Enzymkinetik PDF

Enzymkinetik Enzyme = organische Katalysatoren 1.1 Läuft die Reaktion spontan ab? 1.2 Wo liegt das Gleichgewicht? 1.3 Wie hoch ist die Reaktionsgeschwindigkeit 1.1 Gibbs-Helmholtz-Gleichung 𝛥𝐺 = 𝛥𝐻 − 𝑇 ⋅ 𝛥𝑆 𝛥G = freie Enthalpie (Maß für Triebkraft der Reaktion) → G < 0 (minus): exergone (f...

Enzymkinetik Enzyme = organische Katalysatoren 1.1 Läuft die Reaktion spontan ab? 1.2 Wo liegt das Gleichgewicht? 1.3 Wie hoch ist die Reaktionsgeschwindigkeit 1.1 Gibbs-Helmholtz-Gleichung 𝛥𝐺 = 𝛥𝐻 − 𝑇 ⋅ 𝛥𝑆 𝛥G = freie Enthalpie (Maß für Triebkraft der Reaktion) → G < 0 (minus): exergone (freiwillige) Reaktion → G > = (positiv): endergone (unfreiwillige) Reaktion 𝛥H = Enthalpieänderung → H > 0: Wärmeaufnahme (exotherm) → H < 0: Wärmeabgabe (endotherm) 𝛥S = Entropieänderung → S > 0: Zunahme der Unordnung → S < 0: Abnahme der Unordnung Idealfall: 𝛥H ist negativ und 𝛥S ist positiv → wenn eine Reaktion durch 𝛥H getrieben wird = enthalpisch getriebene Reaktion (Knallgasreaktion) → wenn eine Reaktion von Zunahme von 𝛥S (Unordnung) getrieben wird = entropisch getrieben 1.2 Massenwirkungsgesetz 𝑐(𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑘𝑡𝑒) 𝐾= 𝑐(𝐸𝑑𝑢𝑘𝑡𝑒) beschreibt Konzentrationsverhältnisse im chemischen Gleichgewicht K = Gleichgewichtskonstante durch Katalysatoren wird Gleichgewicht schneller erreicht 1.3 Reaktionsgeschwindigkeit Reaktionsgeschwindigkeit lässt sich durch Enzyme bis um den Faktor 1017 erhöhen → Oritidylatdecarboxylase bei Synthese von UMP aus OMP Carboanhydrase katalysiert Reaktion von Kohlenstoffdioxid und Wasser über Kohlensäure zu Bicarbonat und ein Proton  wichtig für Lösung von CO2 im Blut und für Abgabe in der Lunge → Blut strömt sehr schnell; deshalb muss Reaktion extrem schnell ablaufen Verlaufsdiagramm Differenz zwischen Produkt und Edukt ➔ 𝛥G → keine Aussage über Geschwindigkeit der Reaktion Gipfel der Kurve = Übergangszustand o. aktivierter Zustand → Molekül muss oft einen gespannten Zustand (Geometrie) einnehmen muss Enzyme setzen Aktivierungsenergie herab → energetische Schwelle früher erreicht Arrhenius Gleichung 𝐸𝐴 𝑘 = 𝐴 ⋅ 𝑒 −𝑅⋅𝑇 exponentieller Zusammenhang zwischen Reaktionsgeschwindigkeit, freier Aktivierungsenergie und Temperatur k = Reaktionsgeschwindigkeitskonstante R = ideale Gaskonstante T = absolute Temperatur ➔ Reaktionsgeschwindigkeit nimmt mit steigendem EA exponentiell ab und mit steigender Temperatur exponentiell zu Substratbindung der Enzyme Substrate binden ins aktive Zentrum der Enzyme früher: Schlüssel-Schloss-Modell → Enzym hat eine genau passende Tasche fürs Molekül heute: Induced-fit Modell → exakt passende Form der Bindungstasche wird erst durch Substratbindung erreicht (davor nur ungefähre Form) → Beispiel: Glucokinase - phosphoryliert Glucose mit ATP - Bindungstasche wird so eng, dass Wasser aus aktivem Zentrum verdrängt wird ➔ Enzyme können nur ein Substrat/Substratfamilie binden (sind auch stereospezifisch) ➔ Enzyme katalysieren nur eine Reaktion (keine Nebenreaktion) = hohe Reaktionsspezifität Substratbindung im aktiven Zentrum meistens über nicht-kovalente Bindungen → ionische Salzbrücken → Wasserstoffbrücken → hydrophobe Wechselwirkungen fast immer in Kombination mehrerer Bindungstypen sechs Hauptklassen der Enzyme Hauptklasse Art der katalysierten Reaktion 1. Oxidoreduktasen Reduktionen & Oxidationen 2. Transferasen Übertragung funktioneller Gruppen 3. Hydrolasen hydrolytische Spaltung von Bindungen 4. Lyasen nichthydrolytische Eliminierungsreaktionen 5. Isomerasen Isomerisierungen 6. Ligasen Knüpfen einer Bindung unter Nucleotidtriphosphat-Hydrolyse Oxidoreduktasen katalysieren Redoxreaktionen → Oxidationszustand des Substrats ändert sich → Elektronenübertragungen bei Dehydrogenasen Transferasen katalysieren Übertragung funktioneller Gruppen von Substrat 1 auf 2 bei Kinasen (Übertragung einer Phosphorsäuregruppe) Hydrolasen beschleunigen hydrolytische Spaltungen → Spaltung einer Bindung durch Einbau von Wasser bei Lipasen oder Proteasen Lyasen katalysieren Eliminerungsreaktionen spaltet ein Substrat in (mindestens) zwei → nicht hydrolytisch → oft Umlagerung von Elektronen in Doppelbindungen oder aromatischen Ringen bei Adenylatcyclase (ATP → cAMP + P) Isomerasen katalysieren intramolekulare Umlagerungen von Doppelbindungen oder Gruppen → Isomerisierung bei Peptidyl-prolyl-cis-trans-Isomerase und Protein-Disulfid-Isomerase Ligasen knüpfen einer kovalenten Bindung unter Hydrolyse von ATP/GTP ältere Namen → Synthase (ohne ATP-Verbrauch) → Synthetase (unter ATP-Verbrauch) bei DNA-Ligase Cofaktoren Enzym mit Cofaktor = Holoenzym → besteht aus Apoenzym (Proteinanteil des Enzyms) und Cofaktor Cofaktor oft als Metallionen (im engeren Sinn) → im weiteren Sinne: Coenzyme Coenzyme → oft Abkömmlinge von Vitaminen (durch Nahrungsaufnahme) Cosubstrate → nicht dauerhaft gebunden → müssen außerhalb des Enzyms regeneriert werden → z.B. ATP bei Kinasen → von vielen Enzymen gleichzeitig genutzt oder prosthetische Gruppen → dauerhaft im aktiven Zentrum gebunden → Reaktion läuft in zwei Schritten 1. Bindung des Substrats und Übertragung (Gruppe auf das Coenzym) 2. Übertragung einer Gruppe vom Coenzym aufs Substrat 2 Beispiele für Coenzyme Pyridoxalphosphat (PLP) o aus Vitamin B6 (Pyridoxin) o wichtig im Aminosäurestoffwechsel o in Glykogenphosphorylase an Lysin gebunden Coenzym A (CoA) o aus Pantothensäure (Vitamin B5) o Transfer von Acylgruppen Vitamin K o wichtig bei Blutgerinnung o Cofaktor der Glutamylcarboxylase Tetrahydrofolat o aus Folsäure o C1-Gruppendonator o bei Purinnucleotidsynthese Biocytin (aus Biotin) o Übertragung von Carboxylgruppen NAD(P) (aus Niacinamid) o Nicotinsäureamidadeninnucleotid(phosphat) o Transfer von Hydridionen Vitaminmangelerkrankungen → führen meist zu vielen aber relativ unspezifischen Symptomen, da viele Enzyme betroffen Skorbut o Mangel an Vitamin C o Symptome: Zahnfleischbluten, schlecht heilende Wunden, Hautprobleme, Erschöpfung o fehlerhafte Biosynthese des Kollagens (Cofaktor bei Hydroxylierung von Prolin) Beriberi o vor allem in Südostasien → auf Aufnahme von poliertem Reis ohne Thiamin o Thiamin = Vitamin B1 → wichtiges Coenzym bei oxidativen Decarboxylierungen o Symptome: Müdigkeit, Verstimmung, Unruhe, Depression, Muskelschwäche (Herzinsuffizienz) Pelagra o Mangel an Niacin (vor allem in Mais) → kann auch aus Tryptophan synthetisiert werden o Vorstufe für NAD und NADP o Symptome: Dermatitis, Diarrhoe, Demenz (DDD) Metalloenzyme Metallspurenelemente werden zusammen mit organischen prosthetischen Gruppen gebunden → fest im aktiven Zentrum über Aminosäureseitenketten (Cystein, Histidin) oder direkt am Proteingerüst komplexiert dienen vor allem der Säure-Base-Katalyse und bei Redoxreaktionen vor allem: Zi2+, Fe2+ und Fe3+ Enzymbeispiele → Carboanhydrase (Zink) → Cytochromoxidase (Kupfer) → Katalase (Eisen3+) → RNA-Polymerase (Magnesium) Metallionen aktivierte Enzyme Metallionen nicht dauerhaft gebunden werden mit Substrat gebunden häufg: Na+, K+, Ca2+, Mg2+ Beispiel: Kinasen → arbeiten mit Mg2+ und ATP Mechanismen der Enzymkatalyse Säure-Base-Katalyse eine Base kann H2O in OH- umwandeln → stärkeres Nucleophil als Wasser Säure = Protonendonator (Atom im Übergangszustand protonieren, höhere Elektrophilie) beide Mechanismen hier kombiniert Prinzip in proteolytischen Enzymen genutzt, um Peptidbindungen zu spalten Lactatdehydrogenase LDH reversible Reaktion Lactat bindet erst an NAD+ → geordnete Bindungsabfolge → über eine Salzbrücke an Arginin-171 → über eine Wasserstoffbrücke an Histidin-195 Histidin-195 fungiert als Basenkatalysator: zieht Proton der Hydroxylgruppe von Lactat ab → erleichtert damit Oxidation zur Ketogruppe Ausbildung einer dritten Brücke zu einem weiteren Arginylrest Protonentransfer auf His-195 und Transfer eines Hydridions von Lactat auf NAD+ ➔ Pyruvat Enzym öffnet und gibt NADH sowie Pyruvat frei kovalente Katalyse meist in Kombination mit anderen Katalysemechanismen vor ein Intermediat entsteht: ein Substrat ist kovalent ans Enzym gebunden → unterteilt in 2 Teilreaktionen → kein Übergangszustand im eigentlichen Sinne Beispiel: Seringruppe im aktiven Zentrum von Serinproteasen → Serin reagiert zunächst mit Peptidbindung, dann sekundär mit Wasser gespaltet Metallionen vermittelte Katalyse durch Metallionen (Zink etc.) sinkt pKs-Wert des Wassers auf ca. 7 → Abgabe eines Protons wird erleichtert es kommt zur Zn-OH- - Bindung → OH- ist sehr nucleophil Beispiel: Carboanhydrase → OH- macht einen nucleophilen Angriff aufs C-Atom von CO2 → zusätzliche Salzbrücke zu HCO3- → H2O verdrängt HCO3- zusätzliche Mechanismen Ausschluss von Wasser o LDH macht nach Bindung der Substrate eine Konformationsänderung → aktives Zentrum wird verschlossen o Wasserausschluss verstärkt elektrostatische Wechselwirkungen → Wasser als unerwünschter Reaktionspartner auch fern höhere Affinität im Übergangszustand o Enzyme binden mit größerer Affinität o liefert größten Beitrag zur Katalyse → durch zusätzliche Salzbrücke  Katalytische Antikörper o Analoga zu Übergangszuständen o Phosphonate ahmen tetraederische Übergangszustände nach Annäherung der Reaktanden o Nachbarschafts- und Orientierungseffekt o machen Reaktion wahrscheinlicher, da Bindungsstellen für Reaktionspartner bieten → bewegen sich in vorgegebene Ausrichtung → Reaktionen findet nur statt, wenn sich Moleküle begegnen (in richtiger Orientierung) Kombinierte Katalysemechanismen → am Beispiel der Proteasen des exokrinen Pankreas (Trypsin, Chymotrypsin, Elastase) → alle homologen Proteine mit gleichem Reaktionszentrum / katalytischer Triade (roter Kreis) → katalytische Triade besteht aus Histidin-57, Serin-195 und Asparagin-102 es handelt sich um Serinproteasen, die die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysieren an Peptidbindung sind delokalisierte Pi-Elektronen beteiligt: C-Atom nicht mehr so stark positiv (weniger elektrophil; weniger empfänglich für einen nucleophilen Angriff durch H2O) dies wird durch Anordnung der katalytischen Triade gelöst → Hydroxylgruppe von Serin-195 macht nucleophilen Angriff auf Carbonylkohlenstoffatom der Peptidbindung → eine C-O (Einfachbindung) entsteht zwischen Enzym und Substrat nucleophiler Angriff erleichtert, da Proton von Ser-195 auf eng benachbarte Seitenkette von His-57 übertragen wird gleichzeitig: Doppelbindung in Einfachbindung → Sauerstoff somit negativ geladen = Oxyanion → Einfachbindung ist länger und weist in andere Richtung (Übergangszustand ist tetraederisch) Oxyanion kann zwei H-Brücken zu NH-Gruppen von Trypsin ausbilden → Mechanismus der erhöhten Übergangszustandsaffinität  dann kann erst Wasser hinzutreten → nun nucleophiler Angriff auf Carbonyl-C-Atom möglich → erneut tetraederischer Übergangszustand Schluss: Freisetzung der Acylkomponenten durch Übertragung eines H-Atoms von Histidin aufs freie O-Atom des Serins → katalytische Triade wiederhergestellt ➔ Trypsin schneit auf Grund seiner Substratpräferenz nach Arginin oder Lysin ➔ tetraederischer Übergangszustand essenziell für katalytische Spaltung Spezifitätstasche erklärt Substratspezifität von Trypsin negativ geladener Aspartatrest am Boden kann mit positiv geladenem Lysin / Arginin eine Salzbrücke ausbilden ➔ aktives Zentrum für Substratbindung und Katalyse der Spaltung zuständig weitere Proteaseklassen Enzymklasse Katalytische Reste Typische Reste Serinproteasen Serin, Histidin, Asparagin Trypsin, Thrombin, Enzyme des Komplementsystems Cysteinproteasen (A) Cystein Caspasen, Cathepsin Aspartatproteasen (B) 2 x Aspartat Renin, Pepsin, HIV-Protease Metalloproteasen (C) Zn2+ koordiniert durch ACE (Angiotensin konvertierendes Enzym), 2 Histidin + Glutamin Carboxypeptidasen, Matrixmetalloproteasen HIV-Protease Aspartatprotease (2 x Aspartat im aktiven Zentrum) → Homodimer: 2 identische Untereinheiten durch HIV codiert (11 kD groß) zerlegt das Polyprotein (ebenfalls durch HIV codiert) in seine funktionelle Einzelproteine schneidet sich durch Autoprotolyse selbst aus Vorstufe heraus medikamentöse Therapie von HIV setzt unter anderem hier an → Inhibition der HIV-Protease + Inhibition der reversen Transkriptase Enzymkinetik Auswertung einer Enzymreaktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen wurden Anfangsgeschwindigkeiten → Sättigungskurve (Hyperbel) entsteht Reaktionsgeschwindigkeit nähert sich einer Maximalgeschwindigkeit KM Wert der Substratkonzentration → Enzymreaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit → KM = ½ Vmax x-Achse: Substratkonzentration; y-Achse: Geschwindigkeit Michaelis-Menten-Gleichung Gleichung einer unkatalysierten chemischen Reaktion: A → P dabei ist Reaktionsgeschwindigkeit (v) proportional zur Konzentration von A: 𝑣 = 𝑘[𝐴] → k: Geschwindigkeitskonstante → wenn k = 0,4 s-1, dann dauert die Umsetzung des Substrats 2,5 Sekunden Gleichung einer enzymkatalysierten Reaktion: → k1: Geschwindigkeitskonstante der Bildung des Enzymsubstratkomplexes (-1 des Zerfalls) → k2: Geschwindigkeitskonstante der Bildung des Produkts + freien Enzym (-2 der Rückreaktion) ➔ k2 wird ignoriert, da nur Anfangsgeschwindigkeit gemessen wird und hier noch kein Produkt vorliegt (also auch keine Rückreaktion) Reaktionsgeschwindigkeit hängt von Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes ab: v0 = k2 [ES] → Konzentration nicht experimentell zu ermitteln; d.h. über Substratkonzentration und Enzymkonzentration helfen → Bildung und Zerfall des ES-Komplexes kann mit zwei Gleichungen beschrieben werden: → außerdem liegt Fließgleichgewicht vor (steady-state) – Neubildung und Verbrauch des Komplexes Gleichsetzen beider Gleichungen: → Michaelis-Konstante = quantitative Eigenschaft des Enzyms  [𝐸][𝑆] wenn man Konstante einsetzt und nach [ES] löst: [𝐸𝑆] = 𝐾𝑀 Konzentration von freiem Enzym auch nicht zu ermitteln → über Gesamtenzymkonzentration die Enzymkonzentration bestimmen: → Einsetzen in die vorige Gleichung (rot): Maximalgeschwindigkeit erreicht, wenn ES-Komplex sein Maximum erreicht: 𝑣𝑚𝑎𝑥 = 𝑘2 [𝐸𝐺 ] ➔ Michaelis-Menten-Gleichung folgt: ➔ KM Wert: Maß für Substrataffinität des Enzyms → wenn dieser hoch ist, braucht man viel Substrat für Halbmaximalgeschwindigkeit (Affinität des Enzyms gering) katalytische Konstante - kcat oft eingesetzt in Praxis bei idealisierten Modellen entspricht k2 = kcat gibt an, wie viele Substratmoleküle von einem einzigen Enzymmolekül pro Zeiteinheit maximal umgesetzt werden können → Wechselzahl  betrachtet werden → werden im Quotienten eingesetzt: kcat / kM = katalytische Effizient hohe Umsatzzahlen helfen nur, wenn Affinität hoch genug ist kcat kommt nur bei Substratsättigung vor Darstellung einer Reaktionskinetik mit zwei Substraten untersch. Affinität → KM fürs Substrat mit hoher Affinität deutlich kleiner als fürs Substrat mit geringer Affinität Lineweaver-Burk-Plot Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung → lineare Funktion ergibt sich → mit Steigungsdreieck lässt sich KM bestimmen + über Extrapolation lässt sich vmax bestimmen als Lösung des Problems, dass vmax sich nur schwer ermitteln lässt Hemmung der Enzymaktivität 1. reversible Hemmung a. kompetitive Inhibition b. nicht kompetitive Inhibition c. unkompetitive Inhibition 2. irreversible Hemmung 1a kompetitive Inhibition Substrat und Inhibitor konkurrieren um selbe Bindungsstelle Inhibitor ist ähnlich zum Substrat von der chemischen Struktur = Substratanalogon → passt ins aktive Zentrum → wird aber nicht chemisch umgesetzt → bindet aber nicht kovalent ans Enzym bei Lovastatin als Hemmstoff für beta-HMG-Reduktase bei Cholesterinbiosynthese → veränderte Enzymkinetik in Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors Abflachung der Reaktionskurve KMapp = apparenter KM Wert → höhere Konzentration benötigt, um ½ v(max) zu erreichen vmax ist unverändert → Enzym kann noch genauso schnell arbeiten mit Substratüberschuss kann man Inhibitor verdrängen 1b nicht kompetitive Inhibition meist bei Enzymen mit mehr als einem Substrat verhindert nicht die Bindung des Enzyms mit dem Substrat → binden nicht im aktiven Zentrum, sondern im allosterischen Zentrum Substrat wird nicht mehr umgesetzt → veränderte Enzymkinetik Verschiebung der Kurve nach unten KM ist unverändert vmax aber deutlich erniedrigt 1c unkompetitive Inhibition treten bei Enzymen mit mehreren Substraten auf Unterschied zu kompetitiv: Inhibitor binden vor allem an den Komplex und nicht ans freie Enzym → vermindert nicht die Affinität des Enzyms; entzieht dem ES-Komplex dem Gleichgewicht → mehr ES-Komplex wird gebildet bindet in Nähe des aktiven Zentrums → veränderte Enzymkinetik Kurve weiter nach unten geschoben kleineres KM (Halbmaximalgeschwindigkeit schneller erreicht) → höhere Substrataffinität Vmax ebenfalls herabgesetzt 2 irreversible Inhibition kovalente Bindung eines Inhibitors an ein Enzym im aktiven Zentrum dauerhafte Lahmlegung des Enzyms findet häufig im Blutplasma an Plasmaproteinen statt Serpine (Serinproteaseinhibitoren) hemmen Leukozyten-Elastase → Antithrombin (wichtig bei Blutgerinnung) → alpha-Proteaseinhibitor → erscheinen wie normales Substrat im aktiven Zentrum Enzym spaltet dann Peptid-Bindung = Sollbruchstelle → deshalb macht Acylkomponente eine Konformationsänderung durch → katalytischer Ablauf massiv gestört → suizidaler Hemmmechanismus = Inhibitor wird zerstört ASS bindet kovalent an einen Serinrest im aktiven Zentrum der Cyclooxygenase alpha-Proteaseinhibitor-Deffizienz: erblicher Deffekt → keine Hemmung der Elastase kann auch durch Rauchen auftreten → oxidative Bestandteile zerstören ein Methioninrest im reaktiven Zentrum Folge: fortschreitendende Gewebezerstörung vor allem in Leber und Lunge Stärke der Inhibitoren quantitatives Maß für Stärke ist die Hemmkonstante K1 = Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor Komplexes → K1 = [E] x [I] / [EI] → ein potenter Inhibitor besitzt einen kleinen K1 Wert anderes Maß ist der IC50 Wert → bezeichnet Konzentration eines Inhibitors mit der halbmaximale Inhibition erreicht wird → hoch potente Inhibitoren weisen Konzentrationen im nano- oder picomolaren Bereich auf → häufig in Pharmakologie verwendet Allosterische Regulation → findet meist an Multienzymkomplexen (Fettsäuresynthase) statt am allosterischen Zentrum → dient der Abstimmung der Enzymaktivität → Unterschied zwischen heterotropen und homotropen Effekt  heterotrope Wirkung o allosterischer Regulator bindet irgendwo am Enzym → oft spezielle regulatorische Untereinheiten → kann aber auch auf derselben Polypeptidkette wie das aktive Zentrum liegen o positive Allosterie: Regulator bindet und öffnet das Enzym fürs Substrat o negative Allosterie: Regulator bindet und verschließt das Enzym homotrope Wirkung o ein Ligand beeinflusst die Umsetzung eines gleichartigen Liganden an anderer Stelle o homotrop regulierende Enzyme weichen von Michaels-Menten-Gleichung ab → besitzen andere Kinetik (hier: sigmoidale Kurve) o Verlauf der Kurve ▪ solange Substrat unter Schwellenkonzentration liegt, zeigt Enzym nur geringe Aktivität ▪ danach steigt Kurve massiv an = massive Umsetzung des Substrats ▪ darauf folgt erneut eine Inaktivität des Enzyms ➔ wichtig: kooperativ regulierte Enzyme tragen zur Homöostase eines dynamischen Systems von Stoffwechselwegen bei – dabei werden Konzentrationen wichtiger Metabolite austariert kovalente Regulation → bevorzugt an Aminosäuren mit OH-Gruppe (Tyrosin, Serin und Threonin) meist reversibel fast immer außerhalb des aktiven Zentrums Beispiel 1: Phosphorylierung durch Kinasen → hohe negative Ladungsdichte → Phosphatasen sind Gegenspieler, da durch Hydrolyse der Phosphatrest wieder abgespalten wird Beispiel 2: limitierte Proteolyse von Proteinen → viele Enzyme werden so aktiviert o Verdauungsenzyme → als Zymogene oder Proenzyme gebildet → durch Enteropeptidase wird das N-terminale Hexapeptid abgespalten und somit das Enzym aktiviert (Spezifitätstasche ändert sich) o Caspasen o Enzyme der Blutgerinnungskaskade