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TEMA 6. COMPARTIMENTACIÓN CELULAR Y CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS (I) 1. Compartimentos celulares, orgánulos e inclusiones citoplasmáticas 2. Sistemas de transporte y clasificación de proteínas 3. Retículo endoplasmático: estructura y funciones...
TEMA 6. COMPARTIMENTACIÓN CELULAR Y CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS (I) 1. Compartimentos celulares, orgánulos e inclusiones citoplasmáticas 2. Sistemas de transporte y clasificación de proteínas 3. Retículo endoplasmático: estructura y funciones 1 1. Compartimentos celulares, orgánulos e inclusiones citoplasmáticas Los orgánulos son compartimentos intracelulares que llevan a cabo una función específica (mayoritariamente están rodeados por una membrana interna) Las inclusiones citoplasmáticas carecen de membrana; tienen composición y distribución específicas (gotas lipídicas, gránulos de glucógeno, etc.) gotas lipídicas CITOSOL Inclusiones citoplasmáticas: (partículas α) gránulos de glucógeno partícula α Gotas partícula β lipídicas nxβ Glycogen particles within a liver cell. When the particles occur in clusters (1), they are known as alpha-particles. Single glycogen particles (2) are called beta-particles. Compare the size of glycogen particles with ribosomes seen lining the endoplasmic reticulum (3). 4 = Smooth endoplasmic reticulum. (X122,100) macromolécula de glucógeno partícula β Pm > 107 2 2 glicogenina Glycogen particles within a muscle cell (beta-particles) 3 Inclusiones de proteínas cristales de ferritina asociada cristales de Reinke en células de Sertoli cristal proteico en con hierro en enterocitos peroxisoma agregados intracelulares de tau hiperfosforilado Depósitos proteicos anormales: proteinopatías (ovillos neurofibrilares) (ejemplo: enfermedades neurodegenerativas) agregados intracelulares de sinucleína (cuerpos de Lewy) agregados extracelulares de 4 β-amiloide (placas seniles) 5 Sistemas de endomembranas y compartimentos celulares Las endomembranas dividen el citoplasma de las células eucariotas formando distintos compartimentos La cantidad y distribución de las membranas que forman los distintos orgánulos celulares varían en los distintos tipos celulares según sus funciones, estado de maduración y de activación célula vegetal joven DIFERENCIACIÓN célula vegetal adulta 6 célula pancreática acinar 7 Table 12-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) hepatocito La identidad bioquímica y funcional de los distintos compartimentos celulares depende principalmente de la composición de sus membranas Las proteínas específicas de cada compartimento nos ayudan a entender su función y son utilizadas como marcadores 8 http://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/lab-data-management-analysis-software/lab-apps/cell-staining-tool.html 9 MitoTracker Red 580 580/644 Cells labelled with DAPI, MitoTracker Red CMXRos, and Alexa Fluor 488 conjugated to phalloidin 10 2. Sistemas de transporte y clasificación de proteínas Las proteínas son las moléculas responsables de la compartimentación celular: Cada orgánulo tiene una dotación propia de enzimas y otras proteínas Las proteínas dirigen los sistemas de transporte de moléculas (incluídas las mismas proteínas) entre compartimentos Figure 12-5, 12-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Clasificación de proteínas: las señales que dirigen las proteínas sintetizadas por la célula hacia los diferentes compartimentos están contenidas en su secuencia de aminoácidos 12 Para la correcta clasificación (tráfico) de las proteínas se necesitan: señales de direccionamiento (secuencias contenidas en ellas) receptores complementarios de esas señales (en la membrana del compartimento diana) señales de direccionamiento 1 - secuencia (péptido) señal 2 - región señal 3 - oligosacáridos El péptido señal suele ser eliminado de la proteína madura por una peptidasa de señal (no así la región señal) Los péptidos señal para un determinado compartimento son intercambiables (experimentos de Ing. Genética) Una proteína puede tener más de un péptido señal (si atraviesa más de un compartimento) 3. Retículo endoplasmático: estructura y funciones calretinina Sistema de cisternas aplanadas y túbulos interconectados Membrana RE >50% membranas Origen evolutivo del RE Lumen RE >10% volumen celular 14 RER REL 15 Funciones del Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) Síntesis de proteínas de membrana Experimentos de pulso y caza (George Palade) Síntesis de proteínas del lumen RE-Golgi-lisosomas Síntesis de proteínas de secreción Modificación (glicosilación) de proteínas Autorradiografía Plegamiento y control de calidad de proteínas 16 Estudio de la síntesis de proteínas de secreción en las fracciones microsómicas Figure 12-37b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 17 Experimentos de George Palade en los 60‘s George Palade Nobel 1974 Las partículas (ribosomas) de la fracción microsómica rugosa son necesarias para la síntesis de proteínas Las membranas no son necesarias para la síntesis de proteínas pero sí para su “secuestro” en el lumen La síntesis de proteínas y la translocación al lumen del RER ocurren simultáneamente 18 La hipótesis de la señal “La característica esencial de la hipótesis de la señal es la existencia de una secuencia única de codones, localizada inmediatamente a la derecha del codón de iniciación, que está presente sólo en aquellos ARNm cuyos productos de traducción han de ser transferidos a través de una membrana” G. Blobel & B. Dobberstein. Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. Journal of Cell Biology, 1975. Günter Blobel Nobel 1999 Péptido líder N-terminal (péptido señal de inicio de transferencia): formado por 15-30 aas, núcleo hidrofóbico de 8-12 aas, segmento C-ter más polar que sirve de sitio de corte de una peptidasa de señal El polipéptido atraviesa la membrana del RE con la participación del translocon (llamado más tarde Sec61), que se une al ribosoma durante la translocación Sec61 Figure 12-38, 12-42 MBC Otras secuencias-señal dirigen las proteínas hacia otros orgánulos celulares (señales topogénicas) El péptido señal es un mecanismo universal, que actúa en animales, plantas y levaduras Las proteínas importadas al RE (independientemente de cual sea su destino final en la vía secretora) poseen un mismo tipo de péptido señal Figure 12-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) polirribosomas 20 Partícula de reconocimiento de la señal (SRP) La unión del péptido señal a la SRP detiene la síntesis y dirige el complejo a la membrana del RE: la SRP es reconocida por su receptor y el ribosoma es transferido al traslocón 21 Sec61 Figure 12-39, 12-40 Molecular Biology of the Cell En algunas proteínas, además de una señal de inicio de transferencia puede haber una señal de parada de transferencia proteína transmembrana de paso doble con una secuencia señal de RE interna proteína transmembrana de paso único La topología de las proteínas transmembrana de paso múltiple depende de combinaciones de señales de inicio y paro de transferencia Figure 12-47, 48, 12-49 MBC 22 1 Vía principal de incorporación de 2 Algunas proteínas pequeñas (hasta 70 proteínas al RE (reconocimiento de aas aprox.) se incorporan al RE sin ser la secuencia señal por la SRP) reconocidas por la SRP Figure 12-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Las proteínas residentes del RE llevan una secuencia de retención en el RE de 4 aas KDEL (del lumen) KKXX (de membrana) 23 Funciones del RER Síntesis de proteínas Modificación de proteínas: N-glucosilación, hidroxilación, formación de puentes disulfuro entre subunidades, subunidades anclaje a lípidos de membrana (glucosilfosfatidilinositol –GPI-) Plegamiento y control de calidad de proteínas La mayoría de las proteínas son glucosiladas por la adición de un oligosacárido común en grupo –NH de Asn en secuencia consenso de N-glicosilación –N-X-S/T- (condición necesaria pero no suficiente) La gran variedad de oligosacáridos de las glucoproteínas se produce por modificaciones de este N-oligosacárido en el RE y el Golgi Las proteínas glucosiladas ancladas a la membrana del RE pueden acabar formando parte del glucocáliz X ≠ Pro Oligosacárido común (14 residuos) 3 9 2 24 La síntesis del oligosacárido común se produce con este unido al lipído dolicol fosfato Se inicia en el lado citosólico del RE y se completa en el lumen Después es transferido “en bloque” a la Asn diana por una transferasa de oligosacárido Figure 12-50, 12-51, 12-52 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Procesamiento posterior del oligosacárido: Se inicia en RE y termina en el Golgi (se eliminan todos los residuos de glucosa y varios de manosa, conservándose los del core) Elongación y formación de oligosacáridos complejos a partir del core 25 Funciones del RER Síntesis de proteínas Modificación de proteínas: N-glucosilación, hidroxilación, formación de puentes disulfuro entre subunidades, anclaje a lípidos de membrana (glucosilfosfatidilinositol –GPI-) Plegamiento y control de calidad de proteínas Figure 12-56 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Enzimas del lumen catalizan la formación de un enlace covalente entre un GPI y el extremo C-t de la proteína Estos anclajes GPI dirigen la proteínas a las balsas lipídicas, donde pueden resultar activadas en la MEC por fosfolipasas 26 Funciones del RER Síntesis de proteínas Modificación de proteínas: N-glucosilación, hidroxilación, formación de puentes disulfuro entre subunidades, anclaje a lípidos de membrana (glucosilfosfatidilinositol –GPI-) Plegamiento y control de calidad de proteínas En el RER, la acción coordinada de chaperonas y de una glucosil transferasa controla 1 el correcto plegamiento de las proteínas N-glucosiladas (evitando la formación de agregados por interacciones entre residuos hidrofóbicos anormalmente expuestos en su superfície) Figure 12-53 Molecular Biology of the Cell n ciclos 2 Las proteínas mal plegadas son degradadas en el lumen o retrotranslocadas desde el RE al citosol para su degradación en el proteosoma mediante Endoplasmic-Reticulum-Associated protein Degradation (ERAD) E1 = Enzima activadora de ubiquitina E2 = Enzima conjugadora de ubiquitina E3 = Ligasa de ubiquitina Figure 12-54 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 28 La sobrecarga del ER provoca la acumulación de proteínas mal plegadas y la activación de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR -Unfolded Protein Response-) mediante proteínas sensoras del estrés del retículo Los sensores de estrés reticular por acumulación de proteínas mal plegadas controlan la expresión de factores de transcripción que modulan distintos procesos compensatorios ↑ tasa ERAD ↑ chaperonas ↓ síntesis proteica UPR Apoptosis Autofagia Ampliación en DINÁMICA INTRACELULAR a) Las proteinas de la ruta secretora son traslocadas al lumen del RER. b) En el lumen, las chaperonas residentes (BiP, calnexina, PDI) facilitan el plegamiento de las proteínas. c) Una vez plegadas, éstas abandonan el ER en vesículas de secreción. d) Si el control de calidad del ER detecta una proteína mal plegada, ésta se retrotrasloca al citosol y se degrada en el proteosoma. e) La sobrecarga del ER provoca la acumulación de proteínas mal plegadas y la activación de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) mediante proteínas sensoras del estrés del retículo en la membrana Funciones del REL Síntesis de lípidos (fosfolípidos, esfingomielina, colesterol) y derivados lipídicos (hormonas esteroideas, lipoproteínas, ácidos biliares) Almacenamiento de Ca2+ Metabolismo de glúcidos Reacciones de destoxificación La mayoría de los lípidos de membrana son sintetizados en la hemimembrana citosólica del REL escramblasas 30 Figure 12-57 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Los translocadores de fosfolípidos mantienen la composición y propiedades de las membranas celulares 31 Figure 12-58 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Existen distintos mecanismos de intercambio de lípidos entre membranas de distintos orgánulos, responsables de su composición fosfolipídica específica conversión (enzimática) de un fosfolípido en otro selección de fosfolípidos en vesículas (vía secretora) proteínas intercambiadoras de fosfolípidos Lipid exchange between cellular compartments occurs by both vesicular (A) and non-vesicular mechanisms (B–G) [52,53]. One mechanism of non vesicular lipid transfer between membranes is the spontaneous transfer of lipid monomers (B). This process is too slow to be physiologically relevant for most classes of lipid, with the notable exceptions of sterols and some lysolipids. Some non-vesicular lipid exchange requires lipid transfer proteins (LTPs) (C). There are five large families of LTPs and most cell types express many of them. LTPs bind a single lipid molecule in a hydrophobic tunnel or cleft and can shuttle the bound lipid between membranes. Rather than diffusing long distances through the cytosol many LTPs may function at MCSs (Membrane Contact Sites), where they could rapidly shuttle between membranes ((D)–(F)). Some lipid exchange at MCS does not seem to require LTPs but instead may be mediated by integral membrane transporters (G). Estos intercambios lipídicos ocurren en los sitios de contacto de membranas (MCS, Membrane Contact Sites) Location of membrane contact sites (MCSs) (A) Endoplasmic reticulum (ER) – plasma (D) ER–Golgi complex. membrane (PM) (E) ER and chloroplast (chloro). (B) ER – Mitochondria (Mito) (F) ER–peroxisome (Pex) (C) ER – Late endosome(LE) /multivesicular bodies (G) ER and lipid droplets (LD). (MVB) and ER – lysosome. In yeast there are (H) Contact sites between the inner and outer contacts between the nucleus and vacuole. membranes of mitocondria and chloroplasts. La síntesis de muchos derivados lipídicos (hormonas esteroideas, lipoproteínas, ácidos biliares) se produce entre el REL y las mitocondrias 34 TEM Célula de Leydig Funciones del REL Síntesis de lípidos Metabolismo de glúcidos Almacenamiento de Ca2+ Reacciones de destoxificación El Ca2+ es una molécula utilizada como señal intracelular o segundo mensajero Las células regulan sus concentraciones intracelulares almacenándolo en el REL Su liberación al citosol y su posterior recaptación regulan múltiples procesos (ej. contracción muscular) impulso eléctrico SR: Sarcoplasmic Reticle DHP: Voltage-sensitive dihydropyridine receptors (L-type calcium channels) RyR: Ryanodine Receptors (canales activados por voltaje) SERCA: sarco-endoplasmic reticulum calcium-ATPase TN: troponina (proteína sensora de calcio) TM: tropomiosina Funciones del REL La glucosa-6-fosfatasa de la membrana del REL participa en la glucogenolisis Síntesis de lípidos Almacenamiento de Ca2+ Metabolismo de glúcidos Reacciones de destoxificación 36 Funciones del REL Reacciones de destoxificación: el REL de los hepatocitos tiene enzimas que convierten toxinas apolares en compuestos hidrosolubles que pueden ser solubilizados y eliminados 37 TEMA 6: LECTURAS RECOMENDADAS Alberts et al., 2010, 4/5ª ed., Ed. Omega - Cap. 12. Compartimientos intracelulares y clasificación de proteínas Becker et al., 2008, 6/7ª ed., Pearson/B. Cummings - Cap. 12. Compartimentos intracelulares Karp, 2010, Cell Biology 6ª ed., Wiley eds. - Cap 12. Cellular organelles and membrane trafficking 38
