Cours Centrifugation LST BioA BioP 2021 PDF

LA CENTRIFUGATION Sédimentation sous l’effet de la pesanteur  f1 = force de gravité, f2 = force de frottement Force due à la pesanteur : f1 = m. γ m : masse de la particule γ : accélération due à la pesanteur Force due à la viscosité du milieu : f2 = 6.π.n.r.v n : viscosité du milieu r : ra...

LA CENTRIFUGATION Sédimentation sous l’effet de la pesanteur  f1 = force de gravité, f2 = force de frottement Force due à la pesanteur : f1 = m. γ m : masse de la particule γ : accélération due à la pesanteur Force due à la viscosité du milieu : f2 = 6.π.n.r.v n : viscosité du milieu r : rayon de la particule v : vitesse de sédimentation (ou de migration)  c’est quoi la centrifugation ? C’est une opération permettant de remplacer l’accélération de pesanteur γ (exprimée en g) par une accélération centrifuge développée par un rotor tournant à grande vitesse (6 à 10 000 t/min) Accélération centrifuge : γ = ω2. x ω : vitesse angulaire exprimée en Nb de tours/min x : distance de tube à l’axe de rotation exprimée en cm Définition : La centrifugation est une opération de séparation mécanique, par action de la force centrifuge, de deux à trois phases entraînées dans un mouvement de rotation. On peut séparer : - deux phases liquides - une phase solide en suspension dans une phase liquide - voir deux phases liquides contenant une phase solide  Ces appareils sont composés des éléments suivants : Un moteur : capable de tourner à plusieurs dizaines de milliers de tours par minute. Un rotor : capable de supporter des rotations aussi rapides (en titane généralement pour les rotors des ultra centrifugeuses) Une enceinte : dans laquelle est disposé le rotor, qui est réfrigéré et sous vide. En effet, pour les vitesses de rotation les plus rapides, le déplacement des extrémités du rotor (diamètre de l’ordre de 20 – 40 cm) est supersonique. Ceci entraînerait un échauffement insupportable de l’air. Les différents types de rotor Les rotors sont de trois types : ► à angle fixe ► à godets oscillants (mobile) ► analytique Rotors à angle fixe centrifugation oblique ou angulaire, c’est-à- dire que l’angle entre l’axe et l’emplacement du tube dans la rotation est fixe et que les tubes sont portés obliquement. Les centrifugeuses à rotation à angle fixe sont généralement utilisées pour les séparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protéines,…) et surnageant. Rotor à angle fixe Ces rotors utilisés pour les séparations séquentielles, à des vitesses de rotations croissantes , appelée centrifugation différentielle  Rotors à godets oscillants (mobiles) Centrifugation horizontale Les rotors à godets oscillants utilisés pour des séparations plus fines. Ils sont mobiles autour de leurs points de suspension à la potence. Rotor à godets oscillants Figure A : Exemple de gradient Figure B : Exemple de gradient continu. discontinu. L'échantillon a été représenté Le gradient peut être linéaire (cas au sommet ce qui suppose qu'il soit présenté) mais aussi exponentiel ou moins dense que la première couche de logarithmique selon les besoins. On le solution de saccharose. Il arrive qu'on coule en faisant varier en continu le débit place l'échantillon au fond, au besoin en de deux pompes qui mélangent deux ayant au préalable augmenté sa densité solutions, l'une à 10% et l'autre à 60% de en ajoutant du saccharose (par exemple). saccharose dans le cas présent. Formeur de gradient Types de gradient  Rotors analytiques Ces rotors sont utilisés pour une mesure très précise des coefficients de sédimentation (S). Une cellule est remplie généralement avec une concentration homogène de particules. On observe le déplacement de la frontière de sédimentation au cours de l’expérience, à l’aide d’une mesure optique de la concentration (absorbance) ou d’une variation de concentration (différence d’indice de réfraction).  ULTRACENTRIFUGATION Les ultracentrifugeurs sont caractérisés par des accélérations élevées 100 000 g ou plus. Exp : Airfuge Beckman 160 000 g. 1 Ultracentrifugation préparative 1- 1.1 Ultracentrifugation différentielle 1.2 Ultrcentrifugation en gradient de densité 2- Ultracentrifugation analytique  1.1 Ultracentrifugation différentielle Séparation entre culot contenant des particules sédimentées et surnageant où se trouvent les particules légères. Cette méthode peut être utilisée pour séparer ou pour purifier des particules dont la densité est plus légère que celle du solvant. Exp : lipoprotéines on parle d’une ultracentrifugation de flottation.  1.2 Ultracentrifugation en gradient de densité Il existe deux techniques de centrifugation en gradient de densité : Zonale Iso pycnique  Centrifugation zonale ou de zone Sépare les macromolécules suivant leur coefficient de sédimentation. Dépôt de la solution contenant les particules à séparer sur une colonne liquide constituant un gradient de densité. Sous l’effet de la force centrifuge, les particules d’une même espèce ayant la même vitesse de sédimentation se regroupent en zones séparées. La rotation doit être interrompue pour éviter que les particules les plus rapides n’atteignent le fond du tube. Le saccharose est le plus utilisé. Dépôt d’échantillon  Centrifugation isopycnique Utilise un gradient de densité recouvrant les densités des différentes particules. Au bout d’un certain temps de rotation, celles-ci se rassemblent à un point où leur densité est égale à celle du milieu de sédimentation (position isopycnique) Le chlorure de césium est le plus utilisé Mélange homogène de l’échantillon et du gradient La forme du gradient est importante pour obtenir : bonne séparation détermination des propriétés des particules telles que :. la densité de flottation. coefficient de sédimentation  la centrifugation en gradient de densité deux types de rotors utilisés : ► Les rotors à godets mobiles ► Les rotors zonaux  Les rotors zonaux Cylindres tournant autour de leur axe de révolution. Leur capacité est 50 à 100 fois supérieure à celle des rotors à godets oscillant. La capacité cylindrique de ces rotors est divisée en secteurs à ailettes (plaquettes, lamelle). Le rotor est fermé par un couvercle. La solution constituant le gradient de densité et l’échantillon sont introduits et prélevés du rotor en cours de rotation par l’intermédiaire d’un palier d’étanchéité stationnaire avec joint rotatif. Chargement et déchargement du rotor zonal  ULTRACENTRIFUGATION ANALYTIQUE Utilisée pour déterminer les caractéristiques physiques des molécules. Les appareils utilisés sont en général différents de ceux nécessaires pour l’ultracentrifugation préparative.  PROBLEMES PRATIQUES EN CENTRIFUGATION Tubes utilisés, variables, et doivent être bien adaptés au rotor Tubes bien équilibrés Protection des tubes par des godets en caoutchouc Echauffement de l’appareil (dû au frottement) Présence d’une minuterie Présence d’un cadran compte-tours L’arrêt du centrifugeur doit être toujours progressif afin d’éviter de remettre en suspension les cellules ou les particules du culot. L’arrêt peut être spontané et lent pour éviter ce phénomène, comme il peut être gênant et dans ce cas certains appareils comportent un système de freinage progressif.  Agir sur plusieurs paramètres pour augmenter l’efficacité de la centrifugation : le diamètre des particules, en utilisant des floculants la différence de densité la viscosité du fluide, qui diminue avec l’élévation de la température la surface de base du bol la vitesse de rotation, qui laisse la plus grande latitude de réglage