Biotechnologija medicinoje PDF

**Biotechnologija medicinoje** **[1 TEMA. LIGOS]** **Užkrečiamų ligų kontrolė ir prevencija.** Vakcinos -- preparatai, kurie imituoja patogenus ir dirbtinai sužadina žmogaus imuninę sistemą prieš tam tikrą antigeną. Tuo atveju, kai antigenas pakartotinai patenka į organizmą, imuninė sistema nedel...

**Biotechnologija medicinoje** **[1 TEMA. LIGOS]** **Užkrečiamų ligų kontrolė ir prevencija.** Vakcinos -- preparatai, kurie imituoja patogenus ir dirbtinai sužadina žmogaus imuninę sistemą prieš tam tikrą antigeną. Tuo atveju, kai antigenas pakartotinai patenka į organizmą, imuninė sistema nedelsiant su juo susidoroja. *Yra dvi pagrindinės vakcinų grupės:* -- prevencinės, skirtos apsisaugojimui nuo ligų. -- ir terapinės, skirtos ligoms gydyti. Vakcinų gamybai gali būti naudojami gyvi, tačiau susilpninti **(atenuoti)** patogenai. Jie puikiai aktyvina imuninę sistemą, bet yra per silpni, kad sukeltų infekcijas. Tuberkolozės paskiepinimas nepadeda, liga vis sugrįžta. Rekombinantinės vakcinos dažniausiai yra naudojamos. - Pirmoji rekombinantinė vakcina buvo sukurta nuo **hepatito b.** Ją sudaro tik viruso kapsidės baltymai, vakcinoje nėra viruso genetinės informacijos -- DNR. **Diagnostika-**ligos ,jos priežasties nustatymas. Modernioji biotechnologija kuria naujausius mokslo laimėjimais paremtus diagnostikos įrankius, metodus, leidžiančius ligas diagnozuoti greitai ir tiksliai. **Imunodiagnostika** -- tai diagnostikos sritis, paremta antigeno ir antikūno sąveika. **Antikūnai --** baltymai, kuriuos žmogaus imuninė sistema sintetina prieš **(„anti")** svetimus į mūsų organizmą patekusius organizmus **(„kūnus").** **Kaip nustatoma, ar žmogus yra užsikrėtęs tam tikru virusu (pvz. ŽIV)?** Pirmiausia iš žmogaus paimama kraujo. Imunodiagnostiniai patogenų identifikavimo testai dažniausiai atliekami specialiose plokštelėse, kurios turi daug šulinėlių. Jei kraujyje yra ieškoma paties viruso, šulinėlio *dugnas* yra padengtas *konkrečiam virusui* (pagal šį pavyzdį -- ŽIV) būdingais *antikūnais*. Kai į tokį šulinėlį įpilama kraujo, jame esantys virusai prisijungia prie dugne esančių antikūnų (vadinamų pirminiais antikūnais), likęs kraujas išpilamas. Paskui ant šulinėlio dugne susidariusio *antikūno--viruso komplekso* užpilama kitų virusui specifinių antikūnų (vadinamų antriniais). Jie pažymėti tam *tikra žyme.* Žymė gali būti fermentinė (pabaigoje šulinėlis nusidažys tam tikra spalva), fluorescuojanti ar kt. Ši *žymė a*trankiai prisijungia tik prie *antikūno--viruso komplekso*. Tyrimo pabaigoje visa plokštelė nuskenuojama. Jei šulinėliuose yra aptinkamas ieškomas signalas (pakinta spalva, fluorescencija), vadinasi kraujyje buvo ŽIV virusų. Keičiant pirminius antikūnus šulinėlyje analogiškai nustatomi kiti antigenai ar patogenai (virusai, bakterijos). Pasitelkus **imunodiagnostinius testus** galima identifikuoti ne tik atskiras ląsteles, bet ir atskiras molekules -- pavienius ląstelių paviršiaus baltymus. Taip nustatomi įvairūs vėžinių ląstelių žymenys. Visi imunodiagnostiniai testai yra itin specifiški, patikimi, greitai atliekami, pateikia medikams tikslų atsakymą. **Genų terapija** -- tai toks gydymo būdas (dažniausiai eksperimentinis), kai į ląsteles yra įvedami nauji genai. Siekiama atkurti neteisingo, blogai veikiančio/neveikiančio tam tikro geno raišką. **Pagalbinis apvaisinimas-** technologija leidžianti poroms negalinčioms pastoti natūraliais būdais, susilaukti vaikų. Per šią procedūrą kiaušialąstė su spermatozoidu susitinka ne gimdoje, o mėgintuvėlyje. Vėliau embrionas įdedamas į gimdą. **Transplantacija** -- gydymo metodas, kai pažeistos ar sergančios ląstelės, audiniai arba organai yra pakeičiami sveikais. Dažniausiai transplantuojami organai: inkstai, kepenys, širdis, plaučiai, kasa, čiobrialiaukė. Transplantuojami audiniai -- ragena, kaulai, sausgyslės, oda, širdies vožtuvai, venos. Žmogus, kurio audinių, ląstelių ir (ar) organų paimama transplantacijai, yra vadinamas ***donoru.*** Žmogus, kuriam gydymo tikslais persodinami audiniai, ląstelės ar (ir) organai adinamas ***recipientu.*** Procesas, kai transplantacija yra atliekama naudojant **to paties** žmogaus organus ar audinius yra vadinama **autotransplantacija**, o kai kito donoro -- **alotransplantacija.** **Kamieninės ląstelės -** Žmogaus kūnas yra sudarytas iš įvairių specializuotų ląstelių tipų: odos, kaulų, raumenų ir kt. Visos šios skirtingos ląstelės turi bendrą savybę -- jos yra kilusios iš tų pačių nespecializuotų, galinčių atsinaujinti kamieninių ląstelių. **Kamieninės ląstelės** gali specializuotis (diferencijuotis) ir tapti **bet kurio audinio** ląstelėmis. Tam reikia specifinių biocheminių sąlygų. Ligoms gydyti yra bandoma naudoti ir kitas, ne tik kamienines žmogaus ląsteles. Naudojamos **dendritinių, T** ląstelių terapijos. **Dendritinės ląstelės** -- tai tokios imuninės sistemos ląstelės, kurios atpažįsta antigenus (virusais ar bakterijomis infekuotas žmogaus ląsteles, vėžines ląsteles) ir paskui aktyvina tiems antigenams specifines T ląsteles. Šios ląstelės sugeba atpažinti antigenus turinčias ląsteles ir jas sunaikinti. Diagnozavus, kad pacientas serga vėžiu ir nustačius, kokius baltymus--žymenis turi jo vėžinės ląstelės, galima dirbtinai aktyvinti paciento imunitetą prieš tuos žymenis. Tada paties paciento imuninė sistema vėžines ląsteles sunaikins. **Šiuo metu ligos, kurioms gali būti taikoma genų terapija turi pasižymėti keliomis savybėmis:** **1) Žinant, kad genų terapija gali turėti šalutinių efektų gydomos tik gyvybei pavojų keliančios ligos.** **2) Genai, atsakingi už ligos atsiradimą, turi būti pilnai charakterizuoti.** **3) Turi būti rasti efektyvūs vektoriai galintys specifiškai atakuoti gydomos srities ląsteles.** **Hemofilija-** liga, kai nekreša kraujas, o susižeidus nukraujuojama iki mirties. Sergančių žmonių kraujyje nėra baltymo, kuris skatina krešulių susidarymą. **Cistinė fibrozė** yra paveldima liga, kuriai būdinga sutrikusi endokrininių liaukų funkcija, todėl liaukų gaminamas sekretas pasidaro tirštas, klampus, gali užkimšti kasos, bronchų, žarnyno liaukas bei tulžies latakus. Ligą sukelia geno, koduojančio cistinės fibrozės transmembraninio pralaidumo reguliatoriaus (CFTR), mutacija. CFTR tai transmembraninis c-AMP valdomas chlorido kanalas. Pro šį kanalą be Cl jonų taip pat gali judėti vanduo bei katijonai. Dėl CFTR geno mutacijos, kanalas yra uždarytas. Plaučių ir kvėpavimo takų epitelių paviršiuje susidaro tirštos gleivės, kurios sudaro gerą terpę bakterijų dauginimuisi. Dažnai tai sukelia antraeilius efektus, kurie pasireiškia kasos, inkstų suardymu, bei vyrų nevaisingumu. Kasa sergant cistine fibroze jos fermentai negali palikti liaukų; jie naikina liaukas ir mažiau gamina insulino. **Gydymas cistinės fibrozės:** 1\. antiproteaze alpha1-antitripsinu Apsaugo plaučius nuo fermentų poveikio Reikalingos neutralizuoti pernelyg didelį kiekį neutrofilų elastazių. Slopina neutrofilus. 2\. DNAze I Sumažina skreplių klampumą, suskaidydama neutrofilų elastazę, kuri išsiskiria iš žuvusių neutrofilų pūlingame kvėpavimo takų sekrete. 3\. Plaučių arba plaučių ir širdies transplantacija. **Adenozino deaminazės (ADA) nepakankamumas** ADA nepakankamumas - tai taip pat retas autosominis recesyvinis sutrikimas, kuris pasireiškia stipriu imuninės sistemos veiklos nepakankamumu. Normalus ADA genas koduoja fermentą adenozino deaminazę, kuris yra būtinas efektyviam imuninės sistemos funkcionavimui. Nesant ADA fermento didėja dATP koncentracija, kas sukelia T limfocitų diferenciacijos blokavimą čiobrialiaukėje. ADA nepakankamumas kaip taikinys genų terapijai buvo pasirinktas dėl kelių priežasčių: ligą sąlygoja vieno geno mutacija, ADA kiekis neturi būti tiksliai reguliuojamas. Net maži enzimo kiekiai yra naudingi organizmui. **Šeimyninė hipercholesterolemija (ŠH).** ŠH - tai dažnas autosominis dominantinis sutrikimas, pasireiškiantis dažniu 1 iš 500 gimusių. Sutrikimas dažnai pasireiškia aterosklerozės išsivystymu. Aterosklerozė charakterizuojama nuolatiniu arterijų spindžio siaurėjimu ir galiausiai visišku užsikimšimu. ŠH taip pat yra genų terapijos taikinys. Žinoma, kad ŠH priežastis yra mažas žemo tankumo lipoproteinų receptorių kiekis. **Huntingtono liga.** Tai monogeninė autosominė dominantinė liga. Ji pasireiškia motorikos sutrikimais, elgsenos ir psichiatriniais sutrikimais bei dementija (kognityviniai sutrikimai). Šie sutrikimai pagrindinai yra susiję su smegenų pamato branduolių degeneracija. Pasitaiko 5 -10 atvejų iš 100000 gyventojų. Kadangi liga dominantinė, 50% šios ligos nešiotojų vaikų taip pat paveldi ligą. **Huntingtono ligos priežastys** Ligą sukelia vienas mutantinis genas 4-oje chromosomoje. Šis genas koduoja didelį baltymą, huntingtiną, kurio funkcija iki šiol nenustatyta. Geno mutacija susijusi su CAG (citozinas, adeninas, guaninas) **tripletų padaugėjimu tame gene**. CAG koduoja glutaminą. Normaliame šio geno variante CAG pasikartoja mažiau nei 40 kartų. Sergančiųjų, CAG pasikartojimų skaičius viršija 40. Jei pasikartojimų yra nuo 70 iki 100 liga pasireiškia iki subrendimo. Normalaus geno huntingtinas lokalizuojasi neuronų citoplazmoje, tuo tarpu mutantinis - patenka į branduolį, ko pasėkoje neuronas apoptotiškai žūna. Tikslus ligos mechanizmas nėra aiškus, todėl kol kas genų terapija turi tik potencines galimybes Huntingtono ligos gydymui. **Alzheimerio liga.** Tai neurodegeneratyvinė liga, kurios metu stebima neuronų žūtis. Tai sąlygoja tokius klinikinius simptomus, kaip ryškūs atminties ir dėmesio sutrikimai, elgsenos ir emocijų sutrikimai. Alzheimerio liga yra susijusi su neuronų citoskeleto suardymu. Pagrindinis veiksnys sąlygojantis šį citoskeleto suardymą yra baltymo, kuris susijęs su citoskeleto mikrotubulėmis, mutacija. Kitas ryškus požymis paciento smegenyse yra senatvinių amiloidinių plokštelių formavimasis. **Duchenne raumenų distrofija (DMD)** X-susiję; 1/ 3500 berniukų pasaulyje (mergaitės neserga šia liga, tačiau gali paveldėti ligos geną ir perduoti jį savo palikuonims) Būdinga greitai progresuojanti raumenų degeneracija. Pokyčius lemia DMD geno mutacija. Genas koduoja baltymą distrofiną -- kuris užtikrina raumeninio audinio distroglikanų komplekso stabilumą. Atsiranda kūno sąnarių, kaulų deformacijos, gali pasireikšti net protinis sutrikimas. Duchenne raumenų distrofija prasideda 2-5 gyvenimo metais, jau aštuntaisiais - dešimtaisiais amžiaus metais vaikai labai sunkiai vaikšto, o 14-15 metų patys nebepaeina. **Priežastys DMD** Genetinis defektas sąlygoja raumeninių ląstelių sienelės (membranos) nepilnavertiškumą: joje trūksta tam tikrų baltymų, todėl ląstelėse sutrinka angliavandenių, baltymų apykaita. Dėl šių priežasčių raumenų skaidulos plonėja (atrofuojasi), žūsta, tuomet jas pakeičia riebalinis ir jungiamasis audinys. Raumuo gali atrodyti tokios pačios ar net didesnės apimties, tačiau jo jėga yra sumažėjusi, nes riebalinis audinys susitraukinėti negali. Duchenne raumenų distrofija progresuoja greitai -- neretai ligoniai išgyvena mažiau nei 20 metų. Medicininio gydymo šiai ligai nėra. Gydomos ligos komplikacijos. **Šoninė amiotrofinė sklerozė (ŠAS)** Šoninė amiotrofinė sklerozė -- progresuojanti neurodegeneracinė liga, kuri veikia smegenų ir stuburo nervų ląsteles. Motoriniai neuronai iš smegenų siunčia signalus į stuburo smegenis, o iš ten į viso kūno raumenis. Sergant ŠAS, progresuojanti motorinių neuronų degeneracija lemia jų sunykimą. Mirus šiems neuronams, smegenys nebegali inicijuoti ir kontroliuoti kūno raumenų, todėl prarandamas valingas raumenų judėjimas. **Požymiai ir simptomai.** ŠAS pradžioje simptomai gali būti tokie menki, kad dažnai lieka nepastebėti. Raumenų silpnumas delnuose, rankose, kojose arba sutrikusi kalbos, ryjimo ar kvėpavimo raumenyno funkcija; Pablogėjęs rankų ir kojų valdymas; Prislopinta kalba; Pažengusioje ligos stadijoje -- sutrumpėjęs įkvėpimo laikas, apsunkintas kvėpavimas ir ryjimas; Svorio kritimas. **Gydymas**- labai ribotos galimybės ir jokia terapija negali atstatyti pažeistų neuronų ar užkirsti kelią ligos progresavimuiui. **Priežastys:** Nors yra daugiau nei 50 genų, susijusių su ŠAS, tik keletas genų mutacijų yra patvirtinti kaip ligos sukėlėjai: 9 chromosomos atviro skaitymo rėmelis 72. Superoksido dismutazė. TAR DNR-surišantis baltymas 43. Fus baltymas. Serino palmitoiltransferazįs ilgos grandinės bazinis subvienetas 1. **Pagrindiniai genų terapijos taikiniai** *Centrinė nervų sistema (CNS):* CNS auglių gydymas. Nervų ligoms -- Alchaimerio ligai, epilepsijai, išsėtinei sklerozei -- gydyti genų terapija bus galima taikyti tik tada, kai bus tiksliai nustatyti jas lemiantys konkrečių genų defektai. *Kvėpavimo organų sistema:* plaučių vėžio, mukoviscidozės ir α antitripsino stokos gydymas. hipercholesterolemijos gydymas ir kt. *Kepenys:* šeimyninės hipercholesterolemijos gydymas ir kt. *T ląstelės ir hemopoetinės ląstelės:* kraujo vėžio (įvairių tipų leukozių) ir AIDS gydymas. Deja, kol kas šioje srityje genų perkėlimas laukiamo efekto neduoda, taigi ir gydymo rezultatai yra prasti. *Raumenys.* Daugelis paveldimų ligų sąlygoja raumenų atrofiją. *Kraujotakos sistema.* Jau atlikti klinikiniai bandymai, gydant širdies vainikinių kraujagyslių susiaurėjimą (stenozę). Kitas kraujotakos sistemos genų terapijos taikinys -- aterosklerozė. **Paveldimas žmogaus ligas galima suskirstyti į 5 dideles grupes**. Tai: 1) chromosominės ligos, 2) vieno geno lemiamos (monogeninės) ligos, 3) daugiaveiksnės ligos, 4) mitochondrinės ligos ir 5) somatinių ląstelių genetinės ligos (vėžys). Viena iš genų terapijos panaudojimo sričių širdies ir kraujagyslių ligų gydyme yra **terapeutinė angiogenezė** - naujų kraujagyslių ("atžalų") auginimas iš senesnių organizmo kraujagyslių (nepainioti su vaskulogeneze -- embrioniniu kraujo indų vystymusi iš angioblastų). **Egzogeniniai angiogeniniai citokina**i (arba genai, koduojantys šiuos citokinus) vartojami tam, kad sustiprintų ar paskatintų kolateralinių kraujo indų vystymąsi išemijos paveiktame audinyje. Identifikuota nemažai angiogeninių citokinų (angiopoetinas, granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius, hepatocitų augimo faktorius, interleukinas 8, leptinas, placentos augimo faktorius, trombocitų kilmės faktorius, tiroksinas, navikų nekrozės faktorius ir kiti), tačiau klinikiniuose bandymuose geriausiai veikė **1). endotelinis augimo faktorius 2). fibroblastų augimo faktorius** **Fibroblastų augimo faktorius** -- polipeptidų, potencialių angiogenezės skatintojų, šeima. Šie faktoriai nėra specifiški endotelio ląstelėms, jų receptorių pilna visose ląstelėse, taip pat ir fibroblastuose bei kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelėse. Jo pagrindinė funkcija kardioapsauginė: miokardo infarkto metu jis dalyvauja atsiradusių žaizdų užgydyme, be to, dar gali atlikti citoapsaugines funkcijas kur nors kitur (pvz., CNS) **Genų terapija teoriškai reikalauja tik 1 dozė**s ilgalaikei ir lokaliai norimo augimo faktoriaus gamybai, o tai neabejotinai geriau, nei pakartotinės norimo genų produkto, kuris sąlyginai greitai pasišalina iš plazmos, injekcijos. Pagrindinė terapeutinės angiogenezės problema -- **patologinės angiogenezės tikimybė**. Ji susijusi su navikų augimu, diabetine proliferacine retinopatija, aterosklerozės progresavimu ar aterosklerotinių plokštelių protrūkiais, kuriuos sukelia jų neovaskuliarizacija. Taip pat tai gali prisidėti prie piktybinių navikų augimo. Štai kodėl vėžininkai yra atriboti nuo eksperimentų su šiais augimo faktoriais, tačiau galima ir neaptiktų piktybinių navikų stimuliacija kituose pacientuose. **Idealus agentas terapeutinėje angiogenezėje turi būti saugus, efektyvus, nebrangus ir lengvai kontroliuojamas**. Pagrindinis kraujagyslių entotelinio augimo faktoriaus privalumas - specifiškumas endotelio ląstelėms - gali būti traktuojamas kaip neigiama savybė, jei skatina tik mažų, ne raumeninių arterijų, negalinčių tiekti atitinkamo kraujo kiekio, augimą. Fibroblastų augimo faktorius gali stimuliuoti didesnių, raumeninių arterijų augimą su padidėjusia perfuzine talpa, tačiau jis nėra specifiškas, kas sukelia pašalinį sisteminį poveikį. **Etinės problemos** Genų terapijos panaudojimas sunkių somatinių ligų gydymui visuomenės priimamas gana tolerantiškai. - Vystantis prenatalinei diagnostikai įgimtų ligų gydymui pradedama taikyti *in utero metodika*. - Motinos gimdoje esančiam vaisiui perkeliami reikiami genai. Naudojama ta pati metodika, kaip ir suaugusiųjų ar vaikų gydyme. Dabar ši metodika panaudojama sunkių somatinių ligų, keliančių pavojų motinos arba vaisiaus gyvybei, gydymui. - Tačiau galimos lytinių ląstelių modifikacijos, norint suteikti palikuonims vienokius ar kitokius požymius, sukelia daugybę didžiosios visuomenės dalies vertinamas labai nepalankiai. - Didžiausius prieštaravimus sukelia klonavimo ir genų inžinerijos derinimas. - Tokia technologija buvo panaudota įterpiant į paimtą iš avies gimdos ląstelę žmogaus IX kraujo krešėjimo faktoriaus geną, iš tokios modifikuotos ląstelės buvos užauginta avis, kurios organizme sintetinosi žmogaus IX kraujo krešėjimo faktorius. - Galimas panašių genetinių žmogaus modifikacijų taikymas sukelia dar didesnį priešiškumą nei žmogaus klonavimas **[2 TEMA. VIRUSINIAI VEKTORIAI]** **Genų transfekcijos metodai** **Visi nešikliai** ar su jais susijusios priemonės, **kurie padidina DNR transfekcijos efektyvumą ląstelėse**, gali būti laikomi vektoriais. **NEVIRUSINIAI VEKTORIAI** - Fiziniai (DNR injekcija; genų šautuvas; elektroporacija; sonoporacija) - Cheminiai (lipopleksai ir polipleksai) **VIRUSINIAI VEKTORIAI (Retrovirusai; Lentivirusai; Adenovirusai; AAV; Kiti virusai)** **[Vektorių panaudojimo problemos]** - **Ląstelių-taikinių specifiškumas.** Dauguma vektorių nepaisant jų didelio efektyvumo, nepasižymi dideliu selektyvumu, veikiančiu tik norimo audinio ląsteles. - **DNR integracija į genomą.** Svetimos DNR integracijos į ląstelės-šeimininkės genomą spontaninis dažnis yra labai nedidelis. Tačiau injekuotos plazmidinės DNR integracija į šeimininko genomą gali sukelti mutacijas, jeigu DNR įsiterps į koduojančią sritį. - **Genų ekspresija.** Perkėlus geną iš vienos ląstelės į kitą, reikia užtikrinti ilgalaikę ir stabilią jo ekspresiją. Tai vienas pagrindinių šiuolaikinių vektorių trūkumų. - **Vektorinių sistemų gamybos problemos.** Plečiantis praktiniam genų terapijos panaudojimui reikia gauti didelius vektorių kiekius. Virusiniai vektoriai gali būti auginami tik gyvose ląstelėse. Vienas pagrindinių rizikos faktorių -- galimybė, kad susiformuos replikuotis sugebantys virusiniai vektoriai. - **Etinės problemos.** Genų terapijos panaudojimas sunkių somatinių ligų gydymui visuomenės priimamas gana tolerantiškai. Iki klinikiniai eksperimentai atliekami su gyvūnais, tame tarpe ir primatais. Tai kelia didelį nepasitenkinimą gyvūnų globos draugijų ir kovotojų už gyvūnų teises. Išsivysčius GT technologijoms žmonės gali pradėti ją naudoti norėdami pakeisti savo ūgį įvedant papildomus augimo hormono genus arba padidinti raumenų masę įvedus distrofino genus. Didžiausią susirūpinimą kelia tai, kad GT metodais atsiras galimybė modifikuoti lytines ląsteles, norint susilaukti palikuonio su \"užsakytomis\" savybėmis. **KLINIKINIŲ TYRIMŲ FAZĖS** **l fazė.** Baigus darbą laboratorijoje bei atlikus visą eilę ikiklinikinių tyrimų su gyvūnais (pelytėmis, triušiais, beždžionėmis ir kitais) bei gavus vilčių teikiančius rezultatus, estafetę perima žmonės. Pirmiausia atliekami tyrimai su sveikais savanoriais. Šiame etape paprastai dalyvauja nuo 20 iki 100 savanorių. Paprastai jiems mokami pinigai, bet kartais preparatas ar gydymo metodas pasirodo toks kenksmingas, kad toliau tyrimai nebedaromi. I fazės tyrimas - tai vaisto farmakologijos ar gydymo metodo žmogaus organizme tyrimas, kuris neturi gydymo tikslo. Tyrimo tikslas - gauti preliminarių duomenų apie vaisto ar metodo saugumą ir trumpai aprašyti farmakokinetinius ir farmakodinaminius tiriamojo vaisto ar metodo duomenis žmogaus organizme. **II fazė.** II fazės tyrime jau kviečiami dalyvauti ligoniai. Visuomet aktuali etinė problema - t.y. ar ligoniai nebus priversti atsisakyti šiuo metu prieinamo geriausio įrodyto poveikio gydymų. **Todėl grynai tiriamosios medžiagos ir placebo palyginamieji tyrimai retai gauna bioetikos komitetų leidimus.** Pirminis II fazės tyrimo tikslas - nustatyti vaisto ar gydymo metodo efektyvumą sergant tam tikra liga. Nustatomas reikalingos dozės režimas, taip pat vertinamas dozės ir atsako ryšys. Dažniausiai tyrimas kontroliuojamas palyginamuoju preparatu arba placebu, nors gali būti vertinamas vaisto poveikis ligos eigai, lyginant pradinę būklę su būkle po gydymo. Tai trumpos trukmės tyrimas, kai vaistas ar metodika naudojami gydymui. Tyrimo rezultatai sudaro pagrindą III fazės tyrimams. Dažniausiai dalyvauja apie 200 -300 dalyvių. **III fazė**. III fazės tyrimų tikslas yra patikrinti preliminarius II fazės tyrimų duomenis, įsitikinti, kad vaistas ar metodika yra efektyvūs ir saugūs naudojant pagal tam tikrą indikaciją tam tikra liga sergantiems pacientams. Tyrime dalyvauja jau keli tūkstančiai pacientų. Tyrimo dalyviams už dalyvavime tyrimuose nemokama. Tai paskutinė tyrimų fazė prieš pateikiant vaistą į prekybą ar metodiką gydymui: tyrėjai bando tiksliai nustatyti vaisto saugumą ir veiksmingumą, todėl skiria daug ilgesnį laikotarpį. Tyrimai atliekami didesnėse pacientų grupėse, įvairesnėse pacientų populiacijose, skirtingose ligos stadijose arba derinant gydymą su kitais vaistais. Šios fazės tyrimų tikslas yra nustatyti trumpalaikio ir ilgalaikio gydymo saugumą ir efektyvumą gydant tam tikra vaisto forma, įvertinti bendrą ir terapinę vertę, palyginti su gerai žinomų giminingų vaistų ar gydymo metodikų saugumu ir efektyvumu, nepageidaujamų reakcijų į vaistą dažniu. Jeigu III fazė užbaigiama sėkmingai, naujo vaisto gamintojai gali kreiptis dėl licencijos produktui gaminti ar metodui taikyti. **IV fazė**. IV fazei priklauso visi vaisto ar metodikos tyrimai, kai tiriamasis vaistas ar metodika šalyje yra įregistruoti. Tyrėjai ir toliau privalo tirti ilgalaikį naudingą ir nepageidaujamą jo poveikį; lyginti jo efektyvumą su atitinkamais kitais vaistais ar metodais; nustatyti galimus nesuderinamumo su kitais vartojamais vaistais atvejus; išsiaiškinti, ar nėra geresnio vaisto dozavimo kurso ir ar nėra kitų jo pritaikymo galimybių: atlikti mirtingumo (mirštamumo) tyrimus. **VIRUSIAI IR VIRUSINIAI VEKTORIAI** **Virusai** tai obligantiniai viduląsteliniai parazitai. Tai reiškia, kad jie negali daugintis už gyvos ląstelės ribų. Kiekvienos rūšies virusas paprastai susideda iš dviejų dalių: - iš baltymų sudarytos kapsidės - bei vidinės šerdies, sudarytos iš nukleorugšties - DNR ar RNR. - Kapsidę dar gali supti išorinis membraninis apvalkalas, kuriame dar gali būti atsišakojančių glikoproteinų. Intensyviai tyrinėjami virusai: retrovirusai, adenovirusai, su adenovirusais susiję virusai, herpes simplex virusai. Daugiausia tyrimų atliekama Jungtinėse Amerikos valstijose, ir Jungtinėje Karalystėje. **RETROVIRUSAI** **Retrovirusai** yra apvalkalą turintys virusai, kurių genomas sudarytas iš dviejų vienodų RNR. - Jie replikuojasi panaudodami atvirkštinę transkriptazę (reverse transcriptase), kuri nukopijuoja RNR genomą į viengrandę DNR (ssDNA) molekulę. - Vėliau ta pati transkriptazė katalizuoja komplementarios DNR grandinės sintezę. - Susidariusi dvigrandė DNR integruojama į infekuotos ląstelės chromosominę DNR. - Tuomet integruota provirusinė DNR yra transkribuojama ir transliuojama panaudojant infekuotos ląstelės transkripcijos ir transliacijos aparatą. - Transkribuota iRNR gali būti transliuojama į virusinius baltymus arba supakuojama į viriono apvalkalą, užbaigiant naujo viriono gamybą. Nauji virionai per infekuotos ląstelės membraną atsiskiria į išorę pumpuravimosi būdu. - Virusas susiriša su jam specifiniu ląstelės paviršiuje esančiu receptoriumi, su kuriuo tiesiogiai sąveikauja Env (paviršiaus) baltymas. Šios sąveikos dėka, virusas susilieja ir įsiskverbia į ląstelės vidų endosomų sistemos pagalba. - Atsipalaidavusi viruso RNR iš viruso struktūros verčiama į DNR provirusą. - Ląstelės dalijimosi metu, kada suardomas branduolio apvalkalas, provirusinė DNR pasiekia šeimininko branduolį ir viruso integrazės pagalba integruojama į genomą. Integrazė, kaip ir koduojama pol geno, viruso atsinešama į ląstelę viruso struktūroje. - Branduolyje integruotas provirusas transkribuojamas, jo iRNR splaisuojama, transportuojama į citoplazmą transliacijai. - Sintetinami viruso Gag, Pol, Env baltymai pakuoja viso ilgio nesplaisinguotą viruso transkriptą suformuodami virusinę dalelę, kuri atsipumpuruoja nuo ląstelės išorinės membranos ir išeina į aplinką. Kai kurie retrovirusai savo genome turi vėžį sukeliančių genų - **onkogenų**. Tokiais virusais infekuotos ląstelės transformuojasi į navikines ląsteles. Pavyzdžiui, žmogaus T ląstelių limfotropinis virusas (HTLV) sukelia leukemiją, žmogaus imunodeficito virusas (HIV) sukelia AIDS. Retrovirusų genomas sudarytas iš 3 pagrindinių genų: **gag, pol, env**. Kurie iš abiejų šonų apsupti ilgų galinių pasikartojimų (LTRlong terminal repeat), bei susipakavimo signalo (psi), kuris skatina viruso genomo susirinkimą į virusines daleles. - **Gag** genas koduoja kapsidės baltymus. - **Pol** - atvirkštinę transkriptazę, virusinę integrazę ir virusinę proteazę, kuri veikia gag produktus. - **Env** - koduoja glikozilintus apvalkalo baltymus, kurie lemia viruso tropizmą (sugebėjimą infekuoti ląsteles taikinius). - **LTR (long terminal repeat)** sekos turi cis-veikimo sekas, reikalingas koordinuoti viruso genomo replikaciją, transkripciją ir tarpininkauti viruso genomo integravimuisi į šeimininko genomą. Kaip minėta, paprastai retrovirusai nesukelia vėžio, tačiau kiti, šalia gag, pol ir env genų turi papildomus onkogenus, galinčius modifikuoti infekuotų ląstelių ciklus, sukelti vėžį ir nužudyti visą organizmą. Iš retrovirusinių vektorių dažniausiai yra naudojamas **pelių leukemijos virusas (MuLV - murine leukemia virus)**. Ruošiant vektorių iš šio viruso pašalinami gag, pol ir env, genai, tačiau paliekant LTR ir susipakavimo signalą. - Tam, kad gauti RV gaminančias ląsteles, jos stabiliai transformuotos gag, pol ir env genais, atsakingais už kapsidės ir apvalkalo baltymų sintezę. - Papildomai transfekuojant šias ląsteles terapiniu genu, iš abiejų galų apsuptu LTR ir (viename gale) gaunami rekombinantiniai RV, nešantys įterptą terapinį geną. **TRŪKUMAI** - Naudojant MuLV (pelių leukemijos) virusinį vektorių galima transfekuoti tik **besidalijančias** ląsteles. Todėl jie netinka tokių audinių, kaip raumuo (raumeninės skaidulos), smegenys (neuronai) kepenys (hepatocitai), hematopoetinių ląstelių genų terapijai. - Postmitotinių ląstelių RV negali transfekuoti dėl to, kad jų genomo patekimui į branduolį būtina mitozė. - Kitos svarbios problemos, susijusios su retrovirusinių vektorių panaudojimu yra **žemas jų gamybos titras** **(108-109 virusinių dalelių 1 ml), imunogeniškumas** ir MuLV atveju, jų **inaktyvavimas**, veikiant imuninei sistemai. Siekiant sumažinti imunogeniškumą, RV supakavimui naudojamos žmogaus ląstelės. - Kitas retrovirusus ribojantis faktorius yra tai, kad virusinę dalelę galima įterpti iki **9-10 kb** dydžio svetimą geną (terapinį ar geną markerį). - **Daugelio genetinių ligų gydymui tai nepakankamas dydis.** - Labai svarbi ir kol kas neišspręsta problema išlieka tai, kad RV į šeimininko genomą nešamus genus **integruoja atsitiktinai. Retais atvejais tai gali modifikuoti gyvybiškai svarbių genų veiklą, sukelti vėžį.** - Dar viena problema susijusi su pavojais, kad RV gaminančios ląstelės gali atsitiktinai **užsikrėsti natyviniais retrovirusais**. Tokiu atveju būtų gaminami besireplikuojantys RV. Aišku, tokių vektorių panaudojimas sukeltų neprognozuojamas pasekmes. Šiuo metu tyrinėjami kiti retrovirusai - **lentivirusai ir ŽIV virusai**. Jie gali transfekuoti ir nesidalijančias ląsteles. **Tačiau labai didelis šių virusų patogeniškumas reikalauja milžiniško atsargumo.** **[II. Adenovirusiniai vektoriai]** - Tai vienas iš geriausiai ištirtų ir priimtiniausių virusinių vektorių. Nepastebėta, kad po adenovirusinių vektorių panaudojimo (po genų terapijos) būtų sukeltos rimtos ligos. Adenovirusiniai vektoriai gali transfekuoti ir **nesidalijančias ląsteles**. Jo pernešta genetinė medžiaga nesiintegruoja į transfekuotos ląstelės genomą, o lieka episominėje būsenoje citoplazmoje. - Episominėje būsenoje įvesto geno ekspresija nestabili ir greitai inaktyvuojama. Todėl siekiant palaikyti pastovią įvesto geno ekspresiją, dažniausiai reikia pakartotinos genų terapijos. - Dauguma adenovirusinių vektorių talpina iki **7 kb** dydžio svetimos genetinės informacijos. Nesenai atrastas būdas, kaip pašalinti iš esmės visą adenoviruso genomą. Tokių pseudovirusų talpa siekia iki **35 kb**. - Pagrindiniai adenovirusinių vektorių pranašumai yra palyginti aukšti gamybos titrai (iki **1011-1012 virusinių dalelių 1 ml**), galimybė transfekuoti dauguma audinių, tame tarpe ir plaučius. Tai jį leido panaudoti cistinės fibrozės gydymui. Pagrindinis trūkumas - **virusas pasižymi stipriu imunogeniškumu**. Tai limituoja jo pakartotinus panaudojimus. **Viruso genomas yra dvigrandė, linijinė 36 kb DNR, galuose turi invertuotus terminalinius pasikartojimus (ITR), prie kurių abiejų 5' - galų prisijungęs terminalinis baltymas (TP).** DNR supakuoja bazinis baltymas VII ir mažas peptidas mu. Šią struktūrą supa VI baltymas. Virusas savyje turi ir viruso koduojamą proteazę (Pr). Viruso replikaciją atlieka viruso koduojama DNR polimerazė. - Adenovirusų šeimos virusai gali daugintis įvairiose pomitotinėse ląstelėse, net labai diferencijuotose ląstelėse, skeleto raumenų, plaučių, smegenų, širdies raumenų ląstelėse, tiek besidalinančiose, tiek ramybės būsenoje esančiose ląstelėse. - Virusas patenka į ląstelę naudodamas ląstelės receptorius CAR (coxsackie/adeno receptor), su kuriais sąveikauja išsikišusios fibrilinės struktūros. Tai pagrindinis adenovirusų receptorius, tačiau kai kurios adenoviruso serogrupės patekimui į ląstelę naudoja audinių suderinamumo komplekso imunoglobinų superšeimos baltymą, dar kitos naudoja sialoglikoproteinus. Virusas į ląstelę patenka endocitozės būdu dalyvaujant klatrinui. - Iš endosomų virusas patenka į citoplazmą, jo proteazė apardo apvalkalą, atpalaiduodama nukleokapsidą. Kelionei į branduolį virusas naudoja ląstelės dineiną ir mikrovamzdelių sistemą. Patekus į branduolį, prasideda ankstyvųjų genų, sugrupuotų į keturias raiškos kasetes E1, E2, E3 ir E4 transkripcija, splaisingas ir ankstyvųjų produktų formavimasis. **[ADENOVIRUSINIAI VEKTORIAI]** Adenovirusai yra patogūs vektoriams konstruoti, nes jie gali infekuoti labai įvairias ląsteles, tame tarpe nesidalijančias ląsteles. Virusus nesunku dauginti ir gauti didelius viruso titrus. Į viruso struktūrą, nepažeidžiant funkcijų, galima įterpti apie 2 kb papildomos DNR. Norint įterpti didesnes sekas, reikia pašalinti dalį viruso genomo. Vektoriai naudojami vėžio terapijoje, genų terapijoje, pagalbinei terapijai - įvedant genus, padedančius kovoti su liga. **Pirmos generacijos adenovirusiniai vektoriai** - Pirmos generacijos vektoriuose buvo pakeičiamos E1 ir/arba E3 kasetės. Tai leido įvesti iki 6,3 kb papildomos DNR. E1 sekos pašalinimas vektoriuose turi privalumą, nes E1 reikalingas E2 transkripcijai, ir toks vektorius neturėtų replikuotis ir sintetinti vėlyvųjų kapsidės baltymų.  - Deja, paaiškėjo, kad tokio tipo vektoriai yra tinkami tik laikinai raiškai. Besidalijančios ląstelės tokį vektorių pameta, nes jis nesireplikuoja. - Vėliau, paaiškėjo, kad jis kažkiek tai replikuojasi, ląstelės baltymai dalinai pakeičia trūkstamus E1 produktus ir indukuoja E2 baltymų, būtinų replikacijai sintezę, todėl vektoriai, nors ir silpnai, replikuojasi ir sintetina virusinius baltymus. - Prieš šiuos baltymus formuojasi imuninis atsakas. Dėl šios priežasties, ląstelės, turinčios vektorių yra gana greitai imuninės sistemos eliminuojamos. - Be to, E1B kasetės pašalinimas labai susilpnina viruso galimybes priešintis ląstelės apoptozei. - Sužinojus šias visas problemas, imta tobulinti vektorius, siekiant minimalizuoti viruso genomo dalį, paliekamą vektoriuje. - Be to, virš 50% žmonių populiacijos yra buvę infekuoti adenovirusu, kai kurių šalių armijose yra skiepijama nuo šio viruso, siekiant išvengti netikėtų peršalimo simptomų, todėl adenovirusų vektorių, produkuojančių viruso baltymus galimybės genų terapijoje pasirodė labai ribotos. **Antros ir trečios kartos adenovirusiniai vektoriai** - Tolesniuose etapuose buvo tobulinamos ląstelių linijos, skirtos vektoriaus dauginimui. - Buvo stengtasi sukurti tokias ląsteles, kurios kiek galima daugiau viruso baltymų pateiktų trans, tokiu būdu pašalinti galimybę vektoriui replikuotis. - Buvo sukurtos ląstelių linijos, trans sintetinančios E2 baltymus. Tačiau to nepakako, kad pilnai būtų išvengta vėlyvųjų baltymų sintezės ir imuninės sistemos atakos, todėl vėlesniuose vektoriuose buvo stengiamasi pašalinti kiek galima daugiau viruso genų, konstruojami taip vadinami "gutless" vektoriai, kuriuose visa koduojanti dalis pašalinta. - Tokiems vektoriams dauginti naudojamos ląstelių linijos su pagalbiniais virusais. Pagrindinė problema yra atsivalyti nuo pagalbinių virusų. Siekiant tokiuose vektoriuose ekspresuoti genus, yra labai svarbu išlaikyti viruso dydžio genomą, t.y. apie **36 kb**. - Jeigu įvedama nedidelė raiškos kasetė (promotorius, genas, transkripcijos terminatorius), papildomai būtina įvesti balastinę DNR, kuri papildytų vektoriaus DNR iki 36 kb. - Paaiškėjo, kad vektoriuose naudinga palikti kai kuriuos E4 kasetės genus, jie dalinai apsaugo nuo T-ląstelių atsako. - Tokiu būdu vektoriai pastoviai tobulinami. Tačiau visais atvejais, adenovirusų vektoriai užtikrina įvairų laiką trunkančią laikiną ekspresiją, bet **neužtikrina ilgalaikės transgeno ekspresijos**, nes vektorius funkcionuoja greta genomo, nesireplikuoja kartu su genomu. - Šie vektoriai gana ilgai funkcionuoja lėtai regeneruojančiuose audiniuose, juos galima naudoti genų įvedimui į kepenis, smegenų ląsteles. **[III. Su adenovirusais susiję virusiniai vektoriai (AAV)]** - AAV nepasižymi jokiais patogeniniais reiškiniais. Manoma, kad apie 80% populiacijos šiems virusams turi antikūnų. - AAV vektorius gali pernešti genetinę medžiagą į daugelį audinių. - Jų genomas integruojasi specifiškai į 19 chromosomą, nesukeldamas jokių pastebimų šalutinių reiškinių. - AAV vektoriai pasižymi žemu imunogeniškumu. Pagrindinis jų trūkumas yra tai, kad jų **gamyba yra sudėtinga** (dauguma AAV sistemų turi būti naudojamos kartu su adenovirusais, kurie atlieka pagalbininko funkcijas). Be to, AAV talpina tik iki **4,8 kb** svetimos genetinės medžiagos. - Adeno-asocijuoti virusai (AAV) priklauso parvovirusų šeimai Parviviridea. - Vektorių konstravimui dažniausiai naudojamas AAV2. - AAV infekcija nesukelia jokių pastebimų ligos simptomų - **AAV yra vieni iš mažiausių DNR virusų**, jų genomą sudaro 5 kb viengrandė DNR, kurios galuose yra TR (terminalinių pasikartojimų) sekos, ribojančios viruso genomą, jose taip pat aptinkamas ir pakavimo signalas, būtinas viruso DNR supakavimui į viruso kapsidę. Koduojamoje dalyje randamos dvi genų grupės, rep ir cap. - Dėka alternatyvaus splaisingo susidaro po kelis kiekvieno geno produktus. **Rep** koduoja baltymus, kontroliuojančius replikaciją ir integraciją, **cap** -- struktūrinius viruso komponentus. - Šie virusai infekcijos metu pasidaugina ląstelėje ir integruojasi į specifinį 19 chromosomos lokusą. Virusų replikacijai reikalingas pagalbininkas AdV virusas. **AAV pasižymi labai plačiu šeimininkų ratu bei dideliu tropizmu, t.y. gali infekuoti daug skirtingų audinių**. - Infekavus be pagalbinio AdV viruso, AAV replikuojasi labai blogai ir dideliu dažnumu integruojasi į 19 chromosomą. - Infekavus ląsteles su AdV, AAV genomas iššoka iš chromosomos ir pradeda viruso vystymosi ciklą. - Panaudojant šį vektorių pavyko gauti ilgalaikį geno funkcionavimą **raumenyse, smegenyse, kepenyse,** įvairiuose gyvūnuose: **pelėse, šunyse, beždžionėse**. - Deja, **rep** baltymai yra **citotoksiški**, todėl sunku prigaminti didelius viruso kiekius, be to, viruso replikacijai reikalingas pagalbinis virusas AdV. Kita problema -- **dydis**. Kol kas galima įvesti iki 2,4 kb. - Tačiau jau yra parodyta, kad šie virusai konkatemerizuojasi ir integruojasi tendemiškai, todėl įmanoma integruoti didelį geną dalimis, atskirais vektoriais, turinčiais splaisingo signalus. **[IV. Herpes simplex vektoriai (HSV)]** HSV gali transfekuoti tiek besidalijančias, tiek ir nesidalijančias ląsteles. HSV ypač gerai transfekuoja **nervų sistemos ląsteles**, todėl manoma, kad ateityje gali būti sėkmingai pritaikyti nervų sistemos genų terapijai. HSV vektoriai gali talpinti didžiulį kiekį (**iki 150 kb**) svetimos genetinės medžiagos. Pagrindiniai HSV trūkumai yra **didelis virusinių dalelių imunogeniškumas, ilgalaikis genetinės medžiagos išlaikymas virusinėje dalelėje** ir, kaip ir retrovirusų atveju, **atsitiktinis integravimasis** į transfekuotos ląstelės genomą. **[VIRUSINĖS KILMĖS VEKTORIAI]** Virusai evoliucionavo kartu su žmogaus organizmu, prisitaikė efektyviai infekuoti įvairias ląsteles ir pajungti ląstelės sistemas savo komponentų sintezei. Idealus virusinis vektorius genų terapijai būtų viruso struktūra išlaikiusi galimybę efektyviai infekuoti ląsteles, tačiau nesintetinanti viruso baltymų, kurie skatina viruso replikaciją, turi toksišką poveikį bei sukelia CTL (citotoksiniai T-limfocitai) atsaką. To siekiama šalinant viruso genus, jų produktus pateikiant trans pakavimo ląstelių linijose. Paliekami tik tie viruso elementai, kurie būtini cis padėtyje, tai nukleorūgščių pakavimo signalai, replikacijai būtini signalai, kaip taisyklė, galinės kartotinės sekos. Šios sekos būtinos sukonstruotų struktūrų replikacijai, jų supakavimui į virusinę dalelę, integracijai į šeimininko chromatiną. Ekspresijos kasetė su terapiniu genu klonuojama į viruso "pagrindą" , t.y. minimalią viruso genomo struktūrą, pakeičiant virusinius genus. Pašalinti genai, reikalingi replikacijai ar viruso dalelės formavimui, pateikiami pakavimo ląstelėse trans pavidale. Pakavimo ląstelės transfekuojamos vektoriaus genomu bei pakavimui reikalingomis defektyviomis viruso konstrukcijomis, formuojančiomis trans reikalingus produktus. Tokiu būdu pakavimo ląstelėse suformuojamos vektorių turinčios virusinės dalelės. Rekombinantinės virusinės dalelės gryninamos, įvertinamas jų kiekis bei grynumas. Viena iš pagrindinių rekombinantinių virusinių dalelių charakteristikų yra galimybė gauti **aukštus jų titrus, virusinių dalelių stabilumas, bandymų atsikartojamumas.** [Pagal galimybę integruotis į genomą, vektorius galime suskirstyti į dvi grupes: ] - **RV, lentivirusai ir AAV** **(10%) integruojasi į genomą;** - **AdV, HSV1 ir AAV (90%) funkcionuoja kaip ekstrachromosominiai elementai episominėje būsenoje.** AAV priklauso abiem klasėms, nes apie 10% jų integruojasi į 19 chromosomos specifinę vietą, tačiau didelė dalis lieka episominėje būsenoje. Vektoriai, kurie negali integruotis, naudojami laikinai geno raiškai gauti besidalijančiose ląstelėse, arba ilgalaikei raiškai -- nesidalijančiose ląstelėse. Norint gauti pastovią geno raišką proliferuojančiose ląstelėse, naudojami integruojantys vektoriai. Tačiau susiduriama su problema, kad integruotų vektorių transkripcija po tam tikro ląstelių generacijų kiekio įvairiais mechanizmais yra nuslopinama. Klinikiniuose tyrimuose daugiausiai naudojami onko-RV vektoriai, ypač bandymuose ex vivo infekuojant kraujodaros kamienines ląsteles. Pagrindinis šių vektorių trūkumas yra jų galimybė infekuoti tik besidalijančias ląsteles. Šis trūkumas buvo neseniai įveiktas, prijungus prie RV matrikso baltymo NLS (nuclear localization signal) -- į branduolį nukreipiantį signalą. Tokiu būdu jau rastas būdas, kaip modifikuoti tradicinius RV vektorius ir infekuoti ramybės būsenoje esančias ląsteles. Tokie vektoriai gali infekuoti kraujodaros kamienines ląsteles be papildomo proliferacijos stimuliavimo citokinais. Lentivirusų vektoriai naudojami daugiausiai ramybės būsenoje esančių ląstelių infekcijai (kraujodaros kamieninės ląstelės, nervinės ląstelės, smegenų ląstelės). Jie nesukelia ryškaus uždegiminio atsako, o tai sumažina ir imuninio atsako formavimąsi prieš vektorių ir vektorių turinčias ląsteles. Vektoriaus **tropizmas, transgeno ekspresijos laikas ir vektoriaus imunogeniškumas** yra bene **svarbiausios vektorių savybės**. AdV vektoriai, kaip taisyklė, yra imunogeniški, sukelia uždegiminį atsaką, jų pagalba įvedamas genas dažniausiai funkcionuoja trumpai. Tačiau šie vektoriai randa taikymą gydant kraujagyslių ir vainikinių arterijų sutrikimus, kur reikalinga tik laikina geno raiška. Taip pat vėžio atveju, kada vektoriaus imunogeniškumas ir toksiškumas padeda sunaikinti vėžines ląsteles. Šiuo metu jau bandomi ir mažo imunogeniškumo AdV vektoriai, juose pašalinta didžioji genomo dalis. AAV vektorių sistemos gali pasitarnauti ilgai ekspresijai, todėl gana intensyviai vystomos. Šie virusai gali infekuoti nesidalijančias ląsteles, be to nesukelia jokių pastebimų ligos požymių, nesukelia uždegiminės reakcijos. Pagrindinis jų trūkumas yra maža talpa. Šį trūkumą bandoma įveikti tendemiškai integruojant kelis virusus, tokiu būdu formuojant geną iš dalių, kurios sujungiamos RNR lygyje dėka splaisingo signalų. HSV-1 (Herpes simplex virus) virusas yra pats didžiausias ir sudėtingiausias iš genų terapijoje naudojamų virusų. Jo pagrindu sukurtų vektorių privalumas yra didelė talpa, bei galimybė infekuoti nervines ląsteles. HSV-1 reziduoja nervinėse ląstelėse. Nesireplikuojantys HSV-1 kilmės vektoriai gali talpinti iki 40 kb svetimos DNR, t.y. vieną pilną vidutinio dydžio geną. **Labai daug įvairių vektorių konstruojama kovai su vėžinėmis ląstelėmis.** Tai vektoriai, selektyviai besireplikuojantys vėžinėse ląstelėse. Tokie vektorių tyrimai sudaro apie **64%** visų genų terapijos klinikinių tyrimų. Daug įvairių skirtingų metodų naudojama vėžinių ląstelių naikinimui. Tai vektoriai, turintys antiangiogenetinius faktorius, stabdantys kraujagyslių tinklo vystymąsi auglyje, vektoriai, turintys vėžio supresijos genus, tokius kaip p53, imuno-stimuliacinius genus ar tiesiog vektorius, kurie lizuoja ląstelę. Šiuo metu sukurti vektoriai 10000 kartų efektyviau dauginasi vėžinių ląstelių, negu normalių ląstelių audinių kultūrose. Dažnai viruso-terapija kombinuojama su kitomis terapijos priemonėmis moksliniuose eksperimentuose duoda teigiamus rezultatus. Praktikoje kol kas visi šie aprašyti metodai ir vektoriai veiksmingi nėra. Dažniausiai stebimas vėžinių ląstelių žuvimas aplink vektoriaus įvedimo vietą (adatos dūrį). Didelė problema yra pasiekti kiekvieną auglio ląstelę. **Pagrindinė genų terapijos problema yra imuninė sistema.** Dažnas organizmas jau būna susidūręs su genų terapijai naudojamu virusu, todėl vektorius ar vektorių turinčios ląstelės greitai sunaikinamos. Be to, įvedamas transgenas gali būti priimamas kaip svetimas, todėl prieš jį formuosis imuninis atsakas. Siekiant išvengti imuninio atsako prieš vektorių, stengiamasi pašalinti maksimaliai daug viruso genų, konstruojant sudėtingas pakavimo sistemas, pateikiančias viruso baltymus trans, kuriami taip vadinami gutless arba helper dependent vektoriai. Dažnai tas pats vektorius skirtingiems asmenims sukelia skirtingą uždegiminį ir imuninį atsaką. Iki šiol neužmirštama nesėkmė 1999 m. rugsėjo mėn. JAV Pensilvanijos universitete klinikiniuose tyrimuose, gydant įgimtą ornitino transkarbamilazės (OTC) deficitą. **OTC yra kepenų fermentas**, pašalinantis azoto perteklių, susidarantį iš baltymų ir aminorūgščių. Amonio susikaupimas kraujotakoje sukelia encefalopatiją, smegenų pažeidimus, komą. OTC pilna blokada sukelia mirtį tuoj po gimimo, tuo tarpu dalinė blokada leidžia išgyventi griežtos dietos sąlygomis. Bandymuose dalyvavo 18 savanorių, sergančių švelnia OTC deficito forma. Vienas iš dalyvių, 18 m. amžiaus Jese Gelsinger gavo didžiausią vektoriaus dozę -- 3,8x1013AdV virusinių dalelių (be E1 ir E4 genų) į kepenų arteriją. Jo antikūnų prieš AdV titro duomenys neišsiskyrė iš kitų eksperimento dalyvių. Moterys, gavusios 3,6x1013 AdV dozę pakėlė be komplikacijų, tuo tarpu J.Gelsingeriui po 4 val. pakilo temperatūra, kitą dieną ėmė reikštis kepenų pažeidimo simptomai, prasidėjo plintanti kraujo koaguliacija kraujagyslėse. Jis mirė nuo daugelio organų pažeidimo. Tuo tarpu kiti dalyviai tyrimus pakėlė sėkmingai. Ši nesėkmė ilgam sustabdė genų terapijos bandymus JAV. Skrodimas parodė, kad nors virusas buvo suleistas į kepenų arteriją, didelis jo kiekis buvo rastas kraujotakoje, susikaupė blužnyje, limfiniuose mazguose, kaulų čiulpuose, sukėlė uždegiminę reakciją, privedusią prie kraujo koaguliacijos. Buvo suabejota naudojamų gyvulinių modelių patikimumu. Genų terapija šiuo metu vystosi nepaprastai sparčiai. Susiduriama su daug iki tol nežinomų, nelauktų problemų, tokių kaip genų nutildymas retrovirusų sudėtyje, genų nutildymas, integravus daug geno kopijų, chromatino modifikacijų problemos ir daugelis kitų. **[3 tema. NEVIRUSINIAI VEKTORIAI]** Žinomi du pagrindiniai genų terapijos būdai -- **lytinių ląstelių bei somatinių ląstelių.** **Lytinių ląstelių genų terapija -** tai lytinių ląstelių kiaušialąsčių, spermatozoidų, bei ląstelių iš kurių jos atsiranda manipuliacija siekiant pakeisti jų genetinę informaciją. Jai tai pat gali būti priskiriama manipuliacijos su zigota. Lytinių ląstelių genų terapijos sukelti genetinės informacijos pakeitimai gali būti paveldimi. Tuo tarpu somatinių ląstelių genų terapijos metu keičiama genų veikla paciento ląstelėse; būsimos kartos šių genų veiklos pokyčių nepaveldi. **Lytinių ląstelių genų terapija.** Etiškai nepriimtina dėl to, kad visuomet išlieka rizika pasireikšti nepageidaujamiems ir ilgalaikiams šalutiniams reiškiniams, kurie gali paveikti pacientą bei jo palikuonis. Lytinių ląstelių genų terapijos technologija yra santykinai paprasta, nes nereikalauja specifiškumo terapijos taikiniams ir genetiniai sutrikimai gali būti koreguojami tiesioginėmis manipuliacijomis. **Somatinių ląstelių genų terapija.** Kadangi genai lemia kiekvienos kūno ląstelės veiklą, ligas galima išgydyti į paciento ląsteles įterpus reikiamus genus. Būtina, kad tokie gydymo tikslams vartojami genai saugiai, specifiškai ir efektyviai pasiektų tinkamas paciento ląsteles. Genai į organizmą gali būti įterpiami ex vivo (už gyvo organizmo ribų) ir in vivo (gyvo organizmo viduje) būdu. **Ex vivo** terapijos metu iš paciento organizmo paimtos ląstelės in vitro genetiškai modifikuojamos, kultivuojamos, atrenkamos ir po to grąžinamos į organizmą. Tačiau tokių ląstelių, kurioms galėtų būti taikoma ex vivo genų terapija nėra daug: fibroblastai, limfocitai, hepatocitai, keratinocitai, endotelio ir raumenų ląstelės bei kamieninės kaulų čiulpų ląstelės. Genų įterpimą į organizmą ir jų ekspresiją sunkina kai kurios aplinkybės, pavyzdžiui, netgi monogeninės paveldimos ligos pasireiškia keliuose audiniuose, tuo tarpu ex vivo genų terapiją galima taikyti ne visuose audiniuose. Be to, "sveikasis" genas ne visada normalizuoja koordinuotą bendrame procese dalyvaujančių genų ekspresiją. **In vivo** genų terapija. Terapijos metu genus tiesiai į organizmą įterpia virusai, sintetiniai pernešėjai ar kiti vektoriai. Šiuo atveju nereikia paimti organizmo ląstelių ir jų genetiškai modifikuoti bei kultivuoti -- šį darbą atlieka vektoriai ir pats organizmas. Kepenys sąlygoja greitą vektorių (adenovirusų, DNR/lipidų kompleksų) išvalymą iš organizmo. Dar vienas in vivo genų terapijos trūkumas yra tai, kad pakartotinės vektorių injekcijos gali sukelti stiprias imunines reakcijas. **In situ genų** terapija. Kadangi šiuo metu genų terapijos vektoriai nepasižymi dideliu specifiškumu, dažnai renkamasi genetinį vektorių injekuoti į gydomą audinį. Šis metodas taikomas cistinės fibrozės gydymui, kurio siekiama genetiškai modifikuoti kvėpavimo takų epitelio ląsteles. **Genų įterpimo į pacientų organizmą metodai** Vektoriai gali būti virusiniai ir nevirusiniai. Kartu su reikiamais terapiniais genais į vektorius gali būti įterpti ir indukuojami promotoriai, leidžiantys reguliuoti įterptų genų ekspresiją. Naudojant audiniams specifinius promotorius galima pasiekti, kad terapinių genų ekspresija vyktų tik specifinėse ląstelėse. **Genų transfekcijos metodai** Visi nešikliai ar su jais susijusios priemonės, kurie padidina DNR transfekcijos efektyvumą ląstelėse, gali būti laikomi vektoriais +-----------------------------------+-----------------------------------+ | **Virusiniai vektoriai** | **Nevirusiniai vektoriai | | | fiziniai** | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | -- Retrovirusai | **fiziniai** | | | | | -- Lentivirusai | --DNR injekcija | | | | | -- Adenovirusai | -- genų šautuvas | | | | | -- AAV | --elektroporacija | | | | | --Kiti virusai | -- sonoporacija | | | | | | **cheminiai** | | | | | | --lipopleksai | | | | | | --polipleksai | +-----------------------------------+-----------------------------------+ **Nevirusiniai vektoriai** Nevirusiniai vektoriai turi daug privalumų: **juos paprasčiau gaminti** ir lengviau kontroliuoti nei virusinės kilmės vektorius. Jie metų metais gali būti l**aikomi 4°C** ir kai kurie iš jų net kambario temperatūroje, kai tuo **tarpu dauguma virusinių vektorių** turi būti užšaldomi ilgalaikiam naudojimui. Be to, **nevirusiniai** vektoriai yra **kur kas talpesni** ir atitinkamai galima perkelti didesnius genus. Kurdami nevirusinius vektorius laboratorijoje, chemikai teoriškai gali maišyti ir derinti labiausiai pageidaujamas virusinių vektorių savybes į saugius kompleksus. **Liposomos** Liposomos yra netoksiškos, biodegraduotinos, sumažina alergines bei imunologines reakcijas, turi savybę patekti į ląstelę, todėl yra plačiai naudojamos kaip vektoriai-nešėjai. Jas formuojant galima panaudoti tam tikrus komponentus, pvz., vaistines medžiagas, DNR ar izoliuotus genus. Sumaišius plazmidinę DNR su liposomomis susiformuoja lipidų -- DNR kompleksas. Teigiamai įkrauti lipidiniai lašeliai gali sąveikauti su neigiamai įkrauta DNR, apgaubti ją ir įnešti į ląsteles vidų. Liposomos viduje DNR yra apsaugota nuo degradacijos. Gyvūnuose liposomos į ląstelę patenka praktiškai tik fagocitozės būdu į makrofagines retikuloendotelinės sistemos ląsteles. Norint išvengti šios filtruojančios sistemos poveikio, reikalingos palyginti mažos liposomos, kurių paviršius neindukuoja fagocitozės, tačiau turi grupių, užtikrinančių jų susirišimą su reikalingu aukšto giminingumo receptoriumi tam tikrame audinyje. Daugumą atvejų liposomos, inkubuotos su ląstelėmis in vitro arba in vivo, po endocitozės lokalizuojasi kepenų ir mažesniais kiekiais kasos bei plaučių lizosominiame aparate, kur, joms suirus, aktyvus turinys atsipalaiduoja ir gali veikti pagal paskirtį. **DNR patekimas liposomų pagalba.** Metodas pigesnis nei virusinis. Nėra imuninio atsako. **Problema.** Palyginti žemas jų efektyvumas. Nepaisant daugumos trūkumų, lipopleksai turi savybių, kurios juos daro priimtinais vektoriais DNR įvedimui. Šioms savybėms priskiriama tai, kad: Liposomos yra komerciškai prieinamos ir palyginti aukšto stabilumo gali būti ilgai laikomos iki panaudojimo. Naujų liposomų gamyba nėra sudėtinga. Lengvai jungiasi su DNR ir RNR, nepriklausomai nuo jų dydžio. Todėl šie vektoriai gali būti naudojami didelių genų pernešimui. Transfekuoja daugumą ląstelių, tame tarpe ir nesidalijančias. Nesukelia imuninių reakcijų, todėl gali būti naudojamos pakartotinai. In vivo tyrimuose liposominiai vektoriai dažniausiai buvo naudojami DNR įvedimui į plaučius CF gydymui, į kepenis bei į kraujagyslių epitelines ląsteles aterosklerozės gydymui. **Polilizinas** naudojamas dėl to, kad sudarydamas kompleksą su DNR, nėra toksiškas. Pats polilizinas, ypač didelėse koncentracijose, yra toksiškas, tačiau labai teigiamai įkrautas polilizinas sudarydamas kompleksą su neigiamai įkrauta DNR, absoliučiai netenka šios savybės **"Nuoga DNR" ar DNR vakcinos** „Nuogą" DNR galima naudoti injekcijoms į odą arba į raumenis ir tokiu būdu gauti gana efektyvią laikiną genų ekspresiją. DNR patekimas į branduolį nėra visiškai aiškus, bet faktas, kad ji ten patenka ir kurį laiką funkcionuoja iki kelių dienų.To pakanka suformuoti humoralinį ląstelinį atsaką. Ląstelinis atsakas formuojasi, jeigu DNR patenka į dendritines arba kraujo ląsteles, kurios geba prezentuoti ląstelėje sintetinamą antigeną. Lyginant su AdV ir AAV, genų pristatymas į ląsteles, naudojant nuogą DNR, mažai efektyvus, tačiau laikinai ekspresijai tinkamas. **Kokiu būdu nuoga plazmidinė DNR patenka į audinių ląsteles tiksliai nėra žinoma. Manoma, kad tai gali būti susiję su** 1. audinio ir ląstelių pažeidimais injekcijos metu. Šie pažeidimai, gali palengvinti plazmidės patekimą į ląsteles; 2. padidėjusiu hidrodinaminiu slėgiu audinyje. Į audinį dideliu greičiu injekuojamas tirpalas su plazmide gali palengvinti jos patekimą per ląstelių membraną; 3. endocitoze, tarpininkaujant nespecifiniams receptoriams. **SONOPORACIJA** Šiuo metu sparčiai daugėja duomenų, kad vaistus bei genus į ląsteles ir audinius galime perkelti ir naudojant aukšto intensyvumo ultragarsą. Manoma, kad aukšto intensyvumo ultragarsas sąlygoja kintamą (inercinę) kavitaciją, kurios pasėkoje ląstelių membranoje, kaip ir elektroporacijos metu, formuojasi poros. Dėl to pats metodas pradėtas vadinti sonoporacija. Sonoporacijos metodas yra labiau efektyvus vaistų nukreipimui į gilesnės lokalizacijos patologinius audinius. Šio metodo privalumai yra šie: 1. galima pasiekti gilesnius audinius bei organus. 2. įmanomas sonoporuojamo objekto ultragarsinis vaizdinimas, kuris sudaro galimybę sekti gydymo procesą jo eigoje. Specifinis sonoporacijos mechanizmas dar nėra detaliai išaiškintas, tačiau manoma, kad ląstelių membranos pralaidumo padidėjimas yra susijęs su mikroburbulų (MB) kavitacijos reiškiniu. Esant aukštam UG akustiniam slėgiui (MI\>0.05) garso bangos paveiktas mikroburbulas suyra, skystyje sukeldamas smūgines bangas ir mikročiurkšles. Ši skysčio poveikio banga dideliu greičiu pažeidžia, prakerta ląstelės membraną. Tokiu atveju įvairios molekulės gali patekti į ląstelės vidų. Mikroburbulai papildomai gali būti panaudojami kaip įvairių molekulių nešikliai į ląsteles. Panaudojus aukšto akustinio slėgio ultragarsą, mikroburbulo sprogimo metu yra išlaisvinamas jų nešamas junginys, todėl sonoporacijai naudojant modifikuotus MB su terapinių ar diagnostinių junginių užpildu galima pagerinti sonoporacijos efektyvumą. Veikiant UG, keičiasi MB paviršiaus geometrija, MB membrana neatlaiko UG sukeliamo slėgio ir sprogsta, sukeldama smūginę bangą ir mikrosroves. Tokiu būdu patenka šalia ląstelės esančios molekulės ir MB viduje esanti medžiaga. Sonoporacijos taikymo metodas genų pernašoje yra kelis kartus greitesnis laiko atžvilgiu, negu pvz. lipofekcijos , tačiau yra svarbu išsaugoti ląstelių gyvybingumą. Naudojant sonoporaciją genų pernašos efektyvumas dar yra žemas, tačiau metodas turi didelį potencialą. Atlikti tyrimai parodė, kad sonoporacijos būdu galima padidinti vaisto bleomicino (BLM) pernašą į kininio žiurkėno kiaušidžių ląsteles bei žmogaus navikines ląsteles in vitro. **Mikroburbulų pritaikymas vaistų/ genų pernašai** MB gali būti naudojami kaip vaistų/ genų nešikliai (sonoporacijos vektoriai) įvairiais būdais:1) tiesiogiai prikabinant molekulę prie MB apvalkalo; 2) prikabinant vaistą nešančias pūsleles (liposomas) prie MB paviršiaus; 3) inkorporuojant vaistą į apvalkalą. **Mikroburbulų nutaikymas.** Įvairios molekulės (ligandai) gali būti prijungtos prie MB. Kadangi ligandai yra specifiniai tam tikriems receptoriams, jų naudojimas leidžia nutaikyti ir lokalizuoti MB. Tai yra atliekama siekiant gauti maksimalų ir lokalų biologinį efektą sumažinant MB išplovimą iš reikiamos vietos. Sėkmingi bandymai su MB, nutaikytais į tarpląstelines adhezines molekules (ICAM-1) , kraujagyslių adhezines molekules (VCAM-1) , integrinus ir selektinus buvo atlikti in vivo. **Sonoporacijos taikymas terapijai** Bendrasis ir galutinis sonoterapijos principas in vivo yra toks: 1) iš pradžių vyksta nutaikytų MB, nešančių vaistus/ genus, suleidimas į kraujagysles; 2) vėliau įvykdomas UG poveikis į tam tikrą organizmo vietą, kur yra susikaupę MB; 3) galiausiai įvyksta lokali vaistų ir genų pernaša ir atitinkamo biologinio efekto sukėlimas. **Sonochemoterapijos efektai.** In vivo sonochemoterapijos srityje naudojant citotoksinius vaistus yra pasiekta efektyvių rezultatų odos, krūties, kiaušidžių, kepenų ir smegenų vėžio auglių gydyme modeliniuose gyvūnuose. Vykdant priešvėžinę terapiją yra naikinamas auglio kraujagyslių tinklas bei pačio auglio ląstelės. Sonochemoterapija sukelia auglio ląstelių nekrozę bei apoptozę, o taip pat sumažina angiogenezę. Siekiant saugaus ir lokalizuoto sonoporacijos terapinio poveikio apoptotinė ląstelių žūtis yra didelis privalumas. **MIKROINJEKCIJOS** Genetinės medžiagos mikroinjekcijos (injekcijos į ląsteles) yra preciziškas metodas, tačiau neefektyvus, norint transfekuoti dideles ląstelių populiacijas. Nuogos plazmidinės DNR mikroinjekcijomis galima transfekuoti kai kurių audinių ląsteles (kepenų, raumenų). PROBLEMA - Trumpalaikė ir maža ekspresija. Genų šautuvas - Išrastas DNR transfekuoti augalų ląsteles, pilnai pritaikomas žinduolių ląstelėms. **ELEKTROPORACIJA** Žinoma, kad biologines ląsteles paveikus trumpalaikiais, tačiau stipriais elektriniais laukais vyksta ląstelės plazminės membranos elektropermeabilizacija (elektropralaidinimas), dėl ko laikinai pakinta jos pralaidumas įvairiems cheminiams junginiams. Tinkamai parinkus elektrinio impulso parametrus vyksta grįžtama ląstelių elektropermeabilizacija (elektropralaidinimas), todėl padidėjęs membranos pralaidumas po kurio laiko atsistato. Ląstelės membranos pralaidumo padidėjimas įvyksta, kai ląstelės transmembraninis potencialas viršija kritinę ribą. Dėl skirtingų membranos, išorinės terpės ir kitų savybių, ribinė transmembraninio potencialo vertė svyruoja tarp 0,2--0,9V. Viršijus kritinę transmembraninio potencialo ribą, įvyksta ląstelės membranos pralaidinimas, kurio mechanizmas dar nėra iki galo aiškus. Šiuo metu vyrauja dvi konkuruojančios ląstelių membranų pralaidinimo hipotezės. Pirmoji teigia, kad ląstelės membrana veikia kaip kondensatorius, kuris įkraunamas, kai yra veikiamas elektrinio lauko. Taip atsiranda transmembraninio potencialo padidėjimas, kuris priklauso nuo padėties elektrodų atžvilgiu. Kita hipotezė, aiškinanti membranų pralaidinimą elektrinių laukų pagalba, yra paremta porų susidarymu pralaidintoje ląstelės membranoje. Dėl to membranų pralaidinimas pavadintas elektroporacija. **Elektroporacija** pakeičia terminą **elektropralaidinimas.** Straipsniai, remiantys elektropralaidinimo teoriją teigia, kad prieš pat elektroporaciją pasikeičia tokios membranos storis. Dėl to turėtų stipriai pasikeisti membranos elektrinė talpa. Publikuoti duomenys rodo nedidelį elektrinės talpos pokytį. Tačiau žinoma, kad elektroporacijos metu membranos talpa keičiasi ten, kur atsiranda elektroporų. Tokiu būdu gaunama specifinė membranos talpa. **Porų Hipotezė** Manoma, kad membranos elektropermeabilizacija yra susijusi su nanoporų formavimusi lipidinėje membranos dalyje. Pagal šią teoriją didelių porų diametras gali siekti kelis nm. Čia : **Up -- elektrinio lauko stiprumas**, reikalingas hidrofobinių porų formavimuisi. **Uc - elektrinio lauko stiprumas**, sukeliantis negrįžtamus procesus dėl ko membrana suyra. Mažų hidrofilinių molekulių transportas per permeabilizuotą (pralaidintą) membraną yra susijęs su difuzija, kurios greitis priklauso nuo medžiagos koncentracijos skirtumų ląstelės viduje ir išorėje. Ląstelės permeabilizacija yra ilgalaikis procesas ir po elektrinio lauko poveikio gali tęstis nuo kelių sekundžių iki keliasdešimt minučių. **Ląstelės elektropermeabilizacija (elektropralaidinimas)** priklauso nuo daugelio veiksnių, tokių, kaip: terpės fizikinių - cheminių parametrų (joninės jėgos, pH, osmosinio slėgio, temperatūros), tačiau labiausiai nuo elektrinio lauko parametrų. Didinant elektrinio lauko impulsų trukmę ar skaičių permeabilizuotos (pralaidintos) membranos plotas nekinta, tačiau didėja struktūrinių pokyčių (porų) dydis. Manoma, kad porų dydis siekia kelis nm. (Palyginimui Na+ jono diametras yra apie 0,2 nm, DNR spiralės - apie 2 nm). Pirmasis pritaikęs elektroporacijos metodą DNR pernešimui į ląsteles in vitro buvo **Nuemann et al. (1982)**. Nuo tada elektroporacija tapo populiarus metodas efektyviam svetimos DNR įkėlimui į bet kokios rūšies ląsteles. Eksperimentiniai duomenys rodė, kad vien tik elektrinis laukas, vien tik DNR buvimas ląstelių suspensijoje, ar DNR įdėjimas į šią suspensiją po elektrinio lauko poveikio DNR ekspresijos nesukėlė. Tai aiškiai parodė, kad DNR į ląsteles patenka ne difuzijos keliu. Elektroporacijos metodo paprastumas ir pritaikomumas daugelio tipų ląstelėms paskatino tolesnius DNR elektropernašos tyrimus įvairiuose audiniuose. Šiuo metu parodyta, kad elektroporacijos būdu svetimus genus galima perkelti į daugelį audinių tokių, kaip raumenis, navikus, kepenis, odą, blužnį, plaučius, arterijas ir kt. Raumeninio audinio DNR elektropernaša susideda iš tiesioginės plazmidinės DNR injekcijos į raumenį ir elektrinių impulsų panaudojimo injekcijos vietoje. Eksperimentiniai duomenys parodė, kad įvestų genų ekspresija šiose ląstelėse padidėjo nuo 100 iki 1000 kartų palyginus su tomis ląstelėmis, kurios nebuvo elektroporuotos. Svetimų genų pernaša į ląsteles ir audinius, taikant stiprius, elektrinius impulsus yra plačiai nagrinėjama medicinos ir biotechnologijos problema. Pagrindinis veiksnys ribojantis genų elektropernašos pritaikymą klinikiniuose tyrimuose yra gana žemas elektropernašos efektyvumas. Efektyvumo didinimą ir optimalių sąlygų nustatymą sunkina tai, kad genų elektropernašos mechanizmas nėra pilnai suprastas. Manoma, kad DNR patekimui į ląsteles yra svarbios elektroforezės jėgos. Tačiau kokia yra jų įtaka DNR elektrotransfekcijos efektyvumui nežinoma. Taip pat pilnai nėra aiškus ir elektroforetinių jėgų poveikio mechanizmas. DNR patekimo į ląsteles hipotezės **Viduląstelinis DNR transportas.** Genų pernašai į ląsteles naudojant ląstelių elektroporaciją, pernešto geno raiška priklauso ne tik nuo DNR elektropernašos per plazminę membraną efektyvumo, bet taip pat ir nuo tolesnio perneštos DNR transporto iš citoplazmos į branduolį. Citoplazmoje plazmidės difuzijai iki branduolio trukdo ląstelės citoskeletas. Parodyta, kad β--galaktozidazę koduojančios plazmidės injekcija į ląstelės citoplazmą šalia branduolio padidina šio geno raišką 8 kartus, lyginant su raiška, kuomet plazmidė injekuojama toliau nuo branduolio. Tai rodo, elektropernašos būdu į ląstelės citoplazmą patekusios plazmidės raiška priklauso, kaip lengvai plazmidė pasiekia branduolio apvalkalą. Jei plazmidės difuzija iki branduolio vyksta labai lėtai, dalis jos yra degraduojama citoplazmoje esančių endonukleazių. Pelės odos, kepenų bei kitose ląstelių citoplazmoje rasta nuo kalcio jonų priklausančios DNazė I, rūgštinės endonukleazės DNazė II, ir keletą kitų endonukleazių. Akivaizdu, kad dėl šių endonukleazių aktyvumo priklauso plazmidžių gyvavimo laikas, jų patekimo į branduolį kiekis ir koduojamo geno raiška. In vitro tyrimuose parodyta, kad nepatekusi į branduolį plazmidė yra greitai degraduojama. Injekavus plazmidę į HeLa ląstelių citoplazmą, jos gyvavimo laikas buvo apie 90 minučių. Plazmidei pasiekus branduolio apvalkalą, koduojamo geno raiška pagrindinai priklauso nuo DNR patekimo į branduolį efektyvumo. DNR, kurių ilgis neviršija 200 bp į branduolį gali patekti per jo poras paprastos difuzijos būdu. Tačiau, didesnio dydžio DNR molekulių bei plazmidžių patekimas į branduolį yra susijęs su aktyviu transportu, dalyvaujant sudėtingam molekulių transportavimo aparatui. Parodyta, kad 21 bp dydžio oligonukleotidai į branduolį patenka maždaug per 5 min., tuo tarpu 6000 bp dydžio plazmidės patekimas į branduolį užtrunka apie 60 min. Vidutiniškai, tik 0,1 % plazmidžių, esančių citoplazmoje patenka į branduolį. Siekiant pagerinti DNR patekimą į branduolį siūloma prie DNR grandinės prijungti branduolio lokalizacijos signalą. Parodyta, kad tokio signalo prijungimas prie plazmidės ne tik pagerino plazmidės transportą per branduolio poras, bet taip pat palengvino transportą iki branduolio.  Sėkmingos elektrotransfekcijos metu plazmidinė DNR patenka į ląstelę bei jos branduolį, kur pradedama transkripcija. Publikuoti duomenys rodo, kad 3 valandos po sėkmingos DNR elektropernašos, plazmidė patenka į branduolį. Nevisiškai aišku, kaip tai įvyksta. Žinoma, kad ląstelių, kurios nesidalina, elektrotransfekcijos efektyvumas yra žymiai mažesnis. Manoma, kad tai susiję su ląstelių mitozės M fazėje panaikinamu branduolio apvalkalu. Parodyta, kad elektrotransfekcija yra žymiai efektyvesnė, kai ląstelės sinchronizuotos G2/M fazėje. Taigi vyraujanti hipotezė teigia, kad plazmidinė DNR patenka į branduolį ląstelės dalinimosi metu, kai branduolio apvalkalas yra sunykęs. Elektropernašoje naudojami elektrodai: Plokšteliniai; adatiniai; Elektropernašoje naudojami impulsai: Siekdami detaliau panagrinėti DNR elektropernašos mechanizmus Klenchin ir Sukharev ilgą elektrinį impulsą suskaldė į 2 impulsus. Pirmas impulsas - mažesnės trukmės ir didesnės amplitudės -- skirtas ląstelės elektroporacijai. Antras impulsas -- mažesnės amplitudės, bet ilgesnės trukmės -- skirtas DNR elektroforezei ir jos perkėlimui į ląstelės vidų. Ši metodika buvo naudojama atskirti du skirtingus elektrinio lauko poveikius ir patvirtinti hipotezę, kad taikomuose elektriniuose impulsuose yra du aktyvūs komponentai: ląstelės elektroporacija ir elektroforetinės jėgos. **In vivo buvo nustatytas akivaizdus ŽA impulsų poveikis elektrotransfekcijos efektyvumui.** Manoma, kad elektroforezė in vivo gali turėti įtakos keletu atvejų: 1). padidina DNR difuziją audinyje; 2). leidžia DNR arčiau sukontaktuoti su ląstelės membrana; 3). įterpia DNR į ląstelės membraną ar įstumia DNR per permeabilizuotą membraną. Tačiau kokia ištikrųjų yra elektroforetinių jėgų įtaka DNR elektropernašos efektyvumui nežinoma. Taip pat pilnai nėra aiškus ir elektroforetinių jėgų poveikio mechanizmas. **Raumenų transfekcija atliekama šiais etapais:** Paruošiama plazmidė. Dažniausiai naudojamas cytomegaloviruso promotorius. Kaip genetinis markeris dažniausiai naudojamas genas, koduojantis luciferazę, -galaktozidazę ar žaliąjį fluorescentinį baltymą (GFP). Paruošta plazmidė gali būti dedama į fiziologinį tirpalą ar į PBS. Priklausomai nuo raumens dydžio į jį injekuojama 10-100 l fiziologinio tirpalo, kuriame yra 1-50 g plazmidės. Tuoj po plazmidės injekcijos abipus raumens dedami elektrodai-plokštelės (gali būti naudojami ir adatiniai elektrodai) ir raumuo veikiamas elektriniais impulsais. Praėjus 2-7 dienoms po DNR transfekcijos, raumuo išimamas ir jame matuojama plazmidėsmarkerio ekspresija. Lyginant geno ekspresiją po DNR injekcijos su šio geno ekspresija po DNR injekcijos ir raumens elektroporacijos buvo matyti, kad DNR ekspresija elektroporuotame raumenyje buvo apie 1000 kartų didesnė. **Pagrindiniai elektrogenoterapijos privalumai :** 1\) metodo saugumas ir paprastumas, 2\) plazmidės paruošimas yra daug paprastesnis ir pigesnis lyginant su kitų vektorių paruošimu, 3\) audinių transfekcija gali būti atliekama lokaliai, tiksliai norimose vietose, 4\) praktiškai nėra apribojimų dėl geno ar genų dydžio. Elektroporacijos būdu galima įvesti ir tokius didelius genus, kurie netelpa į virusines daleles. **Pagrindiniai elektrogenoterapijos trūkumai:** 1\) lyginant su virusiniais vektoriais elektrogenoterapijos efektyvumas yra palyginti mažas. 2\) elektroporacijos būdu įvesta DNR neįsiintegruoja į ląstelių genomą, todėl geno ekspresija nėra ilgalaikė. Taigi elektroporacijos metodas, nors ir turintis dar nemažai neatsakytų klausimų, vis plačiau naudojamas svarbiuose medicininiuose tyrimuose. Elektroporacijos pritaikymas tampa pirmaujančia technologija nevirusinėje genų terapijoje, norint įterpti DNR į įvairiausias ląsteles bei audinius.