Cours de Biologie Moléculaire PDF

Cours de biologie moléculaire Chapitre n°1 : Rappel du cours de 2ème Le code génétique est constitué de 4 bases : - Purines (bases bicyclique) -> Adénine et Guanine - Pyrimidine (bases monocycliques -> Cytosine, Uracile, Thymine. Un codon est composé d...

Cours de biologie moléculaire Chapitre n°1 : Rappel du cours de 2ème Le code génétique est constitué de 4 bases : - Purines (bases bicyclique) -> Adénine et Guanine - Pyrimidine (bases monocycliques -> Cytosine, Uracile, Thymine. Un codon est composé de 3 bases ce qui fait que 43 = 64 codons donnent 20 acides aminés. Les bases se lient à un sucre : - Ribose (ARN) -> 2’ on aura OH - Désoxyribose (ADN) -> 2’ on aura un H -> La base + le sucre donnent un nucléoside ou un désoxynucléoside -> La base + le sucre + le phosphate donne un nucléotide ou un désoxynucléotide. Au stade de nucléotide, on parle d’acide désoxycytidylique. Quand on veut allonger le nucléotide, en position 3’, on a un OH. Cet OH va se fixer au groupement phosphate de la base qu’on veut insérer. - Le code génétique - Il a 3 caractéristiques : - Universel car il est le même chez pratiquement tous les être vivants. - Dégénéré car 1 acide aminé pour plusieurs codon. - Non chevauchant car 1 codon est spécifique pour 1 acide aminé mais l’inverse pas le cas. Il y a 3 codons stop -> UAA, UAG, UGA. Ils arrêtent la traduction Le codon start est l’AUG. Il commence la traduction en protéine. - Anatomie du génome humain - L’ADN se trouve dans le noyau et est replier autour de 8 histones donnant le nucléosome. Ensuite le nucléosome est condensé en chromatine et puis en chromosome. De plus l’ADN est chargé négativement. L’ADN mitochondrial est un ADN transmis exclusivement par la mère et il peut être mutées causant des pathologies liées au sexe. -> On étudie les maladies génomiques sur le porc ou les souris car la taille de leur génome ressemble à celui de l’homme. - Du génotype au phénotype - La transcription se fait dans le noyau et la traduction dans le cytoplasme. L’ADN est composé de 2 chaines polynucléiques antiparallèle et complémentaire. -> Entre les bases, il y a des ponts d’hydrogène. Entre la thymine et l’adénosine, il y en a 2 et entre la cytosine et la guanine, il y en a 3. La guanine et la cytosine permet de mieux stabiliser l’ADN et ils sont donc plus difficile à séparer. On lie une purine à une pyrimidine car elles doivent être séparer par la même distance pour garder l’hélice de l’ADN stable. (L’une a 6 carbones l’autre 9) donc si on lie 2 de 6 carbones entre elles la distance entre les 2 ne sera pas identique à celle entre les 2 de 9 carbones. De manière vertical, 2 nucléotides sont reliés par leurs sucres (au niveau 3’ du 1er nucléotide) et par leur lien phosphodiester (au niveau 5’ du 2ème nucléotide). L’ADN est enroulé autour d’histones formant le nucléosome. Pendant l’apoptose, l’ADN est partiellement déroulé pour que les endonucléases (protéines qui coupe l’ADN) puissent accéder à l’ADN et de le fragmenter entre les nucléosomes. - Types d’ARN - Il existe différents types d’ARN :- hnRNA : précurseurs des ARNmature - snRNA : Small nucléotide ARN - hnRNA et snRNA : Processus de transcription - ARNt et ARNr : Processus de la traduction. -> Il y a 80% de ARNr, 15% de ARNt et 5% ARNm. - Structure d’un gène eucaryote - Exon : partie codante, qui porte l’information génétique Introns : partie non codante qui permet de séparer les séquences codantes pour avoir une transcription correcte. -> en jaune : ce sont des exons mais des parties du gène qui ne sont pas traduite et qu’on retrouve tel quel dans l’ARNm mais pas dans la protéine. en gris : ce sont des exons donc des parties du gènes qui sont traduite et qu’on retrouve dans l’ARNm et dans la protéine. Le promoteur est une région en amont du gène où va se fixer l’ARN polymérase II. Ensuite on a aussi des séquences régulatrices qui servent de répresseur ou activateur. Dans le promoteur, il y a une boite TATA que va reconnaitre les facteurs de transcription et s’y fixer. Ensuite, ils vont appeler l’ARN polymérase II. Le promoteur + facteurs de transcription + ARN polymérase II forment le complexe d’initiation. La protéine TFIID se fixe à la boite TATA et fixe les protéines TFIIA et TFIIB pour qu’ils stabilisent le TFIID sur la boite TATA. Ensuite, le TFIIF et l’ARN polymérase vont se lier au complexe déjà formé. Ensuite s’ajoute le TFIIE et le TFIIH. Le TFIIH permet de dérouler l’ADN. -> à la fin il y aura une phosphorylation qui permet de détacher l’ARN polymérase II et de commencer la transcription. Le brin 5’-3’ est le brin codant ou brin sens donc ce n’est pas lui qui est transcrit mais c’est le brin 3’-5’ qui est le brin antisens et qui va créer une copie du brin sens.  => Fragments d'Okazaki : L’hélicase permet d'ouvrir les 2 brin d'ADN. On aura le brin 3' à 5' et le brin 5' à 3'. L'ADN polymérase ne peut lire un brin que de 3' à 5' et créer un brin que de 5' à 3'. -> Donc pour le brin 3' à 5' (leading strand) aucun souci c'est dans le bon sens de lecture, donc il pourra directement créer son brin 5' à 3'. -> Par contre pour le 5' à 3' (lagging strand) ce n’est pas le bon sens de lecture donc on va se baser sur le brin 3' à 5' et on va lui créer une amorce complémentaire grâce à la primase qui se met sur le brin 3' à 5'. L'amorce sera de 5' à 3' et servira de point de départ pour l’ADN polymérase. L'ADN polymérase va prolonger cette amorce par des fragments, fragments d'Okazaki. Il n'y aura pas de problème parce que l'ADN polymérase lit sur le brin 3' à 5' tout en synthétisant grâce à l'amorce de 5' à 3'. L'ADN ligase va ensuite coller les différents fragments d'Okazaki. L’UTR donnent une stabilité à l’ARN et permet la traduction de l’ARNm. En cas de mutations dans les régions UTR, il peut y avoir des dysfonctionnements sévères. - Maturations du ARN pré-messager - Il faut 3 conditions pour que l’ARNm soit mature et puisse sortir du noyau pour aller dans le cytoplasme : - La coiffe méthylée au 5’. Elle protège contre la dégradation par les ribonucléase et phosphatase. Elle permet aussi le transport vers le cytoplasme et le recrutement des ribosomes pour la traduction. C’est à cet endroit que la sous-unité du ribosome va se lier. - La queue poly-AAAA : Elle se fait après la transcription au niveau du 3’. Elle a le même rôle que la coiffe. Donc elle permet le transport vers le cytoplasme, la protection et elle permet au ribosome de se lier. L’ajout de la queue poly-A se fait par une enzyme spécifique -> poly(A) polymérase de type II. - Le splicing : l’épissage. Il se fait dans le noyau et va permettre d’enlever les introns et de lier les exons entre eux. L’épissage est produit par le spliceosome. L’ARN pré-messager contient des signaux spécifiques dans les introns. Il y a des sites GU (donneur du 5’) et des sites AG (accepteur du 3’). Il y a aussi un site de branchement où se lie le spliceosome (structure avec des snARN). -> Liaison de l’extrémité 5’ de l’intron avec un OH 2’ de l’Adénine dans le site de branchement. Ensuite le 3’ de l’intron se détache du 5’ de l’exon suivant. Ensuite une liaison phosphodiester va permettre de relier les exons en éliminant l’intron. On peut avoir plusieurs protéines avec un même splicing car il est alternatif. - traduction - Elle se fait dans le cytoplasme grâce au ribosome et à l’ADN de transfert. Le ribosome va interpréter l’information de l’ARNm et il va le traduire en acide aminé. Les acides aminés ensemble donne la protéine. Mi-ARN : petite séquence d’ARN complémentaire à l’ARNm. Si ces séquences se lient à l’ARNm, celui-ci ne pourra pas être traduit. Polysome : ensemble de ribosome relié par un ARNm. - Lésion de l’ADN, macrolésion - 1°/ Délétion : perte du matériel génétique ou délétion qui peuvent causer des erreurs pendant la réplication. 2°/ Duplication : copie d’un gène et on obtient 2 copies. 3°/ Amplification : multiplication d’un gène (donnant plus de 2 copies) 4°/ Fusion : échange du matériel d’un chromosome avec un autre. - Lésions de l’ADN, microlésion - Il faut voir où se trouve la mutation : promoteur, introns, exons, UTR. 1°/ Substitution : - Transition : remplacement d’une purine par une purine et d’une pyrimidine par une pyrimidine - Transversion : remplacement d’une pyrimidine par une purine et inversement. 2°/ Suppression d’un nucléotide -> changement du cadre de lecture. Si plusieurs rien de changement ça peut apporter un plus ou un moins. C’est pareil avec l’insertion. 3°/ Mutation des UTR : ARNm moins stable et demi-vie réduite. On aura moins de protéine produite avec possible changement du cadre de lecture ce qui peut donner une protéine différente. 4°/ Mutation des introns : aucune conséquence sauf si sur la zone de l’épissage 5°/ Mutations de l’exons : problème 6°/ Mutations du promoteur : Dérèglement de la transcription. 3 types de mutations exoniques : - Modification du cadre de lecture - Mutation non-sens : codon stop. La traduction se finit plus tôt et on aura une protéine absente, petite ou non fonctionnelle. - Mutation faux sens : souvent un changement de nucléotide causant un changement d’acide aminé pouvant rendre la protéine non fonctionnelle. - Mutation somatique ou germinales - Mutation constitutionnelle : mutation d’avant la naissance et qu’on a dans toutes les cellules de l’organisme (même dans les germinales). Elles peuvent être transmises aux enfants. Mutation somatique : mutation d’après la naissance et qui ne touchent pas les cellules germinales. Elles ne peuvent pas être transmises aux enfants. -> Des clones de cette cellule se forme pouvant causer des tumeurs Mutation cellule germinales : mutation transmise par les gamètes aux descendant. La majorité des mutations dangereuses sont récessives et se transmettent de façon dominante (les 2 parents ont transmis ce gène) mais les parents ne ressentent rien car pour eux elle est récessive. Chapitre n°2 : Extraction ADN / ARN -> PCR - Extraction ADN/ PCR - Extraction des acides nucléiques qui sont dans le sang. Pour y arriver, on enlève les éléments inutiles et on garde que les mononucléés. Pour y arriver, on utilise un liquide de faible densité qui va permettre de séparer les cellules mononuclées (vers le haut) des autres constituants. - End-point PCR - C’est une PCR classique où on va produire un brin ADN est produit à partir d’un brin matrice à l’aide de l’ADN polymérase. Ensuite, des désoxyribonucléotides vont s’ajouter à l’ADN qui se crée dans le sens 5’-3’ par des liaisons phosphodiesters. -> L’objectif est d’amplifier une région cible de d’ADN avec une grande sensibilité pour bien le voir sur le gel d’agarose à l’aide d’un agent intercalant. Il faut une bonne température de fusion (Tm) pour une bonne hybridation des amorces. Pour une meilleure réaction, on utilise des additifs :- Dimethylsulfoxide (DMSO) qui permet d’augmenter la température de fusion pour une dénaturation plus facile des régions compliqué comme les régions riche en GC. - Trimethyl-glycine (Betaïne) qui permet une amplification et un séquençage plus efficace des régions riches GC car il permet de réduire les différences de stabilité entre GC et AT. (on sait que les liaisons GC sont plus stables grâce aux 3 ponts d’hydrogène) Donc, elles vont stabiliser l’ADN en réduisant la forte liaison entre GC pour que la température de fusion soit la même pour séparer GC et AT. Les contrôles permettent la qualité et la fiabilité de la manipulation. -> Le contrôle positif utilise un ADN de référence connu qui est amplifié si la réaction fonctionne bien. S’il n’est pas amplifié, pas d’interprétation. -> Le contrôle négatif utilise de l’eau pour vérifier s’il y a une contamination ou pas. Il y a 2 types de contrôle négatif : - un au niveau des locaux -> contamination environnementale. - un au niveau des hottes -> contamination interne. A la fin, on réalise un séquençage qui permet de vérifier que la zone cible a bien été amplifié. - Multiplex PCR - La PCR multiplex est l’amplification de plusieurs régions de l’ADN à l’aide d’une même PCR. Il faut des amorces adaptées comme des amorces consensus dégénérées ou spécifique selon la région recherchée. Les amorces consensus sont des alignements de séquences génétiques venant de différentes espèces. Ces amorces vont cibler une région qu’on retrouve dans différentes séquences bactériennes. -> Amorces consensus non dégénéré qui se fixe à des régions 100% identiques. (Bleu) -> Amorces consensus dégénéré qui sont composé de bases alternatives ce qui permet de s’hybrider à des petites séquences différentes. (Rouge). Il y a aussi des amorces spécifiques qui sont créer pour chercher une espèce dans un groupe d’espèce qui lui ressemble. Exemple : Les Staphylocoques. Le gène femA est un gène qu’on retrouve dans toutes les espèces de Staphylocoques ce qui est parfait pour les amorces consensus. Les amorces spécifiques vont permettre de différencier les 5 espèces de Staphylocoques en amplifiant des régions différentes de chaque espèce. On utilise les amorces spécifiques, par exemple, pour le gène mecA qui permet de voir si les bactéries sont résistantes à la Méticilline. Les fragments PCR des gènes femA et mecA sont de tailles différentes et donc plus simple à voir par électrophorèse sur gel d’agarose. En pratique, la PCR multiplex peut montrer des interférences entre amorces ce qui donnent des dimères d’amorces (cadre pointillé). C’est ce qui arrivent quand des amorces se lient entre elles au lieu de se lier à la séquence. -> Ces dimères diminuent la qualité de l’amplification. C’est un processus complexe car il faut produire des amorces assez spécifiques pour amplifier des régions cibles sans interférences et en gardant leur efficacité dans une réaction unique. -> Il faut des fois créer des amorces plus précises, ajuster les conditions de réaction ou encore l’ajout d’additifs pour une meilleure spécificité et une meilleure efficacité. - Nested PCR ou PCR nichée - Technique d’amplification en 2 étapes. Les 2 amplifications utilisent des amorces différentes pour augmenter la sensibilité et la spécificité de la détection. -> 1ère amplification : on amplifie une région en particulière en utilisant un couple d’amorces dit externe. On aura un fragment de PCR assez long. Mais à ce moment, on s’en fou de la spécificité et de la sensibilité. -> 2ème amplification : on utilise la première PCR comme matrice. On utilise un autre couple d’amorces dit interne qui cible une plus petite région du fragment déjà amplifié. Elle permet d’augmenter la sensibilité et la spécificité. Avantages : - Augmentation sensibilité et spécificité Inconvénient : - Augmentation du risque de contamination parce qu’on transfère le produit de la 1ère PCR vers un 2ème tube pour la 2ème PCR. -> En raison de cet inconvénient, La Nested PCR est utilisé que dans des cas exceptionnels. On préfère utiliser la PCR en temps réel. - Reverse transcription PCR - C’est une technique qui permet de créer un ADN à partir d’un ARN. On utilise une enzyme appelé transcriptase inverse qui est un ADN polymérase à ARN dépendante. Avant de pouvoir amplifier l’ADN, il faut convertir l’ARN en ADN. On commence par une reverse transcription qui permet la transformation de l’ARN en ADN simple brin complémentaire (cDNA). Il faut ajouter des amorces et il y a 3 approches pour y arriver. 1°/ Utilisation d’une amorce poly T : Cette amorce s’hybride à la queue poly-A de l’ARNm. Ensuite la transcriptase inverse se réalise. 2°/ Utilisation d’hexamères aléatoires : Ce sont des amorces avec 6 nucléotides aléatoires. Ils se fixent sur différentes régions de l’ARN permettant la transcription de plusieurs fragments d’ARN en cDNA sans connaitre exactement une séquence de l’ARN. 3°/ Utilisation d’une amorce spécifique : L’amorce va s’hybrider à une séquence particulière de l’ARN ensuite elle va la transcrire en cDNA. Il faut faire attention de ne pas dégrader l’ARN donc les manipulations se font en RNAse free c’est-à-dire sans utiliser d’ARNases. Ensuite, la 2ème étape est la PCR. Donc après la 1ère étape, on a un ADN simple brin complémentaire (cDNA), il va être transformé en double brin grâce à une amorce qui s’hybride au cDNA. Une fois qu’on a les 2 brins, on fait une PCR en temps réel ou une end-point PCR. - Amplification isotherme - Ce n’est pas une PCR. C’est une technique d’amplification à température constante qui utilisent des enzymes spécifiques pour copier des acides nucléiques en particulier. -> TMA (transcription mediated amplification) ou NASBA (Nucleic Acid sequence Based Amplification) RPA (recombinase amplification polymerase) LAMP les signaux de fluorescence sont mesurables et visible en temps réel sur un écran. -> Types de molécules fluorescentes Il n’y a pas besoin pour cette molécule de séquence cible ce qui peut poser problème car elle peut se fixer à des structures indésirables comme les dimères d’amorces créant des signaux non spécifiques. Après chaque cycle, la molécule se remet entre les 2 brins des ADN formé et le principe recommence. Il faudra une analyse post-PCR pour différencier les produits spécifiques des signaux non spécifiques. 2°/ Sondes Oligonucléotidiques (Probes) : spécifique. Elles sont spécifiques à une séquence cible. Ce sont des courtes séquences de nucléotides avec 2 éléments de fluorescence. -> Rapporteur : molécule de fluorescence lié au 5’ -> Quencher : molécule au 3’ qui inhibe la fluorescence quand elle est proche du rapporteur. Il faut alors que le rapporteur et le quencher soient séparé pour produire de la fluorescence. Pour y arriver, il faut que la polymérase rencontre la sonde et la dégrade pour séparer les 2 éléments. Ces sondes sont tellement spécifiques qu’il n’y a pratiquement pas de fluorescence non spécifique. On les utilise surtout en cas d’applications ayant besoin de grande précision. -> De quoi dépend la quantité de fluorescence émise Si les amorces sont mal créées et ils ont tendances à se lier en 5’ et 3’ se liant ainsi entre elles créant des dimères alors il y aura aussi de la fluorescence et on aura une diminution de la spécificité des résultats. -> Molécules fluorescentes non spécifiques couplées aux sondes La machine doit être réglé à la longueur d’onde d’absorption spécifique de la molécule de fluorescence pour qu’elle puisse être détectée correctement. 2°/ Quencher : Molécule non fluorescente se trouvant sur le 3’ de l’oligonucléotide. Les quencher les plus utilisé sont les Black hole quenchers (BHQ). Ce sont des molécules qui absorbent la fluorescence et la transforme en chaleur ce qui évite les signaux parasitent. Les BHQ sont beaucoup utilisé pour le multiplexing car avec plusieurs sondes et chacune avec un rapporteur et un BHQ spécifique, on peut détecter plusieurs séquences cibles en même temps. Le fait que chaque rapporteur émet à une longueur d’onde précise permet de différencier les signaux de fluorescence. Cette méthode est appelée multiplex real time PCR. -> Principe de la sonde PCR dans la real time PCR paramètres de quantification et de normalisation en PCR en temps réel Exemple : Un échantillon avec la même quantité d’ADN qu’un autre mais ayant plus de réactif de fluorescence que le 2ème aura une fluorescence plus grande que le 2ème. On aurait alors du mal à les comparer directement l’un à l’autre. Le ROX donne une valeur de référence fixe dans chaque tube de réaction. En mesurant le ROX, on peut calculer le facteur de normalisation qui corrige les variations causées par les techniques. On ajuste les fluorescences des échantillons en fonction de la fluorescence du ROX. Ça permet de voir uniquement les variations causées par des différences biologiques ou analytique. 3°/ Normalisation : La normalisation est le rapport entre 2 types de fluorescences détectés. Celle du rapporteur et celle de la référence négative. Ce rapport est exprimé en indice standardisé « RN » (Normalized reporter). Elle permet de réduire l’impact de variation non spécifique comme la fluorescence de fond. -> Fluorescence de fond sont des signaux de sources non spécifique qui sont sous la ligne « Threshold » (ligne de base). Cette ligne est calculée pour exclure le plus de ligne de fond possible. La fluorescence spécifique se trouve au-dessus de cette ligne. !"#$"%!#é é(!%%!)" *$+)*#$* 𝑅𝑁 = !"#$"%!#é é(!%%!)" *é, +-%%!.$ (*)0) Pendant les premiers cycles, la PCR est instable et pour éviter les interférences causées par ces variations de fond, on place Threshold assez haut. Le moment où la fluorescence dépasse cette ligne est appelé cycle Threshold (CT) Le cycle Threshold est important car il montre à partir de quel cycle la fluorescence devient spécifique. A ce moment-là, il y a un changement de fluorescence « ΔRN » qui est la différence entre la fluorescence spécifique (RN+) et la fluorescence de fond (RN-). Si ce ΔRN ne vaut pas 0 alors on considère que l’échantillon est positif pour ce qu’on recherche. -> En pratique, plus le CT est bas, plus la concentration de ce qu’on cherche est haute. 4°/ Quantification : courbes d’amplification en temps réel. La quantification se base sur l’analyse de la phase exponentielle car c’est à ce moment que la réaction est la plus efficace et la plus linéaire. Cette phase se passe directement après le CT. Il y a 4 phases : - Phase initiale (background) : La fluorescence est instable et ininterprétable. Elle se situe sous le Threshold. - Phase de détection (CT) : Moment où la fluorescence dépasse le Threshold. C’est la limite de détection montrant que ce qu’on recherche est dans l’échantillon.  - Phase exponentielle (ou linéaire en échelle logarithmique) : Phase d’amplification maximale de ce qu’on cherche et où les résultats sont les plus précis. La fluorescence augmente proportionnellement à la quantité d’ADN amplifié. - Phase plateau : Quand les réactifs de la PCR sont épuisés ou que la réaction a atteint ses limites. La fluorescence est stable. -> Types de sondes spécifiques Le pourcentage en GC dans la sonde est de 40-60% ce qui est parfait car c’est assez stable pour bien se lier à la cible mais pas trop non plus pour pas être dénaturer par la polymérase et empêcher la fluorescence. -> Pas de G en 5’ pour éviter l’inhibition de la fluorescence. -> Une température de fusion > que celle des amorces. -> max 3 G qui se suivent préférence pour les C. La mesure de fluorescence se fait pendant l’élongation. 2°/ Sonde Minor Groove Binding (MGB) : Les sondes ont des molécules (MGB) qui rentrent dans le sillon mineur de l’ADN permettant une meilleur stabilité et liaison avec la sonde. Les sondes seront plus courtes et la température de fusion plus élevé. On utilise ces sondes surtout pour la détection de mutations ponctuelles. La fluorescence est mesurée pendant l’élongation. 3°/ Sondes locked nucléic acid (LNA) : Ce sont des sondes modifiées où certains nucléotides comportent un pont méthylène entre 2 atomes d’oxygène dans le sucre de l’acide nucléique (en 2’ et 4’ du ribose). On aura une structure bicyclique qui rend la sonde plus dure et plus stable. La sonde sera alors plus spécifique et s’hybridera plus facilement à la séquence cible même si la correspondance des bases n’est pas parfaite. On l’utilise surtout pour détecter des mutations spécifiques comme SNPs (polymorphisme de nucléotides simples). -> Ces sondes ont une température de fusion plus élevé et donc elles seront plus courtes tout en restant stables. La fluorescence est mesurée pendant l’élongation. 4°/ Sondes Beacon : Elles ont une séquence palindromique à leurs extrémités permettant à la sonde se replier sur elle-même formant ainsi une boucle avant qu’elle ne rencontre sa cible. Cette forme l’empêche d’émettre une fluorescence puisque le quencher est proche du rapporteur. Une fois en contact avec l’ADN cible, la boucle se déplie et la sonde s’hybride. La fluorescence est mesurée pendant l’hybridation car c’est à ce moment que la sonde est liée à sa cible. On aura une détection plus spécifique et sensible. 5°/ Sonde fluorescence resonance energy transfer (FRET) : Sonde avec une sonde donneuse et une sonde accepteuse. La fluorescence est émise quand les 2 sondes sont proches (1-10 nucléotides) et lié à leur séquence cibles respectives. L’excitation de la sonde donneuse transfère son énergie à la sonde accepteuse créant ainsi la fluorescence. Ce système est aussi appelé Kissing probe.  -> Principes généraux de lectures des résultats La température de fusion égale la température où 50% des molécules d’ADN sont dénaturé. La courbe de fusion montre la diminution de fluorescence quand cette température augmente et cette courbe permet de détecter les différences de séquence entre les amplicons comme c’est le cas pour les SNPs. La dérivée première de la courbe de fusion permet de détecter le point de fusion (pic). Ce pic donne la température où la dénaturation des brins d’ADN s’est produite rapidement permettant de trouver la température de fusion de chaque amplicon. -> Si 2 amplicons n’ont pas les mêmes nucléotides alors la TM sera différente et on aura alors des courbes de fusions différentes. En comparant les courbes, on peut voir les variations génétiques comme les SNPs et d’identifier les différentes séquences comme pour les SNPs où une paire de base entre les amplicons change. -> Intérêt de l’analyse qPCR La PCR donne aussi des informations supplémentaires à la quantification et elle est efficace pour les analyses de routine. -> Quelles analyses peut-on faire par mesure de fluorescence en temps réel, Applications ADN : pour l’identification de pathogènes. Cette technique nous permet de détecter les responsables d’infections et de contaminations. -> ARN : pour l’identification de pathogène à ARN comme le virus Ebola ou de quantifier des cellules cancéreuses résiduelles. Exemple : quantification d’ARNm spécifique aux cellules cancéreuses pour voir l’évolution de la maladie et l’efficacité du traitement. -> Mutations génétiques : Exemple : statut génétique d’un patient drépanocytaire. Cette technique nous permet de faire la différence entre un hétérozygote et un homozygote.  -> Bactérie : qPCR, sonde TaqMan spécifique au Mycoplasma pneumoniae Des amorces sont créer pour viser une région spécifique de cette bactérie mais il faut faire attention qu’elles soient assez spécifiques pour qu’elles ne produisent pas des fluorescences avec d’autres espèces. On teste les amorces d’abord sur un ADN de M.pneumoniae de référence avec SybrGreen. Pour y arriver, on fait une dilution sériée de l’ADN de référence et on regarde la fluorescence avec SybrGreen qui permet de voir si les amorces fonctionnent bien. Ensuite, on vérifie la spécificité de la PCR en appliquant les mêmes amorces mais sur d’autres espèces liées aux Mycloplasma et des espèces non liées. Si on a de bons résultats, sans amplification croisé alors la PCR est spécifique à la bactérie Mycoplasma penumoniae. Une sonde est ajoutée aux 2 amorces pour plus de spécificité. La sonde contient un GC proche de 50% et une température de fusion plus grande que celle des amorces pour une meilleur hybridation. Ensuite, on détermine la limite de détection (LOD) à l’aide de la plus petite quantité de M.pneumoniae détectable par fluorescence qPCR. -> La plus petite quantité a été déterminée à 2,5 fg par échantillon. Ensuite on la convertie en nombre de copies de M.pneumoniae pour avoir une mesure plus précise de la concentration d’ADN dans l’échantillon. Ça donne une estimation du nombre exact de copies du gènes cible dans l’échantillon testé. Pour finir, on teste l’efficacité du système de qPCR. On fait des dilution sérié d’ADN de M.pneumoniae et on mesure le cycle Threshold pour chaque concentration. Ensuite, on trace une courbe de calibration (concentration en fonction de la fluorescence mesurée). On aura une équation de droite où : Y = CT mesuré, X = la concentration en ADN, a = pente et b= L’intercept théorique de la droite. -> L’efficacité est déterminée par cette droite. Plus la pente est grande, plus la PCR est efficace. On a comparé l’efficacité de 2 qPCR (roche et TaqMan). Les résultats montrent une efficacité similaire et donc les performances sont comparables. Les 2 appareils sont fiables pour détecter le M.pneumoniae. -> VIRUS : qPCR, sonde TaqMan « spécifique virus de la varicelle » Contrôle positif et négatif sont utilisés.  -> Toxocara : Triplex qPCR, sonde TaqMan « spécifique Toxocara canis/ T.cati ; consensus nématodes dont T. canis et T. cati » qPCR triplex utilise 3 sondes TaqMan différentes chacunes liées à un marqueur fluorescents différent : - Sonde FAM avec quencher BHQ1 spécifique au T.canis - Sonde Cyr5 avec quencher BHQ3 spécifique au T.cati - Sonde Red610 avec quencher BHQ2 spécifique au Toxocara Les 3 sondes vont différencier les 3 types de contaminations grâces aux fluorescences qui ont des longueurs d’ondes différentes (logique ce n’est pas les mêmes). Ensuite, interprétation en fonction de la fluorescence. -> Signal positif FAM et Red610 = contamination par T.canis -> Signal positif Cyr5 et Red610 = contamination par T. cati -> Signal positif Red610 = Ascaridiacae (ensemble de famille avec Toxocara dedans) mais pas T.canis ou T.cati. -> Fungus : qPCR sybrGreen « consensus fungi » Pour identifier le pathogène, on fait une approche par consensus donc qPCR avec SybrGreen ce qui a permis de voir la présence d’une mycose mais sans préciser l’espèce. Ensuite, on a séquencé les fragments de PCR amplifié et ces séquences ont été comparé à une base de données et on a appris que c’est le Trichophyton rubrum. -> Détection d’un SNP : drépanocytose Ensuite séquençage, lecture de la séquence d’ADN pour détecter la mutation ponctuelle ou alors pyroséquençage qui est automatisé et permet de déterminer la séquence de l’ADN ciblé. Ou qPCR avec sonde MGB : utilisation de 2 sonde spécifique marqué avec : - FAM : voir allèle muté - VIC : voir l’allèle normal Chaque sonde produit une fluorescence unique. L’analyse des résultats se fait par interprétation de VIC et FAM -> VIC -> Homozygote normal (rouge) -> FAM -> Homozygote muté (bleu) ->Mixte rouge et bleu -> Hétérozygote (vert)  -> Hybridation moléculaire On peut avec cette technique analyser l’ADN pour voir les macrolésions ou étudier l’expression de l’ARNm pour obtenir une mesure semi-quantitative. Cette technique a été remplacé par des techniques moderne comme NGS ou autres outils plus automatisés. => Principe de l’hybridation moléculaire. Le procédé change en fonction de la cible : 1°/ Southern blot : Pour l’étude de l’ADN. Fragmentation de l’ADN en petits fragments à l’aide d’enzymes de restriction. Ensuite, dénaturation des fragments pour avoir des fragments monobrins ce qui facilite la liaison avec les sondes. Réalisation par électrophorèse : Les fragments sont séparés par taille par migration sur gel. Transfert sur une membrane : Les fragments sont transférés sur une membrane en nylon à l’aide de tampons spécifiques. Hybridation : une sonde marquée est ajoutée à la membrane et se lie avec le fragment d’ADN complémentaire révélant la présence de mutations. 2°/ Nothern blot : Pour l’étude de l’ARN. Comme le Southern blot mais pas besoin d’enzyme de restriction. Ensuite, extraction et dénaturation de l’ARN, migration par électrophorèse, transfert sur membrane et hybridation avec sonde spécifique. Chapitre n°4 : Paramètres importants de la PCR - Calcul du nombre de copie sur la qPCR - Pour interpréter les résultats de qPCR, il est préférable de traduire la quantité d’ADN détectée en un nombre de copies de génome bactérien pour une meilleure compréhension pratique. Chaque bactérie a un génome unique et il est possible de le relier à une quantité mesurée d’ADN. -> Pour cette conversion, on prend l’exemple du Mycoplasma pneumoniae où le génome contient environ 800 000 paires de bases. Le poids moyen d’un nucléotide est de 327 daltons mais vu que ce sont des paires de bases c’est plutôt 654 daltons. Le calcul est -> Donc 1fg d’ADN de M.pneumoniae correspond à 1,129 copie du génome. Ce rapport peut être utilisé pour convertir une masse d’ADN mesurée pendant une qPCR en un nombre de copies de génome. Le seuil de détection (LOD) est aussi déterminé par une dilution sériée d’ADN. A chaque dilution, la quantité d’ADN diminue de manière connue ce qui augmente proportionnellement le nombre de cycle pour détecter le signal. -> On peut tracer la courbe standard reliant les valeurs du CT à des concentration d’ADN ou copie du génome. Le LOD est la concentration la plus faible qui peut être détecté de manière fiable. Pour M.pneumoniae, la qPCR peut détecter une copie de génome qui est le seuil de détection sensible. - Efficacité (E) en cours de PCR - C’est le nombre de copie d’ADN produite à chaque cycle normalement l’efficacité est de 100 % (E=1) et à chaque cycle on a le double. -> Des facteurs peuvent rendre la PCR moins efficace : - Consommation des réactifs : plus la PCR avance, plus les réactifs sont consommés donc vu qu’il y en a moins, l’efficacité est moins grande. - Présence d’inhibiteurs : s’il y en a dans les échantillons, l’activité de la polymérase est moins grande donc moins efficace. - Créations d’amorces/ Sondes : Si mal produite et un mauvais Tm peuvent rendre la PCR moins spécifique et moins efficace. - Mauvais pipetage ou dégradations des sondes - Dimères d’amorces consomment beaucoup de réactif et donc moins de réactif = moins d’efficacité. - Quantification absolue et relative - 1°/ Quantification absolue : Permet de trouver le nombre exact de copies d’ADN ou d’ARN dans un échantillon. Pour y arriver, on a besoin d’une droite d’étalonnage : -> Dilution sériée d’un étalon (plasmide ou ADN génomique) de concentration connue. Les valeurs du Ct pour les différentes dilutions permettent de tracer cette droite. Il y a une relation logarithmique entre le nombre de copie et le Ct. Ensuite, on peut mettre le Ct d’un échantillon inconnu pour trouver le nombre de copie. Exemple : Ct = 25, si on regarde la courbe, on a 3,17 ce qui correspond à 103,17 = 1482,2 copies. On utilise cette méthode par exemple pour surveiller la charge virale des personnes atteints de VIH ou pour voir l’évolution de mutations génétiques dans les cancers. 2°/ Quantification relative : Comparaison entre l’expression d’un gène cible dans différents échantillons par rapport à un calibrateur (échantillon de référence). -> On construit une courbe à partir d’un échantillon de référence (ex : lignée cellulaire ou échantillon normal). On mesure le Ct du gène qu’on recherche (de l’échantillon de référence) et on le compare à un gène de ménage (housekeeping gene, HKG). Le gène de ménage est un gène exprimé de manière constante dans toutes les cellules. Il permet de normaliser les variations entre les échantillons. Expression relative : ΔCt = Ct (gène cible) - Ct (gène de ménage) ΔΔCt = ΔCt - ΔCt (échantillon) 2-ΔΔCt Cette technique permet de voir si un gène est bien ou sous ou sur estimé. On l’utilise pour la recherche de métastase sanguine dans le cancer de la prostate. => Conditions de validation de 2-ΔΔCt : - efficacité du gène cible = efficacité du gène de ménage - Les pentes des courbes de standardisation pour les 2 gènes sont parallèles. Chapitre n°5 : Polymérase La polymérase est une enzyme qu’on retrouve durant la réplication, transcription et la réplication de l’ADN. Leur fonction principale est de synthétiser des chaines nucléotidiques (ADN ou ARN) de 5’ à 3’. - Réplication de l’ADN : fragments d’Okazaki et brins complémentaires - La réplication sert à produire des copies de l’information génétique. Pour y arriver, on fait intervenir plusieurs enzymes L’hélicase qui permet d'ouvrir les 2 brin d'ADN. On aura le brin 3' à 5' et le brin 5' à 3'. L'ADN polymérase ne peut lire un brin que de 3' à 5' et créer un brin que de 5' à 3'. -> Donc pour le brin 3' à 5' (leading strand) aucun souci c'est dans le bon sens de lecture, donc il pourra directement créer son brin 5' à 3'. -> Par contre pour le 5' à 3' (lagging strand) ce n’est pas le bon sens de lecture donc on va se baser sur le brin 3' à 5' et on va lui créer une amorce complémentaire grâce à la primase qui se met sur le brin 3' à 5'. L'amorce sera de 5' à 3' et servira de point de départ pour l’ADN polymérase. L'ADN polymérase va prolonger cette amorce par des fragments, fragments d'Okazaki. Il n'y aura pas de problème parce que l'ADN polymérase lit sur le brin 3' à 5' tout en synthétisant grâce à l'amorce de 5' à 3'. L'ADN ligase va ensuite coller les différents fragments d'Okazaki. - Types de polymérases et leurs rôles - -> ADN polymérase ARN polymérase T7 beaucoup utilisé en biologie médicale.  - Mécanisme de polymérisation - La polymérisation repose sur la formation de liaison phosphodiester entre le groupement 3’ (où il y a le OH) d’un nucléotide et le groupement 5’ (où il y a le phosphate) d’un autre nucléotide. -> Pour cette réaction, il faut une matrice (pour guider la séquence), une amorce (donnant un 3’ OH libre) et un cofacteur Mg2+ qui stabilisent le triphosphate. - Activité des ADN polymérases - Ils vont étendre d’ADN en ajoutant les nucléotides correspondant dans le sens 5’ à 3’. Elles ont aussi une activité exonucléase : - 3’ à 5’ : la polymérase va relire et corriger les erreurs de réplication en remplaçant le nucléotide incorrect. - 5’ à 3’ : la polymérase va réparer de l’ADN ex : en supprimant des amorces d’ARN dans les fragments d’Okazaki pendant la réplication. - ADN polymérase utilisé en biotechnologie - -> ADN polymérase ADN dépendant Le fragment Klenow est une version modifiée de la polymérase I où l’activité exonucléase 5’ à 3’ qui répare l’ADN a été enlevé laissant juste l’activité exonucléase 3’ à 5’ qui permet la correction des erreurs. On utilise ce fragment pour le marquage de sondes en ajoutant des dNTP fluorescent à des brins d’ADN à une température précise -> La T7 DNA polymérase est utilisée dans le séquençage de l’ADN. Elle a une activité exonucléase 3’ à 5’. On l’utilise pour des méthodes comme le random priming où les amorces aléatoires sont ajoutées et le fragment Klenow pour le marquage. 2°/ ADN polymérases thermostables : ils viennent d’organismes vivant venant d’endroits de haute température comme les eaux sulfureuses. Ces polymérases sont utilisées pour la PCR. -> a. Les polymérases natives : comme celle des Archae ont une activité terminale de transférase donc elles n’ont pas besoin de matrice pour ajouter des nucléotides. La PCR peut introduire des nucléotides par erreurs c’est pour ça qu’on utilise des polymérases d’haute- fidélité pour moins d’erreurs. -> b. Les polymérases recombinantes : enzymes dont les gènes ont été clonés souvent dans E.coli. Elles ont thermostables et ont des inconvénients comme une activité à température ambiante ce qui peut causer une hybridation non spécifique des amorces les rendant inactives à un certain moment. -> c. Polymérases modifiées : comme les polymérases à hot start ont été créer pour que les enzymes ne commencent leurs activités qu’à température optimal ce qui permet d’éviter les hybridation non spécifique et d’autres erreurs.  -> d. Polymérases modifiées « high fidelity » : Ce sont souvent un mélange de polymérase Archae et dUTPase. L’Archae permet une correction des nucléotides incorrect. Ce sont des polymérases qui ne fonctionnent qu’à haute température. Elles peuvent être combiné aussi avec des domaines de liaison à l’ADN venant d’autres protéines rendant l’amplification plus efficace. -> ADN polymérase ARN dépendant (transcriptase inverse) Terminal Desoxynucleotidyl transférase (TdT) La taille des fragments change selon où est le site de restriction ce qui permet de détecter des mutations qui touchent ces sites. Une mutation peut causer la perte ou faire gagner des sites de restriction. - Caractéristiques des enzymes de restriction - L’ADN est coupé à des palindromes spécifiques (séquences connues et symétriques). Il y a 2 types de sites de restriction : - Sites à extrémité franche : coupure nette et symétrique - sites à extrémité cohésive (sticky ends) : coupure asymétrique souvent plus stables et plus utilisé. Des enzymes peuvent reconnaitre plusieurs variantes d’un site de restriction. La quantité d’enzyme utilisé est en « unité ». 1 unité pour 1µg d’ADN en 1h. - Précautions pendant l’utilisation d’enzymes - Ils sont instables à température ambiante donc on les travaille sur glace où à -20°C ce qui fait qu’il y a des cycles de congélation et décongélation pendant les manipulations. - Contrôles dans la RLFP - Pour une détection fiable de la RFLP, il faut : - un site test pour détecter la mutation - un site contrôle qui est indépendant de la mutation et qui permet de voir si l’enzyme fonctionne bien. S’il n’est pas digéré alors surement il y a un problème technique. Normalement ils sont naturels, mais s’il n’y en a pas on peut les mettre par mutagenèse dirigée avant ou après le site test. Exemple : Détection de la drépanocytose (HbS). La mutation qui cause la drépanocytose supprime un site de restriction pour l’enzyme « BSU » qui reconnait de base la séquence CCT GAG GAG. Chez un patient normal, l’enzyme reconnait la séquence et coupe l’ADN à cet endroit. Mais chez un patient drépanocytaire, la séquence est mutée supprimant ce site et empêchant la coupure. -> Pour être sûr que l’enzyme fonctionne bien, on introduit un site de contrôle qui se met avant du site de restriction test. Ce site permet d’être sûr que l’enzyme « BSU » est active. Si le site de contrôle n’est pas digéré alors l’enzyme est inactive et donc la manipulation ne fonctionne pas. -> Chez un homozygote normal : fragments courts visible -> Chez un hétérozygote : 2 fragments courts (allèle normal) et un long (allèle muté) -> Chez les homozygotes mutés : fragments plus longs non coupé - Autre application : détection d’oncogènes (ex : Ki-ras) - Les proto-oncogènes sont des gènes importants pour le développement fœtal et la multiplication des cellules. Normalement après la naissance, l’activité diminue mais une mutation peut réactiver un proto-oncogène causant la multiplication de cellules cancéreuse. C’est le cas du gène Ki-ras qui régule la multiplication des cellules par une cascade métabolique activé par le récepteur GFR. -> Traitement : bloquer les voies métaboliques par des anticorps anti-GFR ou des inhibiteurs de tyrosine kinase. Mais les traitements sont inefficaces parce que la mutation touche le palindrome CC (A/T) GG mais un nucléotide peut empêcher la reconnaissance du site de restriction. - Mutagénèse dirigée - Elle permet de faire rentrer artificiellement des sites de restrictions. L’amorce est modifiée au niveau du 5’ où il y a un mismatch volontaire (mauvais appariement de base ex : A et G). Pendant l’amplification, ce mismatch est copié créant un site de restriction fonctionnel. - Méthode de remplacement de la RFLP - 1°/ Sonde MGB 2°/ Séquençage Sanger 3°/ Pyroséquençage 4°/ qPCR Chapitre n°7 : Clonage Le clonage permet au potentiel génique de se reproduire à l’identique un certain nombre de fois. Ça peut concerner de l’ADN, des tissus et même des êtres vivants. 2 principales applications : - thérapeutique : créer de nouveaux organes à partir de cellules pluripotentes pour remplacer un organe défectueux. - reproductif : créer des organes identiques à partir d’une cellule d’un organisme donneur. - Clonage moléculaire - Il consiste à faire des copies d’un gène en utilisant des endonucléases de restriction. Ces enzymes vont accélérer la production d’une centaine d’enzyme et la production de séquence d’ARN ou autre molécule. Pour un clonage, on introduit le gène qu’on veut cloner dans un vecteur qui permet son expression. La multiplication se fait dans un organisme vivant (souvent des bactéries). Si le matériel génique dans le vecteur s’exprime, on peut produire des protéines, vitamines et autres molécules. - Principe - On met un fragment d’ADN dans un vecteur pour multiplier une séquence particulière. On utilise des plasmides et parfois des phages comme vecteur. -> Les plasmides sont des petites structures circulaires d’ADN double brin. Un plasmide a des sites de restriction où les enzymes de restriction peuvent couper l’ADN pour faire rentrer un fragment d’ADN. Certains plasmides ont un « polylinker » (série de plusieurs sites de restriction consécutif) ce qui permet de choisir la meilleure enzyme pour ouvrir le plasmide. Pour rendre une bactérie résistance à un antibiotique on fait entrer un fragment d’ADN avec un gène de résistance dans le plasmide linéarisé. Ensuite, on utilise une ligase pour fermer le plasmide et on le fait entrer dans la bactérie. La bactérie va utiliser le plasmide pour se multiplier sauf si : - Le plasmide se referme sur lui-même sans avoir faire rentrer le fragment d’ADN. - La bactérie rejette le plasmide. - Vérification et sélection - Utilisation de marqueurs biologique pour être sûr que le fragment d’ADN soit dans le plasmide. Si le plasmide a le fragment et que la bactérie exprime le gène de résistance aux antibiotiques alors la bactérie survit par contre les bactéries sans ce plasmide meurent. Les plasmides ont aussi un ORI (origine de réplication) qui permet la réplication autonome sans dépendre de la cellule hôte. Grâce à ça, le plasmide peut se multiplier dans la bactérie. - Méthode de sélection avec le gène lac Z- On peut aussi vérifier que le fragment soit bien dans le plasmide par le gène Lac Z qui code pour la ß-galactosidase. Cette enzyme peut dégrader un substrat et produire une couleur bleu.  -> Si on a le fragment dans le plasmide entre 2 parties du gène Lac Z ce gène est inactivé et donc la bactérie contenant le plasmide ne produira pas de ß-galactosidase et restera incolore sur le milieu spécifique. -> Si on n’a pas le fragment dans le plasmide, le gène Lac Z est actif (un seul morceau) et les bactéries seront bleu. - Étapes du clonage avec sticky ends - Pour faire rentrer un fragment d’ADN dans le plasmide, on utilise des sites de fixation ou « sticky ends ». D’abord on ouvre le plasmide par le site de restriction. Ensuite le fragment d’ADN est préparé avec des extrémités complémentaires (sticky ends) et puis le fragment s’hybride avec l’ADN du plasmide ouvert grâce au sticky ends. Enfin, la ligase referme le plasmide en reliant les brins d’ADN. - Transformation bactérienne - Une fois que le plasmide modifié est prêt, on le fait rentrer dans des bactéries « compétentes » (capable d’absorber de l’ADN exogène) grâce à des méthodes comme le choc électrique. Chaque bactérie absorbe un plasmide puis on fait une sélection pour isoler les bactéries avec le plasmide qui contient le fragment. Ensuite, on utilise la résistance aux antibiotiques pour tuer les bactéries sans plasmide ou le test du lac Z pour différencier les bactéries qui ont le fragment (incolore) des autres (bleu). Chapitre n°8 : CRISPR CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) est un mécanisme de défense immunitaire acquis utilisé par les bactéries et les archées contre les invasions virale ou les plasmides étrangers. -> C’est plusieurs séquences palindromiques espacées par des spacers qui sont des fragments d’ADN venant du matériel génétique comme celui des bactériophages ou plasmides. Les spacers sont des séquences de 25 à 30 paires de bases permettent aux bactéries de se souvenir de l’invasion par un ADN étranger. Donc quand un étranger rentre dans le génome d’une bactérie, la bactérie va ajouter un spacer par le Cas I dans son locus CRISPR pour qu’il puisse reconnaitre et détruire l’ADN en cas de futur invasion. Le mécanisme de reconnaissance commence par la fixation d’une protéine « Cas » au double brin de l’ADN étranger. Ensuite, production du spacer qui entrent dans le locus CRISPR. Le CRISPR enregistre cette nouvelle séquence ce qui permet à la cellule de reconnaitre en cas de futur invasion. Quand un nouveau spacer est dans le locus CRISPR, le pré-CRISPR RNA produit à partir de ce locus. Ce pré-CRISPR RNA est la forme immature qui est après traité par des protéines Cas II spécifiques. Ces protéines Cas II coupent le pré-CRISPR RNA en petit fragment qui ont chacun un spacer avec des séquences de répétition. -> Ces fragments sont des crRNA et ils vont se lier à la cas III et ensemble ils forment un complexe capable de reconnaitre l’ADN envahissant. Le complexe Cas9-crRNA-TracrRNA est surtout utilisé en génie génétique. Le tracrRNA permet de stabiliser le crRNA pour créer un complexe avec le crRNA. Ce complexe permet de guider le Cas9 vers la séquence cible. Le crRNA a des spacers venant de l’ancienne rencontre avec le pathogène ce qui permet au complexe Cas9-crRNA-TracrRNA de le reconnaitre et de se lier à lui. -> Ensuite le Cas9 va couper le double brin à un endroit spécifique. Au niveau thérapie génique, le CRISPR-Cas 9 est utilisé pour corriger les mutations génétiques. Exemple : Dans les embryons, on utilise ce système pour enlever les fragments d’ADN défectueux et les remplacer par des séquences saines. La création de sgRNA (single guided RNa) est importante car il combine crRNA et tracrRNA. Une fois que le sgRNA et la Cas9 sont dans le plasmide et dans la cellule, le système CRISPT peut couper ou modifier des séquences d’ADN dans l’organisme cible. -> On l’utilise pour corriger des mutations mais aussi pour des insertions génétiques. NB : Spacer : Fragment d’ADN venant de l’étranger Cas I : introduit le nouveau spacer Cas II : maturation du pré-CRISPR RNA en le coupant en petit morceaux (ex : Cas9). Cas III : se fixe à une partie du CrRNApour reconnaitre l’ADN envahissant ATTENTION Cas I, II, III sont des catégories et Cas 9 fait partie de la catégorie CasII Chapitre n°9 : séquençage Sanger - Pyroséquençage - Méthode par séquençage chimique de Maxam et Gilbert - Utilisation de fragments d’ADN avec des extrémité 5’ marqué par du phosphore 32. L’objectif est de modifier une base spécifique par fragment d’ADN à séquencer ce qui va créer des points fragiles dans la structure de l’ADN qui seront ensuite couper par la pipéridine. Les réactifs chimiques sont : - Diméthylsulfate qui modifie la guanine - Diéthylpyrocarbonate qui modifie l’adénine en guanine - Hydrazine qui modifie la thymine en cytosine - Hydrazine + NaCl spécifique à la cytosine. -> Mécanisme moléculaire Avantages et inconvénients Principe général L’innovation est qu’on utilise des didéoxynucléotide triphosphates (ddNTP) qui arrêtent la chaine quand ils sont ajoutés. On mesure la longueur du 5’ marquée jusqu’à la base arrêtée. -> Procédure de marquage Cycle sequencing Optimisations et limites Principe Étapes clés Applications pratiques Pour l’ADN, l’intégrité est évaluée sur gel d’agarose et exprimée en DIN. 2°/ Fragmentation de l’ADN/ARN : L’échantillon est fragmenté mécaniquement ou pas enzyme. 3°/ Ajout des adaptateurs : Les fragments sont modifiés en y ajoutant des séquences adaptatrices. Ces adaptateurs : - ont des séquences spécifiques pour l’amplification clonale et l’hybridation sur le support de séquençage. - ont des séquences Rd1 SP et Rd2 SP pour fixer les amorces pendant le séquençage. - mettre un code barre unique pour identifier chaque échantillon. Ça permet de regrouper plusieurs échantillons dans une même expérience. 4°/ Amplification clonale : chaque fragment est amplifié pour produire une quantité suffisante d’ADN pour le séquençage. On utilise 2 méthodes : - PCR en émulsion (Ion Torrent) : amplification dans des gouttelettes contenant des billes magnétiques. - Amplification par pont (Bridge amplification) Illumina : amplification directe sur une lame de verre. -> Technologie illumina Ion Torrent Les fragments sont préparés avec des adaptateurs spécifiques à la technologie Ion Torrent. Ensuite, on fait entrer les fragments dans des microgouttes de tel sorte que chaque goutte a une bille magnétique, un fragment d’ADN et tous les éléments pour la PCR. Les fragments s’hybrident aux billes grâce aux adaptateurs et une polymérase synthétise un brin complémentaire. A la fin de chaque cycle de dénaturation, le brin d’origine est relargué et les nouveaux brins restent fixés aux billes. On recommence. Ensuite on met ces billes sur un support semi-conducteur qui ont des puits microscopiques. Un puit = une bille. Quand les nucléotides complémentaires sont ajoutés, des ions H+ sont libéré et donc il y a une variation de pH qui est mesurable. -> On ajoute les nucléotides 1 par 1 si c’est le bon le pH change et si on met plusieurs nucléotides en mêmes temps le changement de pH est proportionnel au nombre de base qui se lient. L’ion Torrent est plus rapide et moins cher qu’Illumina mais le taux d’erreurs est plus grand surtout dans les régions homopolymériques.  -> Reconstruction du génome à partir des séquences aléatoires amplifiées si une région est séquencée 100 fois et que 50 fois on a un G et 50 fois un T alors surement hétérozygote. Alors que si une région est séquencée 2 fois et une fois un T et l’autre un G on ne sait pas si c’est une erreur ou une personne hétérozygote. Le taux de couverture est le nombre de fois qu’une même région du génome est séquencée. -> Applications du séquençage étude de certains gènes spécifique de certaines maladies précises 3°/ Analyse de polymorphisme ou mutation 4°/ Bactériologie -> identification de bactérie 5°/ Épidémiologie -> suivre l’évolution d’épidémie -> Applications au niveau de l’ARN Si un gène est bien exprimé, on aura plusieurs copies d’ARN sinon on en aura peu. -> Paramètres importants pour le séquençage Points spécifiques Principes du Nanopore sequencing Petite molécule = petite perturbation -> Grande molécule = grande perturbation Chaque nucléotide perturbe le courant différemment et grâce à ça, on peut savoir la séquence d’ADN. On utilise cette technique pour analyser l’ADN, l’ARN et des protéines. -> MinION On utilise cette technique pour le remaniement génétique (translocation, duplication) ou le novo sequencing. Il est aussi portable et donc on peut l’utiliser sur le terrain. Exemple : on l’a utilisé en Afrique pendant la crise Ebola. Il permet de faire des études épidémiologiques sur le terrain en séquençant les virus pour voir les variations génétiques et suivre l’évolution. -> Avantage et inconvénient du Oxford Nanopore