perspectieven voor gentherapie omdat het monogeen is. 3.2.6 Hemofilie Hemofilie is een erfelijke aandoening waarbij er een stoornis is in de bloedstolling. Één van de bloedstollingsfactoren wordt niet aangemaakt. Er zijn verschillende vormen van hemofilie waarvan de twee belangrijksten hemofilie A en B zijn. Hemofilie A wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen dat codeert voor factor VIII, op het X-chromosoom. Hemofilie B wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen dat codeert voor factor IX (onbekend chromosoom). Vroeger bestond de behandeling uit bloedtransfusies, met de nodige risico’s vandien (leverbeschadiging, HIV). Men is dan overgeschakeld op recombinant DNA technologie om factor VIII aan te maken, maar dit is zeer duur. Gentherapie trials met proefdieren waarbij men het gen inbracht in levercellen en beenmergcellen, hebben niet geleid tot een duurzame productie van factor VIII. Recentere experimenten om het gen te introduceren in darm-epitheelcellen zijn hoopgevender. Trials met factor IX zijn succesvoller en een goede behandeling van deze ziekte is voor de nabije toekomst. 4 3.2.7 Leveraandoeningen Eiwitten worden afgebroken tot aminozuren. Een bijproduct van dit katabolisme is ammonium, dat toxisch is in hoge concentraties. Cellen lossen dit op door ammonium om te zetten in ureum, dat ons lichaam verlaat via urine. De productie van ureum hangt af van het lever-enzym ornithine transcarbamylase (OTC). Als OTC afwezig is of niet goed functioneert , zal de concentratie ammonium snel stijgen. Dit leidt tot coma en eventueel de dood. Het gen voor OTC is gesitueerd op het Xchromosoom, dus meestal zijn de patiënten mannelijk. De behandeling bestaat uit het opvolgen van een streng dieet en continue monitoring van het bloed. Deze ziekte is een ideale kandidaat voor gentherapie omdat het monogeen is en slechts één orgaan aantast. In 1999 liep er echter een klinische trial met gentherapie fataal af waardoor alle andere trials voor minstens 1 jaar stop gezet werden. 3.2.8 Hart-en vaatziekten Atherosclerose is een aandoening van de bloedvaten waarbij ze langzaam aan dichtslibben door de vormingen van plaques en een teveel aan cholersterol. Apolipoproteïne E (gen op chromosoom 19) verwijdert normaal het teveel aan cholesterol uit het bloed door de opname in levercellen, waar het opgeslagen wordt. Mutante apolipoproteïnes kunnen niet meer binden op de leverreceptoren waardoor er een opstapeling is van cholesterol in het bloed. Er bestaan verschillende mutante vormen van apolipoproteïne E. Vooraleer men kan overgaan op gentherapie, moet men eerst deze mutaties in detail kennen. Een tweede vorm van hart- en vaatziekte, die de kroonslagaders treft, wordt momenteel behandeld met gentherapie. Dit is een gevaarlijke ziekte omdat de kroonslagaders het hart bevloeien en voorzien van zuurstof. Falen van deze kroonslagaders kan leiden tot een hartinfarct. Via gentherapie probeert men een gen te introduceren in de hartspiercellen dat codeert voor een groeifactor voor bloedvaten. Deze groeifactor stimuleert de aanmaak en het herstel van kroonslagaders. 3.2.9 Spierdystrofie Spierdystrofie of de ziekte van Duchenne (DMD) is een verzameling van aandoeningen die gekarakteriseerd worden door een pathologische zwelling van de spieren. Het wordt veroorzaakt door een mutatie in het DMD gen, dat gelocaliseerd is op het X-chromosoom. De ziekte treedt reeds op jonge leeftijd op en treft meer dan 1 miljoen jongens wereldwijd. Het DMD gen codeert voor een eiwit; dystrofine; dat instaat voor de versteviging van de spiercellen door het cytoskelet vast te hechten aan het plasmamembraan. Zonder dystrofine, wordt het celmembraan permeabel voor vocht en de cel zwelt op en barst uiteindelijk. Researchers hebben een knock-out muismodel ontwikkeld voor DMD in een poging om de rol van het DMD beter te begrijpen. Gentherapie trials proberen het gemuteerde gen te vervangen of een nauw verwant gen utrofine te introduceren om de celmembraan te stabiliseren. 3.2.10 De ziekte van Huntington De ziekte van Huntington (HD) is een erfelijke neurologische aandoening die leidt tot vroegtijdige dementie. Het HD gen is gelocaliseerd op chromosoom 4. De mutatie bestaat uit een verlenging van een nucleotice triplet repeat (CAG-CAG-) in het gen dat codeert voor het Huntington eiwit. Mensen met verlengde CAG-repeats hebben de ziekte. Maar hoe het eiwit juist functioneert, is nog niet bekend. Men heeft wel een test ontwikkeld om te testen of mensen later deze ziekte zullen krijgen of niet. Er is ook een diermodel ontwikkeld en men weet nu ook dat muizen een gen bevatten dat zeer 5 gelijkaardig is met het humane HD gen. Naar de toekomst toe zijn er verschillende gentherapie trials gepland. 3.3 Belangrijke punten bij gentherapie • • • • • De genoverdracht moet alleen gericht zijn op bepaalde weefsels of organen. Zo voorkom je dat het op de verkeerde plaats in ons lichaam terechtkomt. Dit wordt ook wel specificiteit genoemd. De genoverdracht moet heel effectief zijn, zodat genoeg cellen in het doelweefsel of doelorgaan het gen krijgen om van de aandoening te genezen. De genoverdracht moet liefst blijvend zijn, zodat het gen niet weer vanzelf verdwijnt uit het lichaam en de patiënt weer ziek wordt. Alleen in een klein aantal aandoeningen, bijvoorbeeld bij hart- en vaatziekten, moet het gen na een bepaalde tijd juist weer verdwijnen. Een cel die een voor het lichaam nieuw product gaat maken, zelfs als dat een voor gezonde mensen 'normaal' product is, loopt grote kans na enige tijd te worden opgemerkt door het immuunsysteem van de patiënt en een afweerreactie op te roepen, waardoor de genormaliseerde cellen worden vernietigd en het effect van de gentherapie teniet is gedaan. de genoverdracht moet op een geschikte plaats in het genoom van de ontvanger worden ingebouwd; als het op een plaats gebeurt waardoor b.v. de regulatie van de celdeling in de war raakt kan er juist kanker door ontstaan. 3.4 Virussen Één van de grootste moeilijkheden bij gentherapie is het binnensmokkelen van vreemde genen in een cel. Cellen worden omgeven door een plasmamembraan dat impermeabel is voor grote moleculen zoals DNA. Zelfs als zou een DNA-molecule in het cytoplasma geraken, dan moet het nog binnendringen in de kern, die ook omgeven is door een membraan. Er bestaan twee types vectoren om genen in een celkern binnen te brengen: synthetische vectoren en virussen. In synthetische systemen, wordt het gen overgebracht in een plasmide, dat eerst vermenigvuldigd is in en geïsoleerd wordt uit bacteriën. Het plasmide kan dan ofwel alleen (“naakt”) ingebracht worden (transfectie) ofwel als complex met moleculen die de opname door cellen vergemakkelijken (zoals bv.kationische polymeren en liposomen). Het voordeel van deze vector is de veiligheid, maar de genentransfer is vaak niet efficiënt en van voorbijgaande aard (het gen wordt niet stabiel geïntegreerd). Gentransfer met behulp van virussen is efficiënter, maar potentieel gevaarlijker. Virussen zijn organismen die doorheen de evolutie de capaciteit hebben verworven om hun genoom in het cytoplasma en in de kern van een gastheercel binnen te brengen. Het is dan ook logisch dat men gebruik zal maken van virussen als carrier voor genen die men gebruikt bij gentherapie. Virussen kunnen een cel binnendringen door deze te misleiden. Ze binden namelijk op receptoren op het celoppervlak die normaal instaan voor de opname van suikers, hormonen, groeifactoren of andere signaalmoleculen. Dit noemt men receptor-gemedieerde endocytose. Een vaak gebruikt virus bij gentherapie is het adenovirus. Nadat dit virus de cel is binnengedrongen, zal het capside binden aan een porie van het kernmembraan. Vervolgens zal het virale chromosoom in de kern geïnjecteerd worden, waar het gerepliceerd en getranscribeerd wordt. Viraal mRNA en copieën van het viraal genoom komen dan terug in het cytoplasma terecht waar het mRNA getransleerd wordt in virale eiwitten. De laatste stap is dan de assemblage van het virus en het openbarsten van de gastheercel. 6 Virussen lijken dus de ideale carriers voor genen, gezien hun natuurlijke vermogen om cellen en celkernen binnen te dringen. Er zijn echter twee grote problemen die men moet oplossen. Ten eerste moet de replicatie van het viraal genoom zelf geblokkeerd worden, samen met de transcriptie en translatie van de meerderheid van de virale genen. Ten tweede moet men het gewenste gen in het virale genoom inbrengen op zo’n manier dat de vorming van het virale capside normaal kan verlopen. Zonder capside kan een virus immers geen cellen binnendringen. De aanmaak van virale vectoren gebeurt in proefbuizen. Virale genen voor replicatie en andere eiwitten die een rol spelen bij de infectie, worden verwijderd en vervangen door het therapeutische gen. Het hybride chromosoom wordt gemengd met opgezuiverde virale capsiden. In de proefbuis zal dan spontaan de assemblage plaatsvinden van virale partikels. Als alles goed verloopt, zal het virus in staat zijn een cel binnen te dringen en het gen af te leveren zonder de cel te beschadigen of zichzelf te repliceren. 3.4.1 Voorbeelden Het adenovirus type 2 (AD-2) wordt gebruikt bij gentherapie van T-lymfocyten, lever, huid en verschillende soorten tumoren. Adenovirussen zijn DNA virussen. Een belangrijk aspect bij het gebruik van dit virus, is de hoeveelheid virussen die je toedient aan een patiënt. Bij gentherapie van de lever, wordt het recombinante AD-2 virus rechtstreeks geïnjecteerd in de lever. Als het aantal virussen juist is, zullen de receptoren van de levercellen alle virussen binden. Als er te weinig virussen 7 toegediend worden, zal het aantal cellen dat het virus opneemt te laag zijn en zal er te weinig expressie van het gezonde gen zijn om de ziekte te genezen. Als er teveel virussen worden toegediend, komen er virussen in de bloedcirculatie terecht en infecteren ze andere cellen. Omdat ze recombinant zijn, zullen ze de cellen geen rechtstreekse schade toebrengen, maar hun aanwezigheid kan het immuun systeem prikkelen zodat deze cellen aangevallen worden. In extreme gevallen, kan een volledig orgaan vernietigd worden wat tot de dood van de patiënt kan leiden. Het adenovirus blijkt een zeer goede transport en aflever- vector te zijn, maar de expressie van het geïmporteerde gen blijkt na twee weken te verzwakken. Het viraal DNA wordt niet in het genoom van de gastheer ingebouwd. Adenovirussen kunnen grotere genen overbrengen, maar het effect is van korte duur, omdat het DNA uiteindelijk de cel uit wordt gewerkt, omdat het niet in het erfelijk materiaal in de celkern is ingebouwd. Alleen in een klein aantal aandoeningen, zoals hart- en vaatziekten, moet het gen na een bepaalde tijd juist weer verdwijnen. Voor behandeling van patiënten met een permanente afwijking is het dus wenselijk een retrovirale vector te gebruiken. Bovendien kunnen AD vectoren niet alle cellen infecteren en ze roepen vaak een immuunrespons op. Als gevolg van deze problemen, is men beroep gaan doen op een ander virus, een retro-virus. Voorbeelden zijn het ‘murine leukemia virus (MuLV) of het ‘avian leukosis virus’ (ALV). Dit zijn RNAvirussen die hun RNA kunnen omzetten in dsDNA, wat ze vervolgens kunnen integreren in het gastheergenoom. Het genoom van retrovirussen wordt geflankeerd door ‘long terminal repeat’ (LTR) sequenties. Deze sequenties omvatten belangrijke genen, onder andere het gag, pol en env gen. Deze genen coderen voor structurele eiwitten, enzymen en oppervlakte glycoproteïnen. Bij het omvormen van een retrovirus tot vector, worden deze drie genen verwijderd en vervangen door het transgen. Om de virale vectoren te construeren, wordt gebruik gemaakt van zogenaamde ‘verpakkingscellen’. Deze cellen brengen de drie ontbrekende genen (gag, pol en env) tot expressie zodat de virusdeeltjes aangemaakt kunnen worden. Deze virussen zijn zeer efficiënt in de infectie van cellen van het immuunsysteem en ze roepen niet zo’n sterke immuunrespons op als andere virussen. Bovendien zullen retrovirussen hun genoom daadwerkelijk in het DNA van de gastheer inbouwen, waardoor het effect van de therapie over een langere termijn aanwezig blijft. Wanneer retrovirussen gebruikt worden, is de plaats waar het gen ingebouwd wordt vooraf moeilijk te bepalen. Soms komt het gen op een plaats terecht waar het geen kwaad kan, maar soms verstoort het de werking van andere genen of veroorzaakt het kanker op lange termijn. Dit risico wordt echter steeds kleiner doordat men dit steeds beter kan sturen. Een ander nadeel van een retrovirus is dat er slechts relatief kleine genen mee vervoerd kunnen worden. Meestal echter, is de mate waarin het therapeutisch gen tot expressie komt, te klein om de patiënt te genezen of om de symptomen te verlichten. Bovendien is het altijd risicovol om met virussen die zich integreren in het genoom, te werken. Als er iets misgaat, kan men de klok niet terugdraaien. De risico’s worden zeker groot als men werkt met virussen die zich ook nog kunnen repliceren. Men heeft zulke vectoren gemaakt in een poging om de expressie van het therapeutische gen te verbeteren. Het argument was dat retrovirussen de gastheercel niet beschadigen wanneer ze hem verlaten. Zo lang de ziekteverwekkende genen verwijderd zijn, kan reproductie en verspreiding van het virus geen kwaad. Integendeel: vermenigvuldiging en verspreiding van het virus, zorgt ook voor een vermenigvuldiging en een verspreiding van het therapeutisch gen. Dit is positief voor de patiënt. 8 Er bestaat echter altijd de mogelijkheid dat een van deze vectoren gaat recombineren met een ander intact virus waardoor er wel gevaarlijke virussen kunnen ontstaan. Lentivirussen zijn vergelijkbaar met retrovirussen, maar zijn ingewikkelder opgebouwd. Een voorbeeld is het HIV-1 virus. Daardoor heeft het langer geduurd voor ze werden toegepast, maar is er wel meer sturing mogelijk. Het grote voordeel van lentivirussen ten opzichte van gewone retrovirussen is dat Lentivirussen ook niet-delende cellen kunnen infecteren, zoals neuronen wat ze interessant maakt voor ziekten aan de zenuwen en hersenen. De eerste proef met Lentivirussen is gestart juli 2003, bij onderzoek naar de behandeling van HIV. Er zijn nog geen bijwerking bij de patiënten, terwijl de aanwezigheid van het HIV virus in deze patiënten sterk afgenomen is. Men heeft ook vectoren ontwikkeld die wel een hoge expressie vertonen van het therapeutisch gen, zonder dat ze zich nog kunnen repliceren. Wetenschappers hebben een hybride virus ontwikkeld: Ebola-HIV. Dit is dus een combinatie tussen het ebola-virus en het HIV-virus. Beide virussen zijn dodelijk en heel efficiënt in de infectie van cellen. Het hybride virus werkt goed op proefdieren, maar of het ooit goedgekeurd zal worden om te testen op mensen, is een groot vraagteken. Hoewel het virus defect is zullen heel wat mensen weigerachtig staan om dit hybride virus in hun bloed te laten injecteren. Herpes simplex type 1: dit is een neurotroop dsDNA virus. Het wordt dus gebruikt bij gentherapie van neuronale aandoeningen. 3.4.2 Non-virale vectoren In het verleden heeft het gebruik van virale vectoren tot de dood van patiënten geleid. In één geval waarbij een retrovirus werd gebruikt en drie SCID patiënten overleden, verstoorde het ingebouwde gen het erfelijk materiaal zo dat er leukemie ontstond. In een ander geval overleed een patiënt omdat hij tegen de protocollen in een overdosis van de vector ontving, waardoor zijn afweersysteem op hol sloeg. Daarom wordt ook onderzoek gedaan naar zogenaamde non-virale vectoren. Men gebruikt hiervoor plasmiden, ofwel naakt, ofwel vastgehecht aan dragers. De transfectie met ‘naakte’ plasmiden is weinig efficiënt. Men kan wel mechanische of chemische hulpmiddelen gebruiken om de efficiëntie te verhogen. Men kan de cel ‘bombarderen’ met micro-projectielen die gecoat zijn met de plasmiden. Men kan ook de extracellulaire druk opvoeren om de cel te forceren het plasmide op te nemen. Ook electroporatie kan men toepassen. Een analoge techniek is die met behulp van geluidsgolven. Al deze technieken hebben als doel het meer permeabel maken van de plasmamembraan voor plasmiden: • • • Kleine gouddeeltjes: Deze worden met een gen er aan vast met een luchtdrukpistool de cellen ingeschoten. Deze techniek onderzoekt men nu voor de behandeling van Duchenne. Nanodeeltjes kunnen allerlei superkleine moleculen zijn. Nanodeeltjes zijn voor het eerst in juli 2005 toegepast om erfelijk materiaal in de stamcellen, aanwezig in de hersenen van muizen, te plaatsen. De onderzoekers claimen dat deze vector veiliger is dan een virale vector en tegelijkertijd dezelfde efficiënte (vergeleken met het Herpes virus). Experts wijzen erop dat een nanodeeltje het nieuwe gen niet inbouwt in het genoom van de cel, waardoor het nieuwe gen bij celdeling niet vermenigvuldigd wordt. Liposomen: dit zijn kleine micellen, ronde structuren die omgeven worden door fosfolipen, rond een waterig midden. Afhankelijk van de samenstelling van de hydrofiele ‘koppen’, 9 worden liposomen ingedeeld in anionisch, kationisch, zwitterionisch of non-ionisch. Kationische liposomen worden meestal gebruikt; ze zullen in een waterig milieu zich schikken rond negatief geladen plasmiden of DNA moleculen. Ze vormen dan positief geladen lipoplexen. Deze lipoplexen zullen gemakkelijk fuseren met de plasmamembraan waardoor het DNA in het cytoplasma terecht komt. De overdracht van het DNA van cytoplasma naar kern verloopt echter nog steeds inefficiënt. 3.5 Behandelmethoden De behandeling kan ex vivo (buiten het lichaam) en in vivo (binnen het lichaam) worden uitgevoerd. Dit verschilt per aandoening. 3.5.1 Ex vivo Slechts zeer weinig aandoeningen kunnen op deze manier genezen worden, omdat niet alle soorten lichaamscellen zich daarvoor lenen. Voorbeelden van aandoeningen die misschien wel met deze methode behandeld kunnen gaan worden: • Aandoeningen die hun oorsprong hebben in het bloed of de bloedcellen • Sommige stofwisselingsziekten. Het voordeel van ex vivo gentherapie is dat in het labo de omstandigheden waaronder de genoverdracht plaatsvindt, goed te controleren zijn. Hierdoor is de kans groter dat een genoverdracht slaagt. Een ander voordeel is dat cellen die het nieuwe gen hebben geselecteerd en gekweekt kunnen worden, waardoor een grotere hoeveelheid cellen gemaakt wordt die allemaal het therapeutische gen in zich hebben. Een nadeel is dat de behandeling soms een chirurgische ingreep inhoudt, wat een belasting is voor de patiënt. Bovendien accepteert het lichaam van de patiënt de behandelde cellen niet altijd. Meestal gaat het overigens om bloed- en beenmergcellen en is de benodigde chirurgie minimaal (beenmergpunctie + transfusie). 3.5.2 In vivo Voorbeelden van aandoeningen die mogelijk in de toekomst met deze methode behandeld zouden kunnen worden: • Taaislijmziekte • Diabetes mellitus (suikerziekte) • Hemofilie Het nadeel van in vivo gentherapie is dat de vector heel goed gericht moet worden op het doelorgaan, om genoverdracht in verkeerde weefsels te vermijden. Uit onderzoek blijkt dat dit (nog) vaak erg moeilijk is. Daarbij blijkt het vaak ook lastig om in het lichaam genoeg cellen het gen te bezorgen om een aandoening te kunnen behandelen. 10 3.6 Voorbeelden van enigszins geslaagde gentherapie In Amsterdam werkt AMT NV aan het inbrengen van een proteïnelipasegen met adenogeassocieerde virussen (AAV) bij mensen bij wie dit gen niet goed werkt. Hierdoor hoopt zich bij deze mensen te veel vet op in het bloed, waardoor onder meer hun alvleesklier geregeld ontstoken raakt. In een experiment bij 8 mensen, dat werd afgerond in 2007 bleek dat de therapie de hoeveelheid vet in het bloed tijdelijk verlaagde. Uit de tussentijdse resultaten van het vervolgonderzoek bleek niet alleen dat het vetgehalte bij de meeste patiënten was verlaagd, maar viel ook op dat ontstekingen van de alvleesklier achterwege bleven zodra de behandeling was aangeslagen. Het bedrijf heeft aangekondigd dat het verwacht dit gentherapieproduct, Glybera®, in de tweede helft van 2009 voor registratie in Europa aan te bieden aan de European Medicines Agency (EMEA). Bepaalde vormen van SCID, severe combined immunodeficiency, ernstige gecombineerde immuundeficientie, een zeer zeldzame ziekte (ca. 1 op 1.000.000 geboorten). Deze kinderen overlijden zonder behandeling in het eerste levensjaar. In Frankrijk werden in 1999 11 patiënten met enig succes behandeld. Zij kregen eigen beenmergstamcellen getransplanteerd die een functionele kopie van de 'common gamma chain' ingebouwd hadden gekregen. 9 van hen kregen een normaal functionerend immuunsysteem. Twee van deze patiënten ontwikkelden na enige jaren leukemie doordat de stamcellen kwaadaardig ontaardden - het gebruikte retrovirus bleek een oncogen te hebben geactiveerd. Hierop werden verdere experimenten met deze methode, en een groot aantal (tientallen) andere experimenten waarbij eveneens gebruik werd gemaakt van retrovirussen als vector, voorlopig gestaakt. Dit is het experiment dat altijd als succesvol voorbeeld wordt geciteerd bij artikelen over gentherapie; dat komt doordat er nog geen andere echte successen zijn geboekt. Er gaan inmiddels stemmen op om het onderzoek -voorzichtig- te hervatten. In 2004 werd het onderzoek hervat omdat verscheidene kinderen wel werden genezen en er geen andere volwaardige alternatieven qua behandeling waren. In 2005 meldde het gezaghebbende blad Nature een derde geval van kanker waardoor het onderzoek opnieuw stil ligt. Onderzoeksleider Fischer heeft plannen om de vector aan te passen en dan mogelijk verder te gaan met het onderzoek. Tot hier toe hebben we alleen gesproken over gentherapie van somatische cellen. Dit zijn volwassen cellen. Als men echter DNA verandert van voortplantingscellen of embryonale cellen of stamcellen, dan zullen deze wijzigingen doorgegeven worden aan alle nakomelingen. Het gebruik van stamcellen wordt in een volgend hoofdstuk besproken. 3.7 RNA interferentie Een nieuwe ontwikkeling is dat wordt bekeken of defecte genen gerepareerd kunnen worden zonder nieuw DNA in te bouwen. Zo wordt voorkomen dat genen en controlemechanismen verplaatst worden zoals bij het gebruik van retrovirussen. Een voorbeeld hiervan is het door middel van RNAinterferentie (RNAi) "stilleggen" van bepaalde genen. Aan de basis van RNAi ligt de aanwezigheid van een stuk (enkelstrengs)RNA met de sequentie die complementair is aan het uit te schakelen mRNA = ‘antisense-RNA’. Al sinds de tachtiger jaren van de twintigste eeuw was bekend dat de antisense-RNA een complementair mRNA-molecule kan blokkeren en doen afbreken. RNA interferentie vindt men terug bij eukaryoten en wordt in gang gezet door het enzym Dicer. 11 Dit enzyme knipt lange dsRNA moleculen in korte fragmenten van ongeveer 20 nucleotiden. Één van de twee strengen, de “guide strand”, wordt dan opgenomen in het RNA-induced-silencing complex (RISC). Dit treedt op als de guide strand bindt met een complementaire sequentie op het mRNA en klieving door de katalytische component van het RISC: argonaute. Men noemt dit effect op de genexpressie: “post-transcriptional gene silencing”. Het selectieve en drastische effect van RNA interferentie op de expressie van genen, maakt het zeer interessant voor research, zowel in celculturen als in levende organismen. Monogene aandoeningen zoals thalassemie en sikkelcelziekte zouden, vooral wanneer RNAi zou kunnen worden gecombineerd met gentherapie doeltreffender kunnen worden behandeld.. Men kan synthetisch dsRNA introduceren in cellen om op die manier bepaalde genen te onderdrukken. RNAi kan ook gebruikt worden voor grootschalige screening van de functie van genen in een cel. Men kan systematisch elk gen in een cel onderdrukken om te kijken wat het effect daarvan is op verschillende cellulaire processen zoals bijvoorbeeld celdeling. De researcher introduceert exogeen dsRNA dat het proces op gang kan brengen. Dicer knipt exogeen dsRNA in fragmenten van 21 – 25 baseparen met enkele ongepaarde basen als overhang aan elk uiteinde. Deze lengte is ideaal voor specifieke binding op bepaalde genen en minimaliseert aspecifieke bindingen. De resulterende korte dsRNA fragmenten noemt men small interfering RNAs (siRNAs). Deze siRNAs worden dan omgevormd tot enkelstrengige fragmenten en geïntegreerd in een actief RISC complex. Vervolgens kunnen ze binden op hun doelwit mRNA en verhinderen dat translatie kan doorgaan. De expressie van het betrokken gen wordt zo dus geblokkeerd. In de natuur komt dit fenomeen ook voor. Het gaat dan om endogeen dsRNA. Endogeen dsRNA wordt gecodeerd door bepaalde genen. Het primaire transcript van deze genen pri-miRNA (primair micro RNA), wordt eerst geprocessed om de typische ‘stam-lus’ structuur van pre-miRNA te vormen in de kern. Dit pre-miRNA is ongeveer 70 nucleotiden lang. Vervolgens wordt dit pre-miRNA naar het cytoplasma overgebracht waar het gekliefd wordt door Dicer en omgezet in miRNA. The stem-loop secondary structure of a pre-microRNA from Brassica oleracea. Er is wel een verschil tussen siRNAs en miRNAs, vooral bij dieren. miRNAs vertonen een minder strikte baseparing met hun doelwit mRNA en kunnen dus de translatie van verschillende mRNAs met gelijkaardige sequenties inhiberen. siRNAs daarentegen zullen altijd een heel strikte en perfecte binding aangaan met hun doelwit, zodat zij enkel een specifiek mRNA zullen blokkeren. 12 3.7.1 RISC De actieve componenten van het RISC zijn endonucleasen: argonaut eiwitten. Zij klieven het mRNA dat gebonden is door het siRNA of miRNA. Hoewel dicer dsRNA fragmenten produceert en er dus theoretisch twee functionele siRNAs gevormd worden, is slechts één streng functioneel; de “guide strand”. Deze streng kan op het Argonaut eiwit binden en het proces van gene silencing op gang brengen. De andere streng of de anti-guide strand of passenger strand wordt afgebroken. Het is nog niet geweten hoe het geactiveerde RISC complex het complementaire mRNA in de cel kan localiseren. Argonaut eiwitten, de katalytische componenten van RISC, vindt men terug in specifieke regio’s in het cytoplasma; de P-bodies (of GW bodies). Dit zijn regio’s met een hoge mate van mRNA afbraak. In deze P-bodies vindt men ook veel miRNAs terug. Verstoring of vernietiging van deze Pbodies, vermindert de efficiëntie van RNA interferentie, wat het vermoeden bevestigt dat ze een cruciale rol spelenn bij het RNAi proces. 3.7.2 Toepassingen 3.7.2.1 Gen knockdown Het RNA interferentie proces wordt vaak uitgeprobeerd in onderzoeken naar de functie van genen in celculturen en in vivo in modelorganismen. Men synthetiseert dsRNA met een sequentie die complementair is met de sequentie van het te onderzoeken gen en dit brengt men binnen in de cel of organisme. Het ingebrachte dsRNA wordt als vreemd herkend en de RNAi pathway wordt op gang gebracht. Op deze manier kan men een drastische daling in de expressie van een bepaald gen teweeg brengen. Door het bestuderen van de effecten van deze daling, kan men de functie van het gen onderzoeken. Omdat RNAi meestal geen volledige blokkering van een gen veroorzaakt, noemt men deze techniek “knockdown” om een onderscheid te maken met “knockout” procedures, waarbij (de expressie van) een gen volledig wordt geëlimineerd. Men tracht dsRNA moleculen te maken die zo specifiek mogelijk zijn. Dat wil zeggen dat ze alleen het gewenste gen treffen, en geen “off-target” effecten hebben (ook andere genen beïnvloeden). Die ongewenste neveneffecten komen vaak voor als het dsRNA sequenties bevat die complementair zijn met meerdere genen. Het risico hierop wordt groter als men werkt met dsRNA dat veel repetitieve sequenties bevat. Afhankelijk van het organisme en het experiment, is het RNA een groot molecule dat nog door dicer geknipt moet worden, of is het ineens een kort RNA fragment. In de meeste dierlijke cellen werkt men met korte RNA fragmenten omdat grotere RNA moleculen een afweerreactie kunnen opwekken. Oöcyten van muizen en embryonale muiscellen vertonen geen immuunreactie en worden daarom vaak gebruikt voor onderzoek naar knockdown effecten. Men heft ondertussen ook technieken ontwikkeld om een betere RNA interferentie te verkrijgen. In plaats van rechtstreeks siRNAs te introduceren in de cellen, zal men werken met plasmiden die DNA bevatten dat codeert voor bepaalde siRNAs. Men kan ook gebruik maken van lentivirale vectoren die toelaten om de transcriptie van deze genen te reguleren; men noemt dit conditionele RNAi. 3.7.2.2 Geneeskunde Het zou mogelijk zijn om RNA interferentie te gebruiken in de geneeskunde. Er zijn al enkele klinische trials geweest, onder andere bij de behandeling van infecties met het RSV virus. In muismodellen is het ook al getest om bepaalde leveraandoeningen te genezen. 13 Ook andere antivirale therapieën worden onderzocht, zoals tegen het herpes simplex virus type 2 of inhibitie van virale genenexpressie in kankercellen, knockdown van gastheer receptoren en coreceptoren voor HIV, silencing van hepatitis A en B genen, silencing van influenza genen en inhibitie van de replicatie van het mazelenvirus. Ook behandeling van enkele neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Huntington is in de toekomst misschien mogelijk. RNA interferentie wordt ook als veelbelovend aanzien in de strijd tegen kanker. Men kan genen afzwakken die op hol geslagen zijn in tumoren. Een groot struikelblok bij het gebruik van RNA interfentie is ook hier het vinden van een goeie “aflevermethode” voor het siRNA. Tot hier toe gebruikt men virale vectoren, net zoals bij gentherapie. Ondanks veelbelovende resultaten op celcultuur systemen, is er nog ongerustheid over de veiligheid van de methode. Men maakt zich dan vooral zorgen over de zogenaamde neveneffecten (“off-target effects”), waarbij andere genen die gelijkaardige sequenties hebben met het doelwitgen ook getroffen worden. 3.8 CRISPR-Cas 9 CRISPR/Cas is een methode om een mutatie te genereren op een vooraf bepaalde plaats in het DNA van een organisme. In CRISPR/Cas staat CRISPR staat voor Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats en Cas voor CRISPR-associated. De technologie is ontdekt in 2012 als een verdedigingsmechanisme van bacterieën tegen virussen: Als een virus zijn erfelijk materiaal injecteert in een bacterie, zal de bacterie zich verdedigen en wapenen tegen een volgende aanval van dat virus. De bacterie legt een soort ‘geheugen’ aan in zijn eigen chromosoom: elk nieuw viraal DNA wordt opgeslagen in zijn DNA (thv CRISPR-regio) Bij een volgend contact met dat type virus, zal het viraal DNA vernietigd worden door het CASenzym. Het CAS-enzym bindt op het viraal DNA, daarbij gegidsd door een guide-RNA. Dit guide-RNA of ‘gids-RNA’ is afkomstig van de geheugenbank in het bacterieel chromosoom. Het guide-RNA is complementair met het viraal DNA. Als het CAS-enzym (met nuclease-activiteit) bindt op het viraal DNA (thv PAM site), zal dit leiden tot vernietiging van het DNA Toepassingen: CRISPR/Cas kan men gebruiken als een vorm van site-directed nuclease-technologie. Nucleasen zijn dus enzymen die specifieke plaatsen in het DNA herkennen en knippen. Zo’n herkenningsplaats wordt bepaald door een opeenvolging van vier of meer nucleotiden, afhankelijk van het nuclease. Er bestaat een grote verscheidenheid aan nucleasen die allemaal andere DNA-sequenties herkennen. Men kan het CAS-enzym koppelen aan een stukje homoloog RNA aan een bepaald target –gen. Het CAS zal binden op dit homoloog target DNA en het vervolgends knippen. Wanneer DNA geknipt wordt, zal het natuurlijke herstelmechanisme van de cel de breuk proberen herstellen. Dit gaat echter vaak gepaard met fouten (zeker als er geen intacte streng meer beschikbaar is). Men kan op deze manier een gen uitschakelen: ‘knock-out’. De breuk kan ook hersteld worden met behulp van een homoloog stuk DNA dat toegevoegd wordt. 14 Een ander herstelmechanisme van de cel treedt dan in actie. Via deze methode kan dus een nieuw DNA-fragment ingebouwd worden (knock-in) of kan een fragment ingevoegd worden zodat de oorspronkelijke sequentie hersteld wordt maar met een of meerdere doelbewuste wijzigingen. Met bovenstaande homologe herstelmechanismen wordt de originele DNA-code op een specifieke plaats veranderd. Een andere toepassing van deze technologie laat de onderzoekers ook toe om bijvoorbeeld de expressie van het target-DNA te wijzigen: Men zal in dit geval de nuclease-activiteit van CAS uitschakelen, maar iets anders aan het enzym koppelen. Men kan bijvoorbeeld extra transcriptiefactoren met een positief of een negatief effect koppelen aan CAS. Ondertussen is met er ook in geslaagd op het CRISPR-CAS systeem te koppelen aan het GFP (Green Fluorescent Protein) om de timing en de plaats van de expressie van genen op te volgen. 15