Enzime Plasmatice PDF

**ENZIMELE PLASMATICE** ***Noţiuni introductive*** În 1954 s-a stabilit prima corelaţie între activitatea enzimatică şi boală (GOT şi infarct). *a. Clasificarea enzimelor plasmatice* Enzimele prezente în plasmă pot fi încadrate în două categorii: - *[enzime plasmatice funcţionale]* (au substr...

**ENZIMELE PLASMATICE** ***Noţiuni introductive*** În 1954 s-a stabilit prima corelaţie între activitatea enzimatică şi boală (GOT şi infarct). *a. Clasificarea enzimelor plasmatice* Enzimele prezente în plasmă pot fi încadrate în două categorii: - *[enzime plasmatice funcţionale]* (au substratul în plasmă); - *[enzime plasmatice nefuncţionale]* (nu au substratul în plasmă; ele reprezintă majoritatea enzimelor). *[Enzimele plasmatice funcţionale]* sunt constant prezente în plasmă, locul lor normal de acţiune, unde au de îndeplinit o funcţie fiziologică bine definită. Printre ele se numără: \- lecitin-colesterol-acil transferaza (LCAT), enzimă ce catalizează esterificarea colesterolului prin transferul unui grup acil de pe lecitină; \- enzimele şi proenzimele coagulării şi fibrinolizei; \- pseudocolinesteraza - enzima având ca substrat derivaţi de acil-colină; \- ceruloplasmina - oxidaza conţinând cupru. Majoritatea acestor enzime sunt sintetizate de ficat, care le secretă activ în plasmă, unde se găsesc în concentraţii mari. Modificarea activităţii acestor enzime funcţionale în plasmă, de obicei în sensul scăderii, este expresia unei sinteze proteice defectuoase în ficat şi traduce o suferinţă hepatică gravă. Absenţa acestor enzime în plasmă se poate datora unei erori genetice moştenite, ca în cazul bolii Wilson (degenerescenţa hepato-lenticulară) caracterizată printr-o deficienţă a ceruloplasminei. Absenţa genetică a pseudocolinesterazei are ca rezultat sensibilitatea subiecţilor respectivi la unele anestezice din clasa acetilcolinei. *[Enzimele plasmatice nefuncţionale]* nu au de îndeplinit nici un rol în plasmă. În condiţii fiziologice, ele ajung în plasmă în concentraţii foarte mici, ca urmare a turn-overului celular (diviziune, moarte celulară). La rândul lor, ele sunt clasificate în: a-enzime ale secreţiilor exocrine b-enzime intracelulare, numite şi enzime de leziune a\) Enzimele secreţiilor exocrine (lipaza, amilaza, tripsina pancreatică, fosfataza acidă prostatică şi fosfataza alcalină biliară) pot prezenta scăderi în plasmă în situaţia în care organul secretor este atrofiat sau pot prezenta creşteri în cazul: obstruării căilor excretoare, a unor modificări de permeabilitate a membranei celulelor producătoare sau a unei sinteze şi excreţii crescute. b\) Enzimele intracelulare: lactat dehidrogenaza (LDH), transaminazele (GOT, GPT), creatin kinaza (CK) acţionează exclusiv la nivelul ţesuturilor, ca instrumente de realizare a metabolismului celular. Enzimele ies din celule şi trec în plasmă în urma acţiunii factorilor patogeni infecţioşi (virali şi bacterieni) şi a toxicelor chimice sau ca o consecinţă a ischemiei şi traumatismelor tisulare. *b. Exprimarea activităţii enzimelor* Măsurarea concentraţiei enzimei este prea dificilă datorită valorilor ei foarte mici. Se măsoară, de fapt, activitatea catalitică a enzimei. U.I (o unitate internaţională) reprezintă activitatea enzimatică prin care se asigură conversia unui μmol substrat într-un minut, în condiţii standard de pH, temperatură, prezenţa cofactorilor etc. Valoarea normală a activităţii enzimatice reprezintă echilibrul între rata sintezei şi eliberării în plasmă (pe de o parte) şi clearance-ul ei din circulaţie (pe de altă parte). *c. Clearance-ul enzimelor plasmatice se realizează:* \- pe cale urinară (amilaza serică) \- pe cale biliară (fosfataza alcalină, având drept prescurtare ALP, ceruloplasmina, gamaglutamil-transpeptidaza, care este notată γ-GT sau GGT, 5'-nucleotidaza) \- prin sistemul reticulo-endotelial (enzimele sunt îndepărtate prin fagocitoză sau sunt inactivate prin mecanism neelucidat). *d. Timpul de înjumătăţire (T1/2) a enzimelor plasmatice* Enzimele intracelulare au o viaţă medie scurtă în ser, de ordinul zecilor de ore. T1/2 trebuie cunoscut pentru aprecierea momentului recoltării probei de sânge. De exemplu, în infarct se cer: CK, GOT, LDH în funcţie de timpul scurs de la debutul durerii. *e. Variaţiile fiziologice ale activităţii enzimatice se înregistrează în funcţie de:* \- vârstă (fosfataza alcalină are valori mai mari la copii faţă de adulţi) \- sex (CK are valoare mai mare la bărbat pentru că are musculatura scheletică mai dezvoltată decât la femeie) \- rasă (CK este mai mare la negri faţă de albi) \- activitate fizică (repausul la pat pentru 2-3 zile scade activitatea CK cu 20%). *f. Valorile crescute ale activităţii enzimatice plasmatice apar în condiţii de:* \- leziune celulară (leziune ischemică, virală, toxice etc.) \- turn-over celular crescut (proliferare celulară crescută în neoplazii) \- inducţie enzimatică (sărurile biliare au efect inductor asupra fosfatazei alcaline) \- obstrucţie de duct excretor (pentru enzimele secreţiilor exocrine) \- scădere a clearance-ului enzimei. *Gradul creşterii activităţii enzimatice este funcţie de:* *- localizarea intracelulară a enzimei* Majoritatea enzimelor sunt uniloculare, fiind situate numai în citoplasma celulară sau în formaţiuni subcelulare (glutamat dehidrogenaza în mitocondrii, catalaza în peroxizomi, fosfataza acidă, având drept prescurtare ACP, în lizozomi). Puţine enzime sunt biloculare, fiind situate şi în citoplasmă şi în mitocondrie (GOT, malat-dehidrogenaza, izocitrat-dehidrogenaza). Cunoaşterea localizării enzimelor este importantă pentru că în procesul de citoliză enzimele citoplasmatice sunt primele care trec în plasmă, în timp ce ieşirea enzimelor din mitocondrii sau din alte organite subcelulare se produce numai în cazul unei acţiuni drastice şi prelungite a factorului patogen. *- permeabilitatea membranară* \- *gradul de vascularizaţie* al ţesutului lezat De exemplu, musculatura striată se imobilizează atunci când este lezată, iar circulaţia sanguină şi limfatică se reduce mult, pe când miocardul continuă să se contracte şi atunci când prezintă leziuni. Aşa se poate explica faptul că leziuni relativ reduse ale miocardului, în caz de infarct, produc modificări mai exprimate ale enzimelor în ser decât leziunile traumatice ale musculaturii scheletice. *- numărul celulelor lezate, gradul de afectare al lor, viteza producerii leziunii* ***Atenţie!*** Nu există corelaţie între gradul (severitatea) leziunii şi activitatea enzimatică. Această corelare se poate exprima doar în măsura în care după acţiunea acută a factorului patogen celula îşi menţine potenţialul de refacere, leziunea fiind reversibilă. Dacă acţiunea factorului patogen se prelungeşte sau este atât de severă încât nu mai permite reversibilitatea proceselor induse, insuficienţa metabolică a ţesutului lezat se instalează ireversibil, afectând sinteza proteică şi implicit pe cea enzimatică. Ca urmare, în insuficienţele cronice, concentraţia enzimelor intracelulare plasmatice nu mai suferă modificări semnificative, ea menţinându-se, în general, într-un domeniu echivoc, uşor peste limita normală a valorii. *Creşterile nespecifice ale activităţii enzimatice sunt determinate de:* \- insuficienţa circulatorie \- medicamente, care pot induce sinteze enzimatice (de exemplu, gamaglutamil-transpeptidaza este indusă de fenobarbital şi anticonvulsivante) \- injecţia intramusculară poate creşte CK \- clearance scăzut (de exemplu, în macroamilazemie, amilaza serică formează complexe cu imunoglobulinele şi nu mai poate filtra renal) *Valorile scăzute ale activitaţii enzimatice apar în condiţii de:* -sinteză scăzută (insuficienţă de organ) -deficite congenitale -clearance crescut (apare rar) *Semnificaţia clinică a activităţii enzimatice* *a.* *Determinarea activităţii unor enzime organospecifice.* Aceste enzime sunt prezente exclusiv într-un ţesut şi creşterea lor în plasmă indică organul lezat. De exemplu, ornitin-carbamil transferaza (OCT) este enzimă strict hepatică şi creşterea ei în plasmă indică fără dubiu o suferinţă hepatică. Enzimele organospecifice sunt restrânse numeric. De obicei aceeaşi enzimă este situată în diferite ţesuturi, de unde şi dificultatea localizării leziunii. De aceea, se recurge la metodele de mai jos. *b.* *Determinarea unui spectru larg de activităţi enzimatice şi aprecierea raportului lor cantitativ* De exemplu, o activitate crescută a fosfatazei alcaline poate sugera o afecţiune hepatică sau osoasă; dacă aceasta este însoţită de o valoare crescută a γ-glutamil-transpeptidazei şi a 5'-nucleotidazei, afecţiunea este hepatică. Ca alt exemplu, GOT şi GPT sunt situate şi în cord şi în ficat, dar, în general, valoarea raportului GOT/GPT creşte în afecţiunile cardiace şi scade în afecţiunile hepatice. *c.* *Determinarea activităţii izoenzimelor.* Izoenzimele sunt separate prin variate metode: electroforeza, stabilitatea la acţiunea unor agenţi denaturanţi (căldura), sensibilitatea la inhibitori. De exemplu, o activitate crescută a LDH poate sugera o afecţiune cardiacă, musculară sau hepatică. Dacă LDH total este crescut pe seama izoenzimei LDH~1~, atunci afecţiunea este cardiacă. ***Concluzie*** Importanţa cunoaşterii valorii activităţii enzimatice plasmatice constă în: \- depistarea şi localizarea ţesutului lezat \- depistarea existenţei unei proliferări celulare \- monitorizarea tratamentului sau a progresiunii bolii *Informaţii practice* pentru o bună determinare şi interpretare a activităţii enzimatice serice a\. Hemoliza falsifică în mare măsură determinările de LDH, GOT şi, într-o măsură mai redusă, determinările de GPT, CK, gamaglutamil-transpeptidaza şi fosfataza acidă b\. Modul de conservare a serului până la efectuarea determinărilor de enzime este important. Amilaza, lipaza, gamaglutamil-transpeptidaza îşi păstrează nealterată activitatea catalitică timp de 7 zile, atât la 4^o^C, cât şi la temperatura camerei. Fosfataza alcalină îşi păstrează neafectată activitatea doar la 4^o^C. Fosfataza acidă se inactivează extrem de rapid şi determinările trebuie efectuate imediat după recoltare. c\. Uneori este necesară excluderea unor artefacte. Lactatul seric crescut determină rezultate fals scăzute ale GPT, iar cetoacidoza diabetică determină rezultate fals crescute ale amilazei serice. Lactatdehidrogenaza (LDH) este o enzimă citoplasmatică participantă la glicoliza anaerobă; catalizează următoarea reacţie reversibilă. Piruvat + NADH + H^+^. Lactat + NAD^+^ Enzima are o structură cuaternară tetrameră alcătuită din două tipuri de monomeri H (heart) şi M (muscle), codificate de gene diferite. Prin combinarea în diferite proporţii a acestora rezultă 5 izoenzime: Izoenzima LDH~1~ LDH~2~ LDH~3~ LDH~4~ LDH~5~ ----------- -------- -------- ---------- -------- -------- Structura H~4~ H~3~M H~2~M~2~ HM~3~ M~4~ Izoenzimele diferă prin sensibilitatea la căldură, la diferiţi inhibitori şi prin mobilitatea lor electroforetică. Fracţiunile LDH~1~ şi LDH~2~ rezistă la o încălzire la 55-60^O^C fără o pierdere însemnată a activităţii, pe când LDH~3~, LDH~4~ şi LDH~5~ se inactivează rapid, aceasta reprezentând şi o metodă simplă de diferenţiere. Electroforeza izoenzimelor LDH este delicată şi relativ puţin practicată; după migrarea pe acetat de celuloză sau gel de agaroză se foloseşte la revelare fluorescentă NADH sau cuplarea transformării NAD^+^NADH cu cea a unui colorant adecvat. LDH se complexează cu imunoglobulinele şi apar benzi atipice la electroforeză. LDH complexate cu IgA sau cu IgG migrează de obicei între LDH~3~ şi LDH~4~, iar acest complex macromolecular nu are semnificaţii clinice patologice specifice. Diferenţierea izoenzimelor LDH se poate efectua şi prin cromatografie pe coloană DEAE-celuloză sau prin filtrare în gel de Sephadex, fracţiunile LDH~1~ şi LDH~2~ adsorbindu-se selectiv pe aceste medii. LDH~1~ are o afinitate particulară pentru -hidroxibutirat, mai mare decât pentru lactat. Din acest motiv LDH~1~ este desemnată uneori în literatură sub denumirea de -hidroxibutiratdehidrogenază (HBDH). Izoenzime Origine Proporţie Creştere ----------- ------------------------------------------------------------------------ ----------- ---------------------------------------------------------------------------------------- LDH~1~ Inimă, hematii, rinichi (cortexul renal), sistem reticuloendotelial 20-30% Infarct miocardic acut, anemie hemolitică, anemie megaloblastică, infarct renal acut LDH~2~ Hematii, inimă, sistem reticuloendotelial, rinichi, plămâni 20-35% La fel ca LDH~1~ LDH~3~ Pămâni, placentă, sistem nervos, rinichi, limfocite, splină 10-25% Trombembolism pulmonar, pneumonie în extindere, limfocitoză, pancreatită acută, cancer LDH~4~ Musculatură striată, ficat, rinichi, pancreas, sistem nervos, placentă 5-10% Necroză sau inflamaţie hepatică, leziuni ale musculaturii striate LDH~5~ Ficat, musculatură striată, rinichi, pancreas 5-10% La fel ca LDH~4~ La adult LDH~1~, LDH~2~, LDH~3~ sunt prezente în serul normal, inimă şi absente în ficat, LDH~4~ şi LDH~5~ sunt prezente în ficat, absente în inimă şi sub formă de urme în ser. Plasma nou-născuţilor sau obţinută din sângele ombilical conţine cantităţi mari de LDH şi toate cele 5 izoenzime sunt în proporţii uniform distribuite. Pe lângă determinarea LDH totale (pe ser neîncălzit) se execută o altă determinarea, de această dată pe serul încălzit timp de 60 min la 60 ^o^C. Valori de peste 80% ale LDH termostabile (LDH~1~ + LDH~2~) sugerează un infarct miocardic. În cazul unui infarct miocardic acut, LDH~1~ începe să crească după 10-12 ore de la producere, atinge valori maxime după 48-72 ore și revine la valori normale după 10-14 zile. Nerevenirea la valorile normale după 14 zile sugerează un prognostic grav al evoluției acestuia. Ca markeri tardivi însă ai infarctului miocaredic acut sunt utilizate valorile troponinelor cardiace. În mod normal raportul LDH~1~/LDH~2~ este subunitar. În infarctul miocardic acut devine supraunitar. **2. Creatinkinaza** ==================== Creatinkinaza este o enzima implicată în metabolismul energetic, participănd la menţinerea unui raport optim ADP/ATP în celule. În condiţiile unui exces de ATP, creatinkinaza conduce la înmagazinarea energia legăturilor macroergice din ATP sub formă de creatin-fosfat, iar în condiţiile unui deficit de ATP, eliberează energia înmagazinată în creatin-fosfat pentru a sintetiza rapid ATP-ul necesar celulei (ex. fibra musculară în contracţie). Creatinkinaza este un dimer format din două tipuri de monomeri, M ( muscle, mușchi) și B ( brain, creier), care se asociază în 3 izoenzime: CK-MM, CK-MB şi CK-BB. *Caracterizarea izoenzimelor creatinkinazei* ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ IZOENZIMA LOCALIZARE CREŞTERE ----------- -------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------- CK-MM \- muşchi striaţi, miocard, creier, tiroidă (reprezintă\ \- distrofii musculare, infarct miocardic, tumori ale sistemului nervos central 95-100% din activitatea serică normală) CK-MB \- miocard (reprezintă 0-5% din activitatea serică normală) \- infarct miocardic CK-BB \- creier, tub digestiv, uter, rinichi, plămâni (în condiţii de sănătate nu există în ser) \- infarct cerebral, intestinal, insuficienţă renală ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ *Distribuţia izoenzimelor în diferite organe* Izoenzima Muşchi striaţi Miocard Creier Tub digestiv Uter Rinichi Prostată ----------- ---------------- --------- --------- -------------- -------- --------- ---------- CK-MM 96-100% 60-78% 0-10% 0-3% 2-20% 8-10% 3-9% CK-MB 0-4% 22-40% \- 0-2% 3-20% \- 4-40% CK-BB \- \- 90-100% 95% 60-95% 90-92% 56-93% *Observaţii* 1\. Deşi creierul conţine cantităţi mari de CK-BB, serul nu conţine CK-BB de origine nervoasă deoarece masa moleculară a acestei izoenzime (M = 80.000 D) nu îi permite să treacă bariera hematoencefalică. Această izoenzimă apare totuşi în ser când există leziuni întinse nervoase, cu lezarea barierei hematoencefalice. Deasemenea, la valorile serice scăzute ale acestei izoenzime mai participă şi alţi factori: t1/2 scăzut (1-5 ore), cantitatea mică de enzimă din ţesuturi, tipul metodei de dozare (cele mai multe metode de dozare folosesc anticorpi anti-M care recunosc numai izoenzimele care conţin lanţuri M (CK-MB şi CK-MM) ). 2\. În caz de hemoliză in vitro apar valorile fals crescute ale creatinkinazei serice. Hematiile lizate eliberează enzimele intracelulare: glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (activitatea şuntului pentozelor este relativ ridicată în hematii), hexokinaza, glucoza şi ADP amplificând ritmul sintetizării NADPH. 3\. În unele cazuri de cancer pulmonar, infarct cerebral sau insuficienţă renală stadiul terminal pot să apară valori fals crescute ale activităţii izoenzimei CK-MB. În cancerul pulmonar şi în infarctul cerebral se eliberează în circulaţia sangvină cantităţi mari de CK-BB ca urmare a proceselor citolitice care au loc la nivelul masei tumorale şi respectiv în zona infarctizată ( CK-BB este principala izoenzimă a CK existentă în plămâni şi rinichi). Ulterior poate avea loc în ser un transfer de subunităţi între izoenzime, conform reacţiei: CK-BB + CK-MM 2 CK-MB Rezultă izoenzima CK-MB „atipică" fals crescută. 4\. Nivelurile de CK-MB cresc la 4-6 ore de la producerea unui infarct miocardic acut, ating vârful la 12-24 de ore și revin la valori normale dupa aproximativ 48 de ore. Transaminazele sunt enzime implicate în metabolizarea aminoacizilor (atât în degradarea cât şi în biosinteza lor). Prin reacţia de transaminare are loc transferul gruparii amino de pe un aminoacid oarecare pe - cetoglutarat (-KG), cu obţinerea de glutamat (Glu) şi -cetoacizi (are loc canalizarea azotului din aminoacizi spre Glu). Glutamatul este rezervorul - depozitul de azot din aminoacizi şi este unicul substrat al dezaminării oxidative, din care rezultă amoniac, iar -cetoacizii formaţi sunt oxidaţi în ciclul Krebs, constituind o sursă de energie. Reacţia generală catalizată de transaminaze este: Exemple:  În care: GPT=glutamat-piruvat-aminotransferaza=ALAT=alanină-aminotransferaza GOT=glutamat-oxaloacetat-aminotransferaza=ASAT=aspartat-aminotransferaza Transaminazele au drept coenzimă piridoxal-5-fosfatul din vitamina B~6~. În deficitul de vitamină B~6~ nivelul reacţiilor de transaminare scade (cu 66%) şi deasemenea activitatea plasmatică a acestei enzime (ex. hepatita alcoolică-creşterile sunt mai mici în alte hepatite). *Localizare* Concentraţia GPT e mai scăzută decât cea a GOT în toate ţesuturile, cu excepţia ficatului. GOT GPT ---------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---------------------------------------------------------- Localizare tisulară Inimă, ficat, musculatură striată (localizari principale) sistem nervos, rinichi, pancreas, hematii, plămâni (localizări secundare) Ficat, musculatură striată, miocard, rinichi, pancreas Localizare celulară Enzimă biloculară (40% în mitocondrii, 60% în citoplasmă) Enzimă uniloculară (doar în citoplasmă) Mecanismele creşterii activităţii plasmatice Necroză (moartea celulară) Creşterea permeabilităţii membranei celulare Semnificaţia creşterii în ser Leziuni severe Leziuni uşoare (când nu se asociază cu o creştere a GOT) T~1/2~ 17h 47 h Valori normale \< 45 UI/l \< 27 UI/l *Valori patologice ale transaminazelor serice* Creşterile GPT au în general aceleaşi cauze ca şi creşterea GOT. Transaminazele serice prezintă variaţii fiziologice de maxim 10 u.i./zi la aceeaşi persoană. *Raportul De Ritis* Raportul De Ritis este raportul între activitatea GOT/activitatea GPT *Valori normale*: 1,3 (variază între 0,7-1,4 în funcţie de metodologie) *Valori patologice* În cazul necrozei se eliberează enzime mitocondriale (ex. GOT) şi în consecinţă raportul De Ritis va fi crescut; de exemplu în infarctul miocardic acut, hepatita cronică activă, medicamentele hepatotoxice. În cazul bolilor inflamatorii are loc o creştere a permeabilităţii membranei celulare cu eliberarea enzimelor citoplasmatice şi deci raportul De Ritis va fi scăzut de exemplu în hepatita infecţioasă. În cazul infarctului miocardic acut, GOT este eliberată din celule începând cu 6-12 ore de la declanșare, valorile maxime sunt înregistrate la 48 de ore și revin la normal după 3-5 zile. *Sunt enzime care fac parte din clasa hidrolazelor și catalizează hidroliza unei mari varietăți de monoesteri organici ai fosfatului (esteri fosforici ai alcoolilor primari, secundari, ciclici, fenolilor, etc.).* Rolul fiziologic şi substratele naturale din organism ale enzimelor nu se cunosc. Reacţia generală este: Se clasifică în funcție de pH-ul optim la care acționează, în: a. Fosfataze acide (ACP) care acționează la pH aproximativ 5 b. Fosfatazele alcaline (ALP) care acționează la pH de aproximativ 10 Termenul de fosfatază acidă este folosit pentru o familie de enzime care reacţionează ca esteraze (de exemplu, asupra p-nitrofenilfosfatului, în cazul determinărilor efectuate la laborator). pH-ul optim este de 5, de unde denumirea improprie de fosfatază acidă. *Localizare* În prostată se găseşte izoenzima prostatică a fosfatazei acide. Alte ţesuturi (ficat, splină, os, trombocite, eritrocite) au concentraţie mică de fosfatază acidă. Fosfataza acidă prostatică este sintetizată de prostată şi apoi este excretată, urmând traseul duct prostatic, uretră. În condiţii fiziologice, valorile sanguine ale enzimei sunt foarte mici. *Determinarea activităţii fosfatazei acide în laborator* Se determină în absența şi în prezența tartratului de sodiu. Activitatea inhibată de tartrat corespunde activitaţii fosfatazei acide cu origine prostatică, de unde mai este și denumită „fracțiunea tartrat inhibabilă" a fosfatazei acide. *Recoltarea probei pentru determinarea activităţii fosfatazei acide* Determinarea activităţii enzimatice se face imediat după recoltarea probei deoarece fosfataza acidă prostatică este instabilă. Heparina inhibă activitatea enzimatică, de aceea se foloseşte sânge coagulat. Nu se utilizează probe hemolizate. Este indicat ca proba de sânge să fie recoltată anterior efectuării tuşeului rectal deoarece orice manevra clinică efectuată la nivelul zonei determină o creștere artificială, falsă a valorilor activității ACP. *Semnificaţia clinică* Fosfataza acidă prostatică are valori crescute în unele forme localizate de cancer prostatic (la 5-20% din bolnavi) şi în majoritatea formelor metastatice de carcinom prostatic (la 60-75% din bolnavi). De obicei, determinările de fosfatază acidă prostatică sunt însoţite de determinarea antigenului specific prostatic (PSA) în ser. Acest antigen, descoperit în 1987, este un peptid alcătuit din 237 aminoacizi, este sintetizat de epiteliul prostatic şi este secretat în lichidul seminal. El are activitate proteolitică. Recent s-au găsit şi alte localizări ale antigenului specific prostatic. Fosfataza acidă prostatică şi antigenul specific prostatic sunt markeri biochimici pentru cancerul de prostată. Valorile lor sunt crescute şi în caz de hipertrofie benignă de prostată, prostatită şi după cateterism în investigaţii urologice. De aceea, aceşti doi markeri nu sunt suficient de sensibili şi specifici pentru screeningul cancerului de prostată. Aplicaţia lor majoră este în urmărirea evoluţiei bolii şi pentru monitorizarea terapiei. Fosfataza alcalină reprezintă un termen generic pentru un grup de enzime care au proprietatea de a hidroliza monoesteri organici ai fosfatului, la pH alcalin (pH=10). Enzima necesită Mg^2+^ ca activator şi este inhibată de Ca^2+^ şi de fosfat anorganic. Rolul fiziologic şi substratul enzimei nu se cunosc. *Localizare* Enzima se găseşte în orice ţesut, dar ţesuturile bogate în fosfatază alcalină sunt: osul (osteoblastele), ficatul (tractul hepato-biliar), placenta şi intestinul. Enzima este situată pe suprafaţa membranei celulare, are timpul de înjumătăţire de 7 zile şi clearance-ul ei este probabil hepatic. Activitatea enzimatică plasmatică este reprezentată de: fracţiunea hepatică (30-50%), osoasă (50-70%), intestinală (0-20%). Identificarea izoenzimelor fosfatazei alcaline întâmpină încă probleme de sensibilitate şi precizie de execuţie. Se consideră că determinarea lor este improprie analizei clinice uzuale. *Creşteri fiziologice ale activităţii fosfatazei alcaline* se înregistrează: \- în copilărie şi pubertate, când există o creştere osoasă rapidă \- în trimestrul III al sarcinii, când activitatea fosfatazei alcaline este de 2 ori mai mare decât valoarea de la adult şi revine la normal la 3 săptămâni postpartum \- după vârsta de 60 ani, (boala Paget subclinică) *Semnificaţia clinică a activitaţii crescute a fosfatazei alcaline* a\. Boli hepatobiliare Fosfataza alcalină este enzima sindromului de colestază prin obstrucţie biliară, având două cauze majore: calculul de coledoc şi cancerul de cap de pancreas. O creştere marcată a fosfatazei alcaline plasmatice (de 3-4 ori) şi durabilă este caracteristică icterului colestatic, prin obstrucţie biliară. În acest caz, originea biliară a fosfatazei alcaline (sărurile biliare au rol de inductori enzimatici) este susţinută de valorile crescute ale 5'-nucleotidazei şi gamaglutamil-transpeptidazei. b\. Boli osoase Fosfataza alcalină reflectă activitatea osteoblastelor. Măsurarea activităţii fosfatazei alcaline trebuie însoţită de un bilanţ fosfocalcic complet, seric şi urinar. Valori crescute se întâlnesc în: regenerarea osoasă după fracturi, rahitismul prin carenţa vitaminei D etc. c\. Cancer Ţesutul canceros poate secreta două tipuri de fosfataze: oncofetale, secretate direct de tumoră, şi cele secretate de ţesutul invadat de metastaze. O fosfatază alcalină oncofetală este izoenzima Reagan, identică cu cea placentară, secretată de tumori canceroase pulmonare sau ale aparatului genital feminin. Fosfataza alcalină are valori crescute şi în metastazele hepatice sau osoase. Pentru diferenţierea lor se foloseşte -glutamil-transpeptidaza, care are origine hepatică. Amilaza serică este o -endoamilază care catalizează degradarea hidrolitică a amidonului. Ea acţionează asupra legăturilor -1,4 glicozidice, cu formare de oligozaharide reducătoare (dextrine), maltoză şi glucoză, care sunt compuşi necolorabili cu iodul. *Localizare* Enzima se găseşte în: pancreas, glande salivare, ficat, intestin subţire, rinichi, trompe uterine şi tumori (carcinom pulmonar, esofagian, ovarian, de sân). Există 2 clase de izoenzime: \- izoenzima P (secretată de pancreas), care reprezintă 40% din amilaza serică totală \- izoenzima S (secretată de diverse ţesuturi, în special de glandele salivare), care reprezintă 60% din amilaza serică totală *Timpul de înjumătăţire (T1/2)* este de 48 ore. Amilaza serică creşte în primele 24 ore de la debutul unei pancreatite, se menţine crescută 3 zile şi revine la normal în 3-5 zile. Enzima filtrează renal pentru că are masă moleculară mică (45000). În cazul macroamilazemiei, amilaza nu mai filtrează renal pentru că formează macromolecule cu imunoglobulinele, înregistrându-se astfel valori fals crescute ale amilazei serice. În pancreatita acută, valorile crescute ale amilazei urinare se menţin 7 zile (mai mult decât ale celei serice) datorită unui defect tubular, reversibil, care împiedică reabsorbţia amilazei urinare. *Semnificaţie clinică* a\. Pancreatita acută. O valoare a amilazei serice mai mare de 3 ori decât valoarea normală are o specificitate crescută pentru diagnosticul de pancreatită acută. În pancreatita acută amilaza serică poate creşte până la de 40 ori valoarea normală. Atenţie! - valoarea maximă a amilazei serice şi rata ei de scădere nu se corelează cu severitatea sau cu prognosticul bolii. Există pancreatite cu amilazemie normală în următoarele condiţii: \- recoltarea probei de sânge s-a efectuat la mai mult de trei zile de la debutul bolii (nu s-a ţinut seama de timpul de înjumătăţire al amilazei serice) \- pancreatita cronică este surprinsă în puseu acut \- hipertrigliceridemie b\. Alte boli (când valoarea amilazei serice este peste valoarea normală, dar mai mică decât triplul valorii normale) \- boli acute abdominale: ulcer peptic perforat, colecistită acută, ocluzie intestinală, traumatism abdominal, sarcină ectopică ruptă \- boli ale glandelor salivare: oreion, calculi, după sialografie \- spasm al sfincterului Oddi, după administrarea de morfină \- o disfuncţie glomerulară \- cetoacidoza diabetică (reacţie fals pozitivă, când există condiţii favorabile hidrolizei acide, cu afectarea determinării activităţii amilazei serice în laborator) \- macroamilazemia Valori scăzute ale amilazei serice se înregistrează la sugari Lipaza are origine pancreatică şi hidrolizează esteri ai glicerolului în prezenţa unei proteine cu masa moleculară de 10000 (colipaza) şi a sărurilor biliare de concentraţie slabă (altfel devin inhibitori). Lipaza reacţionează numai în mediu heterogen asupra substratului emulsionat, de aceea este dificil de a măsura activitatea enzimatică în laborator. Totuşi, astăzi sunt disponibile noi metode de determinare (chiar automatizate), având o bună sensibilitate. *Localizare* Lipaza are localizare preponderent pancreatică. Se mai poate găsi în: mucoasa gastrică şi intestinală, leucocite, adipocite. *Timpul de înjumătăţire* este mai mare decât cel al amilazei serice, valorile serice crescute persistând 14 zile. Enzima are clearance urinar. *Semnificaţie clinică* Nivelele crescute ale lipazei serice se înregistrează in pancreatitele acute şi în puseele acute ale unei pancreatite cronice. Aceste valori sunt mai persistente decât cele ale amilazei, deci ajută la punerea retrospectivă a diagnosticului de pancreatită. Valori normale ale lipazei serice, însoţite de amilazemie crescută, apar în afecţiuni extrapancreatice: leziuni ale glandelor salivare, oreion, sarcina extrauterină, macroamilazemie, cetoacdoză diabetică. Organismul dispune de enzime capabile să producă hidroliza esterilor colinei cu diverşi acizi organici. Un grup al acestor enzime este localizat predominant în eritrocite şi în ţesutul nervos, având activitate specifică asupra acetilcolinei; denumirea enzimelor este de acetilcolinesteraze. Celălalt grup de enzime este sintetizat de ficat, apoi secretat în plasmă şi are specificitate largă, hidrolizând esteri variaţi (acetilcolina, butiril-colina, benzoil-colina, succinil-colina). Denumirea enzimelor din acest grup este de colinesteraze serice nespecifice sau pseudocolinesteraze. Există numeroase tehnici de determinare a activităţii colinesterazelor serice. Unele sunt bazate pe modificările de pH datorate eliberării acizilor din esterii colinei, fie pe determinări colorimetrice sau spectrofotometrice ale substratului supus hidrolizei. *Semnificaţie clinică* Pseudocolinesteraza dă indicaţii privind capacitatea proteosintetică a ficatului. Valori crescute ale activităţii enzimatice se înregistrează în perioada de vindecare a unei hepatite şi în sindromul nefrotic, când are loc o exagerare a funcţiei proteosintetice a ficatului. Pentru hepatologie este important de ştiut că în caz de afectare a ficatului la obezi, hiperlipemici sau hipertiroidieni, scăderea pseudocolinesterazei porneşte de la un nivel iniţial mai ridicat. Valori scăzute ale activitaţii enzimatice se înregistrează în boli de ficat (hepatită cronică, ciroză). Urmărirea variaţiei activităţii enzimatice are valoare diagnostică şi pentru urmărirea eficacităţii terapiei. Creşterea valorii în cursul terapiei hepatitei indică un prognostic favorabil, în timp ce scăderea progresivă a valorii denotă evoluţia spre atrofie hepatică. Valori scăzute ale activităţii enzimatice se înregistrează şi în ingestia sau absorbţia prin tegumente de anticolinesteraze (insecticide organofosforice), în prezenţa de variante anormale ereditare ale colinesterazei, care au o activitate biologică scăzută. Sensibilitatea la suxametoniu Suxametoniul (succinil-colina, „scolina") este un relaxant muscular, care este metabolizat prin hidroliza de către colinesteraza serică, scăzându-i astfel durata de acţiune. Administrarea de suxametoniu la un pacient cu activitate scăzută a colinesterazei (de obicei datorită existenţei unei variante genetice anormale) este urmată de o perioadă îndelungată de apnee. Asemenea pacienţi necesită ventilaţie suportivă după operaţie. Pentru demonstrarea prezenţei unei variante genetice anormale se determină şi *numărul la dibucaină* (valoarea normală este de 80% şi reprezintă procentul cu care a fost inhibată activitatea colinesterazei în prezenţa dibucainei). Pentru formele homozigote, activitatea colinesterazei serice este foarte mult scăzută, iar procentul cu care este inhibată de către dibucaină este mai mic de 20%. Formele heterozigote au activitatea colinesterazei serice uşor scăzută şi număr intermediar la dibucaină. Raţionamentul utilizării inhibiţiei la dibucaină constă în: Identificarea pacienţilor susceptibili la suxametoniu şi a rudelor lor este importantă pentru a aprecia riscul utilizării anestezicelor la aceştia. -Glutamiltraspeptidaza (GT) este o enzimă implicată în transferul unităţilor de -glutamil de pe -glutamilpeptide pe aminoacizi sau alte peptide cu moleculă mică. În majoritatea sistemelor biologice donorul de -glutamil este glutationul, reacţia generală catalizată de către -GT fiind următoarea: Glutation + aminoacid glutamilpeptid + L-cisteinilglicină Funcţiile fiziologice specifice ale -GT nu sunt clar precizate. Totuşi, este recunoscută implicarea ei în următoarele procese: sinteza proteinelor şi a peptidelor, reglarea concentraţiilor tisulare de glutation, transportul aminoacizilor prin membranele celulare. *Localizare* -GT este localizată în ficat, căi biliare, pancreas, intestine, rinichi, prostată şi creier. Enzima circulantă este exclusiv de origine hepato-biliară. În hepatocite şi, mai ales, în celulele care tapetează canaliculele biliare, enzima se găseşte aproape exclusiv la nivelul membranei celulare. -GT este supusă inducţiei hepatice microzomale la fenobarbital şi alcool, fapt care sugerează şi o localizare extramembranară a enzimei (în reticulul endoplasmic neted din celulele parenchimului hepatic, la nivelul căruia s-a detectat dealtfel o activitate crescută de -GT în cazul subiecţilor alcoolici sau care consumatori cronici de somnifere barbiturice ). *Valori patologice* Activitatea -GT este crescută în colestază, hepatopatii, alcoolism, pancreatită, cancer de prostată, tratament cu fenobarbital. *Observaţii* Determinarea activităţii serice a -GT este utilă pentru diferenţierea cauzelor creşterii activităţii serice a fosfatazei alcaline (cauză hepatică sau osoasă). -GT nu există în oase, deci creşterea activităţii ei asociată cu creşterea activităţii fosfatazei alcaline indică originea hepatică a fosfatazei alcaline. -GT constituie un marker de boală hepatobiliară la adolescenţi (la care fosfataza alcalină este crescută fiziologic şi nu mai poate fi folosită pentru investigarea stării ficatului). -GT este folosită pentru a diagnostica alcoolismul cronic şi în mod special ocult. Alcoolul induce activitatea enzimatică microzomală şi consecutiv creşterea nivelului seric al activităţii -GT.Acesta revine în limite normale după 2-3 săptămâni de la oprirea consumului de alcool.