Genetica I PDF - Giampiero Valè

GENETICA I Giampiero Valè Agenti mutanti Cenni su mutazioni da elementi trasponibili Meccanismi di riparazione del DNA ANALOGHI DELLE BASI Forma chetonica Forma enolica In laboratorio le mutazioni causate dagli analoghi delle basi sono reversibi...

GENETICA I Giampiero Valè Agenti mutanti Cenni su mutazioni da elementi trasponibili Meccanismi di riparazione del DNA ANALOGHI DELLE BASI Forma chetonica Forma enolica In laboratorio le mutazioni causate dagli analoghi delle basi sono reversibili attraverso trattamento con lo stesso analogo. AGENTI ALCHILANTI, ACIDO NITROSO E IDROSSILAMMINA REAZIONI OSSIDATIVE L’ossidazione converte la guanina in 8-ossi-7,8-diidrodeossiguanina, che spesso si appaia erroneamente con l’adenina invece che con la citosina, causando una mutazione per trasversione G-C a T-A R.O.S.: - anione superossido O2.- - perossido di idrogeno H2O2 - radicale idroperossido HO2. - radicali idrossilici liberi OH. GLI AGENTI INTERCALANTI determinano inserzioni e delezioni di singolo nucleotide durante la replicazione Agente intercalante inserito tra 2 basi Agente intercalante inserito tra 2 basi del filamento stampo del filamento di neosintesi LE RADIAZIONI raggi X, i raggi gamma e radiazioni cosmiche: radiazioni ionizzanti; spezzano i legami fosfodiesterici del DNA causando spesso rotture di entrambi i filamenti del DNA. Il tentativo di riparare queste rotture può produrre mutazioni cromosomiche Effetti dei raggi UV: dimeri di timina IL TEST DI AMES PER LA RILEVAZIONE DELLA MUTAGENICITA’ DEI COMPOSTI Estratto S9: enzimi epatici di ratto, topo o criceto Il test di Ames si serve di diversi ceppi auxotrofi del batterio Salmonella typhimurium che hanno difetti nel rivestimento lipopolisaccaridico (che di solito protegge i batteri dagli agenti chimici presenti nell’ambiente). Inoltre in questi ceppi il sistema di riparazione del DNA è stato inattivato. Ogni ceppo porta una mutazione his- che lo rende incapace di sintetizzare istidina e viene piastrato su terreno privo di istidina. Solo i batteri in cui avviene una mutazione inversa (da his- a his+) sono in grado di sintetizzare his e crescere sul terreno, il che rende queste mutazioni facili da individuare i) Permette di fare una quantificazione utilizzando diverse concentrazioni della sostanza in esame ii) Possibilità di fare una curva dose-risposta iii) Permette inoltre di fare un confronto di mutagenicità tra sostanze diverse GLI ELEMENTI TRASPONIBILI COME ELEMENTI MUTAGENICI CLASSI DI ELEMENTI TRASPONIBILI Ripetizioni fiancheggianti dirette e invertite Su entrambi i lati degli elementi trasponibili classe II sono presenti ripetizioni fiancheggianti dirette, lunghe da 3 a 12 bp. Le sequenze di questi elementi ripetuti variano, ma la loro lunghezza è costante per ogni tipo di elemento trasponibile Alle estremità di molti elementi trasponibili, ma non di tutti, ci sono poi ripetizioni terminali invertite (TIR), sequenze lunghe da 9 a 40 bp che sono complementari e invertite una rispetto all’altra. Di solito la trasposizione è mutagena La ricombinazione omologa tra copie multiple di trasposoni può portare a delezioni, inversioni e duplicazioni  ELEMENTI TRASPONIBILI NEI BATTERI I trasposoni a DNA trovati nei batteri sono divisi in due gruppi principali: (1) trasposoni a struttura semplice, chiamati sequenze di inserzione, che trasportano solo l’informazione necessaria al movimento e (2) elementi trasponibili più complessi, chiamati trasposoni compositi, che contengono sequenze di DNA non direttamente coinvolte nella trasposizione. Le sequenze di inserzione: (IS) è il tipo più semplice di elemento trasponibile nei cromosomi batterici e nei plasmidi. Questo tipo di elemento trasporta solo l’informazione genetica necessaria al suo stesso spostamento; dimensioni da 600 a 3000 bp; sequenze ripetute- invertite di 10-25 bp che servono per il riconoscimento della trasposasi  Le sequenze di inserzione: (IS) IR: 9 bp duplicazioni: 9 bp Appaiamento delle sequenze complementari (TIR) alle estremità Trasposasi fa tagli…. I trasposoni compositi: ogni segmento di DNA che viene a trovarsi in mezzo a due copie di una sequenza di inserzione può anch’esso trasporsi ed è chiamato trasposone composito. Il trasposone composito Tn10 contiene un gene per la resistenza alla tetraciclina tra due sequenze di inserzione IS10. Le sequenze di inserzione alle estremità di un trasposone composito possono avere lo stesso orientamento, oppure orientamento opposto (come accade in Tn10) I trasposoni compositi Questa è IS50R Batteriofago trasponibile Mu: alcuni genomi di batteriofagi si riproducono per trasposizione e usano la trasposizione per inserirsi nel cromosoma batterico durante il ciclo lisogeno; il DNA di Mu può esistere anche come unità extracromosomica e venire impacchettato in un capside potendo così infettare altre cellula batteriche ELEMENTI TRASPONIBILI NEGLI EUCARIOTI Gli elementi Ac e Ds nel mais Le cariossidi screziate (multicolori) del mais sono causate da geni mobili. Lo studio del mais striato ha portato Barbara McClintock alla scoperta degli elementi trasponibili. L’epoca di trasposizione di Ds spiega la variegatura delle cariossidi di mais Un esempio dell’effetto mutageno della trasposizione La mutazione che ha generato acini bianchi consiste nell’inserzione di un retrotrasposone di 10422 bp, chiamato Gret 1, vicino a un gene che promuove la produzione di antocianine. Il retrotrasposone Gret 1 ha interrotto le sequenze che regolano il gene, impedendo di fatto la produzione del pigmento e dando origine ad acini bianchi privi di antocianine. Gli acini rossi sono il risultato di una seconda mutazione verificatasi nelle piante ad acini bianchi. Questa mutazione, che probabilmente deriva da ricombinazione diseguale, ha rimosso in buona parte, ma non del tutto, il retrotrasposone, permettendo una produzione di pigmento ma non ai livelli alti che porterebbero alla colorazione nera originaria degli acini.  Elementi trasponibili nel genoma umano Gli elementi trasponibili rappresentano il 45% del genoma umano Includono: Trasposoni a DNA (~3%) Retrotrasposoni virali o LTR (~8%) Retrotrasposoni non virali o Non-LTR (~34%) ERV (endogenous retroviruses) costituiscono circa 8.5% del genoma umano; in totale ci sono circa 750,000 copie, delle quali alcune sono intatte e altre (la maggior parte) sono presenti come solo-LTR e geni virali degenerati gag, che codifica la proteina del capside del virione; pol, che codifica la trascrittasi inversa; env, che codifica una proteina del rivestimento virale;  Short interspersed nuclear elements (SINE) - le SINE sono brevi sequenze di DNA (di meno di 500 bp) - non codificano per la trascrittasi inversa; hanno perciò bisogno delle proteine codificate da altre sequenze ( LINE) per trasporre - Le sequenze Alu (media circa 300 paia di basi) sono classificate come short interspersed element (SINE). Si stima che le sequenze Alu presenti nel genoma umano siano più di un milione Trasposizione di LINEs e SINEs causano diverse malattie nell’uomo SISTEMI DI RIPARAZIONE DEI DANNI AL DNA I danni giornalieri al DNA umano sono molto frequenti Tutti gli organismi hanno sviluppato diversi sistemi di riparazione, ciascuno specializzato per rimuovere particolari modificazioni al DNA Riparazione per escissione: MMR, MisMatch Repair; BER, Base Excision Repair; NER, Nucleotide Excision Repair; nel NER, il filamento non danneggiato serve da stampo per la riparazione Riparazione per ricombinazione: HR, homologous recombination, viene utilizzata quando entrambi i filamenti di DNA sono danneggiati REVERSIONE DIRETTA DEI DANNI AL DNA Dimerizzazione da UV: fotoriattivazione enzimatica, enzima DNA fotoliasi attivata da luce tra 320 e 370 nm; la proteina è in grado di rompere il dimero e ricostruire la struttura corretta Rimozione del gruppo metilico dalla base O6-metilguanina: una metil-transferasi rimuove il gruppo metilico dalla G e lo trasferisce su uno dei propri residui di Cys RIPARAZIONE DI ERRORI DI APPAIAMENTO DNA pol fa errori di incorporazione (mismatch)con una frequenza che varia da 10–4 a 10-5. Se il nucleotide incorporato in maniera errata non è rilevato e cambiato, un secondo ciclo di replicazione (in cui il nucleotide errato fa parte del filamento stampo) porta all’incorporazione nel filamento di neosintesi di un nucleotide complementare con cambiamento permanente della sequenza di DNA RIPARAZIONE DI ERRORI DI APPAIAMENTO Sistema MMR (Mis-Match Repair) nei batteri 1) L’appaiamento scorretto viene riconosciuto dalla proteina MutS, che si lega in corrispondenza del mis-match; MutH 2) tale interazione è stabilizzata dalla interazione con omodimero MutL. Il complesso MutS e MutL attiva la 3) MutL proteina MutH che si lega a GATC MutS emimetilata più vicina e grazie alla sua attivtà endonucleasica taglia il filamento non metilato nel sito GATC e, con il contributo di un’elicasi che apre il filamento con mismatch, degrada il filamento nella regione compresa fra il taglio e le basi mal appaiate. La DNA polimerasi III e la DNA ligasi riempiono l’interruzione sul filamento non metilato con nucleotidi appaiati correttamente  MutSα: MSH2 + MSH6= mismatch e inserzioni e delezioni singola base MutS eucarioti: MutSβ: MSH2 + MSH3= inserzioni e delezioni 2-4 basi MSH4 + MSH5= ruolo nella ricombinazione meiotica MutL eucarioti: eterodimero con 4 subunità RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DI BASI (BER) Primo passaggio è il riconoscimento del danno da BER (base excision repair) agisce su danni al DNA di origine endogena parte di una DNA glicosilasi che rompe legame causati da ROS, deaminazione glicosidico tra lo zucchero e la base azotata spontanea delle basi azotate del DNA, danneggiata. idrolisi delle basi azotate del DNA Si crea così un sito abasico (sito AP). Endonucleasi specifiche riconoscono il sito AP e tagliano legame fosfodiesterico. Il BER negli eucarioti può quindi procedere per 2 vie: 1) nello short-patch BER la DNA pol β rimuove il desossiribosio senza la base e riempie il buco con il nucleotide mancante; il legame fosfodiesterico è saldato da DNA ligasi 3 2) nel long-patch BER, DNA pol δ o Ɛ, insieme a PCNA (proliferating cell nuclear antigen) allungano il 3’ OH di 4-10 nt, aprendo la doppia elica a valle del danno. Il filamento singolo danneggiato è tagliato da nucleasi FEN1 (flap endonuclease 1). Il taglio a singolo filamento è saldato da DNA ligasi 1. RIPARAZIONE PER ESCISSIONE DI NUCLEOTIDI (NER) Giornalmente, considerando altitudine di 600 Lesioni riparate dal m, in ogni cellula della pelle esposta alla luce del sole vengono prodotti decine di migliaia di NER sono quelle fotoprodotti causati da radiazioni UV dovute alle radiazione UV: dimeri di pirimidine e fotoprodotti 6-4 pirimidine- pirimidone: provocano distorsione doppia elica NER in E. coli: In E. coli un complesso formato da 2 molecole di UvrA e una di UvrB scorre lungo il DNA. Il dimero di UvrA riconosce la distorsione dell’elica e si associa al DNA. UvrB denatura la doppia elica e recluta UvrC, che taglia il DNA a monte e a valle della lesione. Il filamento lesionato viene rimosso da DNA elicasi UvrD che lascia un gap di 12-13 nt che viene riempito da DNA pol I e saldato da ligasi. In tutti gli eucarioti il NER è composto da 2 sottoprocessi: Global Genome NER (GG- NER), e Transcription-Coupled-Repair-NER (TCR-NER) GG-NER: un complesso proteico scorre lungo il genoma e individua distorsioni della doppia elica TCR-NER: due proteine del TCR-NER, CSA e CSB, legano direttamente la RNA-pol II Processi comuni: TFIIH (che contiene i due polipeptidi XPB e XPD con attività DNA elicasica) apre il DNA per circa 30 nt attorno alla lesione. La proteina XPA conferma la lesione legandosi ad essa. La regione aperta del DNA è stabilizzata Mutazioni in geni dal legame con la proteina RPA umani per le proteine NER sono XPG e XPF sono due endonucleasi NER associate a almeno 3 specifiche che tagliano rispettivamente in 3’ e in malattie genetiche: xeroderma 5’ generando un frammento di 30 nt che verrà pigmentosum (XP), eliminato sindrome di Cokayne (CS) e La zona a singolo filamento di circa 30 nt verrà tricotiodistrofia riparata copiando il filamento complementare (TTD) RIPARAZIONE DEI TAGLI ALLA DOPPIA ELICA DEL DNA Meccanismo HR: un complesso eterotrimerico chiamato MRN causa la degradazione in direzione 5’ a 3’ generando regioni a singolo filamento stabilizzate da RPA. Rad51 e Rad52 scalzano RPA; il DNA a singolo filamento è ricoperto da Rad51. L’estremità 3’OH del filamento ricerca NB: meccanismo NHEJ sequenze di DNA omologo formando comporta la perdita di una giunzione di Holliday. Si innesca la nucleotidi nella zona sintesi di DNA e la generazione della di giunzione molecola di DNA riparata. NBNB: La possibilità di Meccanismo NHEJ: le estremità del riparare con HR o NHEJ filamento DBS sono riconosciute da dipende dalla fase del Ku70/Ku80 che interagisce DNA-PK. ciclo cellulare in cui DBS Processamento delle estremità da deve essere riparato parte di MRN. XRCC4 e DNA ligasi 4 saldano le estremità rotte. DIVERSE MALATTIE SONO CAUSATE DA DIFETTI NEI MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA mutazioni nel gene XPD (elicasi) Lo xeroderma pigmentoso può derivare da alterazioni in numerosi geni NER diversi. i) Alcuni individui hanno mutazioni in un gene che codifica per una proteina la cui funzione è riconoscere e legare il DNA danneggiato (XPC); ii) altri presentano mutazioni in un gene che codifica per l’elicasi (XPB o XPD). iii) Altri ancora mostrano difetti nei geni che presiedono al taglio del filamento danneggiato sulle estremità 5′ o 3′ del dimero di pirimidina (XPG e XPF). iv) Alcune persone presentano una forma leggermente diversa della malattia (lo xeroderma pigmentoso variante) dovuta a mutazioni nel gene che codifica per la polimerasi η, la DNA polimerasi translesione che aggira i dimeri di pirimidina. Mutazioni nei geni coinvolti nei meccanismi di riparazione del DNA possono causare mutazioni a cascata