Draft Skripsi ACC Seminar Hasil Agustina Dwi PDF

 PENINGKATAN MUTU BIJI KOPI BERAS ROBUSTA ASALAN DENGAN HIDROLISIS ENZIMATIS MENGGUNAKAN ENZIM PROTEASE BIDURI SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Teknologi Hasil Pertanian (S1)....

 PENINGKATAN MUTU BIJI KOPI BERAS ROBUSTA ASALAN DENGAN HIDROLISIS ENZIMATIS MENGGUNAKAN ENZIM PROTEASE BIDURI SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Teknologi Hasil Pertanian (S1). Oleh Agustina Dwi Sekar Putri NIM 191710101046 KEMENTRIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN, RISET DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS JEMBER FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN JEMBER 2024 i  DAFTAR ISI HAL AMAN JUDUL..................................................................................................................................... i DAFT AR ISI................................................................................................................................................... ii DAFTAR GAMBAR...................................................................................................................................... iv DAFTAR LAM PIRAN................................................................................................................................... v BAB 1. PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1 1.1. Latar Belakang.............................................................................................................................. 1 1.2. Rumusan Masalah........................................................................................................................ 3 1.3. Tujuan Penelitian.......................................................................................................................... 3 1.4. Manfaat Penelit ian........................................................................................................................ 3 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA................................................................................................................... 4 2.1. Karakteristik Kopi Robusta (Coffea canephora. L)............................................................... 4 2.2. Pengolahan Pasca Panen Kopi................................................................................................... 5 2.3. Digestion Method pada Biji Kopi.............................................................................................. 7 2.4. Hidrolisis Protein pada Biji Kopi............................................................................................... 7 2.5. Asal dan Karakteristik Enzim Protease Biduri........................................................................ 8 BAB 3. METODE PENELITIAN...............................................................................................................10 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian..................................................................................................10 3.2. Alat dan Bahan Penelitian.........................................................................................................10 3.3. Metode Penelitian.......................................................................................................................10 3.4. Parameter Pengamatan..............................................................................................................13 3.5. Analisis Data...............................................................................................................................13 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................................................................14 4.1. Aktivitas Enzim Protease Biduri..............................................................................................14 4.2. Derajat Keasaman (pH) Bubuk Kopi......................................................................................14 4.3. Total Asam Tertitrasi.................................................................................................................16 4.4. Kadar Air Bubuk Kopi..............................................................................................................18 4.5. Kadar Abu Bubuk Kopi.............................................................................................................19 4.6. Kadar Kafein Bubuk Kopi........................................................................................................20 4.7. Uji Organoleptik Seduhan Bubuk Kopi..................................................................................23 4.8. Uji Efektifitas Perlakuan Terbaik............................................................................................31 BAB 5. PENUTUP........................................................................................................................................32 5.1. Kesimpulan.........................................................................................................................................32 5.2. Saran.....................................................................................................................................................32 Daftar Pustaka.................................................................................................................................................33 LAMPIRAN...................................................................................................................................................36 ii  DAFTAR TABEL Tabel 2. 1 komposisi senyawa kimia pada biji kopi robusta...................................5 Tabel 3. 1 kombinasi perlakuan dan lama waktu hidrolisis……………………...13 Tabel 4. 1 uji efektifitas…………………….……………………………………31 iii  DAFTAR GAMBAR Gambar 4. 1 Derajat keasaman (pH) kopi bubuk………………………………..15 Gambar 4. 2 Total asam tertitrasi kopi bubuk……………………………………17 Gambar 4. 3 Kadar air kopi bubuk........................................................................18 Gambar 4. 4 Kadar abu kopi bubuk.......................................................................20 Gambar 4. 5 Kadar kafein kopi bubuk...................................................................21 Gambar 4. 6 Nilai kesukaan warna seduhan kopi………………………………..23 Gambar 4. 7 Nilai kesukaan aroma seduhan kopi..................................................24 Gambar 4. 8 Nilai kesukaan rasa seduhan kopi………………………………….25 Gambar 4. 9 Nilai kesukaan Acidity seduhan kopi………………………………27 Gambar 4. 10 Nilai kesukaan body seduhan kopi………………………………..28 Gambar 4. 11 Nilai kesukaan After Taste seduhan kopi.......................................29 Gambar 4. 12 Nilai kesukaan keseluruhan seduhan kopi......................................30 iv  DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 3. 1 Proses eskstraksi enzim protease biduri.........................................36 Lampiran 3. 2 Uji aktivitas enzim protease biduri.................................................37 Lampiran 3. 3 Proses produksi kopi robusta bubuk asalan....................................38 Lampiran 3. 4 Nilai pH (AOAC, 2004).................................................................39 Lampiran 3. 5 Total Asam (AOAC, 1995)............................................................39 Lampiran 3. 6 Uji Kadar Air (SNI-01-2354-2-2006)............................................39 Lampiran 3. 7 Uji Kadar Abu (SNI 01-2891-1992)..............................................40 Lampiran 3. 8 Uji Kadar Kafein (Belay et al., 2008)............................................40 Lampiran 3. 9 Uji Hedonik (Tarwendah et al., 2017)...........................................41 Lampiran 3. 10 Uji efektifitas (De Garmo, 1984).................................................41 Lampiran 4. 1 aktivitas enzim protease biduri…………………………………..42 Lampiran 4. 2 Hasil uji dan ANOVA Nilai pH.....................................................42 Lampiran 4. 3 Hasil uji dan ANOVA total asam tertitrasi....................................43 Lampiran 4. 4 Hasil uji dan ANOVA kadar air.....................................................43 Lampiran 4. 5 Hasil uji dan ANOVA kadar abu...................................................44 Lampiran 4. 6 Hasil uji dan ANOVA kadar kafein...............................................45 Lampiran 4. 7 Data hasil uji organoleptik warna...................................................47 Lampiran 4. 8 Data hasil uji organoleptik aroma..................................................48 Lampiran 4. 9 Data hasil uji organoleptik rasa......................................................49 Lampiran 4. 10 Data hasil uji organoleptik acidity................................................50 Lampiran 4. 11 Data hasil uji organoleptik body...................................................51 Lampiran 4. 12 Data hasil uji organoleptik after taste..........................................52 Lampiran 4. 13 Data hasil uji organoleptik keseluruhan.......................................53 Lampiran 4. 14 Data uji efektifitas........................................................................55 v  BAB 1. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Kopi merupakan komoditas yang memiliki nilai ekonomi tinggi dan dapat berkontribusi dalam pemasukan devisa negara serta memberikan multiplier effect bagi sektor ekonomi lainnya (Aklimawati et al., 2014). Pada tahun 2022, luas perkebunan kopi di Indonesia sebesar 1.220.814 ha, dimana 968.875 ha adalah perkebunan rakyat kopi robusta. Jumlah produksi kopi robusta perkebunan rakyat sebesar 79,47% atau 549.951 ton. Kopi robusta menjadi mayoritas (85%) ekspor kopi Indonesia yang rata-rata per tahun mencapai yaitu 350 ribu ton (Widaningsih, 2022). Pengolahan biji kopi robusta oleh perkebunan rakyat masih banyak menghasilkan biji kopi yang tidak layak ekspor. Kelompok biji kopi imperior tersebut termasuk biji cacat, biji kopi terkena penyakit, dan biji kopi asalan. Kopi asalan merupakan biji kopi yang dipanen secara rajutan yang diawali dengan dengan pemetikasn 70% buah merah terhadap total produksi satu gelondong segar dalam satu kali pemanenan (Aklimawati et al., 2014). Aklimawati et al., (2014) menyatakan bahwa kopi robusta asalan memiliki kualitas mutu yang lebih rendah jika dibandingkan dengan jenis kopi lain. Rendahnya mutu biji kopi robusta asalan terjadi karena beberapa faktor salah satunya adalah pengolahan pasca panen. Metode pengolahan pasca panen kopi robusta asalan cenderung menggunakan metode kering dengan menggunakan alat dan bahan yang sederhana, menghasilkan kopi yang harga jualnya rendah. Upaya perbaikan mutu kopi asalan tersebut dapat dilakukan dengan pengolahan kembali secara basah dengan bantuan enzim protease atau proteolitik. Perlakuan re- fermentasi enzimatis biji kopi asalan diharapkan mampu meningkatkan kualitas kopi robusta asalan. Penggunaan protease mampu memecah protein menjadi senyawa peptida lebih sederhana dan asam amino rantai pendek. Hidrolisis enzimatis dapat membentuk ikatan yang mengaitkan dua molekul lain sehingga menghasilkan senyawa baru atau meningkatkan senyawa yang sudah ada sebelumnya. Fermentasi basah dengan penambahan enzim proteolitik pada biji kopi dapat 1  2 meningkatkan cita rasa kopi (Budiman et al., 2021). Drefin Oktadina et al., (2013) menyatakan bahwa penggunaan Bromelin dapat menurunkan kadar kafein biji kopi beras dengan kadar akhir (1,15%) dari kontrol (2.27%) dan memperbaiki cita rasa serta aroma sebesar (74,50) dari kontrol (70,00). Firdaus (2019) juga menyatakan bahwa buah kopi robusta yang terfermentasi baik secara spontan atau dengan penambahan enzim protease biduri dapat meningkatkan mutu organoleptik kopi yang dihasilkan. Penambahan enzim protease dari tumbuhan dapat meningkatkan citarasa dan mutu kimia kopi. Penggunaan enzim protease biduri pada fermentasi kopi robusta menunjukkan terjadinya peningkatan mutu organoleptik, namun aplikasi protease biduri dalam pengolahan kembali biji kopi beras (green beans) secara basah belum dilakukan. Ekstrak kasar getah biduri mengandung banyak protein dan memiliki aktivitas proteolitik yang kuat. Protease biduri dipilih karena bahan baku yang digunakan tersedia bebas di alam dan belum banyak dimanfaatkan dalam industri pangan. Alasan lain pemilihan enzim protease biduri adalah berdasarkan pola pemecahannya enzim protease biduri dinilai sangat potensial untuk pembuatan hidrolisat protein maupun untuk memperbaiki flavor produk pangan, serta enzim protease kasar (crude enzyme) dari biduri dinilai memiliki aktivitas enzim lebih tinggi dibandingkan dengan enzim protease lainnya (Witono, 2013). Enzim protease dapat memecah protein menjadi senyawa asam-asam amino bebas sehingga menghasilkan kopi dengan rasa, aroma dan flavor yang unik. Afriliana et al., (2019) menyatakan bahwa peningkatan profil aroma 23 senyawa golongan acid, alcohol, aldehyde, dan acetate biji kopi beras asalan dapat dilakukan dengan re-fermentation menggunakan kefir. Re-fermentation biji kopi beras secara enzimatis dipengaruhi oleh kondisi fermentasi yang digunakan, baik konsentrasi enzim dan masa inkubasi. Oleh karena itu, penelitian mengenai pengaruh lama waktu hidrolisis enzimatis menggunakan enzim protease biduri pada biji kopi beras (green beans) robusta terhadap mutu fisik dan organoleptik kopi yang dihasilkan perlu dilakukan.  3 1.2. Rumusan Masalah Kopi asalan yang dihasilkan perkebunan rakyat bermutu rendah, berkadar air relatif tinggi. Hal itu disebabkan proses pengolahan kopi dengan metode kering dengan peralatan pengolahan yang kurang standar dan pemetikan dilakukan secara asal. Peningkatan mutu biji kopi tersebut dapat dilakukan pengolahan kembali biji kopi dengan cara basah (re-fermentation). Afriliana et al., (2019) menyatakan bahwa peningkatan profil aroma 23 senyawa golongan acid, alcohol, aldehyde, dan acetate biji kopi beras asalan dapat dilakukan dengan re- fermentation menggunakan kefir. Namun, pengolahan basah biji kopi beras robusta secara enzimatik (enzymatic re-fermentation) menggunakan enzim protease biduri belum diketahui dengan baik. Berapa lama waktu hidrolisis enzimatis oleh protease biduri dan pengaruh penambahan enzim pada re- fermentation biji kopi beras robusta belum diketahui. 1.3. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Mengetahui pengaruh dari variasi perlakuan dengan dan tanpa penambahan enzim protease dan lama waktu hidrolisis enzim protease biduri terhadap karakteristik fisik, kimia dan organoleptik biji kopi robusta asalan terfermentasi ulang, 2. Mengetahui perlakuan terbaik untuk pengolahan kopi robusta asalan. 1.4. Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Meningkatkan mutu biji kopi asalan yang dihasilkan dari perkebunan rakyat 2. Meningkatkan nilai ekonomi biji kopi asalan 3. Menurunkan kadar kafein berlebih.  BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Karakteristik Kopi Robusta (Coffea canephora. L) Kopi robusta merupakan salah satu jenis kopi yang banyak dikembangkan di Indonesia, sehingga kopi robusta memiliki tingkat produksi yang tinggi. Tingginya tingkat produksi kopi robusta menyebabkan kopi robusta banyak dibudidayakan daripada kopi jenis lain. Kopi robusta banyak dibudidaya oleh perkebunan rakyat. Perkebunan rakyat banyak menghasilkan biji kopi robusta asalan. Biji kopi disebut sebagai biji kopi asalan apabila biji kopi dipanen dengan racutan atau pemetikan dengan 70% gelondong buah segar dalam satu kali pemanenan (Aklimawati et al., 2014). Pemetikan dengan metode racutan atau serentak dapat meyebabkan terjadinya cacat fisik pada biji kopi yang dihasilkan. Contoh cacat fisik yang dapat terjadi pada biji kopi asalan adalah biji berlubang, biji pecah, biji hitam, dan biji coklat. Biji kopi asalan juga cenderung memiliki cacat citarasa baik cacat mayor (Stinker, Moldy dan Earthy) ataupun minor (Winey, Grassy, Harsh, Woody, Burn, dan Rubbery). Proses pengolahan pasca panen juga mempengaruhi biji kopi yang dihasilkan. Biji kopi asalan banyak dihasilkan dari petani yang melakukan pengolahan secara kering dengan alat seadanya. Petani pada umumnya menyimpan buah kopi selama satu malam sebelum diolah dan tidak melakukan proses sortasi pada baik pada buah kopi maupun biji kopi, sehingga masih banyak kotoran selain kopi dan biji kopi cacat. Biji kopi asalan dinilai termasuk dalam mutu 4-6 karena mutu fisik dan citarasanya rendah (Aklimawati et al., 2014). Pengolahan kembali biji kopi juga diketahui dapat meningkatkan mutu biji kopi asalan (Afriliana et al., 2019). Kopi robusta memiliki rasa mirip coklat, aroma khas dan manis, teksturnya lebih kasar, dengan kadar kafein lebih tinggi daripada kopi arabika (Afriliana, 2018). Kandungan kimia biji kopi dipengaruhi oleh jenis kopi, lingkungan tempat tumbuh, tingkat kematangan, kondisi penyimpanan dan proses pengolahannya. Senyawa kimia dalam biji kopi Robusta sebelum dan setelah penyangraian dapat dilihat pada Tabel 2.1. 4  5 Tabel 2. 1 komposisi senyawa kimia pada biji kopi robusta Komponen Konsentrasi (g/100g) Green coffea Roasted canephora coffea canephora Sukrosa 0.9-4.0 1.6-tr Gula pereduksi 0.4 0.3 Polisakarida 48-55 37 Lignin 3.0 3.0 Pectin 2.0 2.0 Protein 10.0-11.0 7.5-1.0 Asam amino bebas 0.8-1.0 Tidak terdeteksi Kafein 1.5-2.5 2.4-2.5 Trigonelline 0.6-0.7 0.7-0.3 Asam nikotinik - 0.014-0.025 Minyak kopi 7.0-10.0 11.0 (trigliserida, sterol/tocopherol) Diterpen 0.2-0.8 0.2 Mineral 4.4-4.5 47 Asam klorogenat 6.1-11.3 3.3-3.8 Asam alifatik 1.0 1.6 Asam quinic 0.4 1.0 Melanoidins - 25 Sumber: Farah, 2012. 2.2. Pengolahan Pasca Panen Kopi Pengolahan kopi dapat dilakukan dengan cara basah maupun cara kering. Proses pengolahan dengan metode basah dan kering memiliki perbedaan yaitu pada metode basah sortasi dilakukan dengan cara merambang biji kopi dengan air, proses fermentasi dilakukan pada buah kopi yang telah di kupas, sedangkan pengolahan kering tanpa dilakukan proses sortasi dengan air dan proses pengupasan dilakukan setelah biji kering. Biji kopi rakyat yang diolah dengan metode kering dinilai bermutu sedang hingga rendah. Adapun beberapa kekurangan pengolahan dengan metode kering menurut (Aklimawati et al., 2014) adalah sebagai berikut: 1. Pada umumnya petani tidak melakukan sortasi baik pada buah kopi maupun biji kopi yang dihasilkan, akibatnya akan banyak komponen pengotor seperti batu,  6 2. ranting, kulit kopi yang tidak dibersihkan sehingga menurunkan mutu fisik biji kopi yang dihasilkan. 3. Pasca pemanenan buah kopi akan disimpan selama satu malam sebelum diolah sehingga menyebabkan terjadinya biji kopi cacat karena adanya serangan jamur, 4. Pada saat proses penjemuran terdapat kurangnya pembalikan atau minimnya sinar matahari mengakibatkan terjadinya moldy dan rasa earthy. Semakin lama durasi penjemuran maka akan menimbulkan karakter fermentasi berlebih (winey) dan apabila terjadi pembusukan maka menimbulkan citarasa stinker (berbau busuk). Pengolahan secara basah juga memiliki kelemahan salah satunya adalah biayan pengolahan yang digunakan lebih mahal daripada proses kering, oleh karena itu pengolahan dengan metode basah lebih sering digunakan untuk mengolah kopi arabika. Hal tersebut karena kopi jenis arabika memiliki nilai jula yang tinggi sehingga biaya pengolahan yang dikeluarkan masih sebanding dengan yang diterima (Afriliana, 2018). Pengolahan kopi dengan metode basah menghasilkan kopi dengan kualitas rasa yang lebih seragam, memiliki karakter yang body yang light/bright dan smooth. Karakteristik kopi dapat dinilai berdasarkan uji indrawi (Organoleptik). Komponen uji cita rasa menurut Afriliana, (2018), sebagai berikut : 1. Aroma adalah bau dari kopi ketika diseduh dengan air panas. Pengujian dilakukan dengan mencium aroma kopi. 2. Rasa merupakan komponen utama dlam seduhan kopi yang meliputi cita rasa yang dikenali dengan lidah dan aroma yang dikenali oleh indra penciuman. 3. Acidity merupakan cita rasa kopi yang digambarkan dengan masam yang enak seperti buah segar. 4. Body merupakan tingkat kepekatan atau kekentalan rasa dari seduhan kopi, biasa dinilai dengan thick, light. 5. After taste dinilai berdasarkan lama bertahannya suatu rasa dan aroma positif yang berasal dari langit-langit belakang mulut setelah kopi dibuang atau ditelan.  7 2.3. Digestion Method pada Biji Kopi Digestion method merupakan metode yang digunakan dalam proses inkubasi biji kopi dengan melibatkan bantuan hewan atau mikroorganisme / enzim dari usus hewan atau penggunaan mikroorganisme/enzim/bahan kimia komersial. Beberapa contoh biji kopi yang diolah menggunakan metode ini adalah biji kopi luwak, biji kopi gading (kotoran gajah), kopi jacu (kotoran burung jacu), biji kopi yang diolah menggunakan khamir, dan biji kopi yang diolah dengan larutan kimia asam asetat. Metode ini diketahui dapat meningkatkan atau membentuk atribut aroma baru yang awalnya tidak ada dari biji kopi, serta meningkatkan mutu sensori dan fungsional biji kopi (Febrianto & Zhu, 2023). Digestion method mempengaruh komponen kimia biji kopi yang dihasilkan. Biji kopi luwak memiliki lebih banyak asam sitrat dan malat daripada biji kopi biasa, serta memiliki kandungan protein lebih rendah dari biji kopi proses lainnya. Hal tersebut terjadi karena adanya leaching protein oleh enzim protease yang ada dalam pencernaan luwak (Febrianto & Zhu, 2023). Metode ini juga berpengaruh terhadap komponen sensori biji kopi yang dihasilkan. Biji kopi yang diolah dengan carboxypeptidase meningkatkan komponen sensori dan atribut dari aftertaste, mouthfeel, flavor dan softness. Peningkatan mutu sensori terjadi karena Carboxypeptidase melepaskan asam amino dari ikatan peptida dan protein sehingga meningkatkan kemampuan sebagai perkusor rasa untuk reaksi Maillard (Murthy et al., 2019). 2.4. Hidrolisis Protein pada Biji Kopi Hidrolisis protein adalah pecahnya ikatan peptida dari protein menjadi asam amino rantai pendek dan peptida sederhana. Hidrolisis protein akan menyebabkan beberapa perubahan pada protein yaitu rusaknya struktur globular protein, berkurangnya berat molekul pada protein atau polipeptida dan meningkatkan kelarutan protein (Witono, 2013). Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan bantuan enzim proteolitik seperti enzim bromelin, enzim zingibain, enzim papain dan enzim calotropin. Hidrolisis protein pada produk kopi akan terjadi pelepasan senyawa-senyawa baru yang berperan dalam 7  8 memperbaiki cita rasa dan aroma kopi (Budiman et al., 2021). Bromelin termasuk enzim endopeptidase yang menghidrolisis protein dengan ikatan peptida pada gugus karbonil, seperti dalam arginin, atau asam amino aromatik yaitu fenilalanin atau tirosin menjadi asam amino (Gautam et al., 2010). Fermentasi biji kopi beras dengan bromelin dapat menurunkan kadar kafein hingga kadar akhir 1,15% dari kontrol 2,27% dan mendapatkan respon baik dari panelis ahli pada uji organoleptik (citarasa dan aroma) sebesar 74,50 dengan notes Acidity, good body (Drefin Oktadina et al., 2013). Firdaus (2019), menyatakan bahwa biji kopi hasil metode basah dengan penambahan calotropin menghasilkan kopi dengan nilai cuptest sebesar 83,42 dengan mutu spesialti (fine robusta). 2.5. Asal dan Karakteristik Enzim Protease Biduri Biduri (Calotropis gigantea) merupakan semak liar yang berasal dari bagian selatan asia timur yang hidup pada dataran kering dan terbuka seperti area pantai. Seluruh bagian dari tumbuhan biduri akan mengeluarkan getah berwarna putih susu apabila tumbuhan dipotong. Getah tanaman biduri mengandung enzim protease, calotorpain FI, calotropain F11, calotropsin D1 dan D11, asam askorbat, calotoxin, calactin, nitrogen dan sulphur yang mengandung racun ikan dan gigantin. Enzim calotropin pada getah biduri diketahui memiliki aktivitas proteolitik yang lebih tinggi dari papain (Merzaia et al., 2017). Bagian-bagian lain dari tumbuhan biduri juga dinilai sangat potensial sebagai sumber enzim protease yang bermanfaat dalam pengolahan pangan misalnya pembuatan keju lunak dari susu kerbau (Bulkaini et al., 2020). Ekstraksi getah dari tanaman biduri dilakukan dengan memotong atau melukai tanaman biduri, kemudian getah yang menetes ditampung dalam wadah, lalu dibawa dan disimpan dalam keadaan dingin (± 4ºC). Penyadapan getah biduri baik dilakukan pada pagi hari, sebelum matahari terbit karena aktivasi transpirasi pada tumbuhan masih rendah. Transpirasi pada tumbuhan dapat mempengaruhi kandungan air dalam batang, sehingga berpengaruh terhadap kepekatan getah yang didapatkan (Witono, 2013).  9 Enzim protease biduri termasuk dalam golongan sulfidril (sistein) dan aktivitasnya tergantung dari adanya gugus sulfidril (sistein) pada sisi aktifnya. Selain itu, enzim protease biduri tergolong ke dalam enzim ekstraseluler atau eksopeptidase. Enzim eksopeptidase memecah ikatan peptida pad a ujung dari protein sehingga menghasilkan asam amino dan peptida (Witono, 2013). Beberapa karakteristik enzim protease biduri diantaranya adalah optimum pada suhu 55ºC dengan aktivitas enzim sebesar 0,077 unit aktivitas/mg protein. Enzim protease biduri memiliki pH optimum pada pH 7 dengan aktivitas sebesar 0,091 unit aktivitas/mg protein enzim (Bulkaini et al., 2020). Menurut Witono, (2013), aktivitas enzim optimal pada suhu 30ºC dan terdenaturasi mulai suhu 45ºC, sedangkan enzim protease biduri masih memiliki aktivitas enzim pada suhu 60ºC dan 80ºC dan mengalami penurunan aktivitas yang cukup signifikan pada suhu 90ºC. Hal tersebut menandakan bahwa enzim protease biduri memiliki daya tahan yang baik dan tentunya akan berguna jika diaplikasikan pada industri pangan yang menggunakan enzim jenis protease.  BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksakan di Laboratorium Pengendalian Mutu Pangan dan Hasil Pertanian, Pangan Fungsional dan Nutraseutical dan laboratorium Inovasi Hasil Pertanian dan Kewirausahaan, Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Jember. Waktu penelitian dilaksanakan dari bulan September 2022 - September 2023. 3.2. Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam produksi enzim dan kopi dan alat untuk pengujian kopi yang dihasilkan. Alat untuk produksi enzim dan kopi terdiri dari: centrifuge dengan pendingin 4000 rpm 4℃ (Denley), alat penyangrai kopi (Hanztowo coffee roaster), pH meter (jen way type 330). Alat untuk pengujian antara lain: spektrofotometer Genensys 10S UV-Vis (Thermo Scientific), tanur listrik, oven. 3.2.2. Bahan Penelitian Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini yaitu green beans kopi asalan jenis robusta dari Karang Pring, Jember. Green beans yang didapatkan kemudian di sortasi untuk menghilangkan kotoran seperti ranting, kerikil, kulit yang kering, dan biji hitam. Bahan yang digunakan untuk ekstraksi enzim protease kasar dari getah biduri adalah getah tanaman biduri dan buffer phosfat (0.05M) pH 7. Enzim protease diproduksi dari getah tanaman biduri (Calotropis gigantea) yang berasal dari Desa Sliwung Situbondo. Bahan kimia yang digunakan untuk pengujian meliputi: NaH 2 PO 4 (Merck), Na2 HPO 4 (Merck), pereaksi follin, tirosin, TCA (Merck), HCL, NaOH, Na 2 CO 3 , NaCl (Merck), kloroform dan aquadest. 3.3. Metode Penelitian Metode penelitian dilakukan dalam 2 tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi pembuatan enzim protease 10  11 biduri dan pengujian aktivitas enzim. Penelitian utama meliputi hidrolisis biji kopi beras (green beans) robusta asalan dan pengujian kualitas mutu kopi yang dihasilkan. 3.3.1. Ekstraksi Enzim Protease Biduri Kasar Tahap pertama dalam ekstraksi enzim protease biduri adalah pengambilan getah yang dilakukan dengan cara penyayatan tanaman biduri. Pengambilan getah dilakukan pada pada pagi dan sore hari. Getah yang telah diperoleh selanjutnya dicampur dengan buffer phosphat 0,05 M pH 7 dengan perbandingan 1:1 (v/v). Penambahan buffer phosphat dilakukan untuk membantu mempertahankan pH dan kondisi optimum getah. Hasil pencampuran tersebut dilanjutkan pada proses deguming yang dilakukan dengan sentrifugasi dingin (4ºC, 4000 rpm selama 10 menit). Supernatan dipisahkan dari endapan yang mengandung gum/impuritas. Supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi merupakan ekstrak kasar enzim protease biduri. Proses produksi enzim dapat dilihat pada lampiran 3.1. 3.3.2. Uji aktivitas enzim Uji aktivitas enzim menurut Walter, (1984) dilakukan dengan 3 perlakuan yaitu blanko, standar dan sampel. Larutan enzim sebanyak 0,1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,5 mL kasein 1% (b/v) dan 0,5 mL buffer fosfat pH 7. Pada perlakuan blanko dan standar, enzim diganti dengan aquades dan tirosin masing-masing 0,1 mM. Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37 ℃ selama 10 menit. Reaksi hidrolisis dihentikan dengan cara penambahan 1 mL TCA 0,1M. Pada blanko dan standar ditambahkan 0,1 mL aquades selanjutnya larutan disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 0,75 mL supernatan ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 2,5 mL Na2 CO3 0,4 M kemudian ditambahkan 0,5 mL pereaksi Folin Ciocalteau (1:2, follin:aquades). Selanjutnya, sampel kembali diinkubasi pada suhu 37 ℃ selama 20 menit. Hasil inkubasi diukur dengan spektrofotometer pada λ : 670 nm. Diagram alir uji aktivitas enzim dapat dilihat pada lampiran 3.2. Aktivitas enzim protease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) dengan rumus :  12 Keterangan : UA : Unit aktivitas enzim (Unit/ml tirosin) Asp : Nilai absorbansi sampel Ast : Nilai absorbansi standart Abl : Nilai absorbansi blanko P : Faktor pengenceran T : Waktu inkubasi 3.3.3. Pengolahan Biji Kopi Hingga Menjadi Kopi Bubuk Tahap pertama dilakukan penimbangan green beans kopi sebanyak 1 kg. Selanjutnya dilakukan 3 perlakuan yaitu perlakuan kontrol, perlakuan tanpa penambahan enzim protease biduri hanya dilakukan hidrolisis dengan air selama 6, 12 dan 18 jam dan perlakuan hidrolisis dengan enzim biduri 1% selama 6, 12 dan 18 jam. Fermentasi dan hidrolisis protein dilakukan dengan menggunakan wadah tertutup selama 6, 12 dan 18 jam. Setelah proses hidrolisis selesai, dilakukan pencucian dengan air hingga bersih. Setelah bersih, biji kopi dilakukan pengeringan. Pengeringan dilakukan dengan metode sun drying yang bertujuan untuk mengurangi kadar air hingga kurang dari 12% yaitu selama ± 48 jam. Setelah pengeringan, biji kopi dilakukan proses penyangraian dark medium roast (suhu 185ºC selama 15 menit). Proses ini bertujuan untuk memunculkan aroma khas kopi. Kopi sangrai yang dihasilkan selanjutnya dilakukan penggilingan untuk mengecilkan ukuran (60 mesh) sehingga dihasilkan kopi bubuk. Diagram alir proses pengolahan kopi dapat dilihat pada lampiran 3.3. 3.3.4. Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan faktor yaitu lama waktu hidrolisis (6, 12 dan 18 jam) dan penambahan enzim protease biduri 1%, dengan perlakuan kontrol sebagai pembanding. Konsentrasi enzim yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 1% didasarkan dari konsentrasi terbaik penelitian (Firdaus, 2019). Setiap perlakuan percobaan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Berikut merupakan formulasi perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 3.1.  13 Tabel 3. 1 kombinasi perlakuan dan lama waktu hidrolisis Perlakuan Lama Waktu (T; Jam) (F) 6 (T1) 12 (T2) 18 (T3) Hidrolisis (F1) F1T1 F1T2 F1T3 Hidrolisis + enzim biduri 1% (F2) F2T1 F2T2 F2T3 Keterangan : F0T0 : Biji kopi beras tanpa perlakuan F1T1 : Biji kopi beras hidrolisis tanpa enzim selama 6 jam F1T2 : Biji kopi beras hidrolisis tanpa enzim selama 12 jam F1T3 : Biji kopi beras hidrolisis tanpa enzim selama 18 jam F2T1 : Biji kopi beras hidrolisis dengan penambahan enzim selama 6 jam F2T2 : Biji kopi beras hidrolisis dengan penambahan enzim selama 12 jam F2T3 : Biji kopi beras hidrolisis dengan penambahan enzim selama 18 jam 3.4. Parameter Pengamatan Parameter pengamatan pada penelitian ini yaitu uji kualitas fisik, kimia dan sensori yang meliputi Nilai pH (AOAC, 2004) (Lampiran 3.4), total asam (AOAC, 1995) (Lampiran 3.5), kadar air (SNI-01-2354-2-2006) (Lampiran 3.6), kadar abu (SNI 01-2891-1992) (Lampiran 3.7), kadar kafein (Belay et al., 2008) (Lampiran 3.8), hedonik (Tarwendah et al., 2017) (Lampiran 3.9), uji efektivitas (De garmo, 1984) (Lampiran 3.10). 3.5.Analisis Data Data yang diperoleh pada penelitian ini yaitu kadar air, kadar abu dan kadar kafein. Data hedonik yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Data pengujian kadar air, kadar abu, nilai pH, total asam dan kadar kafein dianalisis menggunakan ANOVA (Analysis of Variance) dan dilanjutkan dengan uji beda DMRT (Duncan’s Multiple Range Test) pada taraf uji a ≤ 5%, selanjutnya data disajikan dalam bentuk tabel dan histogram.  BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Aktivitas Enzim Protease Biduri Crude Protease getah biduri yang digunakan diuji aktivitasnya menggunakan substrat kasein yang dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml ekstrak enzim. Pada penelitian ini, aktivitas enzim protease biduri yang dihasilkan sebesar 13,89 U/mL. Nilai aktivitas enzim tersebut bernilai lebih rendah daripada penelitian milik Witono et al., (2020) yang memiliki nilai aktivitas enzim Calotropin kasar dari getah biduri sebesar 15,04 U/mL. Menurut Witono (2013) besar kecilnya nilai aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa hal diantaranya adalah adanya perbedaan pH, suhu, media ekstraksi, teknik handling dan penyimpanan bahan baku. Dari hasil uji aktivitas enzim menunjukkan bahwa ekstrak kasar getah biduri mengandung enzim protease dalam keadaan aktif karena memiliki aktivitas yang dapat digunakan untuk menghidrolisis protein. Enzim protease biduri dapat digunakan untuk menghidrolisis biji kopi robusta asalan karena biji kopi mengandung protein sebanyak 11-15% (Farah, 2012). Enzim protease biduri mampu memecah protein menjadi ikatan pendek peptida dan asam-asam amino, semakin tinggi konsentrasi enzim maka semakin banyak pula jumlah asam amino yang ada akibat dari pemecahan ikatan peptida (Bulkaini et al., 2020). 4.2. Derajat Keasaman (pH) Bubuk Kopi Hasil perhitungan ANOVA menunjukkan bahwa perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama fermentasi berpengaruh nyata terhad ap derajat keasaman (pH) kopi bubuk robusta asalan yang dihasilkan, dengan rentang pH berkisar antara 5,50 sampai 6,10. Nilai derajat keasaman (pH) kopi bubuk robusta asalan sangrai hasil hidroliisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan Lampiran 4.2. 14 Gambar 4. 1 derajat keasaman (pH) kopi bubuk robusta asalan sangrai hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Gambar 4.1 menunjukkan bahwa nilai pH masing-masing sampel berturut- turut yakni 6.10; 5.53; 5.67; 5.58; 5.77; 5.50; 5.82. Diagram yang disajikan pada Gambar 4.1 menunjukkan bahwa nilai pH bubuk kopi robusta asalan dengan perlakuan hidrolisis tanpa penambahan enzim protease biduri cenderung menurun dengan bertambahnya waktu fermentasi, sedangkan sampel dengan penambahan enzim protease biduri memiliki nilai pH yang cenderung meningkat seiring dengan lama fermentasi. Hasil penelitian Paramartha et al., (2021) menunjukkan bahwa nilai pH pada bubuk kopi dengan penambahan enzim protease labu siam mengalami penurunan pH. Sari labu siam termasuk dalam golongan enzim protease eksopeptidase yang aktivitasnya dipengaruhi dengan adanya gugus sistein dan serin (Darmawati et al., 2023). Penurunan nilai pH terjadi apabila kandungan asam suatu bahan meningkat. Penurunan pH yang terjadi pada sampel tanpa penambahan enzim protease biduri terjadi karena adanya akumulasi asam-asam organik dan peningkatan jumlah proton H + akibat dari proses perendaman (Tawali et al., 2018). Nilai pH dipengaruhi oleh proses dekafeinasi. Pada saat proses dekafeinasi senyawa asam- asam volatile (Asetat, butirat, propionate dan valerat) yang mudah terurai akan terurai, sedangkan asam non-volatile seperti asam klorogenat akan mengalami dekomposisi menjadi asam kuinat dan larut dalam air. Larutnya asam kuinat menyebabkan peningkatan pH pada biji kopi (Tawali et al., 2018). Pada penelitian ini terjadi peningkatan nilai pH pada sampel dengan penambahan enzim protease biduri. Enzim protease biduri termasuk dalam amino eksopeptidase yang memecah gugus protein dari gugus terminal dan karboksi peptidase yang memotong peptida dari gugus karboksil terminal sehingga menghasilkan fragmen peptida dan asam amino rantai pendek (Witono, 2013). Hasil degradasi protein membentuk ikatan yang akan mengikat dua molekul asam amino disebut dengan ikatan dipeptida yang memiliki gugus -COOH dan NH 2. Zulfahmi et al., (2014) menyatakan bahwa penambahan EKN (Ekstrak Kulit Nanas) diketahui meningkatkan nilai pH dari 5.90-5.97. Hal tersebut terjadi karena adanya gugus hidrogen pada peptida yang akan membentuk air dengan adanya gugus OH, penambahan EKN akan menghidrolisis protein jaring ikat menjadi beberapa asam amino penyusunnya sehingga menghasilkan residu asam amino yang bersifat hidrofilik dan meningkatkan pH daging. Fuller & Rao, (2017) menyatakan bahwa tidak ada korelasi antara nilai pH dengan rasa asam yang terdapat di dalam kopi. 4.3. Total Asam Tertitrasi Hasil perhitungan ANOVA menunjukkan bahwa perlakuan hidrolisis dengan penambahan enzim protease biduri dan lama waktu hidrolisis berpengaruh tidak nyata terhadap kadar total asam tertitrasi kopi bubuk robusta asalan sangrai yang dihasilkan. Total asam tertitrasi kopi bubuk robusta asalan sangrai hasil hidrolisis dengan variasi penambahan enzim protease biduri dan lama waktu hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.2 dan Lampiran 4.3. Gambar 4. 2 Total asam tertitrasi kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Total asam tertitrasi terendah terdapat pada sampel kontrol dengan nilai 1.44%, sedangkan sampel dengan nilai total asam tertitrasi paling tinggi adalah sampel hidrolisis dengan penambahan enzim protease biduri selama 18 jam (1.95%). Gambar yang disajikan menunjukkan bahwa total asam tertitrasi meningkat seiring dengan semakin meningkatnya lama waktu hidrolisis. Hasil penelitian ini sesuai dengan Utama et al., (2022) menunjukkan bahwa kadar total asam tertitrasi kopi robusta terdekafeinasi dengan sari labu siam mengalami peningkatan seiring dengan lama waktu hidrolisis. Peningkatan nilai total asam tertitrasi disebabkan karena sari labu siam memiliki kandungan enzim protease yang mampu mengubah protein menjadi asam amino. Sari labu siam termasuk dalam golongan enzim protease eksopeptidase yang aktivitasnya dipengaruhi dengan adanya gugus sistein dan serin (Darmawati et al., 2023). Protein yang telah dihidrolisis akan membentuk asam amino sehingga kadar asam total mengalami peningkatan. Peningkatan total asam tertitrasi juga dapat terjadi karena adanya aktivitas Bakteri Asam Laktat (BAL). Pemecahan karbohidrat (gula) selama proses fermentasi akan menghasilkan asam asetat dan asam laktat sehingga semakin lama waktu fermentasi akan meningkatkan jumlah asam yang terakumulasi menyebabkan meningkatnya nilai total asam tertitrasi (Paramartha et al., 2021). 4.4. Kadar Air Bubuk Kopi Hasil perhitungan ANOVA menunjukkan bahwa perlakuan hidrolisis dengan penambahan enzim protease biduri dan variasi lama waktu hidrolisis berpengaruh nyata terhadap kadar air kopi bubuk sangrai robusta asalan yang dihasilkan. Sampel kontrol diketahui memiliki kadar air tertinggi yaitu 8.90, sedangkan kadar air terendah terdapat pada sampel F1T3. Kadar air kopi bubuk sangrai robusta asalan hsil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.3 dan Lampiran 4.4. Gambar 4. 3 Kadar air kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar air kopi bubuk sangrai robusta asalan cenderung mengalami penurunan. Sampel dengan perlakuan penambahan enzim protease biduri memiliki kadar air yang lebih tinggi daripada sampel tanpa penambahan enzim biduri. Hasil ini berbanding terbalik dengan hasil penelitian Paramartha et al., (2021) menunjukkan bahwa kadar air semakin meningkat seiring dengan penambahan sari labu siam yang mengandung enzim protease dan lama waktu hidrolisis. Hal tersebut terjadi karena terpisahnya komponen protein pada dinding sel sehingga air terdifusi masuk ke dalam jaringan biji kopi, sehingga semakin lama waktu hidrolisis kadar air juga semakin meningkat. Penurunan kadar air pada penelitian ini terjadi karena beberapa faktor seperti penjemuran atau pengeringan pada penelitian ini dilakukan selama 48 jam menggunakan sinar matahari, sedangkan pada penelitian milik Paramartha et al., 2021) pengeringan dilakukan dengan cabinet dryer selama 12 jam pada suhu 60℃. Faktor lainnya adalah metode penyangraian. Pada penelitian ini penyangraian dilakukan pada suhu 185℃ selama 15 menit sedangkan pada penelitian pendahulu dilakukan pada suhu 200℃ selama 12 menit. Menurut SNI kopi bubuk nomor 01-3542-2004 kadar air maksimal adalah sebesar 7%. Berdasarkan hasil penelituian menunjukkan bahwa kadar air yang diperoleh masuk terpenuhi dalam batasan maksimal. 4.5. Kadar Abu Bubuk Kopi Hasil perhitungan ANOVA menunjukkan bahwa perlakuan hidrolisis dengan variasi penambahan enzim protease biduri dan lama waktu hidrolisis yang digunakan berpengaruh nyata terhadap kadar abu kopi bubuk sangrai robusta asalan yang dihasilkan. Sampel kontrol diketahui memiliki nilai kadar abu paling tinggi dibandingkan dengan yang lainnya yaitu sebesar 5.27%, sedangkan sampel dengan kadar abu terendah adalah sampel hidrolisis tanpa penambahan enzim pada lama waktu hidrolisis 18 jam. Kadar abu kopi bubuk sangrai robusta asalan hsil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan Lampiran 4.5. Gambar 4. 4 Kadar abu kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Kadar abu kopi bubuk sangrai robusta asalan yang dihasilkan cenderung menurun seiring dengan lama waktu hidrolisis dan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri. Hasil penelitian ini menujukkan kadar abu kopi bubuk sangrai robusta asalan paling rendah adalah 3,08, pada penelitian Paramartha et al., (2021) menunjukkan bahwa perlakuan dengan penambahan enzim protease dari sari labu siam memiliki kadar abu paling rendah yaitu 2.70. Penurunan kadar abu terjadi karena selama proses perendaman terjadi pemecahan dinding sel akibat pemecahan protein menyebabkan komponen mineral yang larut dalam air akan keluar dari sel setelah proses pencucian dan menyebabkan komponen mineral seperti natrium, kalium, kalsium, magnesium dan mineral non logam menurun jumlahnya (Paramartha et al., 2021). Menurut SNI kopi bubuk nomor 01-3542- 2004 bahwa kadar abu maksimal sebesar 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar abu yang diperoleh masih terpenuhi dalam batasan maksimal. 4.6. Kadar Kafein Bubuk Kopi Kafein merupakan senyawa alkaloid yang banyak dijumpai secara alami pada biji kopi, daun teh, dan lain-lain. Hasil analisa kadar kafein kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.5 dan Lampiran 4.6. Gambar 4. 5 Kadar kafein kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Hasil analisa menunjukkan bahwa sampel kontrol memiliki kadar kafein paling tinggi yaitu sebayak 2.49%, sedangkan kadar kafein paling rendah terdapat pada sampel F2T2 (1.05%) yaitu sampel dengan perlakuan penambahan enzim protease biduri dengan lama waktu hidrolisis 12 jam. Hasil perhitungan ANOVA meunjukkan bahwa perlauan penambahan enzim protease biduri dan variasi lama waktu hidrolisis berpengaruh nyata terhadap kadar kafein kopi bubuk sangrai robusta asalan yang dihasilkan. Kadar kafein pada penelitian ini lebih tinggi apabila dibandingkan dengan kadar kafein pada penelitian Firdaus, (2019) dengan kadar kafein paling rendah adalah 0,66%. Perbedaan jumlah kadar kafein meskipun dengan jenis enzim yang sama dapat terjadi karena perbedaan jenis bahan yang digunakan dan pemberian perlakuan (Paramartha et al., 2021). Kafein pada biji kopi terletak pada bagian dinding sel dan sebagian terdapat dalam sitoplasma. Kafein yang terletak pada dinding sel biji kopi terikat sebagai senyawa alkaloid dalam bentuk senyawa garam kompleks kalium klorogenat dengan ikatan ionik (Afriliana, 2018). Senyawa kafein dalam bentuk ini sukar larut dalam air. Pemberian enzim protease menurunkan kadar kafein karena terjadi pemecahan protein pada dinding sel biji kopi sehingga kafein terbebas dan mudah larut dalam air (Paramartha et al., 2021). Penurunan kadar kafein semakin meningkat karena senyawa kafein yang terdapat pada sitoplasma dalam keadaan bebas sehingga kandungan kafein akan keluar sel dan larut dalam air. Senyawa kafein yang bebas akan lebih mudah berdifusi melewati dinding sel dan larut dalam air. Semakin lama waktu fermentasi atau perendaman maka semakin banyak kafein yang larut di air sehingga kadar kafein semakin menurun (Tawali et al., 2018). Menurut SNI kopi bubuk nomor 01-3542-2004 bahwa kadar kafein maksimal sebesar 2%, dengn begitu dari hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar kafein yang diperoleh masih memenuhi dalam batas maksimal. 4.7. Uji Organoleptik Seduhan Bubuk Kopi 4.7.1. Warna Tingkat kesukaan panelis terhadap warna kopi dengan variasi penambahan enzim protease biduri dan lama waktu hidrolisis yang dihasilkan yaitu 4.16 untuk perlakuan kontrol, 4.12 untuk sampel F1T1, 4.3 untuk sampel F1T2, 4.16 untuk sampel F1T3, 4.24 untuk sampel F2T1, 4.36 untuk sampel F2T2, dan 4.44 untuk sampel F1T3. Nilai rata-rata kesukaan warna seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.6 dan Lampiran 4.7. Gambar 4. 6 Nilai kesukaan warna seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Skor panelis terhadap warna dari seduhan kopi menunjukkan bahwa kopi dengan penambahan enzim protease biduri dengan lama waktu hidrolisis selama 18 jam mendapatkan skor tertinggi yaitu 4.44. Berdasarkan Gambar 4.6 panelis cenderung menyukai kopi dengan warna yang gelap. Lama waktu perendaman menyebabkan terjadinya oksidasi pada biji kopi robusta sehingga terjadi perubahan nilai kecerahan warna pada biji kopi robusta (Paramartha et al., 2021). Warna pada seduhan kopi dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti proses roasting, dan adanya reaksi mailard yang dipicu adanya kandungan gula dan protein yang terkandung dalam kopi yang dihasilkan (Tawali et al., 2018). Penambahan enzim protease biduri mempengaruhi warna yang dihasilkan karena terjadi pemutusan ikatan peptide oleh enzim protease yang menghasilkan gugus amina. Gugus amina diketahui sebagai bahan pereaksi maillard, gugus amina protein akan berikatan dengan gugus aldehid atau keton dari gula pereduksi sehingga membentuk senyawa melanoidin. Semakin lama waktu hidrolisis yang dilakukan maka semakin meningkat jumlah asam amino dan semakin banyak terbentuknya senyawa melanoidin (Witono et al., 2014). 4.7.2. Aroma Aroma merupakan bau yang keluar setelah kopi diseduh (Afriliana, 2018). Berdasarkan uji organoleptik yang dilakukan tingkat kesukaan panelis terhadap aroma seduhan kopi robusta asalan dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.7 dan Lampiran 4.8. Gambar 4. 7 Nilai kesukaan aroma seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Hasil dari uji organoleptik menunjukkan bahwa panelis menyukai aroma seduhan kopi pada sampel dengan penambahan enzim dengan lama waktu hidrolisis 12 jam (F2T2). Perlakuan penambahan enzim protease biduri disukai karena senyawa volatil yang berpengaruh pad a aroma kopi yang dihasilkan terbentuk dari adanya proses degradasi asam amino serta reaksi-reaksi lain seperti Maillard, degradasi trigonelin, degradasi gula dan senyawa fenolik. Reaksi tersebut akan menghasilkan atau meningkatkan senyawa volatil yang mud ah menguap sehingga tercium oleh hidung seperti golongan aldehid, keton, dan ester (Tenri Fitriyah et al., 2021). 4.7.3. Rasa Rasa merupakan komponen utama dalam seduhan kopi karena meliputi cita rasa (Taste) yang dikenali oleh lidah dan aroma yang dikenali oleh indra penciuman secara keseluruhan (Afriliana, 2018). Nilai kesukaan terhadap parameter rasa seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.8 dan Lampiran 4.9. Gambar 4. 8 Nilai kesukaan rasa seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Skor panelis terhadap tingkat kesukaan rasa menunjukkan bahwa sampel F2T2 memiliki nilai kesukaan paling tinggi yaitu 4.14. Berdasarkan Gambar 4.8 panelis menyukai kopi dengan rasa yang sedikit bitter. Menurut Tenri Fitriyah et al., (2021) perbedaan tingkat kesukaan panelis terhadap rasa kopi disebabkan karena kandungan protein yang berperan sebagai pembentuk rasa pahit pada kopi yang disangrai. Perlakuan penambahan enzim protease biduri diketahui dapat menurunkan kadar kafein. Kafein merupakan salah satu senyawa yang berkontribusi terhadap rasa pahit. Asam klorogenat dan trigonelline juga berkontribusi terhadap rasa pahit yang ada dalam kopi. Perlakuan dekafeinasi dengan hidrolisis dan penambahan enzim mengakibatkan sebagian senyawa asam klorogenat terurai dan larut sehingga kadarnya dalam biji menurun (Paramartha et al., 2021), trigonelline akan terdekomposisi selama penyangraian (Tenri Fitriyah et al., 2021). Perlakuan hidrolisis selama 12 jam dengan penambahan enzim menghasilkan kopi yang tidak pahit karena kandungan kafein, asam klorogenat dan trigonelline yang rendah (Tenri Fitriyah et al., 2021). 4.7.4. Acidity Acidity merupakan citarasa kopi yang digambarkan sebagai rasa asam yang enak seperti rasa buah segar, atau masam yang tidak enak (Afriliana, 2018). Nilai kesukaan panelis terhadap parameter Acidity seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.9 dan Lampiran 4.10. Gambar 4. 9 Nilai kesukaan Acidity seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Hasil uji hedonik Acidity menunjukkan bahwa sampel dengan tingkat kesukaan paling tinggi adalah sampel F2T1 dengan nilai rata-rata 4.02. Hal tersebut menunjukkan bahwa panelis paling menyukai sampel dengan perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama perendaman 6 jam. Keasaman dari kopi dipengaruhi oleh asam-asam organik seperti asam asetat, format, malat, sitrat, dan laktat, serta asam klorogenat dan asam kuinat (Farah, 2012). Penambahan enzim protease biduri dalam proses hidrolisis dapat memecah kalium klorogenat sehingga asam klorogenat dapat terlepas dari kafein dan larut air. Perlakuan penambahan enzim dan hidrolisis selama 6 jam disukai karena menghasilkan kopi dengan keasaman pada tingkat medium. 4.7.5. Body Body merupakan tingkat kepekatan rasa dari seduhan kopi yang ditentukan oleh senyawa-senyawa yang larut air saat diseduh seperti golongan karbohidrat, aromatik, alkaloids, dan minyak (Afriliana, 2018). Nilai kesukaan panelis terhadap Body seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.10 dan Lampiran 4.11. Gambar 4. 10 Nilai kesukaan body seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Hasil organoleptik menunjukkan bahwa sampel dengan nilai kesukaan tertinggi yaitu sebesar 4.52 adalah sampel F2T2. Hal tersebut menunjukkan bahwa panelis paling menyukai sampel dengan perlakuan penambahan enzim protease biduri dengan lama hidrolisis selama 12 jam. Sampel ini dinilai memiliki body yang tidak terlalu pekat. Atribut body dipengaruhi oleh adanya senyawa- senyawa seperti golongan karbohidrat, senyawa aromatik, alkaloid, dan lipid (Afriliana, 2018). 4.7.6. After Taste After taste didefiniskan dengan lama bertahannya suatu rasa dan aroma poitif yang berasal dari langit-langit belakang mulut dan bertahan setelah kopi dibuang atau ditelan (Afriliana, 2018). Nilai uji kesukaan panelis terhadap After taste seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.10 dan Lampiran 4.11. Gambar 4. 11 Nilai kesukaan After Taste seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Skor rata-rata kesukaan panelis menunjukkan bahwa sampel F2T2 merupakan sampel dengan nilai kesukaan After Taste tertinggi yaitu 4.24. Sampel F2T2 adalah sampel dengan perlakuan hidrolisis dengan penambahan enzim protease biduri selama 12 jam. Menurut beberapa panelis sampel ini memiliki durasi After Taste yang lama dan memiliki sedikit kesan smokey. Afriliana, (2018) menyatakan bahwa jika after tase berdurasi pendek atau tidak nyaman di mulut, maka nilai yang dihasilkan rendah. 4.7.7. Keseluruhan Keseluruhan (overall) merupakan penilaian yang mencerminkan aspek keseluruhan sampel kopi yang dievaluasi dengan positif. Kopi dengan skor yang lebih tinggi dimaknai sebagai kopi dengan mutu yang lebih baik sehingga lebih mampu memenuhi harapan konsumen. Nilai keseluruhan merupakan kesimpulan dari beberapa penilaian atribut uji cita rasa kopi dengan mempertimbangkan penerimaan atau kesan positif (Afriliana, 2018). Hasil uji organoleptik keseluruhan seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 4.12 dan Lampiran 4.13. Gambar 4. 12 Nilai kesukaan keseluruhan seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan hasil hidrolisis dengan variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Skor uji keseluruhan menunjukkan bahwa sampel dengan nilai uji tertinggi adalah sampel F2T2 yaitu sampel dengan perlakuan penambahan enzim protease biduri dengan lama waktu hidrolisis 12 jam. Sampel ini dinilai sebagai sampel kopi yang lebih baik daripada sampel kopi lainnya sesuai dengan penilaian panelis pada beberapa atribut lainnya. Sampel kopi dengan perlakuan hidrolisis dan penambahan enzim selama 12 jam dinilai mampu memenuhi harapan konsumen ditunjukkan dengan tingginya nilai atribut overall atau keseluruhan. Menurut beberapa panelis sampel kopi dengan perlakuan penambahan enzim dan hidrolisis selama 12 jam memiliki rasa yang flavourfull dan sedikit bitter, body yang tidak terlalu pekat tetapi bold dengan acidity rendah, serta memiliki long after taste. 4.8.Uji Efektifitas Perlakuan Terbaik Uji efektifitas dilakukan dengan metode pembobotan De Garmo (1984). Pengujian ini digunakan untuk menentukan perlakuan terbaik berdasarkan indeks efektifitas. Uji efektifitas dibagi dalam 2 kelompok. Kelompok A terdiri dari parameter dengan nilai rata-rata semakin rendah semakin baik, kelompok B terdiri dari parameter dengan nilai rata-rata semakin tinggi semakin baik. Nilai efektifitas yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1. dan Lampiran 4.14. Tabel 4. 1 uji efektifitas seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan yang dihasilkan dari variasi perlakuan penambahan enzim protease biduri dan lama hidrolisis Sampel Nilai Hasil Total F1T1 0.329473684 F1T2 1.17573844 F1T3 1.429998544 F2T1 0.798381593 F2T2 2.62627983 F2T3 2.016804127 Nilai efektifitas pada seduhan kopi bubuk sangrai robusta asalan yang tertinggi adalah pada perlakuan penambahan enzim protease biduri dengan lama waktu hidrolisis 12 jam dengan nilai efektifitas sebesar 2.6263. Sampel tersebut memiliki nilai pH 5.77, kadar air 6.27%, kadar abu 4.16%, kadar kafein 1.05%, uji oranoleptik warna 4.36, aroma 4.68, rasa 4.14, acidity 3.84, body 4.52, after taste 4.24, dan keseluruhan 4.46. Berdasarkan nilai efektifitas sampel kopi bubuk sangrai hasil hidrolisis selama 12 jam dengan penambahan enzim protease biduri merupakan perlakuan terbaik karena menurut panelis sampel ini lebih disukai dan menurut kadar kafeinnya sampel ini memiliki kadar kafein paling rendah jika dibandingkan dengan sampel lain. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa sampel F2T2 secara keseluruhan memiliki mutu yang lebih baik dari sampel kontrol.  BAB 5. PENUTUP 5.1. Kesimpulan Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah : 1. Pengolahan kembali biji kopi beras robusta asalan dengan variasi lama waktu hidrolisis dan penambahan enzim protease biduri berpengaruh nyata terhadap nilai pH, kadar air, kadar abu, dan kadar kafein. Nilai pH, kadar air, kadar abu dan kadar kafein cenderung mengalami penurunan seiring dengan lama waktu hidrolisis. 2. Perlakuan terbaik menurut tingkat kesukaan adalah perlakuan dengan penambahan enzim protease biduri dengan lama waktu hidrolisis 12 jam. Hal ini sesuai dengan hasil uji efektifitas yang menyatakan bahwa sampel dengan variasi penambahan enzim dan hidrolisis selama 12 jam memiliki nilai efektifitas paling tinggi yaitu 2.6263. Sampel ini paling disukai oleh panelis karena sampel ini dinilai balance, memiliki rasa yang flavourfull dan sedikit bitter, body yang tidak terlalu pekat tetapi bold dengan acidity rendah, serta memiliki long after taste. Berdasarkan mutunya sampel ini memiliki kadar kafein paling rendah yaitu sebesar 1.05% dari control 2.49%. 5.2. Saran Pengujian kadar air sebelum biji kopi disangrai perlu dilakukan untuk memastikan kadar air pada biji kopi yang dijemur sudah seragam. Pengujian aktivitas mikroba perlu dilakukan untuk memastikan bahwa perubahan mutu terjadi karena penambahan enzim protease biduri. Perlakuan pendahuluan dapat dilakukan proses perebusan biji kopi untuk mensterilkan biji kopi yang digunakan, sehingga data akhir yang diperoleh dapat dipastikan benar-benar terjadi karena adanya penambahan enzim protease biduri. 32  Daftar Pustaka Afriliana, A. (2018). Teknologi Pengolahan Kopi Terkini (First). Deepublish. Afriliana, A., Pratiwi, D., Giyarto, Belgis, M., Harada, H., Yushiharu, M., & Taizo, M. (2019). Volatile Compounds Changes in Unfermented Robusta Coffee by Re-Fermentation Using Commercial Kefir. Nutrition & Food Science International Journal, 8(4). https://doi.org/10.19080/nfsij.2019.08.555745. Aklimawati, L., Yusianto, & Surip Mawardi, dan. (2014). Karakteristik mutu dan agribisnis kopi Robusta di lereng gunung Tambora Sumbawa Karakteristik Mutu dan Agribisnis Kopi Robusta di Lereng Characteristics of Quality Profile and Agribusiness of Robusta Coffee in Tambora Mountainside, Sumbawa. In Pelita Perkebunan (Vol. 30, Issue 2). Budiman, I., Wahyudi, F., Meilina, H., & Teknik Kimia, J. (2021). Studi Fermentasi Biji Kopi Menggunakan Enzim Proteolitik. Serambi Engineering, VI(4). Bulkaini, B., Wulandani, B. R. D., Miwada, IN. S., Dami Dato, T. O., & Dewi, L. (2020). Utilization of Biduri Juice (Calotropis gigantea) in The Process of Buffalo Milk Coagulation on Quality of Soft Cheese. Jurnal Biologi Tropis, 20(3), 485–491. https://doi.org/10.29303/jbt.v20i3.2247. Darmawati, S., Kartika, A. I., Aulia, D. I., Handayani, W., & Aziz, I. R. (2023). Microstructural and Protein Subunit Analysis: The Effect of Protease from Chayote, Pineapple Peel and Biduri Leaves as Natural Tenderizer on Mutton, Beef and Buff. Trends in Sciences, 20(3). https://doi.org/10.48048/tis.2023.6519. Drefin Oktadina, F., Argo, D., & Bagus Hermanto, M. (2013). Pemanfaatan Nanas (Ananas Comosus L. Merr) untuk Penurunan Kadar Kafein dan Perbaikan Citarasa Kopi (Coffea Sp) dalam Pembuatan Kopi Bubuk. In Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem (Vol. 1, Issue 3). Ananas Comosus L. Merr. Farah, A. (2012). Coffee Constituents. In Y.-F. Chu (Ed.), Coffee: Emerging Health Effects and Disease Prevention (First). Blackwell Publishing Ltd. Febrianto, N. A., & Zhu, F. (2023). Coffee bean processing: Emerging methods and their effects on chemical, biological and sensory properties. In Food Chemistry (Vol. 412). Elsevier Ltd. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.135489. Firdaus, D. I. (2019). Peningkatan Mutu Kopi Robusta Melalui Penambahan Enzim Protease Dari Tanaman Biduri (Calotropis gigantea) Selama Fermentasi. Skripsi: Universitas Jember. Fuller, M., & Rao, N. Z. (2017). The Effect of Time, Roasting Temperature, and Grind Size on Caffeine and Chlorogenic Acid Concentrations in Cold Brew Coffee. Scientific Reports, 7(1), 1–9. https://doi.org/10.1038/s41598-017- 18247-4. Gautam, S. S., Dash, S. K. V, Goyal, A. K., & Rath, G. (2010). Comparative study of extraction, purification and estimation of Comparative study of extraction, purification and estimation of bromelain from stem and fruit of pineapple plant bromelain from stem and fruit of pineapple plant. In The Thai Journal of Pharmaceutical Sciences (Vol. 34, Issue 2). Merzaia, A. B., Riaz, H., Rehman, R., Nisar, S., & Azeem, M. W. (2017). A review of toxicity, therapeutic and biological activities of Calotropis. IJCBS, 11, 58. www.iscientific.org/Journal.html. Murthy, P. S., P, S. H., K, B., & Kusumoto, K. I. (2019). Modulation of coffee flavor precursors by Aspergillus oryzae serine carboxypeptidases. LWT, 113. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.108312 Paramartha, D. N. A., Sulastri, Y., Widyasari, R., & Nofrida, R. (2021). Prosiding SAINTEK Pengaruh Konsentrasi dan Lama Perendaman Dalam Sari Labu Siam (Sechium edule) Terhadap Dekafeinasi Kopi Robusta. Prosiding Saintek LPPM Universitas Mataram, 4, 93–105. Tawali, A. B., Abdullah, N., & Wiranata, B. S. (2018). The Influence of Fermentation Using Bacteria Lactic Acid Yoghurt to the Flavor of Coffe  Robusta (Coffea robusta). Canrea Journal: Food Technology, Nutritions and Culinary Journal, 1(1), 90–97. Tenri Fitriyah, A., Kape, D., & Retno Utami, R. (2021). Organoleptic Quality Analysis of Bittuang Toraja Arabica Coffee (Coffea arabica) Powder. Jurnal Industri Hasil Perkebunan, 16(1), 72–82. Utama, Q. D., Nyoman Adi Paramartha, D., Widyasari, R., & Nurul Aini, dan. (2022). Decaffeination of Lombok Robusta Coffee (Coffea canephora) using Chayote (Sechium edule) Juice. Pro Food (Jurnal Ilmu Dan Teknologi Pangan), 8(1), 77–87. http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood Widaningsih, R. (2022). OUTLOOK KOPI 2022 Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian i OUTLOOK KOPI Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian. In Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian. Sekretariat Jenderal- Kementrian Pertanian. Witono, Y. (2013). Enzim Biduri : Agen Aktif Potensial untuk Proses Pangan. Pustaka Radja. Witono, Y., Maryanto, M., Taruna, I., Masahid, A. D., Cahyaningati, K. (2020). Activity of Protein Hydrolysates Common Barb Fish (Rasbora jacobsoni) from Hydrolysis by Calotropin and Papain Enzymes. In Aktivitas Jurnal Agroteknologi (Vol. 14, Issue 01). Witono, Y., Taruna, I., Siti Widrati, W., & Ratna, A. (2014). Enzymatic Hydrolysis of Low Economic Value Fishes using Biduri’s Protease. Jurnal Teknologi Dan Industri Pangan, 25(2), 140–145. https://doi.org/10.6066/jtip.2014.25.2.140. Zulfahmi, M., Budi Pramono, Y., & Hintono, A. (2014). Pengaruh Marinasi Ekstrak Kulit Nenas pada Daging Itik Tegal Betina Afkir terhadap Aktivitas Antioksidan dan Kualitas Kimia. Jurnal Aplikasi Teknologi Pangan, 3(2), 46–48. www.journal.ift.or.id.  LAMPIRAN DIAGRAM ALIR PENELITIAN Lampiran 3. 1 Proses eskstraksi enzim protease biduri Getah biduri 140 ml Buffer phospat 0,05 M pH 7 (140 Pencampuran ml) Sentrifugasi 4000 rpm (T : 4ºC, t: 10 menit) Pemisahan Pellet Enzim protease biduri Gambar 3. 1 Ekstraksi ekstrak kasar enzim protease biduri. (Omotoyinbo dan Sanni, 2017), dimodifikasi 36  37 Lampiran 3. 2 uji aktivitas enzim protease biduri 0,5 ml Buffer 0,1 ml enzim + 0,5 phospat pH 7 ml kasein 1% (b/v) Inkubasi (T : 37ºC, t :10 menit) 1 ml TCA 0,1 M Pencampuran Sentrifugasi 4000 rpm (T : 4ºC, t: 10 menit) Supernatan 2,5 ml Na2 CO3 0,4 M + 0,5 ml Pengambilan 0,75 ml Pereaksi Follin (1:2) Inkubasi (T : 37ºC, t :20 menit) Pembacaan spektrofotometer λ : 670 nm Gambar 3. 2 Produksi ekstrak kasar enzim protease biduri (Walter, 1984) dimodifikasi.  38 Lampiran 3. 3 Proses produksi kopi robusta bubuk asalan Biji kopi beras asalan robusta Sortasi Penimbangan Biji kopi beras asalan 1,5 kg Air 200%, enzim Hidrolisis (12, calotropin Kontrol 24, 36, dan 48 1% jam) Air Inkubasi (12, 24, (v/v) 200% 36, dan 48 jam) (v/v) T : ± 26 ℃ Air mengalir Pencucian Limbah pencucian Biji kopi asalan basah Pengeringan matahari (hingga KA 12%) t : ± 48 jam Penyangraian (t : 15 menit, T: 185 ℃) Grinding Kopi bubuk robusta asalan Gambar 3. 3 Diagram alir proses pengolahan kopi (Firdaus, 2014) dimodifikasi.  39 PROSEDUR ANALISIS Lampiran 3. 4 Nilai pH (AOAC, 2004) Sejumlah 10 gr kopi bubuk diencerkan dengan penambahan 100 ml aquades, lalu dilakukan pengadukan hingga homogen. Nilai pH diukur dengan menempatkan elektroda pada sampel dan nilai pH dapat dilihat pada layar pH meter yang sebelumnya telah dikalibrasi dengan buffer pH 7 dan buffer 4. Lampiran 3. 5 Total Asam (AOAC, 1995) Analisis total asam dilakukan menggunakan metode titrasi dengan cara pengambilan 5 gr sampel yang diencerkan dengan menggunakan aquadest 50 ml, kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring. Sampel yang telah disaring dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan ke dalam aquades. Sampel yang diencerkan diambil sebanyak 5 ml dan ditambahkan 2 tetes fenolftalein 1%, setelah itu dilanjutkan dengan proses titrasi. Titrasi dilakukan dengan menggunakan larutan NaOH 0,1N sampai timbul menjadi warna merah muda. Total asam tertitrasi diasumsikan sebagai total asam laktat dan dihitung menggunakan rumus: Lampiran 3. 6 Uji Kadar Air (SNI-01-2354-2-2006) Uji kadar air dilakukan dengan mengacu pada SNI dengan metode gravimetri. Langkah pertama adalah memasukkan cawan kosong ke dalam oven selama 2 jam. Setelah 2 jam cawan kosong dipindahkan dalam desikator selama 30 menit dan dilakukan penimbangan. Cawan kosong yang telah ditimbang selanjutnya diisi dengan sampel sebanyak ± 2 gram. Cawan berisi sampel kemudian dimasukkan ke dalam oven suhu 105℃ selama 24 jam, Selanjutnya cawan berisi sampel yang telah di oven ditimbang. Hasil penimbangan kemudian dihitung dengan rumus sebagai berikut: w = berat krus kosong (g) = bobot krus + sampel awal (g)  40 = bobot krus + sampel kering (g) Lampiran 3. 7 Uji Kadar Abu (SNI 01-2891-1992) Uji kadar abu dilakukan dengan mengacu pada SNI 01-2891-1992. Tahap pertama yang dilakukan yaitu menimbang sampel sebanyak 2-3 g ke dalam sebuah cawan porselen yang telah diketahui bobotnya. Kemudian dilakukan pengarangan di atas nyala pembakar, lalu proses pengabuan dalam tanur listrik pada suhu maksimum 550ºC sampai pengabuan sempurna. Setelah itu dilakukan pendinginan dalam desikator dilanjut dengan penimbangan sampai bobot tetap. Kemudian dilakukan perhitungan dengan rumus sebagai berikut: w = bobot sampel sebelum diabukan, dalam g = bobot sampel + cawan sesudah diabukan, dalam g = bobot cawan kosong, dalam g Lampiran 3. 8 Uji Kadar Kafein (Belay et al., 2008) Analisis kafein dilakukan dengan menggunakan metode Belay et al., (2007). Langkah pertama yang dilakukan penimbangan dengan teliti sebanyak 50 mg sampel kopi dan dilarutkan dalam 10 ml kloroform. Selanjutnya dilakukan pencampuran menggunakan stirrer selama 15 menit kemudian disaring sehingga menghasilkan filtrat 1. Berikutnya dilakukan penambahan 10 ml kloroform pada residu penyaringan 1 dan di stirrer selama 15 menit, kemudian disaring sehingga menghasilkan filtrat 2. residu dari filtrat 2 kemudian ditambahkan dengan kloroform sebanyak 5 ml dan di aduk menggunakan stirrer selama 15 menit, kemudian disaring sehingga menghasilkan filtrat 3. Hasil dari filtrat 1,2 dan 3 kemudian ditera sebanyak 25 ml dengan kloroform, dan selanjutnya sampel diuapkan dalam waterbath pada suhu 65℃ selama 24 jam. Filtrat yang sudah diuapkan selanjutnya ditambahkan dengan CaCO 3 sebanyak 1 gram dan aquades sebanyak 25 ml. Kemudian sampel dipanaskan dengan hotplate selama 10 menit dihitung apabila suhu sudah mencapai 90℃. Setelah 10 menit sampel kemudian didinginkan dan disaring dengan kertas saring.  41 Filtrat yang dihasilkan kemudian ditera dengan aquades sebanyak 25 ml dan dilakukan pembacaan dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 285 nm. Pada pembuatan larutan standar kafein, langkah pertama yang dilakukan adalah menimbang standar kafein dengan konsentrasi 1 mg/ml sebanyak 100 ml. Kemudian standar kafein diambil sebanyak 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.75, 5 dan 7.5 ml dan masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml dan ditera dengan aquades. Selanjutnya absorbansi standar kafein dideteksi kadar kafeinnya dengan alat spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 281 nm. Lampiran 3. 9 Uji Hedonik (Tarwendah et al., 2017) Pengujian organoleptik dilakukan dengan metode hedonik untuk mengetahui tingkat kesukaan atau kelayakan suatu poduk agar dapat diterima panelis. Uji kesukaan meliputi rasa, aroma dan warna dengan tingkat kesukaan yaitu 5 (sangat suka), 4 (suka), 3 (agak suka), 2 (tidak suka), 1 (sangat tidak suka). Pengujian hedonik dilakukan oleh 60 orang panelis tidak ahli. Lampiran 3. 10 Uji efektifitas (De Garmo, 1984) Pengujian dilakukan dengan pengelompokan parameter menjadi dua kelompok. Kelompok A terdiri dari parameter yang nilainya semakin rendah semakin bagus, sedangkan kelompok B terdiri dari parameter organoleptic yang nilainya semakin besar semakin bagus. Selanjutnya d ilakukan penentuan bobot nilai (BN) pada masing-masing parameter sesuai dengan kepentingan masing- masing parameter dari 0-1. Perhitungan nilai efektifitas (NE) dilakukan dengan rumus: Nilai efektifitas selanjutnya digunakan untuk menghitung nilai hasil dengan rumus:  42 DATA HASIL ANALISIS Lampiran 4. 1 aktivitas enzim protease biduri Nilai absorbansi Aktivitas Ulangan enzim Rata-Rata Blanko Tirosin Biduri (U/mL) 1 0.178 0.401 2.078 17.89237668 2 0.156 0.456 2.001 12.915 13.89868357 3 0.123 0.485 2 10.88867403 Contoh perhitungan : Aktivitas enzim Lampiran 4. 2 Hasil uji dan ANOVA Nilai pH Ulangan Rata-Rata Perlakuan 1 2 3 Kontrol 6.1 6.1 6.1 6.1 F1T1 5.35 5.6 5.65 5.533333333 F1T2 5.4 5.85 5.5 5.583333333 F1T3 5.35 5.55 5.6 5.5 F2T1 5.6 5.65 5.75 5.666666667 F2T2 5.55 5.95 5.8 5.766666667 F2T3 5.8 5.85 5.8 5.816666667 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: nilai ph Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model ,248 a 2 ,124 33,196 ,003 Intercept 181,447 1 181,447 48601,945 ,000 perlakuan ,248 2 ,124 33,196 ,003 Error ,015 4 ,004 Total 228,491 7 Corrected Total ,263 6 a. R Squared = ,943 (Adjusted R Squared = ,915)  43 Lampiran 4. 3 Hasil uji dan ANOVA total asam tertitrasi Ulangan Rata-rata Perlakuan 1 2 3 Kontrol 1.55 1.37 1.40 1.439004 F1T1 1.70 1.32 1.75 1.589016 F1T2 2.20 1.63 1.63 1.822368 F1T3 1.77 1.75 1.93 1.816812 F2T1 1.73 1.93 1.73 1.800144 F2T2 1.93 1.93 1.93 1.933488 F2T3 1.93 2.00 1.93 1.955712 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: total asam Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model ,159 a 2 ,080 6,396 ,057 Intercept 15,484 1 15,484 1245,349 ,000 perlakuan ,159 2 ,080 6,396 ,057 Error ,050 4 ,012 Total 22,033 7 Corrected Total ,209 6 a. R Squared = ,762 (Adjusted R Squared = ,643) Lampiran 4. 4 Hasil uji dan ANOVA kadar air Ulangan Rata-rata Perlakuan 1 2 3 Kontrol 8.088393049 8.229115911 10.36882394 8.8954443 F1T1 6.264637002 6.416913947 7.013792366 6.565114438 F1T2 5.864701237 5.861578198 6.88517612 6.203818519 F1T3 5.740516013 5.839300758 6.044101317 5.874639363 F2T1 6.664902065 6.397253862 6.787859459 6.616671795 F2T2 6.393083943 6.267836381 6.137222548 6.266047624 F2T3 6.738385785 4.618986803 6.645384411 6.000918999 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: kadar air Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 6,007 a 2 3,004 27,396 ,005  44 Intercept 275,033 1 275,033 2508,661 ,000 Perlakuan 6,007 2 3,004 27,396 ,005 Error ,439 4 ,110 Total 314,409 7 Corrected Total 6,446 6 a. R Squared = ,932 (Adjusted R Squared = ,898) Lampiran 4. 5 Hasil uji dan ANOVA kadar abu Ulangan Rata-rata Perlakuan 1 2 3 Kontrol 5.290720828 5.262842594 5.245688578 5.266417333 F1T1 4.424028799 4.334091181 4.741606399 4.499908793 F1T2 3.989797084 4.034327943 4.105132608 4.043085878 F1T3 3.687546607 3.709439234 4.016571126 3.804518989 F2T1 4.509376363 4.034327943 3.835511145 4.12640515 F2T2 4.125493291 4.166266603 4.186575654 4.159445183 F2T3 3.543835672 3.966278284 3.920669056 3.810261004  45 Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: kadar abu Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 1,202 a 2 ,601 7,482 ,044 Intercept 108,811 1 108,811 1354,490 ,000 perlakuan 1,202 2 ,601 7,482 ,044 Error ,321 4 ,080 Total 128,898 7 Corrected Total 1,523 6 a. R Squared = ,789 (Adjusted R Squared = ,684) Lampiran 4. 6 Hasil uji dan ANOVA kadar kafein 1. Standar Kafein Konsentrasi kafein absorbansi 0 0 0.02016 0.087666667 0.04032 0.161666667 0.06048 0.247333333 0.08064 0.309 0.1008 0.38 0.12096 0.500933333 0.1512 0.661 0.2016 0.84 0.3024 1.298  46 2. Kurva Standar Kafein 3. Hasil Uji kafein Ulangan Rata-rata Perlakuan 1 2 3 Kontrol 2.127750678 2.763550136 2.590650407 2.49398374 F1T1 1.463517787 1.629396325 1.142825219 1.41191311 F1T2 1.765312295 1.02473545 0.680744582 1.156930775 F1T3 1.138451444 1.395258677 0.776755751 1.103488624 F2T1 1.977018452 1.186023622 0.761754805 1.308265626 F2T2 0.660962992 1.678125413 0.815438178 1.051508861 F2T3 1.032263536 1.536175508 0.791183825 1.11987429 4. ANOVA Kafein Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: kadar kafein Type III Sum of Source Squares df Mean Square F Sig. Corrected Model 1,448 a 2 ,724 30,783 ,004 Intercept 14,269 1 14,269 606,767 ,000 perlakuan 1,448 2 ,724 30,783 ,004 Error ,094 4 ,024 Total 14,845 7 Corrected Total 1,542 6 a. R Squared = ,939 (Adjusted R Squared = ,908)  47 Lampiran 4. 7 Data hasil uji organoleptik warna Panelis Kontrol F1T1 F1T2 F1T3 F2T1 F2T2 F2T3 P1 4 4 6 4 4 4 4 P2 4 4 4 5 5 4 3 P3 4 4 4 4 4 4 4 P4 4 4 4 4 4 4 4 P5 4 4 4 4 4 4 4 P6 4 4 5 4 4 5 5 P7 4 4 4 4 4 4 5 P8 4 4 4 4 3 4 4 P9 4 4 5 4 4 4 5 P10 4 4 5 4 5 5 4 P11 4 4 4 4 4 4 4 P12 4 5 4 4 3 5 5 P13 4 4 4 4 5 4 5 P14 4 4 4 3 4 4 4 P15 4 4 4 4 4 4 5 P16 4 4 4 4 4 4 4 P17 2 3 4 3 4 3 4 P18 4 4 4 5 4 3 3 P19 4 4 5 4 4 5 4 P20 4 5 4 5 4 3 4 P21 4 4 4 4 4 4 4 P22 4 5 4 4 4 5 4 P23 5 4 4 5 4 4 4 P24 4 5 4 4 4 4 4 P25 5 6 3 4 6 6 7 P26 4 6 2 6 3 3 3 P27 6 6 5 6 6 7 6 P28 6 3 3 3 5 4 4 P29 6 6 4 4 5 6 5 P30 4 5 4 4 4 5 6 P31 6 7 5 3 6 5 5 P32 3 3 3 4 6 4 5 P33 6 5 5 5 6 6 6 P34 4 4 3 4 3 4 4 P35 6 6 5 4 5 5 4 P36 6 6 5 4 5 5 4 P37 3 1 6 6 2 6 6 P38 4 1 4 5 4 4 4 P39 3 5 7 6 4 6 4 P40 4 5 6 5 6 6 7 P41 7 4 4 4 6 6 6 P42 3 5 5 4 4 6 4 P43 4 3 4 3 4 4 5 P44 3 2 5 4 6 2 4 P45 3 1 4 1 3 3 2 P46 3 2 5 5 2 5 3 P47 4 2 4 5 3 2 6 P48 2 5 4 4 4 3 3 P49 4 4 4 3 2 3 4 P50 4 4 4 4 5 4 5 Total 208 206 215 208 212 218 222  48 Rata 4.16 4.12 4.3 4.16 4.24 4.36 4.44 rata 1.0372648 1.3192 0.863074 0.888934 1.060612 1.102131 1.033322 SD 49 45301 712 239 068 516 361 Lampiran 4. 8 Data hasil uji organoleptik aroma Paneli Kontrol F1T1 F1T2 F1T3 F2T1 F2T2 F2T3 s P1 3 5 6 5 3 3 3 P2 4 3 4 4 4 5 4 P3 3 3 3 5 5 5 3 P4 5 3 5 3 2 5 3 P5 4 5 4 5 3 4 5 P6 3 3 4 4 5 5 5 P7 4 3 5 4 5 4 5 P8 4 3 5 5 4 5 4 P9 4 4 4 4 4 4 4 P10 3 5 4 4 4 5 3 P11 4 4 5 5 4 3 5 P12 4 5 4 3 4 5 6 P13 4 4 5 4 4 4 4 P14 4 4 4 3 5 5 3 P15 4 5 4 5 3 5 5 P16 4 4 5 4 5 4 4 P17 4 3 4 4 4 4 3 P18 5 4 5 4 5 4 3 P19 4 3 6 4 4 4 4 P20 3 5 5 5 4 4 5 P21 4 5 4 4 4 4 3 P22 4 5 5 4 4 3 5 P23 4 5 5 6 4 5 4 P24 4 5 3 5 3 5 3 P25 6 4 3 4 4 6 3 P26 6 5 4 6 4 2 4 P27 5 5 4 6 5 6 7 P28 5 3 3 3 4 4 5 P29 6 6 3 3 4 5 4 P30 4 4 2 5 4 6 6 P31 5 1 3 4 3 2 6 P32 6 5 4 3 4 4 5 P33 6 6 4 6 6 6 6 P34 6 4 3 4 3 6 6 P35 7 7 4 7 7 7 6 P36 7 7 4 7 7 7 6 P37 5 6 5 6 5 6 5 P38 4 3 5 5 6 5 5 P39 4 7 7 5 4 6 5 P40 6 7 5 6 7 7 7 P41 6 2 3 3 7 5 5 P42 5 4 5 4 4 6 4 P43 4 3 4 3 4 4 5 P44 2 4 4 4 5 3 4 P45 3 1 4 1 2 4 3 P46 3 4 5 5 2 5 3 P47 3 2 3 5 4 5 5  49 P48 3 4 3 4 3 4 2 P49 5 4 3 3 2 3 4 P50 4 5 4 3 4 6 6 Total 219 211 209 218 210 234 223 Rata 4.38 4.22 4.18 4.36 4.2 4.68 4.46 1.140891 1.403930 0.962352 1.173865 1.228903 1.185628 1.198808 SD 166 343 56 062 61 224 933 Lampiran 4. 9 Data hasil uji organoleptik rasa Panelis Kontrol F1T1 F1T2 F1T3 F2T1 F2T2 F2T3 P1 3 5 4 3 5 4 4 P2 5 3 4 4 3 5 4 P3 5 4 5 5 3 3 3 P4 4 5 3 2 4 5 4 P5 5 4 4 5 3 5 5 P6 4 3 3 4 4 5 4 P7 4 2 4 3 5 3 4 P8 5 3 3 5 5 5 4 P9 3 4 4 3 4 4 4 P10 3 5 4 4 4 4 4 P11 4 5 6 5 3 3 5 P12 4 4 4 2 4 5 5 P13 4 4 6 3 4 4 4 P14 4 5 4 4 5 5 3 P15 5 4 4 4 3 5 5 P16 4 4 4 3 5 4 4 P17 4 3 4 4 4 4 3 P18 5 4 4 3 6 4 4 P19 4 3 5 4 3 5 4 P20 3 5 6 5 4 3 5 P21 4 6 4 4 4 4 3 P22 3 5 4 4 4 3 6 P23 4 6 5 6 4 6 4 P24 4 5 4 6 3 6 3 P25 2 1 3 3 2 1 1 P26 5 1 2 2 4 3 2 P27 1 3 3 3 4 4 2 P28 2 4 5 1 4 3 2 P29 5 3 4 3 3 3 3 P30 5 6 3 5 4 7 5 P31 2 6 2 1 1 3 2 P32 3 5 2 4 4 2 4 P33 4 4 4 4 5 6 3 P34 1 3 2 2 5 2 3 P35 1 1 2 2 6 2 1 P36 1 1 2 2 6 2 1 P37 2 1 6 5 5 5 5 P38 5 2 6 6 6 5 4 P39 5 7 7 5 5 6 6 P40 4 7 5 5 7 7 6 P41 5 3 5 5 7 5 5 P42 5 3 5 4 5 4 5 P43 5 3 5 4 6 5 4 P44 3 2 5 3 6 2 3 P45 4 1 4 1 2 5 2  50 P46 4 2 6 6 2 6 3 P47 5 2 4 6 3 2 6 P48 4 5 3 5 1 4 3 P49 3 4 5 5 2 4 1 P50 4 3 4 4 4 5 4 Total 187 184 206 191 205 207 184 Rat