Biologie Cellulaire - Chapitre 1 Introduction - 2022 PDF

 Biologie Cellulaire Objectifs du cours 1. Introduire l’histoire de la cellule 2. Exposer les principales méthodes d’étude de la cellule 3. Comprendre les différences et les similarités entre les cellules procaryotes et eucaryotes, entre cellules animale et végétale 4....

 Biologie Cellulaire Objectifs du cours 1. Introduire l’histoire de la cellule 2. Exposer les principales méthodes d’étude de la cellule 3. Comprendre les différences et les similarités entre les cellules procaryotes et eucaryotes, entre cellules animale et végétale 4. Décrire la cellule en terme de composition chimique, de morphologie et d’ultrastructure (les différents compartiments de la cellule) Références Biology concepts and connections, Campbell, Taylor and al., Pearson, Ninth Edition. Essentials cell biology, Alberts and al., Garland Science, Fourth Edition. Molecular Biology of The Cell, Alberts and al., Garland Science, Fifth Edition.  Chap.1: Introduction à la biologie cellulaire 1. Généralités 2. Origine et histoire de la cellule 3. Théorie cellulaire 4. Composition chimique 4.1. Composés inorganiques: l’eau et les sels minéraux 4.2. Composés organiques: Glucides 4.3. Composés organiques: Lipides 4.4. Composés organiques: Acides aminés 4.5. Composés organiques: Acides nucléiques 5. Méthodes d’étude de la cellule 5.1. Microscope optique 5.2. Microscope à fluorescence 5.3. Microscope confocale 5.4. Microscope électronique 5.5. Cytométrie de flux 5.6. Culture cellulaire 5.7. Fractionnement cellulaire  1. Généralités Gènes Æ protéines Æ organites Æ cellules Æ tissu Æ organe Æ appareil Æ système Æ organisme Æ population Æ espèce Biologie cellulaire (ou cytologie) La science qui étudie les cellules vivantes d’un point de vue structural et fonctionnel ¾ Structure ¾ Architecture ¾ Composition chimique ¾ Propriétés ¾ Fonctions  1. Généralités La cellule est l’unité structurale fondamentale et fonctionnelle de tous les organismes vivants Homme Æ ≈ 2-3 x 1013 cellules  1. Généralités Quelques classifications des êtres vivants ¾ En fonction de leur structure Organismes unicellulaires et pluricellulaires ¾ En fonction du type trophique: selon les modes de nutrition Autotrophes (processus photosynthétiques) ou hétérotrophes ¾ En fonction du besoin en oxygène et en fonction de la nature de leur métabolisme (selon que l’oxygène est nécessaire à la transformation ou non des aliments en énergie) Organismes aérobies et anaérobies  2. Origine et histoire de la cellule Théorie de la soupe primitive Oparine (1924) et Haldane (1929) L’atmosphère primitive de la Terre: Réductrice Mélange de gaz L’eau (vapeur) Dépourvue d’oxygène (O2) et d’ozone (O3) Ces molécules ont réagi ensemble sous l’effet du rayonnement solaire, des décharges électriques, de la pression atmosphérique et de la température  2. Origine et histoire de la cellule En résultat Æ Apparition des molécules organiques Accumulation de ces molécules dans les océans de cette Terre primitive Réactions spontanées de ces molécules entre elles Ce qui a permis la synthèse abiotique d’autres molécules organiques connue par la soupe primitive Ce sont les‘‘précurseurs des macromolécules’’ comme les acides aminés, les acides gras, les sucres simples, les bases azotées… Certaines expériences au laboratoire menées par Stanley Miller en 1952 ont permis de reproduire et d’expliquer certaines étapes de ce processus  2. Origine et histoire de la cellule La première cellule vivante: cellule ancestrale primitive, appelée aussi LUCA (Last Universal Common Ancestor) aurait donné naissance à tous les organismes vivants (actuels ou ayant vécu) sur la Terre 1665 Æ Robert Hooke fut le premier à observer les cellules Le premier dessin des cellules de liège  2. Origine et histoire de la cellule Représentation hypothétique de la première cellule 2. Origine et histoire de la cellule 2. Origine et histoire de la cellule  3. Théorie cellulaire 1. Les plus petits êtres vivants 2. Principe de la division cellulaire Cellules apparaissent uniquement par division d'une cellule préexistante 3. Entité autonome La cellule est une unité vivante et l’unité de base du vivant 4. Individualité cellulaire grâce à la membrane plasmique 5. Cellule renferme sous forme d’ADN l’information nécessaire à son fonctionnement et à sa multiplication  4. Composition chimique Deux groupes d’éléments constituent les cellules Les éléments majeurs ou macromolécules - Rôle plastique: construction de l’organisme - Représentent 99% des constituants cellulaires C, H, O et N (≈96%) - Pourcentage plus faible P, Ca, S, Cl, Na, K, Mg (≈3%) ¾ Les oligoéléments - B, F, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Se, I, Mo - Rôle catalytique - Très faible quantité  4. Composition chimique Nature des molécules biologiques Les composés inorganiques (minérales): l’eau et les sels minéraux Les composés organiques o Précurseurs: les acides aminés, les acides gras, les sucres et les nucleotides o Macromolécules: les protéines, les glucides, les lipides et les acides nucléiques o Intermédiaires métaboliques (métabolites) o Molécules à fonctions diverses: vitamines, hormones, urée … 4. Composition chimique  4.1. Composés inorganiques L’eau a plusieurs rôles capitals - Un milieu favorable à la mobilité des molécules - Un solvant - Un stabilisateur des macromolécules L’eau intervient aussi - dans certaines réactions biologiques (hydrolyse, polymérisation) - dans certains processus complexes (photosynthèse) - dans l’élimination de certaines substances de la cellule - dans la régulation thermique par absorption de la chaleur  4.1. Composés inorganiques - Un sel minéral est un composé ionique qui résulte de l’association d’un anion (autre que OH-) et d’un cation (autre que H+) par une liaison ionique - Les sels minéraux: cations Na+, K+, Ca++ et Mg++ anions Cl-, SO4--, CO3H-, NO3- et PO4H-- Na+, K+, Ca++ Æ essentielles à la propagation de l'influx nerveux et à la contraction musculaire Le fer ionisé Æ composition de l'hémoglobine  4.2. Composés organiques: Glucides Ce sont des molécules abondantes dans la matière vivante Selon leur taille (càd le nombre de monomères qu’ils contiennent) les glucides sont classés en oses et osides Les Oses ou monosaccharides ou sucres simples - Molécules de base de la structure des glucides - Formule générale Cn(H2O)n (n varie entre 3 et 7) (glucose, fructose, galactose) Glucose C6H12O6  4.2. Composés organiques: Glucides ¾ Les osides: une association de plusieurs oses (les disaccharides, les oligosaccharides et les polysaccharides) o Les disaccharides Association de deux oses ou monosaccharides La liaison est appelée O-osidique ou glycosidique (R1-O-R2) Saccharose (glucose + fructose)  4.2. Composés organiques: Glucides Liaison entre les oses Un groupement hydroxyle OH du premier monomère réagit avec un groupement OH du deuxième monomère avec perte d’une molécule d’eau C’est une réaction de condensation, dans laquelle deux molécules se rejoignent à la suite de la perte d'une molécule d'eau. La réaction inverse (dans laquelle de l'eau est ajoutée) est appelée hydrolyse.  4.2. Composés organiques: Glucides o Les oligosaccharides (oligosides) - Polymères formés de n oses de chaînes courtes, liés par des liaisons O- osidiques ou glycosidiques avec perte de molécules d’eau - Dans les structures biologiques, les oligosaccharides s’associent d’une façon covalente à des lipides (glycolipides) ou à des protéines (glycoprotéines)  4.2. Composés organiques: Glucides o Les polysaccharides (polyosides) - Macromolécules qui résultent de la condensation d’un grand nombre de monosaccharides (n > 20) liés par des liaisons O-osidiques ou glycosidiques avec perte de molécules d’eau - On distingue les homo-polysaccharides (constitués d’une seule variété d’oses) et les hétéro- polysaccharides (constitués de deux variétés d’oses) Le glycogène est un polysaccharide entièrement composé d'unités de glucose réunies  4.2. Composés organiques: Glucides Rôle des glucides Source d’énergie L’oxydation des glucides en molécules plus petites libèrent de l'énergie Ils servent donc de réserves d’énergie Homopolysaccharides de réserve: l’amidon et le glycogène Soutien Homopolysaccharides de structure: La cellulose (paroi des cellules végétales) La chitine (paroi cellulaire de la plupart des champignons et des algues et dans l’exosquelette d’Insectes)  4.2. Composés organiques: Glucides Rôle des glucides Communication intercellulaire Les glycoprotéines et les glycolipides qui se trouvent tous deux dans les membranes cellulaires jouent un rôle dans la communication intercellulaire. Glycolipides: reconnaissance de même types de cellules pour former un tissu Glycoprotéines: ex: les molécules d’adhérence qui permettent la liaison entre 2 types cellulaires identiques/différents  4.2. Composés organiques: Glucides Reconnaissance cellulaire Protection (Mucine) Adhésion (glycocalyx) Déterminants antigéniques: Agglutinogènes du groupe sanguin (différents types de sucres formant la base moléculaire de différents groupes sanguin)  4.3. Composés organiques: Lipides - Constituants biologiques essentiels - Ils représentent 10 à 15 % du poids sec de la matière vivante - Source d’énergie à long terme (réserve) Il existe plusieurs classes de lipides Lipides simples ou Acides gras: CH3-(CH2)n-COOH - Groupement carboxyle acide COOH: extrémité polaire, hydrophile, ionisable et très réactive - Chaîne carbonnée: région apolaire, hydrophobe et peu réactive chimiquement - Amphiphile (hydrophobes et hydrophiles) Acide palmitique  4.3. Composés organiques: Lipides Acides gras insaturés (présence liaison double C=C) Acide gras saturés (absence de liaison double)  4.3. Composés organiques: Lipides Lipides complexes: Acide gras + Autre composant organique Exemples: - Glycérolipides: acide gras + glycérol Triglycérides: 3 acides gras + glycérol (Forme de stockage des acides gras). - Phospholipides Les phospholipides sont composés de deux queues d'acides gras hydrophobes liées à une tête hydrophile  4.3. Composés organiques: Lipides - Sphingolipides: Acide gras + sphingosine (sources de céramides) - Stéroïdes: Se caractérisent par un noyau formé de 4 cycles fusionnés o Cholestérol (Composant membranaire important; précurseur dans la synthèse des hormones sexuelles, des corticoïdes surrénaux et des sels biliaires) - Eicosanoïdes: proviennent de l’oxydation et de la cyclisation de certains acides gras o Prostaglandines (Inflammation)  4.4. Composés organiques: Acides aminés Acides aminés - Unités structurales des protéines - 20 acides aminés différents - Carbone α: groupement carboxyle COOH + groupement amine NH2 + atome d’hydrogène + chaîne latérale R Alanine R: groupe méthyle (CH3)  4.4. Composés organiques: Acides aminés Protéines: polymère d’acides aminés - Les acides aminés dans une protéine sont maintenus ensemble par des liaisons peptidiques (réaction de déshydratation) sans eau - Quantitatif: Elles constituent plus que la moitié du poids sec d’une cellule (55 et 85 % de la matière sèche) depend du type de cellule - Qualitatif: Protéines de structure (cytosquelette) et catalyseurs biologiques (enzymes)  4.4. Composés organiques: Acides aminés Filaments d’actine et de myosine (protéine du cytosquelette de la cellule) - Mouvements cellulaires - Maintient de la structure de la cellule  4.4. Composés organiques: Acides aminés Selon la morphologie, on distingue 2 grandes familles de protéines - Les protéines fibreuses - Filaments - Composées de structures répétitives - Mécaniquement résistantes - Rôle dans la structure: collagène, kératine  4.4. Composés organiques: Acides aminés - Les protéines globulaires - Macromolécules sphériques - Cytosol et dans le fluide extracellulaire - Rôle dynamique: Transport (kinésine et dynéine associées aux microtubules Enzymes Défense (anticorps) Contrôle génétique (Facteurs de transcription)  4.5. Composés organiques: Acides nucléiques - Polymères de nucléotides ou polynucléotides - Nucléotide = base azotée (puriques et pyrimidiques) + ose (ribose C5H10O5 ou désoxyribose C5H10O4)+ acide phosphorique - Soient libres, soient combinées à des protéines (nucléoprotéines) - Présentent dans toutes les cellules vivantes  4.5. Composés organiques: Acides nucléiques On distingue 2 types d’acides nucléiques - L’ADN (acide désoxyribonucléique): - l’ose est le désoxyribose et les bases sont A, T, C et G. - Retrouvé dans les noyaux des cellules animales et végétales - Retrouvé également dans les mitochondries - L’ARN (acide ribonucléique): - l’ose est le ribose et les base sont A, U, C et G. - Retrouvé essentiellement dans le cytoplasme des cellules. - Plusieurs types d’ARN (ribosomiques, de transfert, messagers)  4.5. Composés organiques: Acides nucléiques Fonctions importantes des acides nucléiques - Support de l’information génétique - Synthèse de l’ATP 1. L'ATP se forme par le biais de réactions induites par l'énergie libérée par la dégradation des aliments 2. Ses trois phosphates sont liés en série par deux liaisons phosphoanhydride. 3. Les nucléotides transportent de l'énergie chimique dans leurs liaisons phosphoanhydride facilement hydrolysées. 4. La rupture de ces liaisons phosphate libère de grandes quantités d'énergie: contraction, respiration, division cellulaire, transport de molécules, etc.  4.5. Composés organiques: Acides nucléiques - Synthèse des cofacteurs enzymatiques ou co-enzymes - Les nucléotides se combinent avec d'autres groupes pour former des coenzymes cysteine + acide pantoique + ADp P  4.5. Composés organiques: Acides nucléiques Génération de l’énergie Sous forme d’ATP dans la mitochondrie Dean et al., 2016 Vitamine B1 (Thiamine) TPP: Thiamine pyrophosphate Coenzyme  4.5. Composés organiques: Acides nucléiques - Les nucléotides sont utilisés comme petites molécules de signalisation intracellulaires dans la cellule AMPc (Adénosine monophosphate cyclique): messager secondaire pour la transduction du signal intracellulaire AMPc (Adénosine monophosphate cyclique) 4.5. Composés organiques: Acides nucléiques Effets cellulaires (transport, canaux ionique, etc) Effets cellulaires (contraction, division, prolifération, etc)  5. Méthodes d’étude de la cellule Échelle microscopique Le développement des microscopes a permis d’observer et de caractériser l’ultrastructure de la cellule  5. Méthodes d’étude de la cellule ™ Les études morphologiques L'histoire de biologie cellulaire est étroitement liée au perfectionnement d'un appareil optique agrandissant: le microscope - La microscopie optique (MO) Des grossissements de l'ordre de 2000 fois de cellules vivantes ou mortes et/ou colorées (résolution 0,2 à 0,5 μm) Analyse d'images et morphologie quantitative: à l'aide de programmes informatiques de reconnaissance des formes, un comptage des cellules ou des structures est possible sans l'astreinte d'un comptage visuel Microscopie optique ou photonique, microscopie à contraste de phase, microscopie à contraste interférentiel, microscopie à fluorescence, microscopie confocale, etc…  5. Méthodes d’étude de la cellule - La microscopie électronique (ME) Elle permet des grossissements plus importants de l'ordre de 200000 à 2000000 fois Microscopie électronique à transmission (MET) et microscopie électronique à balayage (MEB)  5.1. Microscope optique - Permet d’agrandir les cellules jusqu’à 1000 fois et de résoudre des détails jusqu’à 0,2 μm Grossissement standard = grossissement objectif x grossissement oculaire  5.1. Microscope optique La lumière est concentrée par un condenseur, elle est reprise par l’objectif puis aggrandie par l’oculaire  5.1. Microscope optique - Microscope optique simple (à champ clair) - Microscope optique à contraste de phase - Microscope optique de contraste d'interférence  5.2. Microscope à fluorescence - Microscope équipé par des filtres qui permettent de visualiser les signaux fluorescents  5.2. Microscope à fluorescence - Détection de la présence d’un antigène par l’insertion d’un anticorps couplé à un fluorochrome - Molécules fluorescentes (Fluo-4; fluoroscéine, Alexa, etc). - Les fluorescents absorbent la lumière à une longueur d’onde et l’émettent à une autre qui est plus grande. - Les molécules fluorescentes apparaissent en couleurs vives sur un fond sombre. 5.2. Microscope à fluorescence  5.2. Microscope à fluorescence Marquage immunofluorescent de la 8- Marquage immunofluorescent de la 8- OHDG sur du tissu rénal normal OHDG sur du tissu rénal ayant subi un stress oxydatif  5.2. Microscope à fluorescence - Imagerie calcique: les mouvements de calcium à travers la membrane plasmique via les canaux ioniques Liu et al., 2017 5.2. Microscope à fluorescence Imagerie calcique  5.3. Microscope confocal - Microscope optique à fluorescence - Source d’excitation: Laser - Intensité plus importante, et vitesse est plus grande o signal est plus fort et les images sont encore plus nettes Cardiomyocyte d’une souris Srinivasan, scientific protocols, 2015  5.3. Microscope confocal - Série de sections optiques à différentes profondeurs et permet de construire une image en trois dimensions de la cellule 5.3. Microscope confocal  5.4. Microscope électronique - Il utilise un faisceau d'électrons au lieu d'un faisceau de lumière et des bobines magnétiques pour focaliser le faisceau au lieu de lentilles en verre - Source d’excitation: électrons - Meilleur pouvoir de résolution (longueurs d’ondes plus courtes que les photons) ¾ Le microscope à transmission ¾ Le microscope à balayage  5.4. Microscope électronique Le microscope électronique à transmission - Faisceau d’électrons traversant l’échantillon - Etudier la structure interne des cellules - Grossissement très important jusqu'à un million de fois - Peut résoudre des détails (1 nm): organites 5.4. Microscope électronique Une cellule eucaryote  5.4. Microscope électronique Le microscope électronique à balayage - Utiliser le faisceau d’électrons - Etudier la surface de l’échantillon en 3 dimensions (3D)  5.4. Microscope électronique - L'échantillon est balayé par un faisceau d'électrons amené au foyer par des bobines magnétiques qui agissent comme des lentilles. - La quantité d'électrons diffusés ou émis est mesurée par le détecteur et sert à contrôler l'intensité de points successifs d'une image construite sur un écran vidéo. - Le microscope crée des images d'objets en 3D et peut résoudre les détails entre 3 et 20 nm. 5.4. Microscope électronique Globules rouges  5.5. Cytométrie de flux Les études fonctionnelles Étude des constitutions physico-chimiques des cellules La cytométrie de flux - Caractérisation quantitative et qualitative d’un grand nombre de cellules - Triage des cellules (séparation physique de cellules ou de particules d’intérêt) - Dénombrement des cellules par l’émission du signal fluorescent  5.5. Cytométrie de flux Le cytométre comprend : - Une source lumineuse laser qui constitue la source d’excitation - Une chambre d’analyse ou Flow cell, dans laquelle passe l’échantillon analysé et où les cellules sont illuminées par le faisceau laser - Des détecteurs de taille et de structure qui mesurent la lumière déviée ou diffusée émise par les cellules lors du passage dans le faisceau laser - Des détecteurs de fluorescence qui mesurent les fluorescences émises par les cellules lors du passage dans le faisceau laser 5.5. Cytométrie de flux  5.5. Cytométrie de flux Les cellules en suspension dans un flux liquidien passent une à une dans un faisceau laser Æ Détection de la diffusion de la lumière La diffusion physique de la lumière émise par la source lumineuse est dépendante de la taille et de la granularité cellulaire. Sous l’effet de l’excitation lumineuse du faisceau laser, la cellule diffuse une partie de la lumière reçue dans toutes les directions. Analyse de la lumière diffusée vers l’avant : (Forward Scatter : FS) La lumière diffractée vers l’avant, c’est à dire dans l’axe optique, est proportionnelle à la taille de la cellule. Il s’agit du signal FS. Ce signal est mesuré par un détecteur appelé photodiode qui convertit l’énergie lumineuse en énergie électrique. Analyse de la lumière diffusée à 90 degrés (Side Scatter: SS) Il s’agit de la lumière du laser qui pénètre à l’intérieur de la cellule et qui est réfractée dans un milieu transparent comme le cytoplasme. Ce phénomène de réfraction ou réflexion dépend des propriétés intrinsèques de la cellule comme le cytoplasme, la présence de granulations plus ou moins abondantes et du rapport nucléocytoplasmique.  5.5. Cytométrie de flux Æ Détection du signal fluorescent Analyse de la fluorescence La lumière du laser va également exciter des fluorochromes préalablement couplés à des anticorps monoclonaux capables de reconnaître et fixer certaines protéines. Les cellules marquées par un fluorochrome absorbe l’énergie lumineuse fournie par le laser et réémettent la lumière à différentes longueurs d’onde. Les signaux de fluorescence sont mesurés par des détecteurs spéciaux: les photomultiplicateurs En multiple marquage, il est nécessaire de séparer les signaux entre eux pour les mesurer individuellement. Pour cela, il existe des filtres spécifiques à chaque longueur d’onde qui laissent passer par transmission chaque longueur d’onde vers son détecteur respectif.  5.5. Cytométrie de flux Représentation graphique des résultats obtenus en cryométrie de flux Quantification des différents types de cellules présentes dans un échantillon sanguin L’histogramme taille/structure permet d’isoler les lymphocytes des monocytes et des neutrophiles. Sur les lymphocytes ainsi sélectionnés, grâce à des anticorps anti-CD3 et anti-CD4, il est ensuite possible d’identifier les lymphocytes CD4+ (qui doivent être positifs à la fois pour le CD3 et le CD4 – quadrant en haut à droite). Par défaut d’expression du CD4, les cellules CD3+ sont alors identifiées comme les lymphocytes CD8+ (quadrant en haut à gauche). Par défaut d’expression du CD4 et du CD3, sont alors identifiés les lymphocytes B et NK (quadrant en bas à gauche) qui n’expriment aucun de ces marqueurs  5.5. Cytométrie de flux La cytométrie de flux présente plusieurs avantages : Détection et quantification de nombreuses sous populations cellulaires simultanément Comptage des centaines de fois plus vite que pour les techniques manuelles d'immunofluorescence Reproductibilité des résultats et bonne sensibilité Quantification précise de l'intensité du signal permettant le Tri cellulaire Cette CMF présente, cependant, des limites Coût élevé Exigence de formation suffisante des utilisateurs Possibilité de production de résultats non désirés si l'opérateur récolte un signal de fluorescence d'une population non concernée  5.6. Culture cellulaire Technique qui consiste à prélever des cellules pour les faire croître en dehors de leur organisme ou de leur milieu d'origine (ex vivo ou bien in vitro) dans un but expérimental ou de fécondation in vitro Cultures de bactéries et de levures Prolifération rapide (1 division toute les 30 min pour la bactérie E coli) Milieu de culture: Glucose pour la fourniture d’énergie NH4Cl pour la synthèse d’acides aminés eau et sels minéraux Ils sont cultivées dans une boite de Pétri, sur un support d’agar (gelée extraite d’algues) à température corporelle dans une étuve  5.6. Culture cellulaire Cultures de cellules animales ƒ Les cultures cellulaires animales sont plus exigentes ƒ Le milieu de culture: Acides aminés essentiels Sels minéraux Oligo-éléments Vitamines Substances tampons pour maintenir un pH voisin à 7.4 Glutamine ou glucose pour fournir de l’énegie 5 a 20% de sérum d’origine animale (sérum du foetus de bovin) qui contient des facteurs de croissance (insulin, EGF, FGF) ƒ Incubateur: Température de 37°C en présence de CO2 qui favorise la stabilité du pH  5.7. Fractionnement cellulaire Principe: Broyage puis centrifugation pour isoler les différents organites cellulaires ce qui permet leur étude biochimique et fonctionnelle 1. La rupture de la membrane plasmique Tout en respectant les autres organites (noyau, lysosomes, peroxysomes, mitochondrie,…) Les Ultrasons (sons de haute fréquence) auxquels on soumet les cellules Le Broyage mécanique manuel L’Homogénéiseur à grande vitesse (ou mixeur)  5.7. Fractionnement cellulaire 2. Fractionnement cellulaire Fractionnement du lysat via une série de centrifugations consécutives à des vitesses de rotation croissantes et élevées (jusqu’a 100 000 tours par minutes) Pendant ces opérations c’est la gravité qui entraine les constituants cellulaires vers le fond du tube à centrifuger pour former une masse de sédiments appelée culot  5.7. Fractionnement cellulaire Les organites sédimentent d’autant plus vite que leur taille ou leur masse (ou les deux) sont importantes.