Chapitre 4. Méthodes de Concentration des Micro-organismes (PDF)

Chapitre 4. Techniques de concentration / de détection des micoorganismes 4.1. Définition La concentration c’est la séparation des bactéries de leur milieu initiale et leur rassemblement dans un petit volume. Elle est effectuée sur les produits alimentaires à grand volume comme exemple: l’eau, boiss...

Chapitre 4. Techniques de concentration / de détection des micoorganismes 4.1. Définition La concentration c’est la séparation des bactéries de leur milieu initiale et leur rassemblement dans un petit volume. Elle est effectuée sur les produits alimentaires à grand volume comme exemple: l’eau, boissons, etc. 4.2. Méthodes de concentration 5.2.1. Concentration par enrichissement C’est l’augmentation du nombre de cellules bactérienne par culture sur des bouillons. Ce sont des milieux complétés par un réactif qui permet la croissance d'une espèce particulière. 4.2.2. Concentration par séparation physique ou physico-chimique - Filtration Un grand volume est filtré à travers des membranes en nitrate de cellulose stérile de porosité 0,22 - 0,45 µm de Ø, puis la membrane, ayant retenu les germes, est retirée puis déposer sur un milieu solide. -Centrifugation Les microorganismes en suspension dans un produit liquide peuvent être séparés par accélération on utilisant une centrifugeuse. La vitesse et le temps dépends de la masse des cellules. -Décantation Les microorganismes ont un caractère floculant ou agglutinant ce qui favorise leur précipitation, cette dernière peut être favorisée par des électrolytes (agents chimiques) , comme : l’hydroxyde ou le sulfate d’aluminium, oxyde de fer, polyélectrolytes et colloïdes, etc. 4.2.3. Concentration par interactions -Intéraction immunologique La concentration peut être réalisée par utilisation d’anticorps spécifiques (Immuno-affinité), qui se fixent aux antigènes de la cellules bactérienne cibles; les cellules s’agglutinent en formant un réseau qu’on peut séparer par une méthode physique ou chimique (filtration , centrifugation ou décantation). -Intéraction non-immunologique Les lectines sont des protéines ou glycoprotéines, on les retrouve chez les végétaux, animaux et même microorganismes. Se sont des molécules non immunologiques mais capables de réagir spécifiquement avec un sucre. Cette propriété est utilisée pour concentrer les bactéries pathogènes. -Intéraction avec un support magnétique Les supports magnétiques sont sous forme de billes en polystyrène sur lesquelles sont adsorbés les anticorps ou les lectines spécifiques d’une bactérie. Ces supports sont commercialisés à différents diamètres (de 1 à 40 µm). Les anticorps ou lectines se lie spécifiquement aux bactéries, ces dernières serrant par la suite élués dans un volume plus réduit. -Utilisation de sondes nucléiques Les sondes sont des fragments d'ADN ou d'ARN simple brin, d'origine microbienne, dont on connaît au moins une partie de la séquence, et qui sont capables de s'hybrider avec des fragments complémentaires d’une manière spécifique pour former des duplex stables. Une sonde peut donc s’hybridée avec l'acide nucléique cible du germe recherché, puis on détecte l'hybride nucléique. -Utilisation de l'amplification génétique (Polymerase Chain Reaction (PCR) La PCR consiste à amplifier spécifiquement une séquence d'ADN double brin. L'initiation de la synthèse d'ADN est réalisée par une enzyme au niveau de courtes séquences oligonucléotidiques (amorces), ajoutées au milieu réactionnel, spécifiques de la séquence d'ADN que l'on souhaite amplifier. La PCR consiste ensuite en l'enchaînement cyclique de trois processus : - la dénaturation de l'ADN - l'hybridation des amorces -l'extension des amorces par une ADN polymérase thermostable, -L'ensemble des opérations est réalisé dans un appareil automatique : le thermocycleur. La PCR, Polymerase Chain Reaction, est utilisée pour reconnaître spécifiquement l’ADN des germes.