Cours 8 - Regulation, Synthèse, Maturation des ARNs PDF

Regulation de l’expression des gènes : Contrôle transcriptionnel, Synthèse et Maturation d’ARN L’ARN s’associe à des protéines dès qu’il est transcrit : protéines impliquées dans l’épissage qui continuent à y être associées même après l’export nucléoplasmique → l’AR...

Regulation de l’expression des gènes : Contrôle transcriptionnel, Synthèse et Maturation d’ARN L’ARN s’associe à des protéines dès qu’il est transcrit : protéines impliquées dans l’épissage qui continuent à y être associées même après l’export nucléoplasmique → l’ARN n’est jamais nu, il est protégé des endonucléases. Contrôle de l’initiation de la transcription L’ARN pol II associée à des facteurs généraux de transcription constitue le Pre-Initiation Complex (PIC). Lors de l’initiation, la TBP de TFIID se lie à la TATA box qui positionne le site d’initiation de la transcription TSS (pas dans tous les cas, d’autres modalités d’initation existent) et recrute le complexe médiateur, des co-activateurs et la Pol II. Dans les cellules mammifères, il existe d’autres types de promoteurs que la TATA box : CGI (îlots CpG) qui ne sont pas aussi précis → certains transcrits commencent à un endroit et d’autres à un autre endroit = promoteur étendu. Le 1er nucléotide d’un ARN mature est relié à la coiffe. Technique CAGE : Capture de la coiffe et séquençage des premiers nucléotides qui y sont reliés pour mesurer l’expression et identifier le TSS. Produit de la transcription RNAseq : Lecture de séquences exoniques. On observe une marque H3K4Me3 sur 500 pb ont cette modification : on peut supposer qu’il s’agit d’un promoteur étendu avec plusieurs sites d’initiation de la transcription possibles, ou d’un démarrage alternatif de la transcription.  Elongation de la transcription, contrôle de l’ARN polymérase 1) Formation du PIC et recrutement de la Pol II et ses facteurs associés : des régions enhancers peuvent interagir avec des co-facteurs pour faciliter l’assemblage du PIC (un des modes d’action d’un enhancer). 2) Pseudo-initation de la transcription où la Pol II est libérée du +1 mais s’arrête rapidement car les signaux d’activation de la Pol II sont incomplets (peut être un mode d’action d’enhancer). 3) Pol II est bloquée sur son site de pause : pour qu’elle puisse continuer, besoin de co- facteurs P-TEFB capables de phosophoryler NELF et DSIF pour les désactiver + phosphorylation de la Ser5 de la Pol II pour qu’elle entre dans une phase d’élongation productive. Le fait d’avoir ces enhancers permet d’agglutiner ces protéines pour faciliter le processus. 4) Transcription = phénomène pulsatif avec des bursts correspondant à des relarguages de la Pol II de son site de pause. L’affinité du promoteur influence la capacité à nucléer (force du burst) et les co-facteurs déterminent la fréquence des bursts. La Pol II a un domaine CTD qui contient des résidus phosphorylables (séquences consensus). La libération de la Pol II se fait grâce à la phosphorylation de la sérine 2 par P-TEFb. Si on fait une CHIP de la Pol II, on la voit au promoteur (soit au site d’initiation soit au site de pause). La production de petits ARNs associés aux enhancers (transcription des séquences enhancers) stabilise la liaison des facteurs de transcription, et donc le recrutement de Pol II. La majorité des promoteurs eucaryotes sont bidirectionnels, ce qui augmente encore la complexité des transcriptomes.  Cycle de la transcription : Ouverture de la chromatine → Fixation de facteurs de transcription généraux du PIC → Initiation de transcription productive ou abortive → Si P-TEFb, libération de l’ARN pol II du site de pause et élongation productive sinon arrêt de la transcription. Terminaison de la transcription  Synthèse, maturation et diversification des ARNs Promoteurs alternatifs Quand la transcription commence, on commence directement sur un exon : il peut être codant ou non codant. Promoteurs différents mais même protéine : chaque promoteur s’exprime dans un tissu différent, avec une force différente. Exemple : Dans une cellule musculaire, 10 000 transcrits et dans un neurone 5 transcrits.  La coiffe en 5’ L’ajout de la coiffe a lieu en parallèle de la transcription. Il se fait par méthylation d’une guanosine. Rôles : - Stabilisation de l’ARNm en le protégeant des exonucléases - Reconnue par les protéines CBC permettant l’export - Reconnue par une des SU du ribosome qui facilite l’assemblage de eiF4E L’épissage du transcrit primaire Mis en évidence par une expérience d’hybridation d’ADN/ARNm où on a vu des régions de l’ADN qui ne s’hybrident pas avec l’ARN : lariats d’introns. L’épissage est un processus nucléaire (peut se faire en parallèle de la transcription) qui se fait grâce à la reconnaissance de séquences au niveau du site donneur (GT) et accepteur (AG) permettant de reconnaitre le début/fin d’un intron. Il consiste en deux réactions de trans-estérification. Un point de branchement attaque au niveau du site donneur : formation d’une structure en lasso. La machinerie de l’épissage fait intervenir le splicéosome (complexe ribonucléoprotéique) qui reconnaît, sélectionne les sites d’épissage et catalyse les réactions de transestérification. L’efficacité avec laquelle il va agir est déterminée par une balance entre différents critères comme : - La force des sites d’épissage (leur conformité par rapport aux séquences consensus ) - La taille des exons - La présence de séquences auxiliaires = enhancer ou silencer de l’épissage au niveau des introns. Les séquences auxililaires liées au niveau des silencers répriment l’épissage → l’exon s’épisse avec le suivant. Les enhancers et silencers peuvent être soit exoniques soit introniques. Epissage alternatif Eléments cis activateurs et répresseurs dans les introns et les exons : - Liaison par des facteurs spécifiques : protéines SR - Domaine RNA Binding - Domaine riche en sérine et arginine pour les interactions protéiques régulées par phosphorylation - Interaction avec les snRNP (small nuclear RiboNucleoProtein) - Stabilisent le splicéosome L’épissage alternatif génère des transcrits différents, contribuant ainsi à la diversification du transcriptome. Conséquences de la variétés des transcrits issus d’un locus : La polyadénylation en 3’ La queue polyA a un rôle de protection face aux exonucléases, et se lie à des protéines qui forment un complexe qui renforce la protection aux extrémités. Une endonucléase clive l’ARNm en aval du signal AAUAAA. La queue de polyA est ajoutée par la polyA polymérase. Certains ARNm n’ont pas de queue de polyA (ou la queue polyA peut être ajoutée plus tardivement). Il existe aussi une polyadénylation alternative qui génère des ARNm de longeur différente (régulation supplémentaire). Schéma bilan sur la diversification du transcriptome : Contrôle post-transcriptionnel : stabilité des ARNs La demi-vie d’un ARNm est d’une dizaine d’heures donc il y a un gros turn-over d’ARNm dans une cellule. Mécanismes diminuant la stabilité : dé-adénylases qui enlèvent la queue polyA, de-capping, rendent l’ARN sensible aux exonucléases. CCR4 est un complexe qui stimule les mécanismes de dégradation des ARNs. Il peut être recruté sur un ARN par différents facteurs : micro ARNs, séquences liant des protéines qui font que cet ARN est pré-programmé à ne pas durer longtemps… La stabilité de l’ARN peut être régulée directement ou indirectement (régulation des protéines se liant à ces séquences). Nonsense-mediated Decay (NMD) : Système de surveillance des ARNm prématurés qui permet de s’assurer que le codon stop est bien dans le dernier exon. Le ribosome dégage les flags puis quand il rencontre un codon stop, si il y a encore des protéines de jonctions exons-exons, dégradation de l’ARN. RNA Editing Une modification sur un nucléotide de l’ARN peut changer sa conformation et donc ses interactions. Cela permet de diversifier l’info génétique en changeant la nature de la protéine, altérer l’épissage… Déamination (catalysée par ADAR) : - Adénosine → Inosine - Cytidine → Uridine Fonctions biologiques : Dans le système hématopoiétique, il y a des évènements d’édition sur des ARNs db brins qui déclenchent la réponse immunité innée → création de mésappariement qui diminuent taille ADN db brin → échappement à l’immunité innée. Les ARNs non codants 3 classes de petits ARNs régulateurs : - siRNAs (