Analytical Biochemistry Lecture One PDF

Lecture One ANALYTICAL BIOCHEMISTRY PROF. NAGWA ABO EL-MAALI  CHAPTER 13 Centrifugation Methods ‫طرق الطرد المركزي‬  13.1. INTRODUCTION  Gravitational sedimentation is a well -known separation method. It was empirically used for thousands of years, for...

Lecture One ANALYTICAL BIOCHEMISTRY PROF. NAGWA ABO EL-MAALI  CHAPTER 13 Centrifugation Methods ‫طرق الطرد المركزي‬  13.1. INTRODUCTION  Gravitational sedimentation is a well -known separation method. It was empirically used for thousands of years, for example, to separate gold particles from sand. ‫ على سبيل‬،‫ تم استخدامها تجريبيا آلالف السنين‬.‫ترسيب الجاذبية هي طريقة فصل معروفة‬.‫ لفصل جزيئات الذهب عن الرمال‬،‫المثال‬  Particles that are in suspension in a fluid are influenced by different forces..‫تتأثر الجسيمات المعلقة في سائل بقوى مختلفة‬  If the particle has a higher density than the fluid in which it is immersed, it tends to migrate downward, following the gravity force direction. ‫ متتب ًعا اتجاه‬،‫ فإنه يميل إلى الهجرة ألسفل‬،‫إذا كان للجسيم كثافة أعلى من السائل المغمور فيه‬.‫قوة الجاذبية‬  The frictional force acts to resist the movement..‫تعمل قوة االحتكاك على مقاومة الحركة‬  If the particle has a higher density than the fluid in which it is immersed, it tends to migrate downward, following the gravity force direction. The frictional force acts to resist the movement (Fig. 13.1). ‫ متتب ًعا اتجاه قوة‬،‫ فإنه يميل إلى الهجرة ألسفل‬،‫إذا كان للجسيم كثافة أعلى من السائل المغمور فيه‬.)13.1 ‫ تعمل قوة االحتكاك على مقاومة الحركة (الشكل‬.‫الجاذبية‬  Figure 13.1. Forces acting on a particle during centrifugation. The gravitational force is not taken into account in practical applications, since its effect is very small in comparison with that of the centrifugal force, even with low-speed centrifuges. ‫ ال تؤخذ قوة الجاذبية في االعتبار في‬.‫ القوى المؤثرة على جسيم أثناء الطرد المركزي‬.13.1 ‫الشكل‬ ‫ حتى مع أجهزة الطرد المركزي‬،‫ ألن تأثيرها صغير جدًا مقارنة بقوة الطرد المركزي‬،‫التطبيقات العملية‬.‫منخفضة السرعة‬  The particles usually separated or studied in biochemistry are cells, sub-cellular organelles and large biomolecules, like DNA and proteins. ‫الجسيمات التي يتم فصلها أو دراستها في الكيمياء الحيوية عادة ً ما تكون خاليا‬.‫ مثل الحمض النووي والبروتينات‬، ‫وعضيات تحت خلوية وجزيئات حيوية كبيرة‬  Centrifugation methods are based on the effects of force fields stronger than the gravitational force, in order to accelerate processes that would otherwise occur over non practical time scales (months or years). ‫ من‬،‫تعتمد طرق الطرد المركزي على تأثيرات حقول القوة األقوى من قوة الجاذبية‬ ‫أجل تسريع العمليات التي بخالف ذلك كانت ستحدث على نطاقات زمنية غيرعملية‬.)‫(قد تستغرق أشهر أو سنوات‬  Centrifugation methods are based on the effects of force fields stronger than the gravitational force, in order to accelerate processes that would otherwise occur over non practical time scales (months or years). ‫ من‬،‫تعتمد طرق الطرد المركزي على تأثيرات حقول القوة األقوى من قوة الجاذبية‬ ‫أجل تسريع العمليات التي على عكس ذلك كانت ستحدث على نطاقات زمنية غير‬.)‫عملية (قد تستغرق أشهر أو سنوات‬  Overcoming back-diffusion forces allows the precipitation of small molecules that would not precipitate in our terrestrial gravitational field. ‫التغلب على قوى االنتشار الخلفي يسمح بترسيب الجزيئات الصغيرة التي لم تكن‬.‫لتترسب في مجال الجاذبية األرضية لدينا‬  13.2. SEDIMENTATION AND RELATIVE CENTRIFUGAL g FORCE ‫الترسيب وقوة الطرد المركزي النسبية‬  By using Stoke s’ law, it is possible to calculate the sedimentation rate (ν) for a particle..‫( لجسيم‬ν) ‫ من الممكن حساب معدل الترسيب‬،‫باستخدام قانون ستوكس‬  The sedimentation rate is the result of two forces, the gravitational force (or centrifugal) that move the particle downward, and the frictional or drag force, resisting its motion through the solution. ‫ قوة الجاذبية (أو الطرد المركزي) التي تحرك الجسيم إلى‬،‫معدل الترسيب هو نتيجة لقوتين‬.‫ وقوة االحتكاك أو السحب التي تقاوم حركته من خالل المحلول‬،‫أسفل‬  Stokes’ law is valid for spherical particles that reach a constant velocity: :‫قانون ستوكس صالح للجسيمات الكروية التي تصل إلى سرعة ثابتة‬  Where: ‫حيث‬  d is the diameter of the particle, ‫قطر الجسيم‬  Pp is the density of the particle, ‫كثافة الجسيم‬  Pm is the density of the medium, ‫كثافة الوسط‬  μ is the viscosity of the medium, and ‫لزوجة الوسط‬  g is the centrifugal force field. ‫مجال قوة الطرد المركزي‬  The sedimentation rate of a particle is proportional to: :‫يتناسب معدل الترسيب للجسيم مع‬  the square of the diameter of the particle..‫مربع قطر الجسيم‬  to the difference between the density of the particle and the density of the medium, and if this difference is zero, the sedimentation rate becomes zero..‫صفرا‬ ً ‫ يصبح معدل الترسيب‬،‫صفرا‬ ً ‫ وإذا كان هذا الفرق‬،‫الفرق بين كثافة الجسيم وكثافة الوسط‬  The sedimentation rate increases with increasing force field and decreasing viscosity..‫يزداد معدل الترسيب مع زيادة مجال القوة وانخفاض اللزوجة‬  The relative centrifugal force (RCF) is defined as the force field relative to the Earth’s gravitational field; Equation 13.2 shows its definition: َّ ُ ‫ت‬ ‫( بأنها مجال القوة بالنسبة لمجال جاذبية‬RCF) ‫عرف قوة الطرد المركزي النسبية‬  :‫ تعريفها‬13.2 ‫األرض ؛ توضح المعادلة‬  Where: ‫حيث‬  r is the distance between the center of rotation and the particle (cm); ‫ هي المسافة بين مركز الدوران والجسيم (بالسنتيمتر)؛‬r   ω is the rotation speed in radians per second (rad/s), and m is the mass of the particle..‫ هي كتلة الجسيم‬m ‫ و‬,(rad/s) ‫ هي سرعة الدوران بالراديان في الثانية‬ω   The velocity in the centrifuge is usually expressed in revolutions per minute (rpm), and if g = 980 cm/s2, ،(rpm) ‫عادة ما يتم التعبير عن السرعة في جهاز الطرد المركزي بالدورات في الدقيقة‬ ،g = 980 cm /s2 ‫وإذا كانت‬  Since RCF is a ratio between two forces, it has no units; however, it is customary to follow the numerical value of RCF with the g symbol. ‫ فليس لها وحدات قياس ؛ ومع ذلك فانه من المعتاد اتباع‬،‫هي نسبة بين قوتين‬RCF ‫نظرا ألن‬ ً g ‫ برمز‬RCF ‫القيمة العددية لـ‬  In the centrifuge tube, the distance r increases from the tube top to the bottom, so that we can define an average g force (gav) for a given rotor and speed, a minimum g force in the tube top and a maximum force in the tube bottom (g-min and g-max, respectively). ‫ حتى نتمكن من تحديد‬،‫ من أعلى األنبوب إلى أسفله‬r ‫ تزداد المسافة‬،‫في أنبوب الطرد المركزي‬ ‫ في أعلى األنبوب‬g ‫ الحد األدنى للقوة‬،‫لدوار وسرعة معينين‬ ّ (gav) >= g ‫متوسط القوة‬.)‫ على التوالي‬،g-max ‫ و‬g-min ( ‫والحد األقصى للقوة في قاع األنبوب‬ Biological particles. ‫الجزيئات البيولوجية‬  Most biological particles are not spherical, and Strokes’ law must be modified to take this into account..‫ ويجب تعديل قانون ستوكس ألخذ ذلك في االعتبار‬،‫معظم الجسيمات البيولوجية ليست كروية‬  One approach is to consider that the biological particles’ shapes could be approximated by ‘‘ellipsoids of revolution’’, or spheroids with one major and one minor axis. ‫يتمثل أحد األساليب في اعتبار أن أشكال الجسيمات البيولوجية يمكن تقريبها بواسطة "مجسمات‬ ‫ أو أجسام شبه كروية ذات محور رئيسي‬، " )‫دورانية ناقصة (مجسمات إهليلجية أو بيضاوية‬.‫واحد ومحور ثانوي واحد‬  Calculations show that the frictional force over these ellipsoids is greater than that expected for spherical particles of the same volume ‫تظهر الحسابات أن قوة االحتكاك فوق هذه األشكال اإلهليلجية أكبر من تلك المتوقعة لجسيمات‬.‫كروية من نفس الحجم‬  Centrifugal conditions are chosen according to: :‫يتم اختيارظروف الطرد المركزي وفقًا لما يلي‬  the type of biological material..‫نوع المادة البيولوجية‬  The chemical composition of the medium, ،‫التركيب الكيميائي للوسط‬  its temperature must be controlled to avoid denaturation..)‫يجب التحكم في درجة حرارته لتجنب التشوه (تغير طبيعة الوسط‬  In addition, the hydrostatic pressure generated by the centrifugal force may be large enough to permeabilise cellular membranes (affecting cell density) or split macromolecular associations, such as those that exist in multisubunit proteins. ‫يرا بما يكفي‬ ً ‫ قد يكون الضغط الهيدروستاتيكي الناتج عن قوة الطرد المركزي كب‬، ‫باإلضافة إلى ذلك‬ ‫ مثل تلك‬، ‫لنفاذ األغشية الخلوية (مما يؤثرعلى كثافة الخلية) أو تقسيم الروابط الجزيئية الكبيرة‬.‫الموجودة في البروتينات متعددة الوحدات‬  Centrifugal forces can also modify the molecular shape; the sedimentation rate is then nonlinearly dependent on the g force applied. ‫ضا تعديل الشكل الجزيئي ؛ عند ذلك يعتمد معدل الترسيب بشكل‬ ً ‫يمكن لقوى الطرد المركزي أي‬.‫ ال ُمطبَّقة‬g ‫غيرخطي على القوة‬  13.3. CENTRIFUGAL FORCES IN DIFFERENT ROTOR TYPES ‫قوى الطرد المركزي في أنواع مختلفة من الدوارات‬  There are four basic types of rotors: :‫هناك أربعة أنواع أساسية من الدوارات‬  the swinging-bucket, ‫الدلو المتأرجح‬  fixed-angle, ‫ثابت الزاوية‬  Vertical (a fixed-angle rotor,) and )‫عمودي (دوار ذو زاوية ثابتة‬  zonal rotors, consists of two half-cylinder sections, which screw onto one another. (habitually chosen for large volume preparative protocols (typical capacities are 300– 1700 mL). ‫ يتم‬.‫ يربط أحدهما اآلخر‬، ‫ تتكون من قسمين كل منهم نصف أسطوانة‬، ‫الدوارات النطاقية‬ 1700 -300 ‫اختيارها عادة للبروتوكوالت التحضيرية كبيرة الحجم (السعات النموذجية‬.)‫مل‬  13.3. 1. SWINGING-BUCKET ROTORS ‫دوارات الدلو المتأرجح‬  The sample tube is inserted into a one-tube holder (bucket)..)‫ يتم إدخال األنبوب الذي يحتوي على العينة في حامل يسع أنبوب واحد (دلو‬  During acceleration of the rotor, the bucket reorients from vertical (earth gravity force) to the horizontal position (centrifugal force). ‫ يعيد الدلو توجيهه من الوضع الرأسي (قوة الجاذبية األرضية) إلى الوضع األفقي‬،‫ أثناء تسارع الدوار‬.)‫(قوة الطرد المركزي‬  In Figure 13.2 the centrifugal g force direction is evident, showing that the particles in this rotor move first to the walls of the tube, then a bulk movement of particles and convection flow accelerates the precipitation process (called the ‘‘wall effect’’). ‫ موض ًحا أن الجسيمات الموجودة في هذا‬،‫ واض ًحا‬g ‫ يكون اتجاه قوة الطرد المركزي‬13.2 ‫ في الشكل‬ ‫ ثم تؤدي الحركة السائبة للجسيمات وتدفق الحمل إلى تسريع‬،‫الدوار تتحرك أوالً إلى جدران األنبوب‬.)"‫عملية الترسيب (تسمى " تأثير الجدار‬  This rotor is generally used for rate-zonal separations..‫ يستخدم هذا الدوار بشكل عام في عمليات الفصل النطاقي بمعدل‬ Note that the precipitation path is along the length of the centrifugation tube; therefore, this method is relatively inefficient for pelleting. ‫ فإن هذه الطريقة غير‬،‫الحظ أن مسار الترسيب يقع على طول أنبوب الطرد المركزي ؛ وبالتالي‬.)‫فعالة نسبيًا لتشكيل الحبيبات (الكريات‬ Figure 13.2. Centrifugal forces in different rotor types. The angle is measured with respect to the rotation axis. These means that a fixed- angle rotor with an angle of 14° is related to a vertical rotor. And therefore its sedimentation pathlength is shorter than in a 40° rotor. ‫ هذا‬.‫ يتم قياس الزاوية بالنسبة لمحور الدوران‬.‫ قوى الطرد المركزي في أنواع الدوار المختلفة‬.13.2 ‫الشكل‬ ‫ وبالتالي فإن طول مسار الترسيب أقصر مما‬.‫ متعلق بدوار رأسي‬°14 ‫يعني أن دوار ذو زاوية ثابتة بزاوية‬.°40 ‫هو عليه في الدوار‬  13.3. 2. FIXED -ANGLE ROTORS ‫الدوارات ثابتة الزاوية‬  In this rotor the sample tubes fit into holes in a solid rotor. The tube angle therefore remains constant during the loading, centrifugation, and unloading process. ‫ وبالتالي تظل زاوية األنبوب ثابتة‬.‫ تالئم أنابيب العينة الثقوب الموجودة في دوار صلب‬،‫في هذا الدوار‬.‫أثناء عملية التحميل والطرد المركزي والتفريغ‬  When the centrifugation force increases, the solution reorients inside the tube..‫ يعاد توجيه المحلول داخل األنبوب‬،‫عندما تزداد قوة الطرد المركزي‬ For a given sample volume, the centrifugation path with a fixed-angle rotor is shorter than that with a swinging- bucket rotor. ‫ يكون مسار الطرد المركزي مع دوار ثابت الزاوية أقصر من المسار مع‬،‫بالنسبة لحجم عينة معين‬.‫دوار دلو متأرجح‬  The particles reach the tube wall more rapidly, and then slide down the wall to form a pellet (Fig. 13.2). ‫ ثم تنزلق على الحائط لتشكيل حبيبة (الشكل‬، ‫تصل الجسيمات إلى جدار األنبوب بسرعة أكبر‬ )13.2  These rotors are more efficient for differential pelleting or other pellet-based procedures, and could be used for isopycnic experiments, which are equilibrium density gradient techniques. ‫هذه الدوارات أكثر كفاءة في تشكيل الحبيبات ال ُم َميّز أو اإلجراءات األخرى القائمة على‬.‫ وهي تقنيات توازن متدرج الكثافة‬، ‫ ويمكن استخدامها في التجارب متساوية ال َكثافَة‬، ‫الحبيبات‬  When the rotor angle is shallow, the sedimentation path is shorter, and the pelleting efficiency is increased..‫ وتزداد كفاءة تكوين الحبيبات‬، ‫ يكون مسار الترسيب أقصر‬، ‫عندما تكون زاوية الدوار ضحلة‬  Fixed angle rotors are available with angles between 14° and 40°..‫ درجة‬40 ‫ درجة و‬14 ‫ تتوفر الدوارات ثابتة الزاوية بزوايا تتراوح بين‬  13.3. 3. VERTICAL ROTORS ‫الدوارات العمودية‬  In vertical rotors (Fig. 13.2) the tubes are fixed in a vertical position during centrifugation, and when the centrifugal force increases the solution reorients to the g force. ‫ يتم تثبيت األنابيب في وضع عمودي أثناء‬، )13.2 ‫في الدوارات العمودية (الشكل‬ ‫ يتم إعادة توجيه المحلول إلى‬،‫ وعندما تزداد قوة الطرد المركزي‬، ‫الطرد المركزي‬.g ‫القوة‬  For this rotor the tube covers are important..‫ فإن أغطية األنبوب مهمة‬،‫بالنسبة لهذا الدوار‬ 13.6. TYPES OF CENTRIFUGATION TECHNIQUES ‫أنواع تقنيات الطرد المركزي‬  It is possible to classify centrifugation techniques as preparative (when the main goal is to obtain a purified material) and analytical (for characterization of purified samples). ‫من الممكن تصنيف تقنيات الطرد المركزي على أنها تحضيرية (عندما يكون الهدف‬.)‫الرئيسي هو الحصول على مادة نقية) وتحليلية (لتوصيف العينات النقية‬  Differential centrifugation is the simplest method, and does not require a density gradient medium; it is a typical preparative methodology. ‫ وال يتطلب وسط متدرج في‬، ‫الطرد المركزي التفاضلي (التفريقي) هو أبسط طريقة‬.‫الكثافة ؛ إنها منهجية تحضيرية نموذجية‬  13.6. 1. DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION )‫الطرد المركزي التفاضلي (التفريقي‬ Figure 13.5. Typical differential centrifugation protocol. In order to obtain more purified fractions, the pellets could be resuspended in buffer and recentrifuged. ‫ يمكن‬،‫ من أجل الحصول على جزيئات أكثر نقاوة‬.‫ بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي النموذجي‬.13.5 ‫الشكل‬.‫إعادة تعليق الحبيبات في معادل وطردها مرة أخرى‬  Figure 13.6 illustrates the main disadvantage of differential centrifugation. The initial sample contains a homogeneous mixture of different particles. ‫ تحتوي العينة األولية‬.‫ العيب الرئيسي للطرد المركزي التفاضلي‬13.6 ‫يوضح الشكل‬.‫على خليط متجانس من جسيمات مختلفة‬  Figure 13.6. Sedimentation process in a multicomponent system (solvent with three sizes of particles). Note that the pellet contains a mixture of particle sizes..)‫ عملية الترسيب في نظام متعدد المكونات (مذيب بثالثة أحجام من الجسيمات‬.13.6 ‫الشكل‬.‫الحظ أن الحبيبة تحتوي على خليط من األحجام للجسيمات‬  13.6. 2. RATE-ZONAL CENTRIFUGATION ‫الطرد المركزي النطاقي بمعدل‬  In rate-zonal centrifugation (or velocity sedimentation) the sample is loaded as a thin layer on the top of a density gradient medium. ‫في الطرد المركزي النطاقي بمعدل (أو سرعة الترسيب) يتم تحميل العينة كطبقة رقيقة على‬.‫الجزء العلوي من وسط متدرج الكثافة‬  During centrifugation, the sample separates into bands, and the particles are separated on the basis of their different sedimentation coefficients (s). ‫ ويتم فصل الجسيمات على أساس معامالت‬،‫ تنفصل العينة إلى نطاقات‬،‫أثناء الطرد المركزي‬.)s( ‫الترسيب المختلفة‬  For biological particles, the coefficient s is mainly related to the size of the particles. This process is illustrated in Figure 13.7(a)..‫ بشكل أساسي بحجم الجسيمات‬s ‫ يرتبط المعامل‬، ‫بالنسبة للجسيمات البيولوجية‬.)a( 13.7 ‫هذه العملية موضحة في الشكل‬  13.6. 3. ISOPYCNIC CENTRIFUGATION ‫الطرد المركزي متساوي الكثافة‬  In isopycnic centrifugation (or equilibrium sedimentation) the particles move through a density gradient until they arrive at their isopycnic points. ‫في الطرد المركزي متساوي الكثافة (أو ترسيب التوازن) تتحرك الجسيمات خالل تدرج كثافة‬.‫حتى تصل إلى نقاطها متساوية الكثافة‬  This is the point where the density of the solution equals the density of the particle..‫هذه هي النقطة التي تساوي فيها كثافة المحلول كثافة الجسيم‬  At this point, the particle stops moving. With this technique, the time necessary for a given separation is not critical..‫ يتوقف الجسيم عن الحركة‬، ‫عند هذه النقطة‬.‫ فإن الوقت الالزم لفصل معين ليس شديد األهمية‬، ‫باستخدام هذه التقنية‬  The sample is separated into bands, and separation occurs on the basis of the buoyant density of the particles..‫ ويحدث الفصل على أساس الكثافة الطفوية للجسيمات‬، ‫يتم فصل العينة إلى نطاقات‬ Figure 13.7. Comparison between (a) rate-zonal and (b) isopycnic centrifugation. Note that the gradient used in rate-zonal is shallow, and if the centrifugation continues, the particles pellet. The diffusion process causes band broadening in rate-zonal centrifugation, but this is not evident when the particles are “focused” using isopycnic centrifugation. ‫ الحظ أن التدرج‬. ‫ مقارنة بين (أ) الطرد المركزي النطاقي بمعدل (ب) الطرد المركزي متساوي الكثافة‬.13.7 ‫الشكل‬ ‫ تتسبب‬.‫تتكور‬ ّ ‫ فإن الجسيمات‬، ‫ وإذا استمر الطرد المركزي‬، ‫المستخدم في الطرد المركزي النطاقي بمعدل يكون ضحل‬ ‫ ولكن هذا ال يكون واضحا عندما تكون الجسيمات‬، ‫عملية االنتشار في توسيع النطاق في الطرد المركزي النطاقي المعدل‬. ‫"مركزة" باستخدام الطرد المركزي متساوي الكثافة‬  The isopycnic method has been used to dramatically demonstrate semiconservative DNA replication, using CsCl density gradients. Separation of DNA, RNA, protein, and carbohydrates can be performed in dense CsCl solutions, ‫تم استخدام طريقة تساوي الكثافة بشكل كبير إلثبات التضاعف (التناسخ) شبه المحافظ‬ ‫ باستخدام تدرجات كثافة كلوريد السيزيوم يمكن إجراء فصل‬،DNA ‫للحمض النووي‬ ‫ والكربوهيدرات في محاليل كلوريد السيزيوم‬، ‫ والبروتين‬،RNA ، DNA ‫الحمض النووي‬ ، ‫الكثيفة‬  where: ‫حيث‬  the RNA pellets, ‫ حبيبات‬RNA ‫يكون ال‬  the DNA forms bands, and ‫ شرائط‬DNA ‫يشكل ال‬  protein and carbohydrates form a thin layer called a pellicle at the top of the gradient..‫ في الجزء العلوي من التدرج‬pellicle ‫تشكل البروتينات والكربوهيدرات طبقة رقيقة تسمى‬  13.7. HARVESTING SAMPLES ‫جمع العينات‬  Once the centrifugation is finished, there are two principal ways to collect fractions: :‫ هناك طريقتان رئيسيتان لتجميع األجزاء‬، ‫بمجرد االنتهاء من الطرد المركزي‬  to pierce the bottom of the plastic (disposable) centrifuge tube, and collect drops as different fractions; the collection is done from the higher density particles to the lower. ‫ وجمع القطرات‬، )‫ ثقب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي البالستيكي (ال يعاد استخدامها‬.‫كأجزاء مختلفة ؛ يتم الجمع من الجزيئات عالية الكثافة إلى األقل‬  displacement of the gradient upward using a more dense solution (the fractions are collected from the top of the tube, from the lower to the higher density parts of the gradient). ‫ من‬، ‫ إزاحة التدرج ألعلى باستخدام محلول أكثر كثافة (يتم جمع األجزاء من أعلى األنبوب‬.)‫األجزاء األقل كثافة إلى األجزاء األعلى كثافة في التدرج‬  Each fraction can be examined separately (e.g., by UV spectrophotometry) and the data plotted as absorbance versus effluent volume or density. ‫ عن طريق قياس الطيف الضوئي لألشعة فوق‬، ‫يمكن فحص كل جزء على حدة (على سبيل المثال‬ ‫البنفسجية) ويتم رسم البيانات بيانيا على أنها االمتصاص مقابل الكثافة أو الحجم المتدفق (الذي لم‬. )‫يمتص‬  13.8. ANALYTICAL ULTRACENTRIFUGATION ‫الطرد المركزي التحليلي الفائق‬  Analytical ultracentrifugation is carried out in low-volume centrifuge cells (1 mL or less), using high purity samples, in a specially designed centrifuge , equipped with an optical detect ion system to follow the sedimentation process continuously. )‫ مل أو أقل‬1( ‫ يتم إجراء الطرد المركزي التحليلي الفائق في خاليا طرد مركزي ذات حجم منخفض‬ ‫ ومجهز بنظام كشف‬، ‫صا‬ ً ‫ في جهاز طرد مركزي مصمم خصي‬، ‫ باستخدام عينات عالية النقاء‬،.‫بصري أيوني لمتابعة عملية الترسيب بشكل مستمر‬  In addition to the determination of molecular weight, it is possible to determinate molecular size and shape, sedimentation coefficients, density, and frictional coefficients. ‫ من الممكن تحديد الحجم والشكل الجزيئي ومعامالت الترسيب‬، ‫ باإلضافة إلى تحديد الوزن الجزيئي‬.‫والكثافة ومعامالت االحتكاك‬  This technique has also been used to demonstrate the semiconservative replication of DNA, the conformational changes that arise when enzyme– substrate complexes form and for the study of macromolecular interactions. ‫ والتغيرات‬، DNA ‫ضا إلثبات التضاعف شبه المحافظ للحمض النووي‬ ً ‫ تم استخدام هذه التقنية أي‬.‫ المادة المتفاعلة ولدراسة التفاعالت الجزيئية‬- ‫التشكلية التي تنشأ عندما تتشكل معقدات اإلنزيم‬  13.9. SELECTED EXAMPLES ‫أمثلة مختارة‬ 13.9. 1. Analytical Ultracentrifugation for Quaternary Structure Elucidation ‫الطرد المركزي التحليلي الفائق لتوضيح التركيب الرباعي‬  Analytical ultracentrifugation methods have been employed to study the serine acetyltransferase (SAT) of E. coli, in order to elucidate how many protein subunits are present in the functional enzyme. ‫( لبكتيريا‬SAT) ‫تم استخدام طرق الطرد المركزي التحليلي الفائق لدراسة إنزيم سيرين أسيتيل ترانسفيريز‬ .‫ من أجل توضيح عدد الوحدات الفرعية البروتينية الموجودة في اإلنزيم الوظيفي‬، ‫اإليشريشيا كوالي‬  In bacteria, L-serine is converted to cysteine in a two-step process; SAT catalyzes the first reaction in this metabolic pathway, described as ‘‘sulfur fixation’’. The SAT subunit has been sequenced, and its MW is 29.3 kDa. ‫ إلى السيستين في عملية تتكون من خطوتين ؛ يحفزإنزيم سيرين‬L-serine ‫ يتم تحويل‬، ‫في البكتيريا‬  ‫ تم تسلسل‬."‫ الموصوف باسم "تثبيت الكبريت‬، ‫أسيتيل ترانسفيريز التفاعل األول في هذا المسار األيضي‬.‫ كيلو دالتون‬29.3 ‫ ويبلغ َو ْزنُها ال ُج َزيئِ ّي‬،SAT ‫الوحدة الفرعية إلنزيم ال‬  Sedimentation equilibrium experiments were performed, using three SAT concentrations (0.096, 0.73, and 3.54 mg/mL) in buffer, at 8000 rpm and 5° C until the concentration versus radial distance reached equilibrium, typically within 24 h. 3.54 ‫ و‬0.73 ‫ و‬0.096( SAT ‫ باستخدام ثالثة تركيزات من ال‬، ‫تم إجراء تجارب توازن الترسيب‬  ‫ درجات مئوية حتى وصل التركيز مقابل نصف‬5 ‫ دورة في الدقيقة و‬8000 ‫ عند‬،‫مل) في محلول منظم‬/‫مجم‬.‫ ساعة‬24 ‫ عادةً ما يكون خالل‬، ‫القطر إلى التوازن‬  13.9. 2. ISOLATION OF RETROVIRUSES BY SELF- GENERATED GRADIENTS ‫عزل الفيروسات القهقرية (االرتجاعية) عن طريق التدرجات المولدة ذاتيا‬  Retroviruses are viruses in which the genetic material is RNA. Several retroviruses are related with human diseases, like influenza or HIV. ‫ ترتبط العديد من الفيروسات‬. RNA ‫ الفيروسات القهقرية هي فيروسات تكون المادة الوراثية فيها هي‬.‫ مثل األنفلونزا أو فيروس نقص المناعة البشرية‬، ‫القهقرية بأمراض بشرية‬  Some human retroviruses have glycoproteins as important surface structures; these are usually of crucial importance for infectivity, and therefore for virus characterization. ‫ تحتوي بعض الفيروسات القهقرية البشرية على بروتينات سكرية كهياكل سطحية مهمة ؛ هذه عادة ما‬.‫ وبالتالي لتوصيف الفيروس‬، ‫تكون ذات أهمية بالغة للعدوى‬  Human cells from patients were cultivated, and the supernatants were separated from cells and debris after centrifugation at 1000 g at 4°C for 30 min. ‫ وتم فصل المواد الطافية عن الخاليا والحطام بعد الطرد المركزي‬، ‫ تمت زراعة خاليا البشرية من مرضى‬.‫ دقيقة‬30 ‫ درجات مئوية لمدة‬4 ‫ وعند‬g 1000 ‫عند‬  The supernatant was transferred to a 60-mL centrifuge tube, and underlaid with 4 mL of a concentrated solution of iodixanol, nonionic density gradient medium, in HEPES– NaOH (60 mM, pH 7.4, 0.8% NaCl). ‫ مل من محلول مركّز من‬4 ‫ أسفلها‬، ‫ مل‬60 ‫ تم نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة‬ ‫ ورقم‬، ‫ ملي موالر‬60( HEPES-NaOH ‫ في‬، ‫ ووسط تدرج كثافة غير أيوني‬،iodixanol.)‫ كلوريد الصوديوم‬٪0.8 ‫ و‬، 7.4 ‫هيدروجيني‬  13.9.3. ISOLATION OF LIPOPROTEINS FROM HUMAN PLASMA ‫عزل البروتينات الدهنية من البالزما البشرية‬  Lipoproteins transport lipids in blood; an early classification system was established using centrifugation methods, which are based on their different densities. Lipoproteins are classified as chylomicrons, largest and lowest in density ( P < 0:96 g/mL), with low protein concentration (2%). ، ‫ تم إنشاء نظام تصنيف مبكر باستخدام طرق الطرد المركزي‬.‫البروتينات الدهنية تنقل الدهون في الدم‬.‫التي تعتمد على الكثافات المختلفة للبروتينات الدهنية‬ ‫ مع‬، )‫ مل‬/ ‫ جم‬96:0 >P ( ‫ أكبر وأصغر في الكثافة‬،‫تصنف البروتينات الدهنية على أنها كيلوميكرونات‬.)٪2( ‫تركيز منخفض من البروتين‬  Very low density lipoproteins (VLDL), low-density lipoproteins (LDL), and high-density lipoproteins (HDL) are progressively smaller, more dense and rich in protein, increasing the P and protein content up to 1.210 g/mL and 40–55% for HDL. ‫ والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة‬، (VLDL) ‫البروتينات الدهنية ذو الكثافة المنخفضة جدا‬ ‫( أصغر تدريجيا وأكثر كثافة وغنية‬HDL) ‫ وتكون البروتينات الدهنية عالية الكثافة‬, (VLDL).HDL ‫ للـ‬٪55 -40 ‫ مل و‬/ ‫ جم‬1.210 ‫ مما يزيد من محتوى الفوسفور والبروتين حتى‬، ‫بالبروتين‬  Standard centrifugation procedures used for fractionation of lipoproteins in human blood plasma are made by sequential flotation using KBr, NaBr, NaCl, or a combination of these salts to produce a solution with determined density, in which a selected lipoprotein fraction moves upward. ‫ يتم عمل إجراءات الطرد المركزي القياسية المستخدمة في تجزئة البروتينات الدهنية‬ NaBr ‫ أو‬KBr ‫في بالزما الدم البشري عن طريق التعويم المتسلسل باستخدام‬ ‫ حيث يتحرك‬، ‫ أو مزيج من هذه األمالح إلنتاج محلول بكثافة محددة‬NaCl ‫أو‬.‫جزء البروتين الدهني ال ُمختار إلى األعلى‬  In a typical procedure, the human plasma is centrifuged (usually in a fixed angle rotor) at 50,000 g for 30 min; under these conditions, chylomicrons float as a milky layer. ‫ يتم طرد البالزما البشرية (عادة في دوار ذو زاوية ثابتة) عند‬، ‫ في إجراء نموذجي‬ ‫ تطفو الكيلوميكرونات كطبقة‬، ‫ دقيقة ؛ في ظل هذه الظروف‬30 ‫ لمدة‬g 50000.‫حليبية‬  The infranatant is removed, and centrifuged at 100,000 g for 20 h, when a floating layer of VLDL is obtained, as well as a pellet, which contains the plasma proteins, LDL and HDL plasma lipoprotein fractions. g 100000 ‫ (التجمع سائل تحت الطبقة الصلبة) وطرده عند‬infranatant ‫ تتم إزالة ال‬ ‫ باالضافة الى حبيبة‬،VLDL ‫ حيث يتم الحصول على طبقة عائمة من‬، ‫ ساعة‬20 ‫لمدة‬ ‫ و‬LDL ‫ والتي تحتوي على بروتينات البالزما وجزيئات البروتينات الدهنية‬, )‫(كرية‬.HDL  The pellet is resuspended and mixed with a concentrated salt solution, in order to obtain a final density of 1.063 g/mL, and centrifuged at 100,000 g for 28 h. ‫ من أجل الحصول على كثافة نهائية تبلغ‬، ‫ يعاد تعليق الحبيبة وخلطها بمحلول ملح مركز‬.‫ ساعة‬28 ‫ لمدة‬g 100000 ‫ وطردها عند‬، ‫ مل‬/ ‫ جم‬1.063  A floating layer of LDL is obtained, and the pellet is then resuspended and adjusted to a density of 1.21 g/mL. ‫ جم‬1.21 ‫ ثم يتم تعليق الحبيبات وتعديلها إلى كثافة‬،LDL ‫ يتم الحصول على طبقة عائمة من‬.‫ مل‬/  Centrifugation at 100,000 g for 48 h produces a floating layer of HDL..HDL ‫ ساعة ينتج عنه طبقة عائمة من‬48 ‫ لمدة‬g 100000 ‫ الطرد المركزي عند‬