Génétique du Développement 2024-2025 ULB V7 PDF

 III. Génétique du développement (à partir de la fin du XXe siècle, années 1970-80) Van Beneden, 1883 Flemming, 1882 Mendel, 1865 WT...

 III. Génétique du développement (à partir de la fin du XXe siècle, années 1970-80) Van Beneden, 1883 Flemming, 1882 Mendel, 1865 WT mutant Marshall Nirenberg, Severo Ochoa Robert Holley, 1968 Watson et Crick, 1953 Rosalind Franklin Les cellules se différentient parce qu’elles expriment de manière différentielle les gènes Une cellule quelconque n’exprime probablement qu’au maximum 20% des gènes à la fois.  Mécanismes de contrôle de l’expression des gènes Les cellules se différencient parce que les gènes sont exprimés de manière différentielle. Une palette de techniques est disponible pour étudier l’expression des gènes. au niveau de l’ARN ou des protéines. La technique de scRNA-seq permet d’explorer le transcriptome de cellules individuelles dans des tissus complexes. La régulation de l’expression génique s’exerce à toutes les étapes (maturation, dégradation, traduction, post- traduction). Des ARN non codant (miRNA) interviennent aussi dans le contrôle de l’expression des gènes. La transcription des gènes est contrôlée par l’état de compaction de la chromatine. Des complexes de remodelage de la chromatine et des enzymes modifiant les histones et l’ADN régulent l’état de de la chromatine. Ces modifications épigénétiques peuvent être réversées. Certaines comme les méthylations de l’ADN contribuent à la stabilité de l’expression des gènes au cours des divisions cellulaires (mémoire épigénétiques). Les complexes de protéines Polycomb et Trithorax jouent un rôle important dans la mémoire épigénétique. L’inactivation du chromosome X et l’empreinte parentale constitue deux exemples de mémoire épigénétique. Le contrôle de la transcription implique des protéines régulatrices (facteurs de transcription et cofacteurs) qui se lient à des séquences d’ADN cis-régulatrices. Les séquences amplificatrices ou « enhancers » sont des séquences ci-régulatrices distales qui augmentent considérablement l’efficacité de la transcription. Elles fonctionnent indépendamment de leur position, de leur distance et de leur orientation par rapport aux gènes qu'ils régulent. Les enhancers orchestrent l’expression spatiotemporelle des gènes. L’organisation 3D de la chromatine intervient aussi dans le contrôle de l’expression des gènes. Les domaines TAD constituent des unités fonctionnelles de régulation du génome, dans le sens où ceux-ci limitent les interactions entre les séquences enhancer et les promoteurs des gènes Certains gènes codant pour des facteurs de transcription sont qualifiés de « gènes de développement » en raison de leur importance dans le contrôle de l’embryogenèse. Les gènes codant pour des facteurs de transcription dont la surexpression est suffisante pour diriger le développement d’un type cellulaire spécifique sont désignés gènes sélecteurs (« master genes»). Les facteurs de transcription pionniers sont ceux pouvant se lier à des sites cibles spécifiques de l'ADN dans la chromatine hautement condensée, la remodelant et la rendant plus accessible à d'autres facteurs de transcription pour activer la transcription des gènes. Les gènes architectes codent pour des FTs à homéodomaine (gènes Hox) qui déterminent le plan d’organisation (« pattern ») d'un être vivant. Les gènes codant pour des molécules de signalisation jouent aussi un rôle central dans le développement  Une palette de techniques est disponible pour étudier l’expression des gènes Techniques qui mesurent la quantité d’ARN Techniques qui mesurent la quantité de protéine https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Au niveau de l’ARNm, techniques basées sur l’hybridation moléculaire https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Au niveau de l’ARNm, techniques basées sur l’hybridation moléculaire et l’utilisation de sondes https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Les sondes peuvent être marquées avec un nucléotide radioactif. Aujourdhui, on utilise des sondes « froides », marquées avec des nucléotides couplés à un groupement fluorescent ou des nucléotides modifiés (DIG-UTP) permettant un marquage enzymatique (alcaline phosphatase). https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Technique d’hybridation in situ, sur sections ou sur embryons entiers Sox3 C.Actin Plaque neurale somites Ant Vue dorsale d’un embryon au Coupe transversale d’un embryon au stade stade neurula précoce neurula tardif  Technique de RT-qPCR (PCR quantitative après transcription inverse) L’ARN est extrait et rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) grâce à une rétrotranscriptase. Des fragments spécifiques de cet ADNc sont alors amplifiés par PCR grâce à des couples d’amorces oligonucléotidiques. La PCR peut être classique, c’est-à-dire que l’on observe la quantité d’ADN obtenue après migration sur un gel d’électrophorèse ou la PCR peut être quantitative (qPCR ou aussi PCR en temps réel) signifiant que l’on observe la quantité d’ADN au cours de l’amplification grâce à une molécule qui devient fluorescente en présence d’ADN double brin (SYBRGreen). Suivi de l’évolution de l’intensité de la fluorescence durant une qPCR. https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Technique de séquençage de l’ARN en vrac (« Bulk RNA-sequencing ») Liste des gènes exprimés dans le tissu d’intérêt. https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Gène X Les résultats de l’analyse par séquençage de l’expression des gènes sont souvent représentés sous forme d’un graphique en forme de volcan (« Volcano plot ») qui représente le rapport des changements d'expression génique et leur signification statistique. L'axe des x représente le rapport des changements d'expression des gènes, l'axe des y représente la signification statistique de ces changements, et chaque gène est représenté par un seul point. Il sont aussi souvent visualisé sous forme de « heat map » où l'axe horizontal représente généralement les échantillons et l'axe vertical représente les gènes. https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/  Single cell RNA-seq ou scRNA-seq Les cellules sont encapsulées dans des gouttelettes avec un tampon de lyse, un mélange de transcription inverse et des microsphères d’hydrogel portant des amorces à code-barres. Après encapsulation, les amorces sont libérées. L’ADNc dans chaque gouttelette est marqué avec un code-barre lors de la transcription inverse. Les gouttelettes sont ensuite cassées et le matériel de toutes les cellules est amplifié linéairement avant le séquençage. Toutes les séquences qui auront le même code- barre proviennent de la même cellule et donc on peut avoir accès au transcriptome de chaque cellule. Après l’analyse des resultats, on obtient des images comme celle-ci ou chaque point représente une cellule et les cellules ont été positionnées dans un espace où plus elles sont rapprochées, plus leur transcriptome est proche. https://bcgdevelop.fr/les-outils-genetiques-a-disposition/ Au niveau de la protéine, à l’aide d’anticorps primaire spécifique Sox3, un marqueur du tissu neural Toutes les étapes de l’expression des gènes constituent des points de contrôle importants dans le développement Transcription Maturation (épissage) des ARNm et transport vers le cytoplasme Stabilité des ARNm Traduction des ARNm Modifications/dégradation des protéines  Epissage, maturation et transport des ARN messagers vers le cytoplasme Vue d'ensemble de la synthèse et de la maturation de l'ARNm nucléaire. Le pré-ARNm est synthétisé par l'ARN polymérase II (Pol II), coiffé à son extrémité 5’ et lié par le complexe de liaison de la coiffe (CBC). Les introns sont éliminés par des complexes ribonucléoprotéiques qui composent le spliceosome, ainsi que de protéines régulatrices qui reconnaissent des séquences au niveau des ARN pré-messagers principalement au cours de la transcription, et les jonctions d'épissage qui en résultent sont marquées par le complexe exon-jonction (EJC). L'extrémité 3’ de l'ARNm est clivée et poly-adénylée par la machinerie canonique de traitement de l'extrémité 3’, et cette nouvelle queue poly-A est liée par la protéine nucléaire de liaison poly-A (PABPN1). L'ARNm mature se compacte en une particule ribonucléoprotéique (mRNP) grâce aux protéines liées à l'ARNm. La mRNP est reconnue par le complexe de transcription et d'exportation (TREX), qui autorise l'exportation nucléaire de l'ARNm en chargeant le facteur d'exportation nucléaire, NXF1-NXT1, sur l'ARNm. Vorlander et al., Current Op. Struct. Biol. 2022 Exemple de l'importance de l’épissage différentiel dans l’expression des gènes au cours du développement La différenciation sexuelle chez la drosophile Chez la drosophile, le chromosome Y n'intervient pas dans la détermination du sexe. C'est le nombre de chromosomes X et le nombre de copies du gène Sex lethal qui détermine le sexe. Une double dose du gène X permet la production de la protéine Sxl chez les femelles, mais non chez les mâles, conduisant in fine à la production de deux isoformes du facteur de transcription Dsx, stimulant l’un le développement de caractéristiques sexuelles mâles, l’autres de caractéristiques femelles.  , codant pour des protéines de liaison à l’ARNm impliquées dans des processus d’épissage, Un épissage d’ARN en cascade, sexe spécifique, détermine le sexe chez la drosophile. Sex lethal (Sxl) est une protéine liant l’ARN intervenant dans l’épissage de transcrits d’autres gènes (Tra, Tra2) codant également pour des protéines intervenant dans l’épissage, qui aboutit à un épissage alternatif des transcrits du gène Doublesex (Dsx) codant pour un facteur de transcription. Des isoformes différents de Dsx sont produits dans les deux sexes, une forme tronquée induisant le développement de caractéristiques femelles et une forme complète stimulant le développement de caractéristiques sexuelles mâles. Exemple de l'importance de l’épissage différentiel dans le développement: le gène myostatin codant pour un régulateur négatif de la croissance des muscles. Des mutations dans le gène myostatin qui n’affectent pas la séquence Conséquences de l’altération de l’épissage du gène myostatin chez la codante mais qui créent un nouveau souris et le bovins. site d'épissage dans le 1° intron du gène myostatin et la production d’un ARNm contenant un codon stop prématuré. La protéine produite est donc tronquée, non fonctionnelle. L’inactivation de cette protéine induit une hypertrophie musculaire.  Exemples de maladies liées à des défauts d’épissage Une mutation au niveau d’un site accepteur du gène de la chaîne bêta de l’hémoglobine entraîne la bêta+ thalassémie qui est caractérisée par un déficit partiel de synthèse des chaînes de bêta-globine de l’hémo- globine et une anémie1. La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie neuromusculaire caractérisée par une atrophie et une faiblesse musculaire progressive due à une dégénérescence des muscles. La maladie est liée à des mutations affectant l’épissage du gène de la dystrophine. La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies génétiques touchant les enfants dans les populations occidentales. Elle est associée à plus de 1 250 mutations dans le gène CFTR (cystic fibro- sis transmembrane conductance regulator)2, dont certaines affectent directement des sites d’épissage Delagrange et al., M/S Altérations de l’épissage et maladies rares 12, 32, 1111, 2016  Stabilité des ARN messagers La stabilité de l’ARNm dépend de sa séquence et de ses modifications. Elle est 7 déterminée par sa coiffe 5' m G et sa queue poly (A) en 3’. Les ARNm sont dégradés par le raccourcissement de la queue poly(A) de l'ARNm, un processus appelé déadénylation, qui est généralement suivi du clivage de la coiffe avant la dégradation du corps de l'ARNm. Garneau et al., The hyghways and byways of mRNA decay. Nature reviews mol. Cell Biol.8, 113-126, 2007  Exemple de l’importance de la régulation de la stabilité des ARNm pour l’expression des gènes au cours du développement Les ARNm maternels qui s'accumulent pendant lors de la croissance de l'œuf doivent être judicieusement dégradés pour assurer le bon développement des embryons de mammifères. Une accumulation anormale de ces transcrits entraine des défauts de développement des embryons. Sha et al., Nature Com 11,4917, 200  Traduction des ARNm La traduction des ARNm par les ribosomes dépend de: La structure de coiffe m7GpppN à l'extrémité 5′ de l'ARNm et la queue poly(A) (A)n à l'extrémité 3′ sont des motifs canoniques qui favorisent fortement l'initiation de la traduction. Les structures secondaires, telles que les épingles à cheveux, bloquent la traduction. Les séquences internes d'entrée dans le ribosome (IRES) assurent la médiation de la traduction indépendante de la coiffe. Les cadres de lecture ouverts en amont (uORF) fonctionnent normalement comme des régulateurs négatifs en réduisant la traduction à partir du cadre de lecture ouvert principal. La présence de sites de liaison (ex.: « AU rich elements » =ARE) (symbolisés par des ovales verts) pour des protéines et/ou autres régulateurs de l'ARN (miRNA) qui inhibent généralement la traduction. Gebauer and Hentze, Molecular mechanisms of translational control. Nature review Mol Cell Biol. 5,827-835, 2004  Etapes de la traduction des ARNm La traduction des ARNm commence généralement par la liaison d’un complexe de protéines (facteurs d’initiation de la traduction) incluant eIF4E lié à la coiffe, qui interagit alors avec eIF4G qui lie la PABP (poly(A)-binding protein) liée à la queue polyA, ce qui conduit la circularisation de l’ARNm. Lorsque l'ARNm est ainsi circularisé, eIF4G recrute le complexe de préinitiation 43S, constitué de la petite sous-unité du ribosome 40S, de l'ARNt de démarrage et des facteurs d'initiation eIF1, eIF1A et eIF3. Ce complexe va glisser à partir de l'extrémité 5' de l'ARNm jusqu'à rencontrer le premier codon de démarrage AUG. La grande sous-unité ribosomique s’associe alors à la petite et la phase d’élongation de la traduction démarre. Muckenthaler and Preiss, Encyclopedic Reference of Genomics and Etapes d’initiation de la traduction. Proteomics in Molecular Medicine pp 1904–1909  Exemples de l’importance du contrôle de la traduction dans le développement L’œuf est une cellule spéciale, un cellule dormante! Les ARNm et les ribosomes y sont stockés par la mère inactif en vue d'une utilisation ultérieure dans l'embryon, où ils soutiennent ses premières divisions cellulaires. Avant la fécondation, l’ovocyte est dans un état de dormance : il maintient un faible métabolisme pour économiser de l'énergie et protéger les molécules importantes contre les dommages. Dans les ovocytes de nombreuses espèces animales, il y a un blocage global de la traduction de tous les ARNm maternels, via des protéines inhibitrices de la formation du complexe de pré-initiation de la traduction (maskin). Gebauer et al., Molecular mechanism of translation, Nature reviews Mol. Cell Biol. 5, 827-835, 2004  La dormance de l’œuf Des travaux récents ont identifié des protéines qui se lient aux ribosomes les maintiennent stables et inactifs dans l’œuf.  Les microARN Les microRNA (miRNA) sont des petits ARN simple brin de 21-22 nucléotides qui contrôlent l'expression des gènes en se liant à l'ARN messager (ARNm) dans le cytoplasme de la cellule. Au lieu d'être traduit rapidement en protéine, l'ARNm marqué sera soit détruit et ses composants recyclés, soit conservé et traduit plus tard. Les miRNA sont produits à partir d’un transcrit primaire (pri-miRNA) plus long formant des structures double brin en épingle à cheveux. Les pri-miRNAs sont maturés par différentes protéines (Drosha dans le noyau) pour produire de petit duplex double brin d’ARN (miRNA/miRNA duplex). Ces duplex sont alors pris en charge par la protéine Dicer qui dégrade un des deux brins et permet à l’autre brin d’être incorporé dans un complexe de protéines (RISC, "RNA induced silencing complex"). Ce miRNA servira alors de guide permettant de cibler des ARNm spécifique et inhiber leur traduction (si complémentarité partielle) ou induire sa dégradation (si complémentarité parfaite)..  De nombreuses protéines néosynthétisées requièrent des modifications pour être biologiquement actives Ces modifications peuvent être nécessaires pour leur activité ou influencer leur stabilité. Certaines modifications sont nécessaires pour que la protéine soit transportée à un endroit particulier de la cellule pour lui permettre de remplir sa fonction. La transcription des gènes est contrôlée par l’état de compaction de la chromatine La chromatine est le mélange d’ADN et de protéines présent dans le noyau des cellules. On parle d’ hétérochromatine lorsque la chromatine est fortement compactée ce qui empêche la transcription. On parle d’ euchromatine lorsque celle-ci est décondensée et que l’ADN est accessible à la machinerie transcription de transcription.  La chromatine L’unité fondamentale de la chromatine est le nucléosome, constituée d’un cœur de protéines histones entouré autour duquel s’enroule l’ADN. Chaque nucléosome est constitué d’un octamère d’histones (2 copies d’histones de 4 types: H2A, H2B, H3 et H4). Avec le concours de l’histone H1, des états chromatiniens plus condensés, jusqu’au chromosome mitotique, peuvent se former. Deux types de protéines peuvent être recrutées pour modifier la chromatine 1 2  Complexes de remodelage de la chromatine (« Chromatin remodeling complex ») Les complexes de remodelage de la chromatine sont des complexes de protéines qui utilisent l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP pour déplacer, éliminer, ajouter ou restructurer les nucléosomes.  Enzymes de modification de la chromatine Les enzymes de modification de la chromatine modifient de manière covalente certains résidus d’histones ou des bases de l’ADN ce qui aboutit à une chromatine plus ouverte ou plus fermée. Il a été proposé que les modifications post-traductionnelles des histones formaient un «code» qui dicterait l’état chromatinien et la manière de régler un gène ou un locus.  La méthylation de l’ADN réprime la transcription des gènes dinucléotides CpG La méthylation de l’ADN a lieu au niveau de cytosines lorsque celles-ci sont suivies d'une guanosine (dinucléotides CpG). La méthylation de l’ADN est une marque épigénétique stable, associée à la répression transcriptionnelle des gènes associés.  Les modifications d’histones activatrices et inhibitrices Les modifications ont lieu sur des résidus spécifiques, principalement au niveau des queues N- terminale des histones. Les lysines d’histones peuvent être mono-, di- ou tri-méthylées. En fonction de leur position et dans le cas de méthylations, du nombre de groupements méthylés ajoutés, les modifications covalentes des histones aboutissent à une chromatine plus ouverte ou plus condensée. Les modifications d’histones activatrices et inhibitrices  Les modifications d’histones activatrices et inhibitrices Certaines modifications comme les tri-méthylation de la lysine en position 4 de l’histone H3 (H3K4me3), sont associées à une activation de l’expression génique, alors que d’autres, comme la tri-méthylation de la lysine en position 27 de l’histone H3 (H3K27me3), sont associées à la répression transcriptionnelle des gènes. Récemment des régions chromatiniennes atypiques, bivalentes (« poised ») , ont été identifiées, caractérisée par un co-enrichissement de H3K27me3 et H3K4me3. Il a été proposé que dans les cellules souches embryonnaires, les gènes jouant un rôle décisionnel dans l’acquisition d’une identité cellulaire seraient dans cette configuration chromatinienne afin de permettre leur activation transcriptionnelle rapide durant l’embryogenèse, mais cette hypothèse élégante reste à prouver. Baudre et al., La chromatine bivalente préserve la plasticité transcriptionnelle. Mes Sci 38, 425-427, 2022 Marques épigénétiques et impact sur la structure de la chromatine Certaines modifications épigénétiques affectent de manière directe la structure de la chromatine. L'acétylation d’histones (ex.: H3K27ac) est caractéristique de régions du génome où les gènes sont actifs. L’acétylation, en diminuant la charge positive des lysines, entraine un relâchement de la chromatine qui devient permissive pour la transcription. Marques épigénétiques et modification de la structure de la chromatine D’autres modifications épigénétiques affectent indirectement la structure de la chromatine, en liant des protéines (« readers »). Mecp2 lie l’ADN méthylé et promeut un état compacté de la chromatine en recrutant d’autres enzymes de modifications de la chromatine (HDAC, HMT).  Les modifications épigénétiques de la chromatine peuvent être réversibles Les modifications d’histones peuvent être inversées par d’autres enzymes qui éliminent les groupements chimiques (« erasers »).  Certaines modifications épigénétiques de la chromatine peuvent être stables et contribuent à la maintenance de l’état réprimé ou actif de l’expression des gènes Les méthylations de l'ADN bien que réversibles sont connues pour contribuer à la stabilité de l’expression des gènes au cours des divisions cellulaires (mémoire épigénétique) et préserver l’identité des cellules au cours du développement. A chaque réplication de l’ADN, l’ enzyme Dnmt1 s'associe aux fourches de réplication et reproduit précisément le schéma de méthylation original de l'ADN en ajoutant des groupes méthyles (rouge) sur le brin fille nouvellement formé (bleu).  Les complexes de protéines Polycomb et Trithorax jouent un rôle important dans la mémoire épigénétique Les protéines du groupe Polycomb sont des facteurs chromatiniens connus pour maintenir l’état transcriptionnel réprimé de leurs gènes cibles au cours du développement. Le complexe reconnait des régions méthylées de l’ADN et est capable d’ajouter trois groupes méthyl à la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3). Schuettengruber et al., Cell 171, 34-57, 2017 Les complexes de protéines Polycomb et trithorax jouent un rôle important dans la mémoire épigénétique Les protéines du groupe trithorax sont des facteurs chromatiniens connus pour maintenir l’expression des gènes au cours du développement. Les protéines Trithorax (TrxG) fonctionnent comme un complexe multicomposant conservé qui régule la triméthylation de la lysine 4 de l'histone 3 (H3K4me3). En résumé le « Toolkit » de régulation épigénétique de la chromatine comprend: Exemples de processus de développement illustrant l’importance des mécanismes épigénétiques de régulation de l’expression des gènes Empreinte parentale Compensation de dose  Empreinte génomique ou parentale (« genomic imprinting ») +/- 100 gènes soumis à l’empreinte L'empreinte génomique parentale est un phénomène épigénétique causant chez les mammifères l'expression d'un gène par un seul des deux allèles parentaux, alors que, dans la grande majorité des cas, les deux allèles des gènes sont exprimés. Autrement dit, lors de la production des gamètes, certains gènes sont « imprimés » et ainsi éteints en fonction du sexe.  Découverte de l’empreinte parentale chez les mammifères Ce sont des expériences qui ont été réalisées chez la souris pour obtenir des embryons dont le génome, 2N, est uniquement d’origine maternelle (gynogénotes) ou uniquement d’origine paternelle (androgénotes) qui ont mis en évidence la non viabilité des animaux androgénétiques et gynogénétiques. Les chromosomes d’origine maternelle et paternelle, contribuent de manière distincte au développement de l’embryon. Cela suggère des modifications épigénétiques qui seraient distinctes chez les mâles et les femelles. Épigénétique et développement : l’empreinte parentale https://www.medecinesciences.org/en/articles/medsci/full_ht ml/2005/04/medsci2005214p390/medsci2005214p390.html McGrath et Solter, 1984 ; Surani et al., 1984  M P On connait une centaine de gènes soumis à l’empreinte et donc inactivé, soit chez les mâles ou chez les femelles. Mise en place, maintien et effacement des empreintes génomiques au cours du cycle de vie de la souris 1 Les empreintes s’effectuent dans les cellules germinales en développement de manière spécifique en fonction du sexe. Les empreintes sont conservées dans toutes les cellules de l’individu au cours de son développement et chez l’adulte, a l’exception des cellules de la lignée germinale où les empreintes sont effacées pour être réimprimées en fonction du sexe de l’individu.  Les gènes soumis à l’empreinte codent pour des régulateurs importants du développement fœtal ou postnatal exprimé dans l’embryon ou le placenta. Les gènes à expression paternelle (i.e. Igf2) réguleraient positivement la croissance et l’apport de nutriments au fœtus. Les gènes à expression maternelle réguleraient négativement la croissance et les transferts maternofœtaux, Kalish et al., Int J Dev. Biol. 291-294, 2014  Si la mutation affecte l'allèle exprimé maternel non exprimé, l’embryon se développera normalement. éteint exprimé Si la mutation affecte l'allèle éteint paternel exprimé, l’embryon présentera un déficit de croissance. Le gène insulin-like 2 (IGF2) dont seul l'allèle paternel est exprimé au cours du développement chez la souris, est important pour la croissance de l’animal. Seul des mutations dans l’allèle paternel exprimé du gène Igf2 affecte le développement de l’individu. http://cvirtuel.cochin.univ-paris5.fr/empreinte/Index.htm  Empreinte parentale, évolution et signification. L'étendue de l'empreinte dans les lignées de mammifères semble coïncider avec le degré de viviparité, la maturité des jeunes à la naissance et la nécessité subséquente de périodes de soins parentaux. L'empreinte parentale, qui revient donc à renoncer aux avantages de la diploïdie pour certains gènes apparaît comme un mystère évolutif. L’hypothèse la plus couramment avancée est celle du « conflit des gènes parentaux » pour la quantité de ressources nutritive disponible. Le père n’est pas n'est pas assuré d'être le père des futurs descendants de la mère. L’intérêt paternel est de favoriser la croissance de sa progéniture pour transmettre ses gènes. L’intérêt de la mère est de donner assez de ressource à sa descendance pour permettre sa survie et son développement tout en gardant des ressources pour de futurs descendants. John et al., Nature Rev. Gen.24, 783-796, 2023  L’empreinte parentale explique le phénotype complexe lié à certaines anomalies génétiques Les syndromes de Prader Willi, et Angelman sont causés par la perte d’une petite région du chromosome 15 contenant 4 gènes soumis à l’empreinte, certains exprimés paternellement et d’autres maternellement. Si l’allèle paternel est perdu, les individus présentent le syndrome de Prader Willi. Si l’allèle maternel est perdu, les individus présentent le syndrome d'Angelman. http://cvirtuel.cochin.univ-paris5.fr/empreinte/Index.htm  Compensation de dose Dans toutes les espèces, un déséquilibre existe entre les sexes pour les gènes liées au chromosomes X. L’un des sexes a deux chromosomes, alors que l’autre n’en a qu’un. Cette inégalité doit être corrigée pour corriger ce déséquilibre, qui peut amener à anomalies ou arrêt de développement. Les animaux utilisent des mécanismes variés pour assurer cette équilibre, désignés sous le terme de compensation de dose. chez la drosophile, en doublant la transcription des gènes sur l’unique X est du mâle chez C. elegans, en réduisant de moitié la transcription des gènes sur les deux chromosomes des individus hermaphrodites chez les mammifères, par inactivation d’un des deux chromosome X chez les femelles (exemple extrême d’empreinte génomique)  Découverte de l’inactivation du chromosome X En 1948, Murray Barr observe que dans toutes les cellules des femelles de mammifères, mais pas de mâles, il y a dans les cellules en interphase un Murray Barr amas de chromatine condensée 1908-1995 (corpuscule de Barr). En 1961, il a été proposé par Mary Lyon que cette structure correspond au chromosome X inactif. Mary Lyon 1925-2014 Dans des individus porteurs d’un nombre anormal (aneuploïdie) de chromosome X, seul un chromosome X reste actif. https://www.khanacademy.org/science/biology/classical-genetics/sex-linkage-non-nuclear-chromosomal-mutations/a/x-inactivation Dans l’espèce humaine, l’inactivation du chromosome X a lieu au hasard dans l’ embryon précoce. Le chromosome inactivé est maintenu dans cet état inactif dans toutes les cellules descendantes. Le chromosome X inactivé est réactivé dans les cellules germinales, au cours de la formation des gamètes femelles. Les femelles de mammifères sont donc des mosaïques pour les allèles des différents gènes présents sur le chromosome X. Chez les marsupiaux, c’est toujours le chromosome X du mâle qui est inactivé (« imprinted X chromosome »). Cette inactivation à lieu au cours de la spermatogenèse.  Inactivation du X chez la souris Chez la souris, l'inactivation de l'X se produit tôt dans le développement embryonnaire de deux manières, d’abord (stade 4 cellules) sexe dépendante (« Imprinted sex inactivation »). Le chromosome X est réactivé dans les cellules de de l’embryon au stade blastocyste ( « inner cell mass », epiblaste) puis inactivé à nouveau de manière aléatoire (« random sex inactivation »). Le chromosome X inactivé est réactivé dans les cellules germinales, au cours de la formation des gamètes femelles.  L'inactivation au hasard du chromosome X (IHC) a des implications en terme de variation phénotypique à l’intérieur d’un individu L’IHC explique pourquoi tous les chats calico (mosaïcisme de pelage roux et noir) sont des femelles! Le gène pour la coloration des poils se trouve sur le chromosomes X. Il y a deux allèles, l’un donnant une couleur noire, l’autre orangée. Les mâles ne possédant qu’un seul chromosome X et donc un seul allèle, seul les femelles, mosaïques, possédant les deux allèles et n’exprimant qu’un des deux, peuvent donc présenter un pelage « calico ».  L'inactivation au hasard du chromosome X (IHC) a des implications en terme de variation phénotypique entre individus Seul les mâles porteurs de la mutation sont affectés. Les femelles sont non affectées, porteuses de la maladie. Une centaine de maladies dues à des mutations récessives de gènes sur l’X (Dystrophie musculaire de duchenne, syndrome de l’X fragile,…) https://www.genomicseducation.hee.nhs.uk/genotes/k nowledge-hub/x-linked-recessive-inheritance/  unaffected slightly affected skewed 70% 30% Les femmes porteuses d’une mutation récessive liée à l'X peuvent cependant présenter des caractéristiques (généralement légères) de la maladie due à une inactivation non aléatoire, asymétrique de l’X (dans le cas où l’asymétrie entraine une diminution de l'expression de l'allèle non pathogène (de type sauvage). https://www.genomicseducation.hee.nhs.uk/genotes/knowledge-hub/x-linked-recessive-inheritance/  « escape » » « mild » « severe » pattern d’inactivation aléatoire/asymétrique du X Des mutations dominantes liées au chromosome X où les mâles et les femelles peuvent être affectés. Les hommes porteurs de la mutation sont atteints plus sévèrement par la maladie que les femmes. Dans certains cas, la maladie est si grave chez les mâles qu'ils meurent in utero ou peu après la naissance. Chez les femmes, l’inactivation non aléatoire, asymétrique du chromosome X explique la sévérité variable du phénotype.  Le syndrome de Rett maladie de type autisme liée à une mutation dominante sur le X. associé à une mutation du gène MECP2 (X-linked) codant pour une protéine liant l’ADN méthylé. 1 naissance sur 10 à 15 000 troubles neurologiques de sévérité variable (défauts de d’apprentissage du langage, psychomoteurs, déficience intellectuelle…) Pas de traitement disponible actuellement Les filles atteintes du syndrome de Rett présentent une expression en mosaïque de l'anomalie MeCP2 au niveau cellulaire. Chez les filles, la sévérité des symptômes associés dépend de la proportion des cellules exprimant la protéine MECP2 mutée par rapport à celles exprimant la protéine normale. https://reverserett.org/ Mécanisme de l’inactivation et de la réactivation du chromosome X? Loda et al. Nature Rev. Mol Cell Biol. , 2022  Mécanisme de l’inactivation du chromosome X Le chromosome X est hyperméthylé , enrichi en marques répressives versus actives. L’inactivation du chromosome X repose sur l’expression du gène Xist, Le produisant un ARN long non-codant («lnRNA») localisé au niveau du locus Xic ( »X inactivation center »). Son activation est une étape essentielle dans le « silencing » du chromosome X. Il est exprimé seulement à partir du X inactivé et son ARN recouvre le chromosome à partir duquel il est produit et qui sera inactivé.. Nora et al., Biol Aujourdhui 204, 199-204, 2010 Carrel and Willard, Nature 434,400-404, 2005  Mécanisme de l’inactivation du chromosome X Une fois Xist exprimé sur l’un des deux X, on assiate celui-ci aide au recrutement d’un grand nombre de protéines de modification de la chromatine pour initier l’inactivation du chromosome X. Loda et al., Gene regulation in time and space during X-chromosome inactivation. Nature Rev. Mol Cell Biol. 23, 231-249, 2022 Le contrôle de la transcription implique des facteurs de transcription agissant sur des séquences d’ADN cis-régulatrices Les facteurs de transcription (TFs) sont des protéines qui modulent la transcription des gènes en se liant à des séquences d’ADN spécifiques. Ils représentent environ, 10% des gènes, (1800 TFs chez l’homme) L’identification des séquences spécifiques liées par les facteurs de transcription s’effectue par des expériences in vitro de type « Selex » où des fragments d’ADN aléatoire sont mis en contact avec le FT Les facteurs de transcription lient des d’intérêt immobilisé. Après lavage, les séquences spécifiques dans le génome. frgments d’ADN retenus sont séquencés.  Les facteurs de transcription: caractéristiques Les facteurs de transcription sont regroupés en différentes familles, en fonction de leur domaine de liaison à l’ADN.  Les facteurs de transcription: caractéristiques DRE « distal regulatory element » Les FTs spécifiques régulent l’expression des gènes en recrutant des cofacteurs (coactivateurs ou corépresseurs). Ils ont une structure modulaire, avec des domaines de la protéine impliqués dans la liaison à l’ADN ( « DNA-binding domain », DBD) et d’autres régions permettant le recrutement des cofacteurs, permettant l’activation ou la répression des gènes cibles (« activation domain », AD). On distingue deux types de FTs: les FTs généraux (ex: "TATA box Binding Protein"TAF: "TBP associated basal factors »), exprimés de manière ubiquitaire, qui agissent au niveau du promoteur de tous les gènes, et les FT spécifiques, exprimés de manière tissu-spécifique, qui se lient à d’autres séquences d’ADN situées à proximité ou à distance.  Les facteurs de transcription: caractéristiques Les FTs sont essentiels dans les les processus de différenciation cellulaires au cours du développement et dans la maintenance de l’identité des cellules.  Méthodes classiquement utilisées pour étudier les facteurs de transcriptions, les séquences qu’ils reconnaissent Electrophoretic mobility shift DNASel Footprinting assay (EMSA/gel shift) Facteur de transcription (ex.: produit en ADN* bactérie et purifié) Gel http://andrew.gibiansky.com/blog/genetics/technique-primers/ DNAsel Footprinting Séparer les différents fragments sur un gel d’acrylamide La technique d’immunoprécipitation de la chromatine, une méthode qui a révolutionné l’étude des facteurs de transcription Principe de la technique de ChIP Les cellules/tissus/embryons sont traités pour que toutes les protéines associées à l’ADN soient liées de façon covalente à l’ADN (par traitement à la formaldéhyde). La chromatine est ensuite fragmentée (par sonication). L'ADN fragmenté est alors incubé avec un anticorps spécifique d’un facteur de transcription donné. Les fragments d’ADN sur lequels sont liés le facteur de transcription sont alors immunoprécipités. Les fragments immunoprécipités sont débarrasés des protéines, amplifiés par PCR et séquencés. Les gènes associés à ces séquences peuvent être identifiés en interrogeant les banques de données d’ADN génomique. Etapes de la technique d’immunoprécipitation de la chromatine. Les séquences sont alignées sur la séquence du génome. Le nombre de séquences lues à chaque position du génome est comptabilisée. La fréquence de distribution des séquences lues à chaque position est calculée. Dans une expérience de ChIP-seq, les sites liés par la protéine d’intérêt apparaissent sous la forme de pics. Les régions cis-régulatrices proximales Le promoteur est la région de l'ADN directement adjacente au site d'initiation de la transcription (+1) contient souvent une séquence TATAA (boite « TATA »,….) et d’autres motifs (boite GC, CAAT…).  Les séquences cis régulatrices distales: découverte Activité luciférase Le terme « enhancer » a été inventé pour la première fois à partir d'études sur le virus simien 40 (SV40). En 1981, Banerji et al. ont observé pour la première fois qu'un élément d'ADN viral du SV40 avait la capacité de renforcer l'activité d'un antigène T ou d'un rapporteur β-globine dans des cellules de mammifère. Le promoteur n’est pas suffisant pour une transcription efficace du gène. Des séquences plus distales sont aussi nécessaires. Ces séquences distales (100-1000bp) qui augmentent considérablement l’efficacité de la transcription sont appelées séquences amplificatrices ou « enhancers ». Banerji, J.; Rusconi, S.; Schaffner, W. Expression of a beta-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 1981, 27, 299–308  Caractéristiques des séquences « enhancers » Elles fonctionnent indépendamment de leur position, de leur distance et de leur orientation par rapport aux gènes qu'ils régulent. Banerji, J., Rusconi, S. & Schaffner, W. Expression of -globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 27, 299–308 (1981) M. & Berg, P. Simian virus 40 early- and late-region promoter functions are enhanced by the 71-base-pair repeat inserted at distant locations and inverted orientations. Mol. Cell. Biol. 3, 991–999 (1983)  Caractéristiques des séquences « enhancers » Les éléments régulateurs possèdent une signature épigénomique unique permettant de les identifier. Ainsi, les marques H3K4me1 et H3K27ac sont enrichies dans les séquences enhancer actives.  Caractéristiques des séquences « enhancers » (LacZ) Les enhancers sont actifs dans certains tissus. La panoplie des enhancers actifs est remodelée de manière dynamique à chaque étape de la différenciation. A chaque étape de différenciation, de nouveaux enhancers actifs apparaissent et d’autres sont éteints. Les séquences enhancers orchestrent l’expression spatiotemporelle des gènes. Les enhancers actifs correspondent à des régions de chromatine ouverte (visualisées par ATAC-seq).  Caractéristiques des séquences « enhancers » Les séquences enhancers sont généralement conservées évolutivement. Pennachio et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature 444, 499-502, 2006 Snetkova et al., Ultraconserved enhancer function does not require perfect sequence conservation. Nature Genetics 53, 521-528, 2021  Caractéristiques des séquences « enhancers » Les "enhancers" sont des régions enrichies en motifs d'ADN reconnus par des facteurs de transcription spécifiques. C’est pratiquement toujours une combinatoire de facteurs de transcription (FT) spécifiques qui se fixent sur une séquence enhancer.  Résumé des caractéristiques des séquences « enhancers » Signature combinée d’un enhancer. Au niveau d'un enhancer typique, les facteurs de transcription (TF) se lient à leurs motifs de liaison et recrutent des co-activateurs, y compris des remodeleurs ou des modificateurs de la chromatine tels que l'acétyltransférase p300. Ainsi, les nucléosomes sont déplacés du cœur de l'enhancer et conduisent à une plus grande accessibilité qui peut être mesurée par ATAC-seq par exemple. Les nucléosomes environnants sont souvent marqués par des modifications typiques des enhancers, telles que H3K27ac ou H3K4me1. En outre, les enhancers eux-mêmes sont transcrits. Les ARN longs non codants (« lncRNAs ») provenant des enhancers sont appelés eRNA. La signification de ces eRNA (aide au recrutement de FT,…) est aujourdhui encore largement inconnue.  Mode d’action des séquences « enhancers » dans le contrôle de l’expression tissu-spécifique des gènes Les facteurs de transcription (et cofacteurs) liés aux séquences enhancers interagissent avec les FTs généraux impliqués dans l’initiation et l’élongation de la transcription pour stimuler l’expression des gènes via la formation de boucle d’ADN.  L’expression des gènes, souvent complexe, dépend d’un ensemble d’ enhancers, chacun permettant à ce gène d’être exprimé dans une région spécifique de l’embryon. L’activité des séquences enhancers dépendrait de la présence d’une combinaison appropriée de facteurs de transcription. Les enhancers sont des intermédiaires entre les signaux/FTs contrôlant l’expression des gènes. Ils orchestrent l’expression spatiotemporelle des gènes. Visel et al. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature 461, 199-205, 2009  Les enhancers sont essentiels pour le développement Ablation > membres tronqués Mutations > polydactylie Des mutations dans les séquences "enhancers" entrainent des anomalies et s. Visel et al. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature 461, 199-205, 2009  Le dysfonctionnement des enhancers contribue à un large éventail de maladies humaines (enhanceropathies). La fonction de l'enhancer peut être perturbée par des effets génétiques, structuraux ou épigénétiques. Claringbould and Zaugg, Trends Mol Medecine, 27,1060-1073, 2021 Méthodes expérimentales d’identification des séquences « enhancer » Techniques basées sur le fait que les séquences enhancers actives sont dépourvues de nucléosomes. Méthode ATAC-seq: La méthode ATAC-seq, ("Assay for Transposase-Accessible Chromatin") identifie les régions de la chromatine accessibles à une transposase (Tn5) in vivo. Les cellules sont perméabilisées pour permettre l'accès au noyau à la transposase. Celle-ci va couper l'ADN nu et y insérer des séquences définies d'ADN ("adaptateurs") au niveau du site d'intégration. Les petits fragments capturés entre deux "adaptateurs" peuvent alors être amplifiés par PCR et séquencés.  L’organisation 3D de la chromatine à l’intérieur du noyau contribue à la régulation de l’expression des gènes Au sein du noyau interphasique, chaque chromosomes se positionne de manière non aléatoire (territoire chromosomique). A l’intérieur des territoires chromosomiques, on distingue des régions de chromatine active (euchromatine, A) versus des régions ayant une chromatine inactive(hétérochromatine (B) (compartiments). Bolzer et al., Plos Biol. 3, e157, 2005 Parada et al., Genome Biology, 5,R44, 2004 Le génome, est aussi organisé en régions (de l’ordre de la Megabase) qualifiées de TAD pour « Topologically Associating Domains » à l’intérieur desquelles les séquences d’ADN interagissent plus fréquemment qu’avec des séquences situées en dehors de ces régions.  Importance fonctionnelle des domaines TAD Les domaines TAD constituent des unités fonctionnelles de régulation du génome, dans le sens où ceux-ci limitent les interactions entre les séquences enhancer et les promoteurs des gènes. Ainsi, au sein d’un TAD, les interactions physiques entre locus vont aboutir à une régulation des différents gènes par les enhancers présents, avec un possible effet de co-régulation des gènes par un même enhancer. A l’inverse, un enhancer situé dans un TAD ne pourra pas réguler les gènes situés dans un TAD adjacent.  Formation et définition des limites des domaines TAD La formation des domaines TADs implique les protéines cohésine et CTCF. Les TAD sont formés par mouvement de déversement, d’extrusion de la chromatine à l’intérieur d’un anneau de cohésine. Ce mouvement s’arrêterait lorsque les FTs CTCF liés à leurs séquences cibles interagissent avec la cohésine. Les domaines TAD jouent un rôle important. Des mutations qui altèrent les domaines TAD sont à l’origine d’anomalies de développement. Des délétions dans le locus chromosomique incluant les gènes indian hedgehog (ihh) et/ou Pax3 et éliminant des domaines TAD sont à l’origine de malformations des doigts de la main. Matharu et al., Plos Genetics 2015  Méthodes pour l’ identification des domaines TAD via des expériences de CTCF ChIP- seq en estimant la fréquence des interactions entre différents régions chromosomiques, via les techniques 3C (capture de conformation chromosomique)  Etapes d’un protocole 3C classique Toutes les techniques 3C démarrent par une étape de fixation qui va faire que toutes les protéines associées à l’ADN soient liées de façon covalente à l’ADN. Ensuite l'ADN est fragmenté avec une enzyme de restriction. Les fragments obtenus sont liés. Après s’être débarassé des protéines, les fragments hybrides sont séquencés. Les séquences obtenues des fragments hybrides sont alignées sur le génome et révèlent les régions génomiques en contact. La fréquence des contacts observée entre les différentes régions chromosomiques est visualisée sous forme d’une carte de chaleur (heat map). Dans cette carte, plus la fréquence des boucles de chromatine observée est grande, plus l’intensité de la couleur rouge est forte.  Les gènes de développement Différentes catégories de gènes: Gènes qui sont exprimés dans la plupart des cellules qui codent pour des protéines essentielles au maintien des fonctions cellulaires de base (gènes de ménage ou « house keeping genes » )(glyceraldeyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Gènes responsables des propriétés fonctionnelles des cellules (i.e hémoglobine des globules rouges) Gènes responsables de la construction de l’organisme (gène de développement). Beaucoup de ces gènes codent pour des facteurs de transcription ou des molécules de signalisation.  Les gènes sélecteurs ou maîtres (« master genes ») Les FTs jouent des rôles essentiels dans le développement. La surexpression de certains FTs isolés est suffisante pour enclencher des modifications de l’expression d’un ensemble de gènes (« gene regulatory network, GRN ») constituant un programme permettant la différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules différentiées de différents types. Les gènes codant pour des FTs dont la surexpression est suffisante pour diriger le développement de d’un type cellulaire spécifique sont désignés gènes sélecteurs (« master genes»). En d’autres termes, les gènes sélecteurs sont ceux qui, dans un processus de différenciation cellulaire, sont responsables de l’étape de détermination des cellules. MyoD est un gène maître de la myogenèse squelettique en raison de sa capacité à initier le programme myogénique dans les myoblastes, les fibroblastes et d'autres types de cellules.  De cellules différenciées peuvent être reprogrammées en cellules embryonnaires pluripotentes via l’expression combinée de seulement 4 gènes maît res (« master ») codant pour des FTs fortement exprimés dans les cellules embryonnaires pluripotentes (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc). Les facteurs de Yamanaka Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc sont des gènes maîtres pour le rajeunissement de cellules différenciées en cellules pluripotentes. Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663-676, 2006 Pax6, un gène maître pour la formation des yeux, chez les vertébrés et les invertébrés. Il est nécessaire à la formation des yeux. Dans les mutants Pax6 de drosophile et de souris, les yeux ne se développent pas. L'expression ectopique de Pax6 dans les disques imaginaux de la larve à l’origine d’autres structures du corps (pattes, ailes, antennes,…) entraîne la formation d'yeux ectopiques (W. Gehring,1991).  Parmi les facteurs de transcription maîtres, certains sont désignés « facteurs pionniers » Les FTs pionniers sont ceux pouvant se lier à des sites cibles spécifiques de l'ADN dans la chromatine hautement condensée, qui initie une décompaction locale de la chromatine, la rendant accessible à d'autres facteurs de transcription. Les facteurs pionniers recrutent des complexes de remodelage des nucléosomes et des enzymes modifiant la chromatine afin de promouvoir la réorganisation de la chromatine silencieuse, le dépôt de modifications actives de la chromatine et, par conséquent, l'activation des séquences d'ADN promotrices et amplificatrices sous-jacentes. Balsabrone and Drouin, Pioneer factors as master regulators of the epigenome and cell fate, Nature Reviews Mol. Cell Biol. 23,449-464, 2022  Facteurs de transcription utilisés dans la conversion directe de fibroblastes en neurones, cardiomyocytes et hépatocytes. Les facteurs pionniers dans les listes de facteurs de transcription nécessaire à la reprogrammation des fibroblastes dans ces trois types cellulaires sont surlignés en rouge. Korisawa and Suzuki. The role of pioneer transcription factors in the induction of direct cellular reprogramming. Regen. Ther. 24,112-116, 2023 Moris et al., Direct lineage reprogramming via pioneer factors; a detour through developmental gene regulatory networks, Development, 143, 2696-2705, 2016  « Gènes architectes » Les gènes architectes sont des gènes conservés évolutivement codant pour des FTs à homéodomaine (gènes Hox) qui déterminent le plan d’organisation (« patterning ») des animaux, qui dirigent le développement des différentes parties du corps, des organes, des membres.  Les gènes codant pour des molécules de signalisation Le développement est contrôlé par un nombre limité de gènes codant pour des signaux, utilisés dans toutes les étapes et tous les processus de développement. Ces signaux ne sont pas instructifs mais sélectifs, dans le sens où, en pratique, les options de différenciation accessibles à une cellules à un moment donné sont limitées. Ces options sont imposées par l’état interne de la cellule. La réception du signal aboutit très souvent à la modulation de l’expression des gènes dans le noyau.  Les signaux peuvent être classés en 3 catégories, en fonction de la manière dont la transduction du signal vers le noyau a lieu 1. Dans certaines voies de signalisation, ce sont des facteurs de transcription déjà présent dans le noyau sous forme inactive qui sont activés suite à la présence du signal. La transduction du signal implique souvent des cascades de phosphorylation, avec au final une kinase activée qui rentre dans le noyau pour activer et phosphoryler un facteur de transcription spécifique qui va modifier l’expression des gènes… - Les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) - Les facteurs de croissance de l’épiderme (EGF)  Les facteurs de croissance des fibroblastes La famile des facteurs FGF (Fibroblast growth factor) contient environ douze membres (FGF1,2,8,….). Ces facteurs ont été identifiés initialement comme mitogènes dans des fibroblastes en culture. La transduction du signal a lieu via l’activation de protéine G (qui fixe le GTP) activant la voie des MAP kinases, ce qui induit la translocation dans le noyau de la kinase ERK activée et l’activation par phosphorylation de facteurs de transcription. 2. D’autres voies de signalisation vont entrainer le déplacement du cytoplasme vers le noyau d’un facteur de transcription ou cofacteur de transcription. - La famille des TGF-b - La famille des Wnt - La famille Hedgehog Les facteurs de croissance TGF-b La famille des facteurs transformants TGFb ("transforming growth factor b") identifiés initiallement pour leurs propriétés à induire le développement tumoral, contient plus de 30 membres (TGFb, activine, BMPs, nodal,..). La transduction du signal a lieu par l’intermédiaire de récepteurs transmembranaires à activité sérine thréonine kinase. La liaison du ligand au récepteur de type II permet sa dimérisation avec un récepteur de type I. Le récepteur de type I est phosphorylé par le récepteur de type I. Le récepteur de type I activé phosphoryle à son tour des cofacteurs de transcription appelés Smads dans le cytoplasme, ce qui induit leur migration dans le noyau.  Les facteurs Wnt Le gène wingless a été identifié en premier lieu en tant que gène impliqué dans la morphogenèse de l’aile chez la drosophile. Chez la souris, le gène homologue "integrated" a été désigné ainsi parce qu' il correspond à un site d'insertion d'un rétrovirus, insertion causant l'apparition de cancer. Le nom Wnt (prononcez « winnt ») utilisé aujourd’hui vient de la contraction du gène wingless, (« sans aile ») de drosophile et Int ( integrated, « site d'intégration ») chez la souris. Mutant "wingless" de drosophile. La transduction du signal Wnt a lieu via des récepteurs transmembranaires (Frizzled) et des corécepteurs (LRP,…). Dans la voie canonique, la b-caténine est le médiateur de la voie Wnt. Celle-ci est phosphorylée par un complexe de protéines incluant la kinase GSK3 ce qui induit sa dégradation. En absence de Wnt, la GSK3 est active. Elle En présence de Wnt, la protéine adaptatrice disheveled phosphoryle la b- caténine et induit sa (dsh) est recrutée à la membrane, ce qui séquestre le dégradation. complexe de protéine dégradant la b-caténine et incluant la Gsk3 à la membrane et l'inactive. La b-caténine non phosphorylée s’accumule dans la cellule et migre dans le noyau où elle s’associe à des facteurs de transcription (= cofacteur) leur permettant d'activer leurs cibles.  La voie de signalisation hedgehog La voie de signalisation hedgehog (hh) a été découverte chez la drosophile. Dans les larves wt, des poils apparaissent au niveau de de la face ventrale dans les parties antérieures de chacun des segments. Dans le mutant hedgehog, ces poils sont plus nombreux, ce qui fait que la larve ressemble à un hérisson.  Hedgehog se lie à un récepteur Patched qui ne transduit pas le signal. Patch lie et inhibe une autre protéine membranaire, smoothened (smo), qui est responsable de la transduction du signal. Smoothened (smo) bloque l'activité d'un complexe de protéines (PKA, Slimb) induisant le clivage protéolytique du facteur de transcription (Gli ou Cubitus interruptus, Ci). - En absence de ligand, Patched est actif, Smo est inhibé. Le complexe de dégradation de Gli/Ci est actif. Gli/Ci dégradé migre dans le noyau ou il fonctionne comme répresseur. - En présence du ligand, Patched est inactivé, Smo est actif. Le complexe de dégradation de Gli/Ci est dégradé. Gli/Ci peut migrer intact dans le noyau et activer l’expression de gènes cibles. 3) Dans d’autres voies de signalisation, c’est le récepteur lui-même qui, activé, migre dans le noyau et agit comme cofacteur de transcription. - La voie de signalisation Notch  La voie de signalisation Notch La mutation Notch a été identifiée chez la drosophile au début du XXe siècle dans le laboratoire de Thomas Hunt Morgan. Les femelles portant une mutation dans le gène Notch à l'état hétérozygote présentent des déchirures caractéristiques à l’extrémité des ailes, à l’origine du nom donné à cette mutation (notch signifie « encoche » en anglais).  La voie de signalisation Notch Le récepteur Notch et ses ligands son des protéines transmembranaires médiant des interactions entre cellules adjacentes. La voie est activée par la liaison du récepteur Notch avec l’un de ses ligands. Lorsque le récepteur Notch est activé, il change de conformation ce qui permet à des protéases de venir cliver sa partie intracellulaire. Le produit de ce clivage (Notch-ICD pour "Notch Intra- Cellular Domain") peut alors migrer dans le noyau pour se lier à un facteur de transcription, CSL, et lui permettre d'activer la transcription de gènes cibles.