Cours 10 - La Réplication PDF

Réplication La réplication est un processus universel présent chez tous les groupes du vivant. Rappel : Le cycle cellulaire et la réplication Contrôle de la réplication au cours du cycle cellulaire chez tous les organismes. Phase G1 : Préparation de la réplication. Phase d’accumulation de m...

Réplication La réplication est un processus universel présent chez tous les groupes du vivant. Rappel : Le cycle cellulaire et la réplication Contrôle de la réplication au cours du cycle cellulaire chez tous les organismes. Phase G1 : Préparation de la réplication. Phase d’accumulation de matière et d’énergie (augmentation de la taille de la cellule) : augmentation de la capacité de synthèse des macromolécules, il faut doubler le patrimoine génétique et les protéines associées. Phase G2 : Phase de réparation d’accidents survenus pendant la S, important pour avoir un matériel génétique conforme. Cytogramme : population de cellules asynchrones. Signal déconvolué en 3 pics : 1er pic : population de cellules en G1 (petite proportion) 2ème pic : population de cellules en phase S 3ème pic : population de cellules en phase G2 Checkpoints : 1er checkpoint en phase G1, une cellule peut démarrer la phase S même sans quantité de matière suffisante → stockage minimum puis environnement favorable. 2ème checkpoint en phase G1 : vérification que l’ADN ne soit pas endommagé → protéines de signalisation bloquent le passage en phase S pour la réparation. Timing de réplication : les gènes se répliquent dans un ordre précis selon le type cellulaire. En phase G2, on a le double du génome : on peut se servir de ces 2 copies s’il y a des erreurs pour réparer efficacement. Il y a une redondance de l’information génétique car l’ADN est bicaténaire : chaque brin permet de synthétiser son complémentaire. Chaque brin est répliqué de façon indépendante : séparation des brins puis copie de chacun d’eux ➔ Réplication semi-conservative. Il y a un peu de modèle dispersif lié à la réparation de l’ADN.  1) L’organisation des génomes en réplicon : les origines de réplication Visualisation des origines de réplication : Culture de E.coli sur des NTPs tritiés : lyse sur grille de microscope électronique en milieu hypotonique → autoradiographie où les grains d’argent montrent la structure de l’ADN. Le chromosome d’E. coli correspond à un réplicon. Le marquage de l’ADN à faible radioactivité puis ajout d’une grande quantité de radioactivité montre que la thymidine tritiée a été incorporée des deux côtés donc la réplication est bidirectionnelle. On voit des yeux de réplication de taille différente sur la même molécule d’ADN chez les Eucaryotes : il y a beaucoup d’origines de réplication par chromosome. Elles n’ont pas démarré au même moment vu qu’elles sont de tailles différentes. IdU = Uracile auquel on a rajouté un iode en C5 / CldU → prend la place de la thymine (la thymine est synthétisée dans la cellule en méthylant l’uracile). Marquage rouge : on a répliqué uniquement pendant la phase d’ajout du IdU donc quand on a rajouté du CldU il n’y a plus de réplication. Marquage vert : la réplication a démarré quand on a mis du CldU. Le peignage moléculaire consiste à accrocher l’ADN à une lame. En noir : régions d’initiation de la réplication. Approche bioinformatique pour identifier des signatures au niveau des régions de terminus de réplication ou d’initiation : les terminus sont bien repérés (pauvres en T, influence sur la courbure de l’ADN). Biais en GC cumulatif : regarder là ou il y a des changements brusques dans la teneur en GC. Il y a peu de GC dans les régions de réplication. Détermination des origines de réplication : approche génétique Fragmentation du génome d’E.coli → Insertion dans des plasmides → Transformation d’E.Coli sensible à Kan. Si un fragment possède une ORI, on peut répliquer le gène de résistance à la Kan et donc la bactérie pousse sur le milieu de sélection. Détermination des ARS chez la levure S. cerevisiae Chez la levure en phase haploïde, utilisation de gènes de sélection (URA3). Plasmide navette : Contient des origines de réplication de deux organismes différents. On peut donc cloner le plasmide en grande quantité chez E.Coli puis transfecter la levure. Prérequis : le génome de la levure est entièrement connu. Constitution d’une banque d’ARS = Autonomously Replicating Sequence. 1) Fragmentation au hasard du génome de la levure 2) Insertion dans un plasmide navette (E.Coli) 3) Sélection chez la levure Utilisation de chromosomes artificiels de levures en linéarisant un plasmide. Transformation de levures ura- et sélection sur un milieu ura- : si les levures sont ura3+, elles pourront pousser. Donc le chromosome aura embarqué un fragment qui peut servir d’origine. Toutes les ARS ne sont pas utilisées in vivo, ça dépend de la pression de sélection exercée. Densité potentielle en origine très importante chez la levure. La machinerie de réplication des eucaryotes va moins vite que celle des bactéries. Plus le génome est grand, plus on a d’origines. Chez les autres Eucaryotes, on ne connait pas les séquences d’initiation de la réplication. On sait seulement qu’elles sont riches en AT et dans des régions intergéniques. Mais on peut dire que des protéines ORC (Origin Recognition Complex) se fixent dans des régions particulières. On utilise la fréquence allélique pour localiser les sites d’initiation : lors de la réplication, les origines sont les premières séquences à être en double exemplaire. Méthode : Puce à ADN ou DNAseq. Sur une population asynchrone, il y a une sur-représentation des séquences d’origines proportionnelle à la proportion de cellules en phase S. On prend un ADN sans réplication (cellules en phase stationnaire ou bloquées pour la réplication) qu’on marque avec un fluorophore (mesure l’excès allélique). On fait la même chose avec des cellules en réplication → mesure de la quantité de fluorescence verte / fluorescence rouge. Rapport du signal entre cellules en croissance exponentielle et phase stationnaire : les pics correspondent à l’augmentation de fréquence allélique. On voit 3 origines (prendre en compte le fait que le chromosome est circulaire). Les pics n’ont pas la même amplitude donc ils n’ont pas démarré au même moment. Les origines peuvent converger (signal au- dessus de 1). On retrouve les pics sur analyse par NGS. Approche ciblée : Utilisation de sondes marquées (demande la connaissance préalable de la région étudiée) Syncytium de milliers de noyaux synchrones chez Physarum polycephalum (Eucaryote). Ici, le gène redB est répliqué avant redA.  Electrophorèse bidimensionelle pour l’étude détaillée d’une région Une région avec une sonde donnée : on regarde un fragment d’ADN qui déborde. Au cours du temps, on voit la progression de la fourche de réplication. Séparation des molécules d’ADN en fonction de leur masse + dimension qui sépare selon la forme de l’espace (encombrantes migrent plus lentement). DUE : DNA Unwinding Element = régions qui s’ouvrent très facilement. Un complexe de 6 protéines intervient dans la reconnaissances des origines : formé de protéines ORC. ORC6 ressemble à TFIIB. Modification des histones interviennent. Hélice : reconnaissance de motifs spécifique à S. cerevisiae. Intervention d’une hélice dans la fixation des ORC ? Délétion de l’hélice supplémentaire de l’ORC de S. cerevisae → on voit des régions sans fixation où la protéine peut se fixer après délétion ➔ séquences consensus qui ressemblent à des origines de type humaines. Chez E. Coli : 1 initiateur agit sur 1 origine. Chez les Archées : 3 origines, 3 protéines ORC qui permettent l’initiation des origines. Chez les Eucaryotes : hexamères d’ORC permettent des initiations multiples à différents endroits. Dna A : Protéines homologues conservées au cours de l’évolution. Fixation des hélicases réplicatives : la fixation et activation des hélicases se passe en deux temps chez les eucaryotes et les archées. Il y a de multiples origines dans un génome mais toutes ne sont pas utilisées. Ces régions sont regroupées dans l’espace pour former le réplisome. La diffusion est un obstacle aux interactions protéiques : le fait de regrouper des protéines de même fonction limite la diffusion et augmente l’efficacité. On retrouve toutes les protéines nécessaires à la réplication dans le réplisome. Réplication foci = regroupement de réplisomes. Signalisation qui donne le départ au complexe formé des ORC, démarrage brusque : Les protéines impliquées dans les différentes phases de la réplication Utilisation de précurseurs radioactifs pour allonger la chaîne. L’ADN Pol I de E. Coli 1 seul polypeptide de 109 kDa qui polymérise dans le sens 5’ → 3’. Elle nécessite une matrice ADN, des dNTPs et du Mg2+. Il faut un brin amorcé avant une extrémité 3’OH pour faire la réplication. Les ADN pol ont des efficacités variables. Sans dNTPs, on voit que l’ajout d’ADN pol donne des brins plus petits : c’est l’activité exonucléase de relecture qui élimine les mauvais appariements. Les nucléotides aux extrémités ont tendance à flotter car ils ont seulement 1 force d’empilement, ce qui est reconnu par la polymérase.