Introduction à la biologie cellulaire PDF

GBM3000 Introduction à la biologie cellulaire Professeur: Dr. Casimiro Gerarduzzi [email protected] www. gerarduzzilab.wixsite.com/site Hôpital Maisonneuve-Rosemont...

GBM3000 Introduction à la biologie cellulaire Professeur: Dr. Casimiro Gerarduzzi [email protected] www. gerarduzzilab.wixsite.com/site Hôpital Maisonneuve-Rosemont Assistante: Djazia Haferssas email: [email protected] FIBROSE RÉNALE Casimiro Gerarduzzi, PhD, MSc Parcours de carrière Mémoire de maîtrise: Réponses inflammatoires à l’ARN viral. Thèse de doctorat: Mécanismes de réparation suite à une réponse immunitaire destructrice: effets antifibrotiques de la PGE2 sur les myofibroblastes (cellule effectrice de réparation / fibrose). Postdoctoral Fellow I: Signalisation de p53, un régulateur maître de l'arrêt du cycle cellulaire et de l'apoptose, deux signaux connus pour être dérégulés dans les myofibroblastes. Postdoctoral Fellow II: Signalisation des protéines extracellulaires dans la fibrose rénale. Chercheur principal: Intérêt pour la recherche translationnelle, fusionnant la signalisation moléculaire antérieure dans la fibrose avec diverses techniques in vivo (rein) et in vitro.  SURGICAL MODEL Funding TOXICANT MODEL KRESCENT/CIHR New Investigator Award Laboratory of Kidney Fibrosis and Nephrology Regeneration Axis KRESCENT Infrastructure Award https://gerarduzzilab.wixsite.com/site Healthy Nephropathy Cancer Research Society 1) MECHANISM Unilateral Ureter Folic Acid (FA) A quantitative systems approach to identify genes/proteins HMRObstruction Foundation (UUO) involved in the pathogenesis of HEALTHY kidney disease Cole Foundation 2) DETECTION NSERC Translational biomarkers for Matricellular Proteins Matricellular Proteins early diagnosis and prognosis FIBROSIS of kidney disease 3) TREATMENT Targeted translational therapeutics to halt progression of the disease 1) IN VITRO 2) IN VIVO 2) HUMAN DISEASE 3) THERAPEUTIC Intravenous Dr. Vincent PICHETTE delivery via tail Wild type SMOC2 KO Dr. Louis-Philippe vein Myofibroblasts Masson’s Trichrome LAURIN CoK FIBROBLASTS MYOFIBROBLASTS SMOC2 Wild SMOC2 Confirmation in Human Disease type KO 50 µg / 200µL SMOC2 | α-SMA | DAPI 7d UUO 10 ng/mL Migration HUMA 4 Hours Control ssiRNA Fluorescein Myofibroblasts Y HEALTH N Normal siRNA URIN Vehicle SMOC2 E F actin/DAPI Co Immunoblotting K ~31 ~24 54 kDa SMOC ssiRNA SMOC2 siRNA KIDNEY DISEAS E 7d FA 2 7d UUO g g 66 kDa Albumin KIDNEY TISSUE KIDNEY TISSUE KIDNEY TISSUE www. gerarduzzilab.wixsite.com/site Bibliographie MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter ~140$ la 5e édition. 4e gratuit online NCBI Le microscope optique peut résoudre les détails Optical microscope distants de 0,2 mm Microscopie optique Transmission Electron Microscope La distance entre les fichiers adjacents d'atomes d'or est d'environ 0,2 nm (2 Å). The propagation of photons and electrons is very similar. Lenses for electrons can be created with magnetic fields that deflect the beam Les échantillons biologiques nécessitent une préparation. L'imagerie en direct n'est pas possible avec TEM ORGANISATION CELLULAIRE Les cellules procaryotes n'ont pas de Eucaryote fait référence à toutes les plantes et membrane nucléaire, ou d’organites sub- animaux. cellulaires liés à la membrane comme les mitochondries et les chloroplastes. Les cellules eucaryotes sont caractérisées par de vrais noyaux qui sont délimités par une La membrane qui délimite la cellule est repliée membrane nucléaire et des organites sub- vers l'intérieur en divers points et remplit de cellulaires liés à la membrane. nombreuses fonctions enzymatiques similaires à des membranes internes d'eucaryotes. CELLULE PROCARYOTE CELLULE EUCARYOTE Eucariotas ADN – ARN – Protéines L’ADN DNA L’anatomie de l’ARN INFORMATION CONTENUE DANS L’ADN HUMAIN 2.9x109 paires de bases 30% de génome sont des gènes 1.5% du génome code pour des protéines Le reste contient des régions régulatrices, des introns et ADN non-codant Dans ces régions, il y a des séquences très conservées, une forte pression évolutive. Une fraction de ce ADN est transcrit en ARN, mais pas traduit en protéines 25,000 gènes, qui codent pour 100,000 protéines PLAN Duplication de l’ADN Microscopie optique et électronique Transcription de l’ADN Réaction en chaîne par polymérase Séquençage de Sanger Séquençage à haut débit Traduction de l’ARN Microscopie de fluorescence Cytométrie de flux L’information que porte l’ADN doit être copiée avant chaque division cellulaire Le taux de mutations est extrêmement bas: 10-9. Ceci est plus bas que ce qui causerait les forces électriques. La machinerie moléculaire a plusieurs mécanismes de correction. L’ADN polymérase catalyse la synthèse de l’ADN  LES FRAGMENTS D’OKAZAKI Les ADN (et ARN) polymérases opèrent dans la direction 5’-3 ’, ce qui complique la progression de la fourche de réplication. Les fragments d'Okazaki sont de courtes séquences de nucléotides d'ADN (~150 à 200) qui sont synthétisées de manière discontinue Ils sont ensuite liés ensemble par l'enzyme ADN ligase pour créer le brin retardé lors de la réplication de l'ADN Replication forks, DNA polymerases work in the 5’-to-3’ direction Une fourche de réplication Pixar Molecular Biology of the Cell 5e Micrographie d’une fourche de réplication Transcription de l’ADN Réaction en chaîne par polymérase Séquençage de Sanger Séquençage à haut débit LA COMPOSITION DE L’ARN LA TRANSCRIPTION LES SIGNAUX DE DÉBUT ET DE FIN DE TRANSCRIPTION ONT UNE SEQUENCE HÉTÉROGÈNE Structure de deux gènes humains montrant la disposition des exons et des introns. SPLICING, ÉPISSAGE Épissage alternatif du gène de l'a-tropomyosine de rat Molecular Biology of the Cell 5e Résumé DE L’ARN AUX PROTÉINES Le Code Génétique Instructions: ARN Composants de l'ARN Translation Pièces: Acides Amides Composants de Protéines: Acides Amides Protéines Protéines: Meubles LE CODE GÉNÉTIQUE et les ARN de TRANSFERT LE CODE GÉNÉTIQUE et les ARN de TRANSFERT L’ARN messager est lu par les ribosomes TRADUCTION DES ARNm Début de la traduction Start Codon Stop Codon A) B) C) Modifications des protéines Enzymes Modifications des protéines Hsp60 et Hsp 70 Régulations génomique et protéomique https://www.slideshare.net/ L’EFFET DES MUTATIONS Substitution d’une seule base. L’EFFET DES MUTATIONS #1 L’EFFET DES MUTATIONS #2 Substitution d’une seule base. MISSENSE MUTATION: Un acide aminé qui change EXAMPLE: Sickle-cell disease, Drépanocytose L’EFFET DES MUTATIONS #3 Substitution d’une seule base. NONSENSE MUTATIONS: Un codon STOP prématuré mRNA: 5' - AUG ACU CAC CGA GCG CGA AGC UGA - 3' Protein: Met Thr His Arg Ala Arg Ser Stop mRNA: 5' - AUG ACU CAC UGA GCG CGU AGC UGA - 3' Protein: Met Thr His Stop EXAMPLE: Fibrose kystique La mutation se produit dans le gène qui code pour un canal de chlore L’EFFET DES MUTATIONS #4 Insertions et délétions d’une seule base. FRAMESHIFT MUTATIONS AUG UUC GCA CAC UAU GGC AAC AAC AAC Met-Phe-Ala-His-Tyr-Gly-Asn-Asn-Asn- AUG AUU CGC ACA CUA UGG CAA CAA CAA C Met-Ile-Arg-Thr-Leu-Trp-Gln-Gln-Gln- EXEMPLE La maladie de Tay-Sachs, aussi appelée idiotie amaurotique familiale C'est une maladie neurodégénérative secondaire due à l'absence de l'enzyme hexosaminidase A, ce qui entraîne une accumulation dans le lysosome de ganglioside GM2. L’EFFET DES MUTATIONS #5: Mutations et Cancer Types de gènes liés au cancer 1. Gènes suppresseurs de tumeurs: Normalement, ils limitent la croissance cellulaire. Lorsqu'un gène suppresseur de tumeur mute, les cellules se développent de manière incontrôlable. Et ils peuvent éventuellement former une tumeur. Des exemples: BRCA1, BRCA2 et p53. 2. Oncogènes. Ceux-ci transforment une cellule saine en une cellule cancéreuse. Deux oncogènes courants sont: HER2, une protéine spécialisée qui contrôle la croissance et la propagation du cancer La famille de gènes RAS, qui rend les protéines impliquées dans les voies de communication cellulaire, la croissance cellulaire et la mort cellulaire. 3. Gènes de réparation de l'ADN. Si une personne a une erreur dans un gène de réparation de l'ADN, les erreurs ne sont pas corrigées. Ensuite, les erreurs deviennent des mutations. Ces mutations peuvent éventuellement conduire au cancer, en particulier des mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs ou les oncogènes. Régulations génomique et protéomique MUTAGÈNES MUTATIONS Réparation Les systèmes de réparation dans la cellule éliminent les mutations. Les humains ont environ ~3X109 de bases d’ADN Le taux de mutations spontanées d'un organisme est < 1 mutation par 109 nucléotides par génération Deux types de réparation par excision Régulations génomique et protéomique MUTAGENS MUTATIONS Misfolded Régulation protéomique  Digestion par le protéasome Protéasome Techniques pour étudier l’ADN/ARN et les protéines ANALYSER DES PROTÉINES SÉQUENÇAGE D’ADN SÉQUENÇAGE D’ARN ANALYSER LES PROTÉINES I Fonction Fonction spécifique: anticorps (a) Neutralisation: Les anticorps empêchent un virus ou une protéine toxique de se lier à leur cible. (b) Opsonisation: Un pathogène marqué par des anticorps est consommé par un macrophage ou un neutrophile. (c) Activation du complément : Les anticorps fixés à la surface d'une cellule pathogène activent les cellules immunitaires pour éliminer les microbes et les cellules endommagées d'un organisme, favorisent l'inflammation et attaquent la membrane cellulaire de l'agent pathogène. https://alevelbiology.co.uk/notes/functions-of-proteins/ ANALYSER LES PROTÉINES II Lyse cellulaire Structure https://microbenotes.com WESTERN BLOT 518 Dessus du gel Fond de gel WESTERN BLOT - Détection des protéines totales Haut du gel Bas du gel WESTERN BLOT - Détection des protéines spécifiques Haut du gel Bas du gel www.creative-proteomics.com WESTERN BLOT - Résumé SÉQUENÇAGE D’ADN A) B) SÉQUENÇAGE D’ADN C) SÉQUENÇAGE D’ADN C) CHROMATOGRAMME RÉACTION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE Polymerase Chain Reaction SÉQUENÇAGE D’ADN - PCR DÉTECTION DE COVID-19 Les premiers tests d'infection reposaient sur la présence d'anticorps dirigés contre le virus circulant dans le sang. Les anticorps n'apparaissent que plusieurs semaines après l'infection, les anticorps maternels masquent l'infection d'un nouveau-né et les agents thérapeutiques pour combattre l'infection n'affectent pas les anticorps. Des tests PCR ont été développés pour détecter aussi peu qu'un génome viral parmi l'ADN de plus de 50 000 cellules hôtes. Les infections peuvent être détectées plus tôt, le sang donné peut être testé directement pour le virus, les nouveau-nés peuvent être immédiatement testés pour l'infection et les effets des traitements antiviraux peuvent être quantifiés. Des molécules spécifiques peuvent être localisées dans des cellules par des fluorophores Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Microscopie à fluorescence Microscopie à plusieurs sondes fluorescentes Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) FISH: Fluorescence in situ hybridazation Figure 9-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Organelles cellulaires ADN ARN PROTÉINES Les principaux compartiments intracellulaires d'une cellule animale cytosol Organelles cellulaires Trois grands thèmes et leurs organelles associés: 1. Production de protéines – Ribosomes, ER, Golgi 2. Production d'énergie - Mitochondries 3. Structure intracellulaire et extracellulaire Compartiments intracellulaires et tri des protéines Une «feuille de route» simplifiée du trafic de protéines Ribosomes: usines de protéines Les ribosomes sont des complexes d'ARN ribosomal et de protéines associées. Les ribosomes effectuent la synthèse des protéines à deux endroits: Dans le cytosol (ribosomes libres) Synthèse libre À l'extérieur du réticulum endoplasmique ou de l'enveloppe nucléaire (ribosomes liés) La séquence du peptide signal sur ceux liés au réticulum endoplasmique est reconnue par la particule de reconnaissance du signal (SRP) Endoplasmic Reticulum There are two types: 1. Rough ER has ribosomes attached Has bound ribosomes, which secrete glycoproteins (proteins covalently bonded to carbohydrates) Distributes transport vesicles, proteins surrounded by membranes Is a membrane factory for the cell 2. Smooth ER does not have ribosomes on it. Synthesizes lipids Metabolizes carbohydrates Detoxifies drugs and poisons Trafic Vésiculaire  LE TRANSPORT DEPUIS LES RE À TRAVERS L'APPAREIL GOLGI The Golgi apparatus consists of flattened membranous sacs called cisternae Functions of the Golgi apparatus Modifies products of the ER Manufactures certain macromolecules Sorts and packages materials into transport vesicles Intracellular Compartments and Protein Sorting Une «feuille de route» simplifiée du trafic de protéines Les signaux de localisation nucléaire dirigent les protéines nucléaires vers le noyau Translocateurs de protéines transmembranaires La MITOCHONDRIE Image au microscope électronique La mitochondrie contient une membrane externe, une membrane interne et deux compartiments internes Chimiosmose: Étape 1 Étape 1: les électrons de haute énergie (provenant de l’oxydation des molécules alimentaires) sont transférés à travers une chaine de protéines membranaires. Le passage des électrons par chacune de ces protéines libère une énergie qui est utilisée pour pomper des protons vers l’espace intermembranaire. Ce processus donne lieu à un large potentiel électrochimique à travers la membrane, qui sert de réserve d'énergie polyvalente qui entraîne des réactions nécessitant de l'énergie.. Chimiosmose: Étape 2 Étape 2: Les protons diffusent à travers un protéine membranaires appelée ATP synthétase, qui catalyse la production d’ATP à partir d’ADP et de phosphate. Cette protéine fonctionne à la façon d’un turbine, propulsée par des protons pour synthétiser ATP. L’énergie dérivée des aliments est convertie en énergie chimique dans la liaison du phosphate des molécules d’ATP. Processus de transport d'électrons A) B) A) Résumé des processus de transport d'électrons dans les mitochondries. B) Résumé du métabolisme générateur d'énergie dans les mitochondries - Le pyruvate et les acides gras pénètrent dans la mitochondrie (en bas) et se décomposent en acétyl CoA. L'acétyl CoA est ensuite métabolisé par le cycle de l'acide citrique, qui réduit le NAD + en NADH (et le FAD en FADH2, non représenté). Dans le processus de phosphorylation oxydative, les électrons à haute énergie du NADH (et du FADH2) sont ensuite passés le long de la chaîne de transport d'électrons dans la membrane interne vers l'oxygène (O2). Ce transport d'électrons génère un gradient de protons à travers la membrane interne, qui entraîne la production d'ATP par l'ATP synthase. Le NADH généré par glycolyse dans le cytosol transmet également des électrons à la chaîne respiratoire (non représentée). Puisque le NADH ne peut pas traverser la membrane mitochondriale interne, le transfert d'électrons à partir du NADH cytosolique doit être accompli indirectement au moyen de l'un de plusieurs systèmes de «navette» qui transportent un autre composé réduit dans la mitochondrie; après avoir été oxydé, ce composé est renvoyé au cytosol, où il est à nouveau réduit par le NADH. La principale conversion d'énergie nette catalysée par la mitochondrie. Une comparaison des oxydations biologiques avec la combustion Le chemin des électrons à travers les trois complexes enzymatiques respiratoires Lors du transfert d'électrons du NADH à l'oxygène (lignes rouges), l'ubiquinone et le cytochrome c servent de porteurs mobiles qui transportent les électrons d'un complexe à l'autre. Comme indiqué, les protons sont pompés à travers la membrane par chacun des complexes enzymatiques respiratoires. Jonctions cellulaires / adhésion, cytosquelette et matrice extracellulaire Protéine de matrice extracellulaire (fibronectine, verte) Microfilaments cytosquelettiques (actine, rouge) Noyaux (ADN, bleu) Rôles du Cytosquelette: Soutien et Motilité Le cytosquelette aide à soutenir la cellule et à conserver sa forme Il interagit avec les protéines motrices pour produire la motilité À l'intérieur des cellules, les vésicules et autres organites peuvent se déplacer le long du cytosquelette Jonctions serrées, desmosomes et jonctions espacées dans les cellules animales Quatre classes fonctionnelles de jonctions cellulaires dans les tissus animaux. (A) Les jonctions d'ancrage lient la cellule à la cellule (généralement via des protéines de cadhérine transmembranaires) ou de cellule à matrice (généralement via des protéines intégrines transmembranaires). (B) Les jonctions occlusives (impliquant des protéines de claudine) scellent les espaces entre les cellules épithéliales. (C) Les jonctions formant des canaux (composées de protéines de connexine ou d'innexine) forment des passages pour que les petites molécules et les ions passent d'une cellule à l'autre. (D) Les jonctions de relais de signal sont des structures complexes, impliquant généralement des protéines d'ancrage aux côtés de protéines médiatisant la transduction du signal.  La Matrice Extracellulaire (MEC) Les cellules animales n’ont pas de parois cellulaires mais sont couvertes par une matrice extracellulaire élaborée La MEC est composée de glycoprotéines telles que le collagène, les protéoglycanes et la fibronectine Les protéines de la MEC se lient aux protéines réceptrices de la membrane plasmique appelées intégrines Exemples: Résumé des compartiments Résumé des compartiments Merci Pour Votre Attention Laboratory of Kidney Fibrosis and Regeneration Sept. 2, 2020