DNA Concentraties Meetmethode PDF

1. DNA-CONCENTRATIES METEN Vooraleer men verdere arbeidsintensieve en dure experimenten inzet met een DNA- extract, zal men steeds de concentratie bepalen. De daaropvolgende experimenten vereisen namelijk een vaste hoeveelheid template-materiaal om optimaal te werken. Soms bevat een staal zo weinig...

1. DNA-CONCENTRATIES METEN Vooraleer men verdere arbeidsintensieve en dure experimenten inzet met een DNA- extract, zal men steeds de concentratie bepalen. De daaropvolgende experimenten vereisen namelijk een vaste hoeveelheid template-materiaal om optimaal te werken. Soms bevat een staal zo weinig DNA dat verdere experimenten zelfs onmogelijk zijn. Een concentratiebepaling bespaart dan veel tijd, moeite en geld. Voor de kwantificatie van nucleïnezuren zijn er verschillende technieken beschikbaar. De goedkoopste techniek is ongetwijfeld UV-spectrofotometrie. Helaas is deze techniek niet erg gevoelig noch specifiek. Door gebruik te maken van DNA of RNA bindende fluorochromen kan men gevoeliger en specifieker de concentratie van nucleïnezuren meten. De allergevoeligste aanpak voor de kwantificatie van DNA-extracten is tenslotte de kwantitatieve PCR. Afhankelijk van de toepassing zal men een keuze maken uit één van bovenstaande technieken. Vergelijk bijvoorbeeld een DNA-extractie uit een cellijn (heel veel DNA van één enkele bron) met een DNA-extract van een spoor op een plaats delict (heel weinig DNA). In dit labo gebruiken jullie het DNA-extract van de mondmucosacellen, het plasmide DNA- extract of een extract bekomen met specifieke extractiekits. Jullie meten de DNA-concentratie met UV-spectrofotometrie en met DNA bindende fluorochromen. Jullie vergelijken en interpreteren de bekomen resultaten. 1.1. UV-spectrofotometrie De concentratie van nucleïnezuren in een oplossing wordt klassiek bepaald met behulp van een UV-spectrofotometer. Nucleïnezuren absorberen ultraviolet licht, het absorptiemaximum bevindt zich bij 260 nm. De stikstofhoudende basen in het DNA, de purines en pyrimidines zijn verantwoordelijk voor deze lichtabsorptie bij 260 nm. Hoe meer licht het staal absorbeert, des te hoger is de concentratie van het nucleïnezuur. Met behulp van de wet van Lambert-Beer kan de concentratie van het nucleïnezuur worden berekend. Moleculaire Biologie Labo ML2 1 www.kdg.be Wet van Lambert-Beer: A= ε.l.c A = absorptie (in dit geval bij λ=260 nm) ε = absorptiecoëfficiënt ε = 0,020 (µg/mL)/cm voor DNA bij 260 nm ε = 0,025 (µg/mL)/cm voor RNA bij 260 nm l = lengte die het licht door de vloeistofmoet afleggen (=1 cm voor een standaardcuvet) c = concentratie van de opgeloste stof (µg/mL) Voor de concentratie van dubbelstrengs DNA geldt: [dsDNA] = A260/ 0,020 (µg/mL), ofwel [dsDNA] = A260 x 50 (µg/mL) Met andere woorden: Een DNA-oplossing van 50 µg/mL of 0,05 µg/µL heeft een absorbantie van 1 bij een lichtweg van 1 cm en bij 260 nm. Naast de concentratie, kan je met spectrofotometrie ook een inschatting maken van de zuiverheid. De verhouding tussen de extinctie bij 260 nm en 280 nm van een zuivere DNA- oplossing is 1,8. Eiwitten hebben een UV-absorptiemaximum bij 280 nm. Bij verontreiniging met eiwitten zal de verhouding A260/A280 kleiner zijn dan 1,8. Bij RNA moet de verhouding tussen de extinctie bij 260 nm en 280 nm ongeveer 2 zijn. Het is echter goed om te beseffen dat andere stoffen in de oplossing (buffer, EDTA, fenolverontreinigingen) het UV-absorptiespectrum ook kunnen beïnvloeden. Hou dus steeds in het achterhoofd dat de concentratiebepaling enkel correct is, indien je extract 100% zuiver is. Wanneer dit niet het geval is, geeft de spectrofotometer eerder een ruwe inschatting van de DNA of RNA concentratie. Omdat we in de moleculaire diagnostiek doorgaans werken met kleine hoeveelheden in kleine volumes zijn er spectrofotometers ontwikkeld die de concentratie en zuiverheid van een nucleïnezuur-extract bepalen met slechts enkele µl oplossing en dit in een paar seconden en met een gevoeligheid in de nanogram-range 1 (ng/µL). Vermits deze toestellen ook gebaseerd is op UV-spectrofotometrie geldt ook hier dat contaminanten de absorbantie sterk kunnen beïnvloeden. Om de concentratie van DNA te meten met behulp van UV-spectrofotometrie gebruiken we in ons labo de NanoDropTM One van Thermo ScientificTM. De spectrofotometer kan d e absorbantie en fluorescentie meten bij stalen van slechts 1-2 µL. 1 1 ng = 10-3 µg = = 10-6 mg Moleculaire Biologie Labo ML2 2 www.kdg.be In de software zit een programma voor nucleïnezuurmeting, die de absorbantie weergeeft op 260 en 280 nm, de ratio van de 2 absorbanties en de concentratie aan DNA voor jou berekent. Hoe gebruik je de Nanodrop? o Zet de Nanodrop aan en klik op dsDNA. o Doe de arm omhoog en veeg de twee meetoppervlaktes schoon met een papieren doekje. o Laad op het onderste meetoppervlak 2µL van de blanco (dH2O), sluit voorzichtig de arm en druk op de knop blanco. Er zit een magneet op de sluiting, zorg dus dat het niet dichtslaat, zodat er geen belletjes ontstaan. o Doe de arm omhoog en veeg de twee metingoppervlaktes schoon. o Laad op het onderste meetoppervlak 2µL van het staal en sluit voorzichtig de arm. De optie automatisch meten staat aan dus de meting begint van zodra je de arm sluit. De concentratie (ng/µL) en de A260/A280 wordt rechts op het scherm weergeven. o Voer de vorige twee stappen uit voor elk staal. o Steek op het einde een USB-stick in het toestel en druk op end experiment. o Klik op export en kies het juiste bestandstype (.cvs) o Klik op de knop end experiment Moleculaire Biologie Labo ML2 3 www.kdg.be  1.2. DNA/RNA bindende fluorochromen Voor de modernste moleculaire technieken is nog een hogere gevoeligheid vereist in de picogram-range 2 (pg/µL). Daarmee samenhangend moet ook de specificiteit beter. Inderdaad wanneer je slechts picogrammen DNA of RNA wilt opsporen, mag je staal geen enkel spoor van contaminanten bevatten, of moet je techniek hyperspecifiek zijn, zodat contaminanten niet mee gemeten worden. Dit wordt mogelijk gemaakt door gebruik te maken van DNA of RNA bindende fluorochromen. PicoGreen is zo een fluorochroom dat selectief bindt aan dsDNA. Indien gebonden aan dsDNA, is de fluorescentieversterking van PicoGreen uitzonderlijk hoog; er treedt weinig achtergrond op omdat de ongebonden kleurstof vrijwel geen fluorescentie heeft. Vergelijkbare fluorochromen werden ontwikkeld die specifiek binden aan enkelstrengs DNA en aan RNA. Samen met de reagentia worden eenvoudige fluorometers verkocht, zoals de Qubit-fluorometer van Invitrogen. In één Qubit-assay zit er Qubit reagent Qubit buffer Standaarden Hoe gebruik je het Qubit Assay met de Qubit fluorometer? o Gebruik de ‘calculator’ om te bepalen hoeveel reagent en buffer je nodig hebt voor jouw meting. Maak de working solution en verdeel ze in de speciale Qubit epjes (190 µL voor de standaarden en 198 µL voor de stalen). o Voeg de standaarden (10 µL) en stalen (2 µL) toe. o Vortex alle tubes 2-3 seconden. Verwijder eventuele belletjes. o Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. ________________________________________________ 2 1 pg=10-3 ng = = 10-6 µg = = 10-9 mg Moleculaire Biologie Labo ML2 4 www.kdg.be  o Kies op het scherm de juiste toepassing. o Duid aan hoeveel van het extract je gebruikt (2 µL). o Meet eerst de standaarden. o Meet nu de stalen. o Noteer je resultaten en interpreteer ze. Moleculaire Biologie Labo ML2 5 www.kdg.be VRAGENBLAD: DNA-CONCENTRATIES METEN 1. Noteer je resultaten uit de absorbantiemeting. Wat kan je berekenen uit de absorbantie bij 260 nm? Wat kan je afleiden uit de ratio van de absorbanties bij 260 en 280 nm? 2. Noteer je resultaten uit de fluorescentiemeting. 3. Vergelijk de resultaten van de twee metingen. Liggen de resultaten in dezelfde lijn? Welke resultaten lijken je het meest betrouwbaar? Hoe schat je de kwaliteit in van je verschillende DNA-extracten? 4. Denk terug aan je PCR-resultaten. Is er een verband tussen je PCR-resultaten en de concentratiemetingen? Denk terug aan je agarosegel met plasmide-extracten. Is er een verband tussen wat je zag op gel en de concentratiemetingen? 5. Bereken de opbrengst van je plasmide opzuivering als mg plasmide/g natte celmassa. Werk eenmaal de berekening uit Moleculaire Biologie Labo ML2 6 www.kdg.be