Ciclo di Krebs PDF

Ciclo di Krebs Reazioni e regolazione Reazioni anaplerotiche La trasformazione del glucosio in piruvato attraverso la glicolisi fornisce solo una parte dell’ATP generato dal catabolismo del glucosio stesso La maggior parte dell’ATP si genera durante la completa ossidazione dei derivato del glucos...

Ciclo di Krebs Reazioni e regolazione Reazioni anaplerotiche La trasformazione del glucosio in piruvato attraverso la glicolisi fornisce solo una parte dell’ATP generato dal catabolismo del glucosio stesso La maggior parte dell’ATP si genera durante la completa ossidazione dei derivato del glucosio a biossido di carbonio mediante il ciclo di Krebs Il catabolsimo di proteine, grassi e carboidrati avviene nelle tre fasi della respirazione cellulare  Schema generale del metabolismo ossidativo dei carburanti metabolici Il ciclo dell’acido citrico o ciclo di Krebs o ciclo degli acidi tricarbossilici costituisce la via finale di ossidazione delle molecole organiche presenti nelle sostanze nutrienti (acidi grassi, carboidrati e amminoacidi), la maggior parte delle quali entrano nel ciclo sotto forma di acetil CoA Il ciclo dell’acido citrico occupa una posizione centrale nel metabolismo cellulare in quanto costituisce la porta di ingresso al metabolismo aerobico di ogni molecola che può essere trasformata in acetil CoA o in un altro intermedio della via Negli eucarioti, le reazioni del ciclo dell’acido citrico avvengono all’interno della matrice mitocondriale La funzione del ciclo dell’acido citrico è quella di raccogliere gli elettroni ad alta energia dall’ossidazione dei combustibili carboniosi che saranno poi utilizzati per la sintesi di ATP. Il ciclo ossida due unità bicarboniose producendo due molecole di CO2, una di GTP ed elettroni ad alta energia sotto forma di NADH e FADH2 Un composto a 4 atomi di carbonio condensa con una unità bicarboniosa dando un composto a 6 atomi di C (acido tricarbossilico) Vengono poi rilasciate due molecole di CO2 mediante decarbossilazione ossidativa liberando elettroni ad alta energia Il composto a 4 atomi di carbonio vien poi metabolizzato rigenerando ossalacetato Il ciclo dell’acido citrico è la prima fase della respirazione cellulare. Gli elettroni ad alto potenziale di trasferimento rimossi dalle molecole organiche carboniose sotto forma di NADH e FADH2 riducono poi l’O2 e generano il gradiente protonico che viene usato per la sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa) La decarbossilazione ossidativa del piruvato per formare acetil CoA, che avviene nei mitocondri delle cellule eucariotiche, è il legame tra la glicolisi e il ciclo dell’acido citrico Tale reazione è irreversibile ed è catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi Tale complesso produce CO2 e cattura elettroni sotto forma di NADH Le reazioni dell’acido citrico L’atomo di carbonio metilico del gruppo acetilico si lega al gruppo carbonilico (C2) dell’ossalacetato La reazione catalizzata dalla citrato sintasi è una condensazione aldolica seguita da un’idrolisi Il citril CoA è una molecola ad alto contenuto energetico poiché contiene un legame tioestere originariamente dell’acetil CoA L’idrolisi del citril CoA fa procedere la reazione verso la sintesi del citrato La citrato sintasi deve impedire l’idrolisi di acetil CoA, reazione che avverrebbe con spreco di energia  Il legame all’ossalacetato, che avviene per primo, induce un importante strutturale dell’enzima (adattamento indotto) in forma aperta determinando la creazione di un sito di legame per l’acetil CoA La citrato sintasi catalizza la reazione di condensazione portando i substrati molto vicini, orientandoli e polarizzando specifici legami Il residuo di His 274 dona un protone all’ossigeno carbonilico dell’acetil CoA per promuovere la rimozione del protone metilico da parte dell’Asp 375 e formare un intermedio enolico Il citril CoA induce altre modificazioni strutturali dell’enzima. Il sito attivo viene chiuso completamente e l’His 274 dona ancora un protone per idrolizzare il legame tioestere producendo citrato e CoA Quando il CoA abbandona l’enzima seguito dal citrato, l’enzima torna nella conformazione aperta. L’enzima è in grado di idrolizzare il citril CoA ma non l’acetil CoA in quanto: - L’acetil CoA non si lega all’enzima finché l’ossalacetato non è legato e pronto alla condensazione; - I residui catalitici cruciali per l’idrolisi del tioestere non sono posizionati in modo appropriato finché non si forma il citril CoA Il gruppo ossidrlico del citrato non è localizzato in modo appropriato per le reazioni ossidative successive per cui viene isomerizzato a isocitrato da un’aconitasi L’isomerizzazione avviene attraverso una reazione di deidratazione seguita da una di idratazione L’aconitasi è una proteina ferro-zolfo. Il centro Fe-S è importante sia nel legame col substrato sia nel processo catalitico. Uno degli atomi di ferro del centro si lega ai gruppi carbossilico e ossidrilico del citrato Questa è la prima reazione di ossido-riduzione del ciclo. L’isocitrato viene ossidato e decarbossilato a opera della isocitrato deidrogenasi Durante questa reazione si forma l’intermedio ossalosuccinato, un b- chetoacido instabile che perde CO2 mentre è ancora legato all’enzima formando a-chetoglutarato e il primo trasportatore di elettroni ad alto potenziale di trasferimento, il NADH Questa è la seconda decarbossilazione ossidativa. L’energia dell’ossidazione dell’a-chetoglutarato viene conservata mediante la formazione del legame tioestere del succinil-CoA Questa reazione è praticamente identica alla reazione della piruvato deidrogenasi; il complesso dell’a-chetoglutarato deidrogenasi è molto simile al complesso della piruvato deidrogenasi sia come struttura (3 enzimi e 5 coenzimi) sia come funzione (decarbossilazione di un a-chetoacido e successiva formazione del legame tioestere) La scissione del legame tioestere del succinil CoA è accoppiata alla fosforilazione di un nucleoside difosfato purinico costituendo la sola tappa del ciclo nella quale si produce un composto a elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico Nei mammiferi esiste un’isoforma specifica per l’ADP (muscolo scheletrico e cardiaco) e una per il GDP (fegato). Il gruppo fosforico in g può comunque essere trasferito dal GTP all’ADP a opera dell’enzima nucleoside difosfato chinasi La succinil CoA sintetasi interconverte due tipi di energia biochimica passando attraverso la formazione di un intermedio fosforilato - L’ortofosfato sostituisce il CoA formando il succinil fosfato ad alta energia - Un residuo di His riceve il gruppo fosforico liberando il succinato - La fosfoistidina si sposta verso l’ADP (o il GDP) - Il gruppo fosforico viene trasferito all’ADP (o al GDP) formando ATP o GTP  La sequenza amminoacidica della succinil CoA sintetasi nei batteri e nei mammiferi è simile e presumibilmente è molto simile anche la struttura tridimensionale Il residuo di His che partecipa al meccanismo catalitico è localizzato tra il CoA e l’ADP Esso cattura il gruppo fosforico che si trova vicino al CoA e, ruotando, lo trasferisce al nucleotide legato al sito di legame dell’ATP Il FAD è l’accettore di atomi di idrogeno in questa reazione in quanto la variazione di energia libera è troppo piccola per ridurre il NAD+. Il FAD è strettamente legato alla succinato deidrogenasi La succinato deidrogenasi è il solo enzima del ciclo dell’acido citrico a essere legato alla membrana. Gli elettroni estratti ossidando il succinato passano attraverso il FAD ed entrano nella catena di trasporto degli elettroni della membrana mitocondriale interna Il FAD è quasi sempre l’accettore di elettroni nelle reazioni di ossidazione in cui vengono rimossi due atomi di H dal substrato formando un doppio legame Il nucleo isoallossazinico del FAD è covalentemente legato a una catena laterale di His dell’enzima (E-FAD). La succinato deidrogenasi è una proteina ferro-zolfo Il malonato è un inibitore competitivo della succinato deidrogenasi in quanto è simile al succinato poiché presenta due gruppi carbossilici. In tal caso l’enzima non è capace di rimuovere gli atomi di idrogeno. Il grado di inibizione può essere diminuito aumentando la concentrazione di succinato La fumarasi catalizza un’addizione trans specifica di un atomo di idrogeno e di un gruppo ossidrilico. Poiché il gruppo ossidrilico si addiziona solo a un lato del doppio legame si forma solo l’isomero L-malato Il malato viene ossidato a formare ossalacetato a opera della malato deidrogenasi. In tale reazione il NAD+ è di nuovo l’accettore di elettroni. L’ossidazione del malato è favorita dall’utilizzazione dei prodotti: l’ossalacetato da parte della citrato sintasi e il NADH dalla catena di trasporto degli elettroni  La reazione complessiva del ciclo dell’acido citrico è: - 2 atomi di C entrano nel ciclo come Acetil Coa e 2 atomi di C abbandonano il ciclo come CO2 - 4 coppie di atomi di H abbandonano il ciclo in 4 reazioni di ossidazione che portano alla riduzione di 3 NAD+ e un FAD - la scissione del legame tioestere del succinil CoA genera un GTP (o ATP) - vengono consumate due molecole di H2O Studi con traccianti radioattivi hanno rivelato che i due atomi di carbonio che entrano nel ciclo non sono gli stessi che lo abbandonano. I due atomi di carbonio che entrano nel ciclo come acetil CoA verranno rilasciati come CO2 nel ciclo successivo Una unità di acetile genera approssimativamente 10 molecole di ATP in netto contrasto con la glicolisi anaerobica che genera solo 2 molecole di ATP per molecola di glucosio (oltre a due molecole di lattato). Il ciclo di Krebs è un processo strettamente aerobico in quanto il NAD+ e il FAD possono essere rigenerati nel mitocondrio solo a opera dell’ossigeno molecolare Il glucosio si può formare dal piruvato ma la formazione dell’acetil CoA dal piruvato è una reazione irreversibile negli animali, i quali non possono riconvertire l’acetil CoA in glucosio La decarbossilazione ossidativa del piruvato in acetil CoA indirizza gli atomi di C verso l’ossidaizone a CO2 attraverso il ciclo di Krebs oppure verso l’incorporazione nei lipidi L’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è strettamente regolata Il complesso della piruvato deidrogenasi è regolato mediante diversi meccanismi. E’ inibito dai suoi prodotti immediati, il NADH (inibisce E3) e l’acetil CoA (inibisce E2). Alte concentrazioni di NADH e acetil CoA «informano» l’enzima che il fabbisogno energetico della cellula è stato soddisfatto o che è attiva la degradazione degli acidi grassi che producono acetil CoA e NADH Il componente piruvato deidrogenasi è regolato allostericamente anche dalla modificazione covalente per fosforilazione reversibile. Una chinasi specifica fosforila e inattiva la piruvato deidrogenasi (E1) e una fosfatasi attiva la deidrogenasi rimuovendo il gruppo fosforico L’attività della piruvato deidrogenasi è regolata anche dalla carica energetica. L’aumento del rapporto NADH/NAD+, acetil CoA o ATP/ADP promuove la fosforilazione e quindi l’inattivazione del complesso. La piruvato deidrogenasi è inattiva quando la carica energetica è elevata e gli intermedi biosintetici sono abbondanti Il complesso è attivato dal piruvato e dall’ADP che inibiscono la chinasi che fosforila la piruvato deidrogenasi La velocità del ciclo dell’acido citrico è regolata con precisione in modo da soddisfare il fabbisogno di ATP di una cellula animale. Il ciclo dell’acido citrico è regolato in più punti: I punti di regolazione primari sono gli enzimi allosterici isocitrato deidrogenasi e a-chetoglutarato deidrogenasi L’isocitrato deidrogenasi è stimolata allostericamente dall’ADP ed è inibito da ATP e NADH La regolazione dell’a-chetoglutarato deidrogenasi è simile a quella della piruvato deidrogenasi con cui ha omologia strutturale. L’enzima è inibito dai prodotti della reazione catalizzata (i.e. succinil CoA e NADH) e dall’ATP I componenti del ciclo dell’acido citrico sono importanti intermedi biosintetici Gli intermedi del ciclo di Krebs prelevati per le biosintesi devono essere rimpiazzati. Le reazioni anaplerotiche riforniscono il ciclo dell’acido citrico di intermedi Un esempio di reazione anaplerotica è la formazione di ossalacetato per carbossilazione del piruvato mediante una reazione catalizzata dall’enzima biotina dipendente piruvato carbossilasi L’ossalacetato viene prodotto a partire dal piruvato: L’enzima è attivo solo in presenza di acetil CoA, un segnale di fabbisogno energetico Se la carica energetica è bassa, l’ossalacetato entra nel ciclo dell’acido citrico. Se la carica energetica è 1 Glicolisi 2 Ciclo dell’acido citrico elevata, l’ossalacetato viene convertito in 3 Fosforilazione ossidativa glucosio 4 Ossidazione degli acidi grassi Il ciclo dell’acido citrico, come tutte le altre vie metaboliche, è il prodotto dell’evoluzione, la maggior parte della quale è avvenuta prima della comparsa della comparsa degli organismi aerobici Molto probabilmente i primi organismi anaerobici usavano alcune delle reazioni del ciclo dell’acido citrico in processi biosintetici lineari Esistono moderni organismi anaerobici che mancano dell’a-chetoglutarato deidrogenasi e pertanto non sono in grado di compiere un giro completo del ciclo dell’acido citrico L’a-chetoglutarato e il succinil-CoA sono tuttavia precursori importanti di una varietà di vie biosintetiche