Genetica Medica - Appunti PDF

GENETICA MEDICA Genetica: capire il rischio di ricorrenza ed eventuali portatori di patologie Scienza del genoma → ereditario, DNA e basi ereditarietà ma anche le nozioni acquisite del genoma come le mutazioni. Umana: variazioni genoma differenze individuali Medica: diagnosi malattie genet...

GENETICA MEDICA Genetica: capire il rischio di ricorrenza ed eventuali portatori di patologie Scienza del genoma → ereditario, DNA e basi ereditarietà ma anche le nozioni acquisite del genoma come le mutazioni. Umana: variazioni genoma differenze individuali Medica: diagnosi malattie genetiche date da variazioni Dna sul fenotipo (es polimorfismo: caratteristica genetica che da uno specifico fenotipo ma non da patologia quindi non va trattato) Il fenotipo = genotipo + ambiente L’unione viene chiamata carattere, ossia una caratteristica fisica osservabile. (l'ambiente influenza il fenotipo attraverso risposte modificate) Un carattere può avere diverse manifestazioni = forma allelica. TEORIA CELLULARE La cellula è l’unita di base del "vivente" (funzionante assestante) Tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule Nuovo deriva da vecchio ( anche in vitro ) CLASSIFICAZIONE La cellula può essere Procariote (dimensioni circa 10 micron e + semplici) o Eucariote (10-100 mcron + complesse) e sono simili in: Membrana plasmatica: rinchiude il confine cellulare Formata da un doppio strato fosfolipidico di testa glicerolo + gruppo P (carica parziale (-) che permette legame polare con l'acqua) + 2 code di acidi grassi (apolari) La micella formata dai fosfolipidi è fondamentale per la separazione tra ambiente e organismo Citoplasma: ossia liquido prevalentemente acquoso Ribosomi: responsabili della produzione di materiale genetico Nucleoide/nucleo CELLULA PROCARIOTE Le prime cellule furono le procariote e sono suddivisibili in: Archaea o Bacterya. Prive di nucleo Ciglia, flagelli e pili → x muoversi  Dna circolare Parete cellulare all'esterno protetta da capsula (Le ultime due sono esclusive della cellula procariote) La prima è costituita da peptidoglicano ossia carboidrati interconnessi da polipeptidi. La penicillina sfrutta l'interconnessione tra i peptidoglicani in modo da eliminare le strutture batteriche (fa entrare così acqua). La capsula invece viene costituita da gel di polisaccaridi ed aderisce alle strutture dell'ospite. (La loro neutralizzazione per questo motivo deve essere specifica). La selezione naturale → fondamentale nei batteri per la resistenza antibiotici. CELLULA EUCARIOTE "Bel nucleo", fanno parte gli organismi come: protisti, funghi, piante e animali appartenenti tutti al dominio Eukarya. Il nucleo serve per: la protezione del DNA, è formato da: 4 strati fosfolipidici, "doppia membrana" di conseguenza gli scambi interno-esterno complessi Il DNA circolare procariote è però meno preda di attacchi alla molecola (in quanto le estremità sono unite fra loro) – Struttura cellula animale: Organelli per lo più proteici PROTEINE Le proteine sono molecole polifunzionali polimeri di amminoacidi Amminoacido: al carbonio si lega COOH + NH2 mentre sul quarto legame un residuo variabile R. In natura sono 20 ma ce ne sono di ulteriori di molteplici funzionalità: dal trasporto al sostegno, al metabolismo ecc.. *(Nota di genetica: la prolina è l’unico amminoacido che si lega al gruppo amminico provocando un ripiegamento della catena peptidica. Una mutazione di questo genere è quindi molto facile distinguerla) La forma della proteina determina la sua funzione, per questo è importante. *Gli amminoacidi con gruppo R ionizzato sono fondamentali per legami. – STRUTTURA 1. Primaria = sequenza amminoacidica 2. Secondaria = alfa elica e foglietto ripiegato 3. Terziaria = forma globulare grazie ponti disolfuro ( forma totale ) 4. Quaternaria = + polipeptidi Struttura ripiegata = stabilità. ACIDI NUCLEICI Polimeri di nucleotidi – Nucleotide 1. Gruppo P 2. Zucchero Pentoso 3. Base azotata – GLI ACIDI NUCLEICI SONO: DNA o acido desossiribonucleico: Doppio filamento a doppia elica (il doppio avvolgimento da la max protezione alle basi azotate) necessario a contenere l'informazione genetica Zucchero = desossiribosio RNA o acido ribonucleico Funzionale alla sintesi proteica e trasporto di DNA al citoplasma Il filamento è singolo quindi la probabilità di attacco/mutazioni sono alte perché di facile distruzione, il vantaggio di ciò è la possibilità di distruggerlo senza intaccare la cellula ed avere un'accessibilità maggiore per la produzione di proteine Base azotata sostitutiva della timina = uracile Zucchero = ribosio Queste funzioni sono rese possibili grazie all'ATP o adenosintrifosfato in quanto l’idrolisi dei gruppi P rilascia molta energia. 1. Base Adenina 2. Zucchero Ribosio 3. 3 gruppi P – BASI AZOTATE Pirimidine: Timina, Citosina, Uracile (anello singolo) Purine: Adenina, Guanina (anello doppio) DNA – Caratteristiche Variabile e specifico tra diverse specie Custodisce info K nella stessa specie Duplicabile o Trascrivibile con gran precisione Soggetto a rare mutazioni Circa 60 rispetto alla cellula madre spesso irrisorie ma anche deleteri, vengono chamate "mutazioni de novo" Difatti ci sono sistemi di correzione degli errori della duplicazione che tentano di riparare gli errori ma se non funzionano → mutazioni *Per esempio “pelle scura”: hanno difficoltà a resistere a temperature basse o zone di bassa irradiazione come al nord in quanto soggetti ad alto rischio di rachitismo. In un ambiente è fondamentale che ci siano più mutazioni in grado da poter procedere con l'evoluzione + adattamento ambientale. L’evoluzione è permessa alle specie con "fitness" vantaggioso. *Dal punto di vista evolutivo le prime molecole a formarsi non furono DNA o RNA, bensì anelli di amminoacidi, il fattore trasformante però si scoprì che fu il DNA – STRUTTURA: Doppia elica Basi azotate A---T (2 legami H) C---G (3 legami H) La molecola, perché sia solida, deve essere rigida e apribile. Le basi vengono legate da legami H e lo spazio intra-legame deve essere omogeneo. → Ad una purina---pirimidina e viceversa per donare al filamento una forma omogenea. L'appaiamento tra basi è fondamentale perché la duplicazione è semiconservativa: abbiamo una molecola conservata originale e una nuova. – SCOPERTA DNA (1953) Watson e Crick sugli studi di Rosalind Franklin + Wilkins. I primi avevano studiato la forma cristallina del DNA usando un esperimento di diffrazione a raggi X dei secondi (le parti scure dell’immagine di diffrazione sono basi, il resto zucchero). DUPLICAZIONE DNA 3 fasi 1. Enzima di partenza = elicasi: proteina che svolge l'elica e apre i filamenti dando lo spazio per copiare il filamento 2. La DNA polimerasi → sistema capace di leggere il filamento stampo + crearne una copia, essa procede in direzione 5' → 3' grazie ad un primer 3. Il filamento lento copiato necessita di frammenti di Okazaki che replicano il filamento in senso inverso. Successivamente i due strand vanno legati dalla ligasi in modo da non avere spazio tra di loro, ma così c'è maggiore possibilità di errore. Tutto ciò avviene solo se la polimerasi è legata ad un innesco chiamato primer. Solo i telomeri (sequenza di DNA ripetute un numero di volte a seconda dall'età) ossia le parti finali del cromosoma vengono replicati in un’altro modo. Essi servono a proteggere i geni che si trovano all'estremità dei cromosomi. Il loro numero e la loro lunghezza sono diversi in ognuno di noi e possono conferire a.d.v (aspettativa di vita) maggiore rispetto a coloro che ne hanno meno o ne hanno di più corti. SINTESI PROTEICA Trascrizione → fatta dall'mRNA grazie all'RNA polimerasi, viene usato il DNA come stampo mRNA primario è un lungo filamento di esoni + introni che vanno protetti all'estremità grazie ad un cappuccio + coda di poli-a (adenina) Esoni + introni grazie allo spliceosoma vengono separati tramite splicing e gli introni vengono così rimossi e abbiamo la formazione di un mRna maturo che presenta un cappuccio + coda di poli-a Traduzione → l'RNA trascritto dirige la sequenza amminoacidica grazie ad una tripletta o “codone” La tripletta di partenza è sempre una Metionina AUG che verrà poi tramite legame covalente si lega fino alla una delle 3 triplette di stop: UAA, UGA e UAG. “Così funziona per ogni organismo perché il codice genetico è degenerato e universale in quanto per un amminoacido ci possono essere + codoni” Il complesso di traduzione = “poliribosoma” Sull'estremità 3' del tRna si attacca l'amminoacido mentre dalla parte dell'anticodone si accoppia l'mRna complementare (ciò avviene in estremità separate a causa dell'ingombro sterico delle molecole.) All'interno del ribosoma abbiamo la traduzione che viene segnalata dal codone di start identificato come metionina. Ogni ribosoma ha 3 siti di attacco per i tRna ossia sito E, P, A mentre la direzione = dal cap alla catena di poli-a. – INIZIO TRADUZIONE Siamo nel sito P dove troviamo il codone d'inizio, i siti E ed A sono vuoti, solo il tRna complementare al codone si legherà al nuovo amminoacido passando prima per il sito A, successivamente abbiamo lao scorrimento nel sito E. Il tRna con la lunga catena nel sito P libera il sito A arrivando fino al codone che da il sito di terminazione. – FASE FINALE Quando il ribosoma raggiunge un codone di stop, la traduzione si conclude con la fase di terminazione in cui il peptide viene rilasciato. Traduzione + Trascrizione = Espressione genica! “GENETICA” Studio della struttura dell'informazione = genomica Studio trasmissione = ereditarietà Studio dell’utilizzo = espressione Come so che il DNA è identico in ogni cellula? Via trapianto nucleare, il nucleo di una cellula intestinale viene trasferito in un Xenopus Laevis il cui nucleo è stato distrutto. Il risultato → uomo uguale intero. L'uovo viene attivato e il nucleo differenziato. (es: cellula intestinale, ha tutti i geni di uno zigote ma il genoma durante lo sviluppo non subisce perdite; è di possibile riutilizzo; l'unico problema è l’adv, così come nel clonaggio) *Lo Xenopus Laevis è un rospo utilizzato spesso in studi genici siccome presenta una fecondazione esterna e un uovo ben visibile PARENTESI SUGLI ANIMALI MODELLO Anfibi: facile lavoro embrionale Topi: molto prolifico Conigli: mammifero prolifico che usa in maniera diversa i geni (vd gravidanze e sviluppo fetale con arti corti che vengono bloccate da un farmaco, "il Talinomid", innocuo per il topo ma non per il coniglio) L'uomo è pessimo a causa di gravidanza generazioni a distanza difficile incrocio, nonostante sia il fruitore finale, ma non tutto funziona per sillogismi logici! Scimmie: specie per trapianti Se il DNA è uguale come mai ci sono cellule differenziate? Il modo in cui si legge l’istruzione genica è diversa a seconda della cellula → “dogma centrale” “Geni diversi si esprimono in momenti diversi in tessuti diversi!” L’espressione è regolabile per: quantità di molecole livello dei processi stessi come in quello trascrittivo quante volte leggo la molecola anche per quanto dura la vita della molecola (deciso dal livello di protezione garantito dalla catena di poli-a che è proporzionale alla lunghezza di essa ) CELLULA – STRUTTURA  Membrana nucleare: da cui passano RNA, sostanze ormonali + fattori di trascrizione via pori nucleari RER: il reticolo endoplasmatico rugoso è in continuità con la membrana nucleare e la sua funzione: sintesi proteica mediante ribosomi REL (reticolo endoplasmatico liscio): dove le proteine ottengono strutture secondarie o sup, dove vengono perfino fosforilate e glicosate, Apparato del Golgi: sistema di vescicole appiattite responsabile dello smistamento delle proteine *Le vescicole possono essere di trasporto ma anche di distruzione grazie ai loro enzimi litici in grado di ridurre amminoacidi. Esse rilasciano nel citoplasma le materie prime poi riutilizzate. Il sistema si può deteriorare, alcune proteine non vengono lise e nei lisosomi si accumulano prodotti di scarto che aumentano il volume del lisosoma e della cellula dando origine a malattie progressive causa apoptosi progressiva (es: Alzheimer) La posizione degli organelli non è casuale, è decisa dal citoscheletro e da microtubuli organizzati dal centriolo, inoltre organizza anche la divisione/riproduzione della cellula, sia somatica (con l’organizzazione del fuso mitotico) sia meiotica. Vescicole: sono di endo o esocitosi → entrata o uscita di sostanze Mitocondri: sede della respirazione cellulare (ATP) e posseggono gene proprio – FUNZIONI PRIMARIE Sintesi proteica: fondamentale, è possibile la sua malregolazione ma non la sua assenza (tranne per il sistema nervoso) Tutte informazioni sono codificate dal Dna (in tutte le cellule e durante tutta la vita dell'organismo) Spesso è spiralizzato e organizzato in cromosomi in numero diverso a seconda della specie. Dentro il cromosoma si riconoscono unità operative chiamate “geni”. *(sequenze usate per codificare la proteina, non lineari, ma spezzettate in esoni e sequenze regolatrici dette introni che hanno alcune funzioni che non sono ancora tute conosciute) I ribosomi sono la sua causa: la proteina entra grazie ai pori nel lume del RER e non l'mRNA che invece viene intrappolato nelle due subunità proteiche. La sequenza primaria può cosi assumere la struttura secondaria grazie ai legami tra residui (gruppi R) che danno funzionalità alla proteina. Di base i reticoli sono entrambi formati da citoplasma ma varia la presenza di ribosomi. Nel REL avviene anche: la sintesi di steroidi la funzione detox sintesi di lipidi. Proteine e lipidi vengono poi inglobate in vescicole di trasporto nell'apparato del Golgi. Vescicolette Lisosomi → digerire sostanze di scarto Perossisomi, stessa funz dei lisosomi ma specifiche per gli acidi grassi Vacuoli dove vengono accumulati acqua, zuccheri + sali; se non funzionano si accumula sostanza di scarto → apoptosi (l'assenza di questi enzimi portano ritardi mentali ma anche malattie degenerative come SLA ed Alzheimer) *Alcune di queste malattie sono depistabili via screening neonatale. Spesso facilmente curabili, fornendo o meno certi amminoacidi per dare la possibilità al bambino di crescere in maniera normale. Es: fenilchetonuria → no digestione fenilalanina che provoca danni neuronali progressivi. IL consumo di cibo privo di questa proteina preserva lo sviluppo del neonato. Tutti gli organuli presentano membrane plasmatiche che lavorano in sinergia per dare proteine e lipidi, unire i due, condurre esocitosi ma anche catturare sostanze esterne adibite a nutrimento e demolizione (dinamismo). PRODUZIONE ENERGETICA – STRUTTURA E FUNZIONE MITOCONDRIO (Cloroplasti piante, mitocondri animali) L'energia viene prodotta nei mitocondri via respirazione cellulare. I mitocondri demoliscono carboidrati → ATP: glucosio + ossigeno = CO2, acqua e ATP. Il mitocondrio è dotato di due membrane, l'interna presenta ripiegamenti chiamati creste che contengono al matrice mitocondriale. La respirazione cellulare avviene nella spazio intermembrana, il glucosio viene demolito nella matrice mentre nelle creste si produce ATP. – TEORIA ENDOSIMBIMBIOTICA (inglobamento e relazione simbiotica tra organismi) Guardando la forma e la capacità di produrre energia da parte dei mitocondri in modo simile a quello batterico viene così espressa la teoria dell'endosimbiosi. Una cellula eucariote (inizialmente incapace di produrre sostentamento) è entrata in relazione con un organismo autotrofo capace di produrre energia ed immagazzinarla. Da quel momento la cellula eucariote ha inglobato l'organismo procariote vivendo cosi in simbiosi. La membrana interna è quindi quella del procariote, quella esterna invece dell'eucariote. L’mtDNA (DNA mitocondriale) è circolare, di conseguenza la teoria è confermata, ma esso viene usato ma è insufficiente al sostentamento. Il DNA mitocondriale non ha tutti i geni a causa dello scambio di geni avvenuto nell'inglobamento. Esso è l'unico organello per cui si ha la certezza della teoria. La divisione di esso non per forza segue la divisione cellulare, infatti si divide per scissione binaria quando è necessaria molta energia. – MALATTIE MITOCONDRIALI L'mtDNA può mutare → malattie Poca energia di conseguenza malattie muscolari e neurologiche “nota soprattutto gli occhi, primo organo che va fuori uso, non si riesce ad aprire bene le palpebre.” Nota: i mitocondri vengono trasmessi solo dalla madre perchè quello dello spermatozoo non entra nello zigote. (è raro ereditare malattie mitocondriali dal lato paterno). *Nota clinica: Eteroplasmia = in un soggetto coesistono mitocondri di DNA diversi previa mutazione ma non è possibile prevederne la prole. CITOSCHELETRO “Non tutta la cellula è formata da acqua altrimenti avrebbe una struttura globulare bensì hanno strutture differenti a seconda del contributo del citoscheletro che regola anche la posizione e la connessione tra organelli” Esso e formato da: Filamenti di actina = fasci presenti ovunque, sono filamenti flessibili e resistenti che consentono movimenti a struscio (movimento ameboide) o si raggruppa in  subunità a perla che si avvolge ad un altro filamento; 2 subunità si associano, successivamente si possono aggiungere o togliere subunità dando l’impressione come se si tirassero verso un pseudopolo, in realtà aumentano le subunità in una direzione e si tolgono dall'altra Filamenti intermedi = filamenti più grossi dell'actina, simili ad una corda ritorta, sono costituiti da polipeptidi fibrosi, svolgono una funzione strutturale Microtubuli = costituiti da tubulina, due catene A e B ritorte su loro a formare un cilindro, agiscono come rotaie grazie al quale lo scorrimento avviene grazie alle chinesine o dineine (proteine di movimento): movimento chimico = energia chimica → in meccanica = reazione accoppiata eso/endoergonica. ACTINA E MIOSINA La miosina è simile ad una mazza da golf siccome deve agganciarsi ad altre molecole. La testa si lega all'actina, ma è anche capace di idrolizzare ATP in modo da cambiare la conformazione secondaria trascinando l'actina. Tutte le cellule hanno almeno un ciglio (estroflessione della membrana) formato da 9 coppie di microtubuli periferici fusi e 2 centrali collegati fra loro in modo anellare. Il tutto viene collegato in modo radiale ma anche da braccia protundenti dai tubi periferici (a ruota) Il collegamento tra i microtubuli è dato dalla dineina che ha forma simile alla miosina. Questo movimento sincronizzato → frusta Alcune volte le ciglia sono + lunghe e permettono un movimento rotatorio. Esso è necessario per il movimento in particolare nei batteri, ma anche nei spermatozoi. Nell'apparato respiratorio sono necessarie per il movimento della mucosa, con un meccanismo di cleaneance del muco ciliare per prelevare le sostanze di scarto. *Nota clinica: se il ciglio non funziona lo spermatozoo non si muove → cinestesia cigliare primaria Mutazioni delle dineine danno così infertilità + maggiore probabilità d'infezione causa la mancata pulizia del muco. CIGLIA Stereo ciglio = presente nello sviluppo embrionale nel nodo di Hansen, serve a creare un vortice di liquido extracellulare in modo da garantire un gradiente proteico di morfogeno (fattore di trascrizione) Questo genera asimmetria nel corpo perché il ciglio ha generato un flusso di morfogeno alterando così la posizione di geni e organi diversi provocando "Lateralizzazione". Se lo stereo ciglio non funziona si possono avere alterazioni nella posizione degli organi in maniera casuale (situs invertus). Ciò provoca ripetute bronchiti e infertilità. Questi sono sintomi della sindrome di Kartagener o cinestesia cigliare primaria che diventa secondaria a causa dell'ambiente come: fumo *Il problema della fecondazione in vitro è che non permette di conoscere eventuali malattie genetiche. *Quando si usa il defibrillatore va fatto attenzione che non abbiano questa sindrome. MOSAICO “Le parti polari per forza sono all'esterno o interno della cellula, questo modello si chiama mosaico fluido.” Altre specie chimiche presenti sono il colesterolo (dona fluidità al mosaico, importante nella struttura della membrana) il suo livello se si abbassa implica la creazione di + membrane cioè tumori. PROTEINE DI MEMBRANA Hanno funzioni diverse: Segnale per definire la cellula (self-transmembrana, come sistema immunitario e nelle malattie autoimmuni) Il sistema immunitario non entra mai in contatto con le cellule germinali del maschio perché protette da membrana, nel momento in cui entra in contatto (calcio nei testicoli per es) si crea una rottura della barriera. Il sistema può entrare in contatto riconoscendole come non self attaccandole → infertilità maschile. Proteine Esterne: recettori, in grado di riconoscere specie chimiche che possono agire da segnalatori, posso attuare trasduzione del segnale senza spostare molecole chimiche ma info Ancoraggio: la membrana viene ancorata al resto della cellula e al citoplasma L'aggancio è dato dal sistema multiproteico necessario al trasferimento del movimento dato dallo scorrimento tra actina e miosina. Proteine da canale: scarti ed elementi vanno passati, così come ioni e protoni I canali possono effettuare trasporto attivo e passivo: passivo → implica l'apertura incondizionata del canale e il passaggio avviene per osmosi senza consumo di energia attivo → deve mantenere contro gradiente proteico il canale chiuso dopo il passaggio della sostanza Proteine enzimatiche transmembrana svolgono azioni chimiche Proteine di giunzione che si legano alle cellule per legame covalente, lo scambio può avvenire per rilascio e ricezione di sostanze o per canali via giunzioni serrate senza perdere trasmettitori nello spazio intercellulare SCISSIONE BINARIA Metodo di riproduzione delle cellule procariote. Più semplici, sufficiente la scissione binaria. Viene duplicato il DNA, il citoscheletro attira il DNA verso le estremità e una volta che sono ben distanziate una strozzatura all'esterno si completa producendo così 2 cellule figlie. Esse sono la copia della cellula madre. Il processo è molto veloce ma si ottiene poca variabilità genetica. CICLO CELLULARE Sequenza ordinata di fasi, ogni fase è regolata dalla presenza di segnali esterni G0 → stasi Interfase periodo della cellule di crescita e preparazione della divisione: G1 → duplicazione S → sintesi cromatidi fratelli G2 → produzione delle proteine necessarie alla divisione (cromatidi filamentosi) M → divisione mitotica, 2 cellule figlie identiche NOMENCLATURA Cromosoma: DNA super avvolto su se stesso + proteine (cromatina). *Il DNA si addensa per protezione siccome è necessario il suo movimento nel citoplasma. Numero cromosomi caratteristico = diploide 2n, ogni cromosoma ha due copie per backup prevenzione al malfunzionamento. I gameti invece sono di tipo n = aploidi Il DNA despiralizzato è lungo circa 1/2m x cellula. Viene per questo avvolto nella doppia elica, poi grazie agli istoni si formano i nucleosomi attorno ai cromosomi super avvolti. Fishing multicolor “Ibridazione in vitro in situ fluorescente” Colorazione cromosoma in base al colore. La banda nera → centromero e può essere a: metà cromosoma = metacentrico  apicale = sub-metacentrico sulla testa del cromosoma = acrocentrico Ciò serve per capire eventuali traslocazioni. La distribuzione dei nuclei difatti non è casuale. All’interno del nucleo in interfase il DNA occupa un distretto specifico del cromosoma. In zone limitrofe del nucleo avviene l'espressione simultanea di geni utilizzati nello stesso momento (machinery= aree di cromosomi diversi vicini aperti e usati) in questo momento il DNA è molto fragile, ma grazie ai punti di controllo in caso di errore, il cromosoma viene riagganciato in un altro posto libero (traslocazione). *Nota clinica: coloro che hanno la leucemia (mieloide cronica, LMC) spesso presentavano la traslocazione 9-2(cromosoma Philadelphia) la cellula diventa più resistente e si forma una chinasi che dona un vantaggio selettivo alla molecole per cui cresce meglio e in breve periodo genera leucemia cronica.* Le industrie hanno premuto sullo sviluppo di farmaci selettivi contro la proteina chimerica tumorale BCR-ABL (prevede l’aumento sintesi DNA quindi promozione della divisione cellulare → tumore) MITOSI Mantiene inalterato il numero di cromosomi PUNTI DI CONTROLLO G1 -> la cellula viene controllata e se il DNA è danneggiato in modo irreparabile la cellula va in apoptosi, se invece il DNA ha passato il checkpoint, la cellula inizia a duplicarsi G2 -> controllo della corretta duplicazione del DNA M -> controllo del corretto allineamento dei cromosomi Cicline e chinasi specifiche regolano il corretto funzionamento dei punti di controllo Ci sono anche regolatori esterni come ormogeni, fattori di crescita e ormoni. (Es: ciò permette al fegato di raggiungere la dimensione prestabilita e non infinita, una volta giunta la confluenza e si è creato uno strato monocellulare, le cellule non si dividono più) MEIOSI – Durata Maschio = 77 gg  Donna = dall'utero fino a 40 anni *Nota clinica: facile evasione da eventuali cataclismi per il maschio, maggiori errori nella meiosi materna, nel maschio la divisione è simmetrica, nella donna ogni divisione è asimmetrica Nonostante la differenza di grandezza tra i due cromosomi X e Y la parte distale del cromosoma X è simile all'Y rendendo per questo possibile il legame fra i due. Sinapsi = adesioni tra i due cromosomi, in questa unione il DNA si rompe e viene cucito con il DNA del cromosoma opposto, se si verificano errori in ciò, la cucitura potrà essere al posto errato. ANOMALIE CROMOSOMICHE EREDITABILI Le aneuploidie sono le più frequenti e possono essere: Monosomie (2n-1) Trisomia (2n+1) La causa più probabile delle due è una non disgiunzione durante la meiosi, o degli omologhi nella I fase meiotica o dei cromatidi fratelli nella II fase. Un errore genetico in una cellula somatica spesso causa morte o tumori, potrebbe portare apoptosi oppure un tumore benigno/maligno. Nella meiosi invece se i gameti difettosi vengono usati nella fecondazione, la prole potrà ricevere un difetto genetico. Possono inoltre esserci anomalie di struttura nel crossing-over di norma bilanciato, a volte però il sistema s'inceppa per cui lo scambio si sbilancia: Ad un cromatidio fratello si abbina una parte omologa più lunga o un l'altra più corta → duplicazione o delezione. Può esserci inversione quando il materiale non è nella giusta posizione. L’inversione diventa pericentrica → coinvolto centromero La traslocazione può avvenire quando lo scambio tra cromatidi non è tra cromosomi omologhi ma tra coppie diverse STRUTTURA GENE EUCARIOTA Posso esserci mutazioni del gene, ma sono correggibili. Se avviene a livello delle sequenze regolatrici o ad un esone la mutazione è trasmissibile, se invece avviene in zone coinvolte nello splicing, non avviene nulla. CROMOSOMA: lungo filamento di DNA che contiene molti geni e si compatta al momento della divisione cellulare ESONE: parete del gene codificante INTRONE: regione che divide gli esoni via splicing (non è junk!) STRUTTURA GENOMA UMANO  Pseudogeni: simil-geni ma non producono proteine, regolano per es il pelo, abbiamo perso quel gene DNA extragenico = DNA ripetuto che non codifica, spesso sono regioni spaziatrici *Nota clinica: spesso i virus entrano nel genoma nelle sezioni mediamente ripetute Il DNA ripetuto in tandem può essere satellite o anche mini e micro (diversi in tutti noi, 19 stanno sul genoma e vengono usati per identificarci ) MAMMIFERI XX = femmina (omogametico) XY = maschio (eterogametico) X-O ( cavallette X uomo - XX donna ) Z-W ( galli ZZ uomo- ZW donna) Aplo-diploide ( api Apolide uomo - Diploide donna In alcuni organismi invece, il sesso è determinato dall'ambiente (es cibo, temperatura, alligatori ecc..) FECONDAZIONE Nell'uomo la fecondazione è interna (perché fondamentale proteggere l'ovocita), in natura non è sempre così. Il problema dell'efficienza della fertilità dell'ovocita lo troviamo a 35 anni, gli ovociti iniziano ad avere non disgiunzioni; avvengono fecondazionim ma il risultato riscontra problemi. Dopo i 45 anni si sono già consumate le cellule precursori → menopausa, non produce più cellule uovo atte alla fecondazione, ciò avviene come meccanismo di difesa. FERTILIZZAZIONE = fusione dei gameti 1. Uovo e spermatozoo devono incontrarsi. 2. La combinazione è attiva tra il movimento dello spermatozoo e passiva da parte dell'ovocita tra organismi della stessa specie (il processo si chiama “chemiotassi”, movimento tramite molecole chimiche, lo spermatozoo capta le molecole ed è in grado di capire la direzione verso il quale aumenta la concentrazione di queste molecole) 3. Una volta incontrati devono riconoscersi tramite contatto. 4. Lo spermatozoo deve penetrare la membrana esterna e fondersi con la membrana plasmatica dell'uovo rilasciando gli enzimi litici contenuti nell’acrosoma. 5. Una volta entrato lo sperma deve bloccare il possibile ingresso di altri spermatozoi (Blocco della polispermia) STRUTTURA SPERMATOZOO BLOCCO POLISPERMIA Immediato: cambiamento del potenziale di membrana (avviene con la penetrazione della membrana che viene cosi depolarizzata) Ritardato: reazione corticale (sotto gli ovociti ci sono vescicole contenenti proteine che rimangono cosi fin dal cambio di potenziale, successivamente rilasciano un contenuto proteico "grani corticali" (proteasi, perossidasi, e una proteina strutturale che forma la membrana) che coagulano creando una membrana corticale che blocca fisicamente l’acrosoma degli spermatozoi ) ZIGOTE Cellula che contiene il necessario per formare organismo dato da metà istruzioni materne e metà paterne, inoltre allo sviluppo partecipano le proteine ed RNA presenti nella cellula uovo. Con lo sviluppo dell'embrione le diverse parti acquistano ciascuna un programma di sviluppo e attività specifiche (da totipotenti → unipotenti) Dai blastomeri posso originare i gemelli, alla seconda divisione 4 successivamente 8. Le membrane non sono complete e si rischia di perdere informazione fino alla formazione della cellula compatta (morula). Successivamente si specializza in una blastociste, un sacchetto cavo monocellulare con dentro del liquido e all'interno una massa (embrionaria = bambino), mentre tutte le cellule periferiche si chiamano annessi embrionali (cordone, placenta e sacco amniotico) dati dal trofoblasto. FENOTIPI MOSAICALI Possono anche venire non disgiunzioni mitotiche → morte per monosomia, invece la trisomia origina un organismo con sindrome down. Un mosaico per trisomia 21 → alcune parti sono affette, altre no. Il fenotipo mosaicale dipende dal destino delle cellule, possono avvenire ritardi mentali, come no. Se la mutazione avviene per esempio nella cellula del trofoblasto i danni sono più contenuti per cui ho una trisomia 21 solo al livello della placenta → bambino sano. EMBRIOGENESI L'embriogenesi è il processo attraverso il quale si sviluppa un embrione a partire da una singola cellula, lo zigote, fino a formare un organismo multicellulare complesso. Ecco i principali stadi e fasi dell'embriogenesi: Divisione cellulare (cleavage) Queste divisioni sono rapide e non comportano una crescita significativa dell'embrione; piuttosto, lo zigote si divide in cellule più piccole chiamate blastomeri. Formazione morula Dopo diverse divisioni, si forma una massa di cellule chiamata morula. Questa fase è caratterizzata da un numero crescente di cellule, ma ancora senza una differenziazione significativa. Formazione blastocisto La morula continua a dividersi e forma un blastocisto, una struttura a forma di sacca che contiene un interno cavo. Il blastocisto è composto da due tipi principali di cellule: il trofoblasto, che si sviluppa nella placenta, e la massa cellulare interna, che darà origine all'embrione vero e proprio. L'embriogenesi è influenzata da una combinazione di fattori genetici e ambientali. Alterazioni in questo processo possono portare a malformazioni congenite o altre complicazioni. ERRORI GROSSOLANI EMBRIOGENESI 1. Gemelli – Omozigoti: Fertilizzazione: si forma un singolo zigote da un ovulo e uno spermatozoo Divisione dell'embrione: lo zigote si divide in due durante le prime fasi dello sviluppo (blastocisto) Questi embrioni identici hanno lo stesso patrimonio genetico. – Dizigotici (Fraterni): Fertilizzazione di più ovuli: due ovuli distinti vengono fecondati da spermatozoi diversi Ogni zigote si sviluppa in un proprio blastocisto Risultato: I gemelli fraterni condividono circa il 50% del loro patrimonio genetico, come normali fratelli Fattori che aumentano la probabilità di gemelli: Ereditarietà: storia familiare di gemelli Età materna: donne più anziane hanno maggiori probabilità di ovulare più ovuli Trattamenti per la fertilità: uso di farmaci per la fertilità può aumentare le possibilità di ovulazione multipla 2. Chimere Definizione: organismi che contengono cellule di due o più zigoti distinti, con patrimoni genetici diversi. Formazione: Fusione di zigoti: se due zigoti si sviluppano in modo indipendente all'inizio della gravidanza, possono fondersi per formare un singolo embrione chimera Trapianto di cellule: in alcune situazioni, può avvenire un trapianto di cellule staminali da un altro embrione, creando una chimera *Nota clinica: chimere umane possono manifestarsi come persone con macchie di pelle di colore diverso, segno che alcune aree del corpo derivano da cellule di zigoti differenti. 3. Moli Idatidee Definizione: le moli idatidee sono anomalie della gravidanza in cui si sviluppa una placenta anormale e, in alcuni casi, possono presentarsi anche tessuti embrionali. Formazione: Fertilizzazione anomala: una mola idatidea si forma tipicamente quando un ovulo non è fertilizzato, ma si verifica una fertilizzazione anomala che porta a una proliferazione anomala del tessuto placentare Mola completa: Si verifica quando uno spermatozoo fertilizza un ovulo privo di nucleo (o un ovulo normale con un secondo spermatozoo), risultando in una placenta anormale senza embrione Mola parziale: Si verifica quando un ovulo normale è fertilizzato da due spermatozoi, portando a un embrione non viabile e a una placenta con tessuti anomali Sintomi: Le moli idatidee possono causare sanguinamento vaginale, crescita uterina anomala e sintomi di gravidanza intensificati. SCREENING PRENATALE – Villocentesi 10/13 settimana Prelievo placenta si ripulisce cercando di eliminare il tessuto materno e si analizzano i villi, se non è fatta bene c'è l rischio di accrescere cellule materne Falsi negativi se prelevata decidua (parte uterina della placenta) Possibilità di aborto spontaneo legata all'operatore Amniocentesi 15/19 settimana Prelievo cellule bambino nell'amnios meno errori, svantaggioso in quanto va fatta tardi in particolare per eventuali aborti (solo in gravi casi si può attuare) ALTERAZIONI NUMERICHE Esse sono causate da una non disgiunzione durante le meiosi oppure inizio sviluppo. Trisomie che permettono vita: 21 (Down), 13 (Patau), 18 (Edwards) ma bassa a.d.v Le trisomie parziali sono compatibili con la vita ma presentano dismorfismi, sono invece più tollerate aneuploidie dei cromosomi sessuali quali: Trisomia X (super femmina): nessun problema se non leggermente infertili, a volte più alte e presentano più lentiggini X0 (sindrome di Turner): individui più bassi, collo basso, piene di lentiggini, ripiegamenti di pelle, no mestruazioni, gli ovari non si vedono, molti nei,  metacarpo corto e deformità ossee XXY sindrome di Klinefelter → sterile, lo sviluppo prende la via maschile ma i caratteri sessuali secondari sono femminili, sono alti, distribuzione del grasso tipicamente feminile, seno e depositi femminili, pelo pubico e del corpo simil femminile e peli glauri, no barba, no calvizie, osteoporosi, meno testosterone XXY 47 cromosomi (super maschio) = nessuna anomalia Trisomia 21: può avvenire mediante una traslocazione Robertsoniana (la traslocazione robertsoniana è un tipo di anomalia cromosomica che coinvolge la fusione di due cromosomi acocentrici (cromosomi con centromeri situati verso un'estremità) in un solo cromosoma; questo tipo di traslocazione è comune e può avere effetti significativi sulla salute e sullo sviluppo) in un altro cromosoma, non sempre la trisomia è libera e la possibilità di ricorrenza della prole futura è bassa, altrimenti se non è libera, il rischio è elevato; se la trisomia è piena porta ritardo mentale cognitivo, assenza dei tabù, ipotonia, faces particolare, lingua grossa, rischio maggiore di leucemia, sensibilità sociale Sindrome di Williams: delezione cromosoma 7, faces simil elfo e ottime abilità musicali Trisomia 12 = quasi tutte le leucemie (anche tumori) portano alterazioni cromosomiche in quanto legate al midollo CROMOSOMI X-Y “In modo da assomigliare al genotipo maschile perché altrimenti le differenze geniche sarebbero molto più accentuate, casualmente, un cromosoma X della femmina, si disattiva.” Corpo di Barr: corpuscolo denso vicino alla periferia del nucleo = cromosoma X inattivo (l'inattivazione del cromosoma X non disattiva le regioni pseudoautosomali) *Per esempio nei gatti se presentano macchie sono femmine, in quanto le macchie sono date dall'inattivazione del cromosoma X e il colore della macchia in base a quale dei due si disattiva. *Questo avviene anche per ogni malattia recessiva X-linked come l'emofilia e la distrofia muscolare di Duchenne. –CARATTERISTICHE CROMOSOMI X e Y Dimensioni differenti Il cromosoma Y presenta il male determining factor Precursore ancestrale identico (regioni pseudoautosomali) Ricombinazione tra X e il braccio corto di Y (nel crossing over) *Nell'uomo la determinazione del sesso avviene quando l'embrione ha due mesi. DETERMINAZIONE DEL SESSO-SRY Il gene SRY (Sex-determining Region Y) è un gene fondamentale per la determinazione del sesso maschile negli esseri umani e in molti altri mammiferi. Esso viene trasmesso poco prima della formazione del testicolo sulle creste genitali indifferenziate dell’embrione. Ecco come funziona: 1. Posizione e Struttura -Localizzazione: Il gene SRY si trova sul cromosoma Y, nella regione Yp È uno dei principali determinanti del sesso maschile -Struttura: Codifica per una proteina chiamata fattore di trascrizione, che è coinvolta nella regolazione di altri geni 2. Funzione -Attivazione del SRY: Durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, la presenza del gene SRY nel cromosoma Y induce lo sviluppo di gonadi maschili (testicoli). -Stimolo alla differenziazione: La proteina prodotta dal gene SRY stimola la differenziazione delle cellule della gonade in cellule di Sertoli, che sono cruciali per la produzione di spermatozoi. 3. Inibizione della via femminile -Inibizione dell'ovaio: Il SRY promuove lo sviluppo dei testicoli e inibisce la formazione delle ovaie. Questo avviene grazie all'attivazione di geni che bloccano il percorso di sviluppo femminile. 4. Produzione di ormoni -Testosterone: I testicoli (nelle cellule di Leydig) producono testosterone e altri ormoni sessuali maschili (androgeni) che sono essenziali per lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari maschili e per la formazione degli organi sessuali maschili. -Inibina: Le cellule di Sertoli producono anche inibina, che regola la produzione di FSH (ormone follicolo-stimolante) a livello dell'ipofisi. RISULTATO La presenza del gene SRY e la successiva attivazione dei percorsi ormonali portano allo sviluppo di un organismo maschile. In assenza di SRY, lo sviluppo segue il percorso femminile. Il SRY viene espresso poco prima della formazione del testicolo o delle creste genitali indifferenziate nell'embrione (circa a 2 mesi) – ANOMALIE SRY Micro delezione braccio lungo Y → sterilità in quanto la maggior parte della funzionalità del cromosoma Y è avere geni dei testicoli. Ricombinazione illegittima → l’SRY si trasloca sul cromosoma X, se usato nel gamete il cromosoma X con SRY mi farà ottenere: –Maschio 46XX che gli manca spermatogenesi data dal SRY nonostante presenti testicoli *(questo errore può avvenire se la ricombinazione non avviene a livello delle regioni pseudoautosomali) –Femmina 46XY senza SRY: gonadi femminili, rimane donna, è alta, sterile, atletica. aspetto esterno femminile in questo caso non c’è una produzione maggiorata del testosterone. –46XY → SINDROME dell'INSENSIBILITA agli ANDROGENI ( AIS ) CASO CLINICO - TRISOMIA 8 PLACENTALE Bambina con trisomia 8 alla villocentesi → trisomia limitata alla placenta Trattasi di mosaico = possono esistere linee cellulari con cariotipo diverso, la loro percentuale determina il fenotipo. La placenta ha trisomia 8, il feto no Da tenere sotto controllo la placenta CASO CLINICO - TRISOMIA 12 Trisomia cromosoma 12 Persona con Leucemia Linfatica Cronica Clone trisomico confinato al midollo osseo/linfociti L'esame del cariotipo negli adulti viene effettuato solitamente partendo dal sangue periferico CASO CLINICO - DONNA 46XY Sul foglio c'è scritto Anna Rossi, ma il cariotipo è 46XY 1) possibili errori tecnici, scambio fogli, etichette, ecc 2) operazione per il cambio di sesso 3) leucemia → trapianto di midollo osseo sano in genere di sesso opposto in modo da rendere facile il monitoraggio dell'eventuale rigetto 4) delezione SRY 5) AIS 6) altre sindromi rare di Sex Reversal ALTERAZIONI STRUTTURALI Traslocazioni Robertsoniane, succede spesso con gli aborti ripetuti, è una traslocazioe dei cromosomi acrocentrici (cetromero nell'apice). Il cariotipo è di 45 cromosomi perché due si sono fusi a stella durante la meiosi (es 14+21) Il complesso si può rompere in più linee di frattura → 6 possibili gameti, uno normale uno bilanciato con il cromosoma fuso altri gameti non bilanciati quali: 1 monosomia 14 1 trisomia 14 1 monosomia 21 1 trisoma 21 I sbilanciamenti sono però non vitali. Sintesi: *Aborto spontaneo dei gameti 6-5-4 (causa monosomie 14 e 21), 1/6 hanno trisomia 21, 1/3 normali, 1/3 traslocazione Robertsoniana. LEGGI DI MENDEL 1. Legge dell'uniformità o dominanza: incrociando 2 individui omozigoti per un carattere, ma con un carattere dominante si ottiene un F1 con individui eterozigoti con carattere dominante → monoibridi 2. Legge della separazione dei caratteri: incrociando 2 individui eterozigoti per un carattere, nella F2 i 2 caratteri di partenza ricompaiono in quantità numeriche 3:1 3. Legge dell'indipendenza caratteri: incrociando più individui con più caratteri distinti si ottengono nella F2, individui di nuovi fenotipi CASO CLINICO FIBROSI CISTICA Marito e moglie entrambi eterozigoti per una malattia recessiva (portatori per es di fibrosi cistica) – Rischio di avere figlio affetto? 25% Però è un evento indipendente, la probabilità si calcola su ogni gravidanza. 50% figli di un portatore ha la probabilità di mostrare la malattia. EREDITARIETA’ CARATTERE Autosomico Dominante non salta mai le generazioni sia maschi sia femmine affetti 50% figli porta il carattere passaggio diretto tra genitore affetto e figlio Autosomico Recessivo solo gli omozigoti recessivi sono malati  salta generazioni spesso genitori consanguinei altri casi in famiglia ma lontanissimi o isolati genetici (es Burano, incrocio tra famiglie ma anche fibrosi cistica) X-Linked Recessivo affetti solo i maschi solo per via materna affetti solo maschi, e tutti maschi affetti sono collegabili seguendo le linee materne (mamme portatrici dei figli malati) es → Emofilia, DMD a rischio i figli delle portatrici e i figli delle sorelle delle mamme affette X-Linked Dominanti maschi e femmine affette maschi passano solo a femmine femmine passano a maschi + femmine Malattia dominante mitocondriale femmine affette passano a tutti i figli, gli uomini a nessuno effetto muscolare Tumore al seno Avviene per una mutazione del gene BRCA 1 e 2 (gene Angelina Jolie). La probabilità è alta se si è avuto casi in famiglia. Quando muta solo uno dei due alleli casualmente → età avanzata. Se abbiamo già un allele di BRCA 1 non funzionante, attraverso uno brutto stile di vita, aumentiamo il rischio di sviluppare un tumore perfino bilaterale in età prematura. La differenza tra le due situazioni: nel primo caso abbiamo un tumore ambientale in tarda età e sarà isolato spesso monolaterale. Nel secondo caso avremo tumori in giovane età anche a causa a dell'ambiente e spesso bilaterale a causa della predisposizione ricevuta con l'eredità del gene BRCA → “Ipotesi di Knudson” *Predisposizione = un allele non funziona ma la cellula vive anche senza essa, siamo portatori sani ma se l'ambiente rovina l'altro allele diventiamo affetti. Anche il padre della signora può ereditare la malattia ma la probabilità di incorrere in un tumore al seno è minore a causa del numero inferiore di cellule. *Per tenere sotto controllo le persone che potrebbero esse affette vanno fatti controlli ogni 6 mesi attraverso ultrasuoni. – COME PREVENIRE Test predittivi = specie a coloro che hanno avuto una storia clinica Chirurgia  Monitoraggio MUTAZIONI DE NOVO Nella famiglia non c’è storia clinica ma il figlio invece porta una grave malattia dominante. Esempi: Retinoblastoma = tumore all'occhio MEN (neoplasia endocrina multipla) Poliposi Spesso capita che i genitori mosaici sani trasmettano queste malattie ai figli ma non sono quindi più definibili “de novo”. ANEMIA FALCIFORME Mutazione gene della beta globina → emoglobina anormale che s’impacchetta. A livello periferico gli eritrociti da tondi → falce e occludono i capillari o si rompono. Fenotipo: debolezza sviluppo non coerente problemi mentali ed insufficienza cardiaca Gli eritrociti però invece di rompersi potrebbero alterare il flusso sanguigno causando: ictus paralisi insufficienza cardiaca dolori e insufficienza renale fibrosi della milza. Essa è una malattia autosomale recessiva. Il vantaggio dell'eterozigote → espansione dell'anemia falciforme nelle zone in cui la malaria è endemica. L'eterozigote è avvantaggiato perché i globuli avendo forma strana non sono un ambiente consono allo sviluppo batterico. *Microcitemica = persona eterozigote affetta da anemia falciforme che ha globuli rossi più piccoli. *Si pensava la stessa cosa della fibrosi cistica rispetto al colera ma non è cosi. GRUPPI SANGUIGNI Sulla parte dei globuli rossi abbiamo dei recettori transmembrana leggibili dal sistema immunitario e ogni individuo ne ha uno specifico. Le proteine più note e che danno più peso sono quelle dei gruppi sanguigni: A B AB O nemmeno una (0) AB ricevente universale e 0 donatore universale Rh - Fattore Resus – negativo → solo da negativi Per le donne in gravidanza il segno del fattore Rh è fondamentale. Le donne Rh (-) creano anticorpi contro feti Rh (+) alla prima gravidanza. Alla seconda se il feto è nuovamente Rh (+) ha una reazione avversa al feto e lo uccide. Attraverso iniezioni di immunoglobuline non succede nulla al feto – positivo → positivi e negativi CASO CLINICO - TRASFUSIONE Signore che ha gruppo 0, la banca sangue è vuota, si offre di donargli il sangue del figlio Probabilità del figlio di essere compatibili? 0 ANALISI CARIOTIPO (mappa cromosomica) Vedo il DNA quando è ben spiralizzato nella divisione mitotica. Per l'analisi del cariotipo si usa l'eparina. Va controllato il "Bandeggio" in modo che le zone cromatiniche ci siano tutte. Col Cariotipo possiamo notare: 1. traslocazioni (anche bilanciate quindi asintomatiche) 2. aneuplodie 3. delezioni 4. duplicazioni 5. inversioni (peri centriche o paracentriche se coinvolgono o meno il centromero) Con la Fish invece si vedono: 1. traslocazioni (BCR-ABL) 2. aneuploidie 3. delezioni (anche piccole) note 4. duplicazioni note CGH ARRAY EDTA anticoaugulante Il DNA del paziente lo coloro di verde, prendo un DNA di controllo e lo coloro di rosso, mescolo in egual quantità. Utilizzo poi un vetrino su cui sono stati messi sequenze di DNA più o meno corte formare degli spot che corrispondono a sequenze specifiche di DNA. Ibrido il DNA e dopo applico sul vetrino il DNA del paziente e quello di controllo. 1. Se sono in egual quantità → il colore del fluoro cromo sarà giallo 2. Se invece ci fosse una delezione avrò che il controllo avrà più DNA specifico rispetto al paziente → sul fluoro cromo il colore sarà rosso 3. Se invece ci DNA del paziente > di quello di controllo → trisomia = ibridazione competitiva Posso osservare: Delezioni o aneuploidie la cui grandezza dipende dal vetrino e quanto piccoli e molti sono gli spot Non si vedono traslocazioni e inversioni Duplicazioni piccole Spesso non si sa se l'alterazione è collegata al fenotipo  PCR - ELETTROFORESI EDTA anticoaugulante Sfrutta la capacità della polimerasi per amplificare il Dna con lo scopo di ottenerne una grande quantità (di specifiche sequenze). 1. Denaturazione = 90 più gradi per la denaturazione delle proteine, la polimerasi a quella temperatura si degrada 2. Amplificazione = temperatura minore in modo da far si che i primer si attacchino al complementare attraverso TAQ polimerasi 3. Annealing (allungamento) = saldamento dei primer a temp.circa 70 gradi Tra DNA stampo ed amplificato la differenza sta nella sequenza stabilita. Nello stampo è tutto, nell'altro no. Visibile perfino ad occhio nudo mettendola in gel (agarosio), successivamente applicando una differenza di potenziale attraverso anodo e catodo, il DNA migrerà verso la carica + ad una velocità direttamente proporzionale alla lunghezza del filamento. Si può controllare l'infertilità in base a delle regioni specifiche della spermatogenesi come la ZFA, la ZFB e ZFC. Si vedono quindi: delezioni piccole polimorfismi mutazioni note! LIMITI Possibili falsi (+), anche per piccole molecole dovute a contaminazione Falsi negativi a causa di mutazioni puntiformi dove agganciano il primer che non permette cosi la duplicazione del filamento *(allel dropout) SEQUENZIAMENTO DI SANGER EDTA anticoaugulante 1. Annessione dei primer al complementare 2. Ciclo di PCR con dideosossinucleotidi 3. Ogni base ha un fluoro-cromo differente che funge da marker 4. Ogni ciclo ha lo probabilità del 50% che la sequenza proceda o meno a seconda del legarsi del dideossi o del nucleotide normale 5. La probabilità che abbiamo un nucleotide più lungo rispetto a uno più corto entrambi marcati è analoga  6. Ogni sequenza compare in ordine crescente con uno scarto di 1 solo nucleotide Nel polimorfismo posso riconoscere i picchi di colore sovrapposto, due frammenti di egual misura rilevati dal laser. L'unico amminoacido presente in tutte le specie è la K (una sua eventuale mutazione, sarà grave in quanto e un amminoacido fondamentale per quella proteina) La serietà della mutazione dipende se: missenso frameshift silente non senso mutazione dello splicing che inserisce un sito nuovo o ne opprime il sito Si vedono con il sequenziamento di particolari geni: mutazione polimorfismi SEQUENZIAMENTO MASSIVO PARALLELO - SEQUENZIAMENTO NEXT GEN (NGS) EDTA anticoaugulante “Necessito di pezzi piccoli di sequenza dove ci lego degli adattatori alle estremità per compiere la CPR. Gli adattatori si attaccano su matrice solida che ha sequenze complementari alla matrice solida. Uso una sequenza della quale eseguo la PCR e introduco nucleotidi legati a molecole fluorescenti (nucleotidi normali); ciò che viene noto sarà che in ogni spot avrò l'attacco del nucleotide. Per ogni spot avrò una foto corrispondente al primo nucleotide. Successivamente faccio un lavaggio del fluorocromo, taglio il cap e faccio un altra foto. Farò poi una seconda ondata e a scalare. Potrò vedete tutti i geni di una persona nello stesso momento, polimorfismi e mutazioni. (circa 14.000 differenze) Si può vedere quasi tutto con questa tecnica ma è molto costosa e lunga, possiamo perfino notare inversioni e traslocazioni ma vanno ripulite molto le sequenze in quanto sono poco sensibili.” NIPT (screening genetico prenatale non invasivo) = Non Invasive Prenatal Test Non comporta prelievo dei villi o liquido amniotico! Può avere falsi (+) o (-) → in quanto screening ci inserisce in una categoria di rischio. Esiste del DNA del feto che circola nel sangue materno a causa degli scambi uterini. Questo DNA permane per parecchi mesi dopo il parto (c'è quindi DNA fetale libero di origine placentare). Si può capire quindi se il DNA del feto è normale o meno: 1) Si sequenziano i pezzi di DNA e si dividono per appartenenza cromosomiche (cromosoma 1,3 ecc) 2) Li si conta e si vedrà che in una gravidanza normale il numero di sequenze per il cromosoma 21 sarà equivalente al numero degli altri cromosomi normalizzati sul numero dei cromosomi In caso di trisomia 21, il numero di sequenze normalizzate per il cromosoma 21 saranno maggiori alle altre. Si vedono spesso delezioni ed aneuploidie, in particolare dei cromosomi 21 e 13 Il problema del test è che si vedono i cromosomi sessuali quindi la mamma sa già se porta in grembo un maschio o una femmina. Sequenziando DNA materno e quello unito tra materno e feto si possono vedere dove sono le differenze. CASO CLINICO - DELEZIONE DI 50 MEGABASI Diagnosi prenatale CGH array ad alta risoluzione e si trova che il bambino ha una delezione di 50 megabasi sul cromosoma 4, grave? Dipende dalle sequenze che ci sono sulle megabasi e se c'è o meno nei genitori, se ereditaria e i genitori sono sani allora la delezione non porta nulla Possiamo dire alla famiglia se è patologica o meno. CASO CLINICO - VARIANTI DI UN GENE, COME COMPORTARSI Sequenzio il genoma e trovo una variante di un gene, domande da porsi: In quale punto avvene? introne o esone? Cambia l'amminoacido? Elimina/aggiunge siti di splicing? Esiste nei database? Polimorfismo o mutazione? Mutazione o fattori di rischio? Si può fare qualcosa? CASO II - ALZEHEIMER? Signore perde la memoria e decide di effettuare l'analisi per l'APOE per vedere se ha l'aplotipo e4 associato all'Alzheimer (il 25% delle persone lo può contrarre) Ha senso farlo? Sì, per vedere se è causa genetica in quanto già sintomatico. Il signore risulta E3/e4! La figlia di 40 anni vuole a sua volta fare il test; glielo si fa fare nonostante no sintomi? In genere no CASO III - TROMBOSI Signora 60 anni, seconda trombosi, analisi del fattore V di Leiden. Risulta portatrice, la figlia 35enne e 15enne vogliono fare il test, glielo si fa fare? Nella minorenne in genere no, solo maggiorenni oppure sintomatici, alla signora di 35 anni si fa in quanto se sa di avere la predisposizione puo prendere precauzioni per evitare trombosi. Se la bambina ha già avuto rapporti sessuali le si fa il test per evitare di prescriverle anticoncezionali che aumentano la probabilità di trombosi. CASO IV - CRISI EPILETTICHE, COMPORTAMENTI ANORMALI → TEST ESOMA Difficoltà di apprendimento, crisi epilettica, comportamenti anormali. Test consigliato? CGH ARRAY oppure analisi Cariotipo per scovare eventuali sintomi ereditari. Cariotipo normale 46XY Si può escludere la causa getica? No, perché può essere una mutazione puntiforme. Devo vedere anche la sequenza del genoma ma non è consigliato come test di routine, si fa invece il test dell'esoma ossia l'insieme di tutti gli esoni. PEDIATRIA Bambino con ripetute bronchiti? 1. Test del sudore → canale per il cloro mutato, se positivo possono avere figli affetti necessario quindi raccogliere l'albero genealogico per vedere eventuali figli a rischio 2. Ricerca fibrosi cistica (25% probabilità che sia malato) Se i due test fossero negativi sì puo escludere la causa genetica? No, dire alla mamma di evitare corenti d'aria Suggerire visita di un genetista *(possibile sindrome di Munchausen) 1/2000 possibilità di avere malattie rare Parlare di casi ricorrenti Eterogeneità genetica Allelica: mutazioni diverse sullo stesso gene Di locus: mutazioni diverse in geni diversi ma stesso fenotipo (es: cinestesia cigliare primaria) Pleiotropia Effetto di un gene su più caratteri fenotipici (es anemia falciforme) Fenocopia  Effetto dell'ambiente che mima un difetto genetico (es fumatore con ciglia cinestetiche, sordità genetica o ambientale ecc) NEUROLOGIA - ALBINO Signore con nonno albino sposa un albina probabilità figlio albino? -> 25% Possibili ictus quindi importante sapere. PEDIATRIA - MALATTIA RARA Anna moglie dello zio materno fa un figlio con una malattia rara, potrebbe avere la stessa malattia? Prima cosa, non siamo obbligati a dare una risposta DERMATOLOGIA - ITTIOSI Ittiosi (pelle squamosa dura) X-Linked e la figlia è in gravidanza. Rischia il bambino di avere l'Ittiosi? Se femmina non ha il rischio Se maschio ha una probabilità del 25 La signora non vuole effettuare alcuna diagnosi perchè non è un difetto grave. Consiglio? Test genetico per monitorare il bambino per evitare l'aborto o disfunzioni mentali “Bambini con ittiosi potrebbero avere una placenta non performante e un possibile distacco placentare → morte per malfunzionamento placentare + soffocamento” CHIRURGIA - IPERTERMIA Ragazzo sotto i ferri morto di ipertermia sotto anestesia, così come il fratello anni prima. C'è qualcosa che non va con l'anestesia? Signora poi ricoverata in reparto per un nodulo al seno, potrebbe avere problemi all'anestetico a causa di una malfunzione del recettore → cambio anestetico CENTRO PMA (centro fecondazione assistita) - SINDROME X-FRAGILE Signora in menopausa precoce, vuole recuperare i suoi ovuli per una fecondazione assistita in vitro. Ha già però un figlio con un ritardo mentale = sindrome dell'X fragile che da nel maschio emizigote ritardo mentale, nella femmina invece da menopausa precoce MEDICINA LEGALE - TEST DEL PADRE Test di paternità, il bimbo ha il cromosoma Y congruente al 100% con il signor A che non ha mai avuto rapporti con la signora A, credibile? Tutti i maschi parenti del signore A hanno lo stesso gene Y!! CAUSE DI VARIABILITA GENETICA Il gene e dato da 5' e 3' regolatrici, introni ed esoni. Mutazioni sulla regione 5' UTR (untranslated region), variazioni su questa parte danno variazione sulla trascrizione ma anche su quantità e funzione della proteina Variazione sull'esone da alterazione della sequenza amminoacidica Alterazioni sugli introni invece da alterazione della trascrizione genica FARMACOGENETICA Studio del diverso effetto di farmaci su persone diverse con polimorfismi diversi FARMACOGENOMICA: studio dell'effetto sull'espressione genica stimolata da ciascun farmaco - Possibili reazioni avverse 1. Dose related 2. Non dose related 3. Dose and time related Ci sono più tipi di pazienti che con la stessa dose e prescrizione reagiscono in modo diverso, vanno soprattutto individuate le persone per cui i farmaci sono tossici e non benefici. L'esempio tipico di farmacogenetica è il Coumadin. La maggior parte delle persone lo metabolizza molto velocemente ma c’è una piccola parte di esse che lo metabolizza talmente poco che le dosi devono essere minime. Altri rispondono perfino in modo tossico, letale. Siccome potrebbero avere degli effetti collaterali, va quindi fatto l'esame del DNA per poter dare delle dosi adeguate in modo da garantire il giusto trattamento. METABOLISMO La succinilcolina: agisce molto lentamente sugli europei (miorilassante) 1 su 3500 potrebbero avere paralisi prolungate. L'isoniazide: un farmaco per la tubercolosi nel 50% degli americani bianchi, a seconda di come uno reagisce può risultare in un fallimento del trattamento o perfino tossicità Fluorouracile: ottimo farmaco tumorale ma all'1% causa danni al SNC se si ha questo polimorfismo, col test genetico si può vedere se siamo portatori di polimorfismo Aspirina: può povocare crisi di emolisi, usato per deficit glucosio-6-fosfato deidrogenasi, antimalarico Citocromo P450: incapace di convertire codeina in morfina per cui la codeina non fa effetto Trastuzumab: un farmaco per il tumore al seno agisce solo contro la proteina HER2 Le variazioni ereditate riguardanti i fattori della coagulazione aumentano il rischio di avere trombosi nelle vene profonde nelle donne che fanno uso di contraccettivi orali. Tamoxifene: può prevenire lo sviluppo del cancro alla mammella nelle donne a rischio solo in mutazioni di gene BRCA2 e non nel BCRA1 Nei pazienti con alterazioni genetiche dei canali trasportatori per gli ioni Na e K si ha un elevato rischio di andare incontro alla “sindrome della QT lunga” indotta da farmaci. I farmaci hanno azioni diverse anche in base al sesso, età ed origine etnica. SESSO L’alcol: metabolizzato + lentamente nelle donne rispetto agli uomini, se una donna beve la stessa quantità di un uomo (in base al peso) ne sarà + intossicata Certi oppioidi (pentazocina, nalbuphina) fanno + effetto nelle donne che negli uomini La chinidina → prolungamento dell’intervallo QT più grande nelle donne che negli uomini e per questo sono tendenzialmente più predisposte a sviluppare una aritmia cardiaca fatale GENETICA FORENSE Microsatellite = regioni di dinucleotidi o trinucleotidi che si ripetono in modo diverso in alleli diversi. 19 sono sufficienti per dare un codice a barre identificativo a ognuno di noi. Usati anche per lo studio della migrazione della popolazione e anche per il test paternità. Va fatta la PCR dei 19 marker, si costruisce gli amplificati in modo che ognuno abbiano una dimensione molto diversa in un capillare, si dividono in base al peso, peso troppo simile hanno fluoro-cromo diversi e ciò che si ottiene dal capillare è un pattern che ci dice che a livello di un tot microsatellite abbiamo tot alleli e in base alla distanza possiamo dirne anche la ripetizione. Successivamente si fa una tabella dei risultati (l'omozigosi presenta un picco unico). (Solo i gemelli omozigoti hanno lo stesso codice microsatellico) ANOMALIE CROMOSOMICHE L'OMIM Esso registra tutte le malattie genetiche. DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (Osserva quando i bambini s'arrampicano su se stessi, possibile distrofia muscolare di Duchenne!) Gene DMD della distrofia muscolare di Duchenne: Uno dei più grandi geni noti E’ costituito da 79 esoni L’mRNA è di circa 14,000 basi Codifica per → distrofina La distrofina serve come aggancio tra citoscheletro e le proteine transmembrana e inoltre attacca citoscheletro-membrana plasmatica. Il gene DMD codifica anche per la cardiopatia dilatativa (riguarda il polmone che inizia a dilatarsi) e la distrofia di Becker. Mutazioni sullo stesso gene → fenotipi diversi, dipende dal luogo in cui avviene la mutazione del gene. La distrofina se mutata molto manca della parte finale coinvolta nell'aggancio al sarcoglicano. La distrofina in tutto il corpo non è identica, ogni tipo di muscolo ha il suo tipo che viene espresso da un promotore diverso. Se la mutazione = promotore e all'esone 1 = la distrofina non funziona anche a livello cardiaco, il resto è analogo, mentre resta specifica per il cuore se a essere coinvolti nella frameshift sono solamente esone e promotore cardiospecifici (cardiopatia dilatativa) DMD Frequenza: 1 su 3500 maschi alla nascita Eredità: recessiva legata al sesso Epoca di insorgenza primi segni: 2 –3 anni Progressiva, irreversibile difficolta nella corsa a 8 anni(è un bambino pigro), cadute frequenti, difficoltà a salire le scale Invalidità verso i 12/18 anni Aspettativa massima di vita: fino a 30 anni (con autorespiratore) Disfunzioni: Pseudoipertrofia dei polpacci, aritmie cardiache, iperlordosi e cifoscoliosi, Percentuali: Nel 70% dei pazienti c’è la delezione della distrofina, nel 10% duplicazioni parziali, nel 15% mutazioni puntiformi e nel 5% origine ignota. Molto facile avere mutazioni de novo su questo gene. CARDIOMIOPATIA DILATATIVA X-LINKED DA DISTROFINOPATIA Fenotipo = interessamento del miocardio senza significativi segni di miopatia scheletrica Distrofina = assente nel muscolo cardiaco mentre presente o ridotta nel muscolo scheletrico Evoluzione rapida in insufficienza cardiaca congestizia Uso di promotore e primo esone diverso Mutazione nella parte specifica NEUROPATIA DISTALE DEL NEURONE MOTORIO HMN TIPO VII Caratterizzata da debolezza muscolare congenita prevalentemente distale e atrofia variabile  Comporta iporeflessia, (risposta muscolare agli stimoli nervosi inferiore alla norma) o areflessia (no risposta) Spesso associati anomalie scheletriche (piedi torti equino-vari, scoliosi, cifoscoliosi, iperlordosilombare) Ritardo della deambulazione, andatura a base allargata Iperlassitàarticolare e/ o disfunzione della vescica e intestino Non progressiva ma si verificano fenomeni di denervazione delle fibre muscolari, soprattutto a carico delle fibre tipo II La neuropatia motoria distale ereditaria tipo VIII (HMN8) è una patologia autosomica dominante; si può vedere precocemente per ridotti movimenti del feto; Dovuta alla mutazione del gene TRPV4, che codifica per canale cationico (canali TRP) L’alterazione dell’omeostasi dello ione calcio comporta un alterazione all’eccitabilità muscolare, con riduzione della risposta agli stimoli nervosi Spesso necessari interventi chirurgici ortopedici o supporti per la locomozione o trattamenti paliativi a causa dell’assenza di una cura →“FSHSMA = atrofia muscolare facio-scapolo-omerale” Colpisce la muscolatura della cintura pettorale + faccia. Assomiglia alla distrofia muscolare facio-scapolo-omerale, ma differisce per diversa risposta muscolare che per istologia muscolare Degenerazione delle cellule del corno anteriore del midollo spinale + nuclei bulbari senza intaccare il nervo Malattia autosomica dominante Insorge nella prima età adulta Lentamente progressiva Altra atrofia: → “Atrofia muscolare spinale scapolo-peroneale” Autosomica dominante Colpisce i motoneuroni Prevalenza = 60% all'esordio dei sintomi. Presenza di Corpi di Lewye o neuriti di Lewy (aggregati proteici anormali) nelle cellule nervose del tronco encefalico → contenenti il gene SNCA (PARK-1) che implica il ripiegamento errato delle proteine nella sintesi proteica interrompendo la normale funzione cellulare. In Italia colpisce circa 230.000 persone, delle quali circa il 70% ha un’età superiore ai 65 anni. In media impiega 9,7 anni dall'esordio → morte Leggermente più frequente nei maschi: 1,5-2 volte in più Progressivo aumento incidenza Presenza di una predisposizione genetica SINTOMATOLOGIA - “TRAP” 1. Tremore a riposo, rigidità muscolare progressiva, bradicinesia, anomalie posturali caratteristiche, disautonomia, crampi 2. Ipoventilazione centrale, ipotensione posturale, incontinenza della vescica, disfagia, iperreflessia, grave spasticità, afasia 3. Marcate manifestazioni psichiatriche, comprese allucinazioni, deliri, ansia e depressione