Criblage et évaluation d’antiviraux (PDF)

Criblage et évaluation d’antiviraux Franck Touret Associate Professor Responsable PCVMT Unité des virus émergents i-Le criblage Le criblage Méthode d'investigation permettant d'effectuer un tri (en anglais,...

Criblage et évaluation d’antiviraux Franck Touret Associate Professor Responsable PCVMT Unité des virus émergents i-Le criblage Le criblage Méthode d'investigation permettant d'effectuer un tri (en anglais, screening) parmi des substances naturelles ou synthétiques dont on ignore les propriétés pharmacologiques éventuelles, dans la perspective de la recherche d'un médicament. Seules sont présélectionnées les molécules qui présentent une activité intéressante, lors d'essais systématiques sur un ou plusieurs tests selon le programme adopté. Cette façon de procéder est particulièrement intéressante lorsqu'il s'agit de molécules chimiquement originales puisqu'elle permet non seulement de détecter à l'aide d'un maximum de tests une activité parfois imprévue, mais encore d'obtenir le plus de renseignements possibles sur le produit concerné. Le criblage orienté, lui, se propose de rechercher ou de vérifier si une molécule possède une (ou plusieurs) activité(s), déterminée(s) dans un (ou plusieurs) domaine(s) préalablement défini(s). Il permet notamment, lorsqu'on étudie une série de molécules chimiquement homogène ou des molécules agissant par des mécanismes biologiques semblables, d'établir des relations structure-activité directement exploitables en drug design (recherche de molécules sur des bases rationnelles théoriques et expérimentales). Encyclopédie Universalis Le criblage dans le développement du médicament Hughes et al., 2011 Le criblage en chiffre Sun et al., 2022  Des chimiothèques Naturelles Avec quoi? Synthétiques Avec des propriétés connues ou inconnues La cible d’intérêt peut etre : Contre qui? Un pathogène ( virus, bactérie, champignons) une maladie (cancer, etc..) Le criblage « en paillasse » doit pouvoir etre Comment? effectué à moyen ou à haut débit pour pouvoir tester un grand nombre de molécules: 96 ou 384 puits Analyse rapide et à « moindre » cout des résultats c a d read out « facile » ii-Application aux antiviraux Les virus Virus= poison Entité biologique nécessitant obligatoirement l’infection d’un organisme vivant pour sa réplication Monde des virus extrêmement complexe Grande diversité de forme, de taille, de type de génome et d’hôte. Les virus https://www.geeksforgeeks.org/tmv-diagram/ Yvon et al., 2024 Le génome d’un bunyavirus ne peut être défini qu’à l’échelle de la population de ses virions Cycle de réplication viral Schéma basé sur "The flavivirus life cycle," de Ted Pierson Cycle de réplication viral et antiviraux Molécule qui va bloquer ou ralentir la réplication virale Directement en ciblant une protéine virale(Direct Acting Antiviral) Indirectement en ciblant une protéine cellulaire nécessaire à la réplication Boldescu et al., 2017 Niveaux de biosécurité: manipuler des virus Difficulté d’implémentation du criblage/validation Niveaux de biosécurité: manipuler des virus Type de criblage pour antiviraux Sur protéine purifiée/enzyme In silico Contre un « virus pseudotypé » Contre un virus réplicatif: Non modifié Modifié Projet collaboratif Chimistes Biochimistes Biologistes structuraux Biologistes moléculaires Chemo-informaticiens Virologistes Médecins/cliniciens  Criblage: Sur enzyme viral Sur enzyme viral Utilisation de protéines virales (ou complexe) ayant une activité enzymatique pour cribler des banques de molécules Mesure de l’activité enzymatique de celle-ci en présence des composés de la chimiothèque Par exemple crible sur RNA polymerase-RNA dépendante Enzyme de réplication propre aux virus ARN Indispensable à la réplication virale Cible pertinente: ex: Sofosbuvir (HCV), Remdesivir ( CoV-2, Ebola) Sur enzyme viral -Exemple: criblage de la banque prestwick chemicals contre le complexe de réplication du SARS-CoV-2 Eydoux et al., 2021 Valle et al., 2020 Sur enzyme viral -Exemple: criblage de la banque prestwick chemicals contre le complexe de réplication du SARS-CoV-2 Criblage 1520 molécules FDA approved Eydoux et al., 2021 Sur enzyme viral Validation biochimique avec détermination des IC50 Aucun « HITS » communs avec notre criblage de la meme banque contre le virus réplicatif ( cf Criblage avec virus réplicatif) Eydoux et al., 2021  Criblage: In silico No biosafesty risk In silico On va utiliser la structure des protéines virales d’intérêt qui a été élucidée On va y « docker » informatiquement des banques de molécules Xu et al., 2021 In silico Ex: SARS-CoV-2 Xu et al., 2021 In silico HITS HITS à valider in vitro et/ou avec la protéine virale purifiée  Criblage: Contre un virus réplicatif Contre un virus réplicatif : viabilité Au cours de leur réplication ( multiplication) les virus peuvent induire des dommages aux cultures des cellules classiques ( 2D) Une culture de cellule classique = Une lignée cellulaire, c’ est une population homogène de cellules, stables , et ayant, en théorie, une capacité illimitée de division. Il s'agit en général de cellules cancéreuses prélevées chez un patient (comme les cellules HeLa), transformées artificiellement par un oncogène (un gène immortalisant tel que T de SV40) ou encore mutées pour des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (comme la protéine p53). Hela, VeroE6, HEK293, Calu-3, Caco-2, MRC-5, A549 etc…. Contre un virus réplicatif : viabilité Schéma basé sur "The flavivirus life cycle," de Ted Pierson Contre un virus réplicatif : viabilité Ces dommages sont quantifiables par un test de viabilité cellualire ou visuellement Permet un criblage rapide à semi ou haut débit sans réactifs spécifiques (rapidité de mise en place) Sélectionne les molécules pour leur capacité à prévenir la mort viral viro-induite c’est une mesure indirecte de l’activité antivirale Ex: Coloration +ZikV Ex: Cell viability assay Mock Rezazurine Fluorescence Rezorufine 560/590nm Lecture automatisable par IA Exemple : Prestwick chemical Library (1520 compounds) screening on SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 CC T+ CC T+ CC VC CC VC CC: Cell control Dilute compound (10µM) CC VC VC: Virus control and add to VeroE6 CC VC T+: Control compound and add virus CC VC CC VC (25 µl per wells) 3 days at 37°C, 5% CO2 Analysis Cell Viability assay CTB CTB Reading at 590 nm Tecan M200 Pro ClH Benoxinate H2N O 01F08 Prestw-57 O O CH3 Neuromuscular Local anesthetic hydrochloride N CH3 H3C 31 Touret et al., 2020  Exemple : Prestwick chemical Library (1520 compounds) screening on SARS-CoV-2 EC50 determination in VeroE6 HITS analysis and selection Inhibition index plot In vitro validation Hydroxychloroquine 2.0 1.5 Inhibition index 1.0 In a second cell line Caco-2 0.5 0.0 −0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Molecules sor ted per plate 32 Touret et al., 2020 Validation in vivo ( cf préclinique in vivo) Contre un virus réplicatif : IF Au cours de leur réplication ( multiplication) les virus produisent des protéines virales Ces protéines peuvent etre détectées par des anticorps spécifiques ( ex: immunofluorescence) ZIKV PF Mock https://microbenotes.com/immunofluorescence/ Schéma basé sur "The flavivirus life cycle," de Ted Pierson Contre un virus réplicatif : IF Nécessite un anticorps spécifiques Automatisable et miniaturisable Mesure directement la réplication virale Rapide Lecture automatisable par IA Mazzon et al., 2019  Criblage: Contre un virus réplicatif modifié Contre un virus réplicatif modifié Génération TBEV Hypr mCherry Fluorescence TBEV Hypr mCherry x20 x40 36 Contre un virus réplicatif modifié Cinétique de réplication Signal fluorescence TBEV Hypr mCherry In vitro : Cellule BHK-21 37 Contre un virus réplicatif modifié Criblage des molécules antivirales de la chimiothèque de Prestwick ® Plan de plaque : A : contrôle cellule B : composés à tester C : Nitd008 D : contrôle virus Incucyte live cell imaging 38 Contre plusieurs virus réplicatif modifié Rainbow assay Li et al., 2024 Nature Com  Criblage: Contre virus pseudotypé Contre un « virus pseudotypé » On « décore » une particule virale avec une enveloppe du virus contre lequel on cherche un antiviral Particule non réplicative donc niveau de biosécurité plus faible (BSL-2) Permet donc de cribler des molécules contre des virus BSL-4 en BSL-2 Permet l’ajout d’un gène rapporteur( fluorescent) Ne sélectionne que des inhibiteurs d’entrée Permet de cribler dans anticorps pour le développement d’Ac thérapeutiques Peut « surestimer » l’activité des molécules car on ne mesure qu’un aspect de l’inféction Xiang et al., 2022 Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies Contre un « virus pseudotypé » (inhibiteurs d’entrée) Xiang et al., 2022 Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies Validation des HITS Une fois une molécule identifiée il faut valider la cible virale: Si criblage sur enzyme/protéine >ok validation préclinique ( in vitro/in vivo) Si criblage in silico il faut valider on peut valider par test biochimique avant la validation préclinique Si criblage avec pseudo-type on valide avec le virus réplicatif Si criblage sur virus réplicatif on peut: tester des protéines seules contre le HIT c a d validation biochimique Faire des passages successifs de virus en présence de molécules: protéines virale mutée spécifiquement+ baisse de l’activité = cible On peut également avoir des informations avec des expériences de time of addition: Étape du cycle etc…. Une fois la cible et le mode d’action élucider on passe aux études pré-cliniques Validation préclinique + Cible/SAR Validation préclinique: in vitro Expérience classique de validation de l’activité: dose-réponse Utilisation de culture de cellules simples 2D (comme pour le criblage) pour déterminer des paramètre basiques d’activité antivirale: EC50: elle correspond à la concentration en molécule qui diminue de 50 % la réplication virale par rapport au témoin CC50 : elle correspond à la concentration en molécule qui diminue de 50 % la viabilité des cellules par rapport au témoin A B C VC: Virus Control (no drug,) CC : mock cell control (no drug, no virus) Validation préclinique: in vitro Collecte du surnageant qRT-PCR quantitative en temps réel A B C + Incubation 1,5 à 4j Extraction de l’ ARN/ADN viral On peut aussi utiliser: un test de viabilité ou l’observation des ECP si le virus est cytopathique Un marquage IF Un virus fluorescent Validation préclinique: in vitro Expérience de dose-réponse N it a z o x a n id e C a c o - 2 exemple:Lyz-PA4 On continue ? V ir a l R N A in h ib it io n ( % ) Viral RNA inhibition (%) 100 100 Cell viability (%) C e ll v ia b ility (% ) 100 100 EC90 EC 90 EC50 CC50 EC 50 C C 50 0 0 Index de sélectivité 25 50 39 78 56 13 25.5 12 0, 0. 1. 3. 6. Conc µM log scale 0 0 5 10 20 5 16 31 63 25 2. 0. 0. 0. 1. C o n c µ M lo g s c a le Validation préclinique: ex vivo Au cours la pandémie de SARS CoV-2 : nécessité d’avoir un modèle entre in vitro et in vivo (3R= réduire le nombre d’animaux) Valeur prédictive négative très forte Utilisation de culture de cellules primaires bronchiques reconstitué en épithéliums 3D à l’interface air-liquide → Tissu cible du CoV-2 Réplication robuste du virus SARS-CoV-2 9 8 3 µM copies/ml log10 scale 1 µM Viral RNA yields 7 6 X PGL 221 0.33 µM 5 0.11 µM 4 3 µM 3 2 Remdesivir 1 µM 1 0.33 µM 0 0.11 µM 2 3 4 Y Y Y VC A A A D D D Days post-infection 9 3 µM TCID50/ml log 10 scale 8 X 1µ M Infectious titers 7 PGL 221 6 0.33 µM 5 0.11 µM 4 3 µM 3 2 Remdesivir 1 µM Basolateral compound 1 0.33 µM exposure 0 0.11 µM 2 3 4 Y Y Y VC A A A D D D Days post-infection Validation préclinique: ex vivo A montré l’inefficacité de nombreuse molécules envoyées en essai cliniques sans données précliniques (donc trop tôt). Une molécule ne montrant pas d‘activité en HAE n’a jamais montré de résultats positif en essai cliniques HCQ HCQ+AZM Maisonnasse et al., 2020 Imatinib Basolateral compound Cochin,Touret et al., 2021 exposure Intérêt croissant En développement Touret et al., 2021 pour d’autre virus Validation préclinique: in vivo Une fois les étapes précédentes passées on valide l’activité de la molécule in vivo En fonction de l’activité in vitro, de la toxicité et de la pk on va tester plusieurs doses avec plusieurs schéma thérapeutiques Une fois par jour, deux fois etc… En préventif, au moment de l’infection et en curatif Voie orale, ip, musculaire, veineuse Il est nécessaire de posséder de bons modèles in vivo Réplication virale suffisante Proche de la maladie humaine c a d : similarité de foyers de réplications etc… En général d’abord modèle murin et après modèle singe ( si disponible) in vivo: ex:SARS-CoV-2 Hamster doré syrien 4 week-old females Naturellement susceptible Maladie proche de la forme la plus rependue chez l’homme Infection robuste Lung tissues (5 day pi) des poumons Viral replication Clinical follow-up Lung histology Lungs Nasal washes Plasma Validation préclinique: in vivo Pourqoi les molécules du crible Courtesy of Dr Driouich ne marchent pas? Limite des criblages: exemple du SARS-CoV-2 Drug-induced phospholipidosis confounds drug repurposing for SARS-CoV-2 by Tia A. Tummino, Veronica V. Rezelj, Benoit Fischer, Audrey Fischer, Matthew J. O’Meara, Blandine Monel, Thomas Vallet, Kris M. White, Ziyang Zhang, Assaf Alon, Heiko Schadt, Henry R. O’Donnell, Jiankun Lyu, Romel Rosales, Briana L. McGovern, Raveen Rathnasinghe, Sonia Jangra, Michael Schotsaert, Jean-René Galarneau, Nevan J. Krogan, Laszlo Urban, Kevan M. Shokat, Andrew C. Kruse, Adolfo García-Sastre, Olivier Schwartz, Francesca Moretti, Marco Vignuzzi, Francois Pognan, and Brian K. Shoichet Science Volume ():eabi4708 June 22, 2021 Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY). Phospholipidosis -La phospholipidose médicamenteuse (DIPL) est causée par le traitement à long terme des animaux et des humains avec des médicaments amphiphiles cationiques (CAD), ce qui entraîne une accumulation intracellulaire de phospholipides dans les reins, le foie, les poumons, le cerveau, la cornée et d'autres organes (Lüllmann et al., 1975). -Le DIPL se caractérise par l'apparition d'inclusions cytosoliques constituées de structures concentriques ressemblant à de la myéline, appelées corps lamellaires, qui sont d'origine lysosomale. La DIPL a été observée pour la première fois chez des rats traités à la chloroquine (Nelson et Fitzhugh, 1948), un médicament antipaludéen qui est une CAD. Breiden et al., 2019  Fig. 1 Representative examples of cationic amphiphilic drugs that are identified in SARS-CoV-2 drug repurposing screens. Criblage -Azythromycin Prestwick 1520 -Promazine -Propanolol composés en VeroE6 en 2020 Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY).  Fig. 2 Cellular phospholipidosis may confound antiviral screening results. Tia A. Tummino et al. Science 2021;science.abi4708 Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY).  Fig. 3 Quantitative relationship between phospholipidosis and viral amounts. Tia A. Tummino et al. Science 2021;science.abi4708 Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY).  Fig. 4 Phospholipidosis and spike protein measurements in the same cellular context. Tia A. Tummino et al. Science 2021;science.abi4708 Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY).  Même résultats obtenus à l’UVE Fig. 5 Phospholipidosis-inducing drugs are not efficacious in vivo. sur les composes identifiés dans la prestwick. Tia A. Tummino et al. Science 2021;science.abi4708 Identifié en VeroE6 en 2020 Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution License 4.0 (CC BY). Limite des lignées cellulaires: exemple du SARS-CoV-2 Cellules VeroE6 = cellules rénales de singe=ACE2+/TMPRSS2- Limite des lignées cellulaires: exemple du SARS-CoV-2 Voie d’entrée ACE2 dépendante/ TMPRSS2 dépendante Voie d’entrée ACE2 Calu-3 dépendante/ Caco-2 TMPRSS2 indépendante Ex: VeroE6 From https://viralzone.expasy.org/ Et chez l’homme dans l’épithélium nasale/Bronchique? Limite des lignées cellulaires: exemple du SARS-CoV-2 -Les épithéliums bronchiques, nasaux et intestinaux expriment ACE2 et TMPRSS2 Que nous disent les modèles pré-clinique? Chloroquine does not inhibit infection of human lung cells with SARS-CoV-2 Hoffman et al.,2020 Aucune activité de l’HCQ chez l’homme dans des essais randomisés Limite des modèles animaux: exemple du Favipiravir -In vitro Ok -Mode d’action Ok Limite des modèles animaux: exemple du Favipiravir -Hamster Ok a haute dose -Mode d’action Ok -EX Vivo pas ok Driouich et al.,2021 -Que fait-t-on? La molécule est déjà en essai clinique Limite des modèles animaux: exemple du Favipiravir -Aucune activité antivirale du favipiravir en contradiction avec le hamster -Une maladie exacerbée pou 4 des 20 singes traités Explication : -La pharmacocinétique des médicaments chez les Primates diffère de celle des hamsters, caractérisée par un métabolisme rapide des médicaments, réduisant leurs effets toxiques et offrant la possibilité d'administrer de fortes doses chez les hamsters? -Pas activité jusqu’ a 600µM ex vivo? Concentration necessaire plus haute (toxique) dans le poumon de primate -Aucune activité du Favipiravir chez l’homme dans des essais randomisés Seule molécule à avoir montré une telle différence dans les modèles pré-clinique Conclusion Bien choisir son modèle cellulaire pour le criblage et la validation! Valider l’activité dans d’autres cellules ( attention au « cell specific effect ») Valider dans le tissu cible (si possible) Valider le mode d’action ( relevance face aux sites de réplication viraux) Validation in vivo (si possible sur 2 modèles) Vérifier la Pk ii-Application aux antiviraux -Exemple de la Dengue: crible phénotypique et développement d’un antiviral prometteur La dengue La dengue est la maladie virale endémique-épidémique qui menace le plus grand nombre de personnes dans le monde. Elle est transmise par des moustiques du genre Aedes. A ce jour, il n'existe aucune molécule antivirale sur le marché. La dengue est un flavivirus présentant une grande diversité génétique : 4 serotypes Plusieurs genotypes. Touret et al., 2019 Criblage Posséde une chimitothéque 35.000 to 50.000 “high value” composés Criblage avec une souche de Dengue 2 produisant des effets cytopathiques en culture de cellules Mesure de la capacité des composes à prévenir la mort cellulaire Identification d’un composé Discovery of Indole Derivatives as Novel and Potent Dengue Virus Inhibitors. Bardiot et al., 2018 Optimisation/SAR Kesteleyn et al., 2023  Characterisation of the viral target Validation et préclinique JNJ-A07 Kaptein et al., 2021  Characterisation of the viral target Validation et préclinique JNJ-A07 Kaptein et al., 2021  Pan serotype/ pan genotype activity Validation et préclinique Vérification que l’effet n’est pas cellule spécifique/ vérification dans une lignée cellulaire relevante Vérification que la JNJ-A07 molécule est pan serotype/ pan genotype Kaptein et al., 2021 Validation et préclinique In vivo activity: préventif JNJ-A07 Kaptein et al., 2021  In vivo activity: curatif Validation et préclinique JNJ-A07 Kaptein et al., 2021 Optimisation II Kesteleyn et al., 2024 Validation et préclinique II Pan serotype/ pan genotype activity JNJ-1802 Mosnodenvir Goethals et al, 2023 Validation et préclinique II Pan-serotype activity in vivo JNJ-1802 Mosnodenvir Goethals et al, 2023 Validation et préclinique II Pan-serotype activity in vivo JNJ-1802 Mosnodenvir Goethals et al, 2023  In vivo activity in NHP Validation et préclinique II JNJ-1802 Mosnodenvir Goethals et al, 2023 Validation et préclinique II In vivo activity in NHP JNJ-1802 Mosnodenvir Goethals et al, 2023 Validation et préclinique II Pan-serotype activity in vivo Pan serotype/ pan genotype activity JNJ-1802 Mosnodenvir In vivo activity in NHP Le travail ne s’arrête pas… Goethals et al, 2023 Suivi de la susceptibilité des souches circulantes JNJ-1802 (Mosnodenvir) blocks NS3/NS2B-NS4B interaction Reduction in EC50 compared with wt and natural occurrence of JNJ-1802 mutations Fold reduction in EC50 Natural occurrence compared (% of ViPR database) with wildtype Resistance mutations prevent blockage of the NS3-NS4B NS4B mutation DENV-2 DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4 interaction induced by JNJ-1802 V91A 180 0% 2.2% 0.5% 0% L94F 490 0% 0.1% 0% 0% T108I 11 0% 0% 0% 1.2% Suivi de la susceptibilité des souches circulantes Co-directed with Genomic surveillance reveals a dengue 2 virus epidemic lineage with a marked Dr Raphaelle Klitting decrease in sensitivity to Mosnodenvir Bouzidi#, Sen# et al.,2024 (accepted Nature com) Suivi de la susceptibilité des souches circulantes Co-directed with In vitro characterization of V91A strains against JNJ A07 and JNJ 1802 Dr Raphaelle Klitting Bouzidi#, Sen# et al.,2024 (accepted Nature com) Suivi de la susceptibilité des souches circulantes Co-directed with Mosnodenvir resistance mutation V91A has emerged repeatedly within DENV-2 Dr Raphaelle Klitting serotype over the last 30 years Bouzidi#, Sen# et al.,2024 (accepted Nature com) Suivi de la susceptibilité des souches circulantes Co-directed with The mosnodenvir-resistance mutation V91A previously also emerged in DENV-3, but Dr Raphaelle Klitting has not been reported in DENV-1 or DENV-4 Bouzidi#, Sen# et al.,2024 (accepted Nature com) ii-Application aux antiviraux -Exemple du SARS-CoV-2: crible in silico SARS-CoV-2: inhibiteur de 3CLpro Jin et al., 2020 Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors Buxeraud et al., 2022 Enistrelvir SHINOGI Criblage enzymatiques utilisant la spectrométrie de masse pour composés IC50 < 10 μM. Unoh et al., 2022 Discovery of S-217622, a Noncovalent Oral SARS-CoV-2 3CL Protease Inhibitor Clinical Candidate for Treating COVID-19 Enistrelvir: optimisation Unoh et al., 2022 Discovery of S-217622, a Noncovalent Oral SARS-CoV-2 3CL Protease Inhibitor Clinical Candidate for Treating COVID-19 Ensitrelvir: préclinique In vitro In vivo Unoh et al., 2022 Discovery of S-217622, a Noncovalent Oral SARS-CoV-2 3CL Protease Inhibitor Clinical Candidate for Treating COVID-19 Ensitrelvir: clinique phase 2a phase 3 A Randomized Phase 2/3 Study of Ensitrelvir, a Novel Oral SARS-CoV-2 3C-Like Protease Inhibitor, in Japanese Patients with Mild-to-Moderate COVID-19 or Asymptomatic SARS-CoV-2 Infection: Results of Efficacy and Safety of 5-Day Oral Ensitrelvir for Patients With Mild to Moderate COVID-19 TheSCORPIO- the Phase 2a Part. Mukae et al., 2022 SR Randomized Clinical Trial. Yotsuyanagi et al., 2024 Ensitrelvir→Xocova Syed, Y.Y., 2024 Ensitrelvir Fumaric Acid: First Approval. Questions/informations [email protected]