Capítulo 6: Enzimas PDF

Capítulo 6: Enzimas Principles of Biochemistry Lehninger David L. Nelson Michael M. Cox - Considere la siguiente reacción: C12H22O11 + 12O2 → 12CO2 + 11H2O ΔG = -2,840 KJ/mol - Reacción exergónica - ¿Por...

Capítulo 6: Enzimas Principles of Biochemistry Lehninger David L. Nelson Michael M. Cox - Considere la siguiente reacción: C12H22O11 + 12O2 → 12CO2 + 11H2O ΔG = -2,840 KJ/mol - Reacción exergónica - ¿Por qué razon el azúcar no se hace agua y CO2 en la alacena?  Enzimas ✓ Catalizadores biológicos específicos que aumentan la rapideces de las reacciones bioquímicas. ✓ Casi todas las enzimas son proteínas, excepto las ribozimas (moléculas de rRNA. Catalizan el procesamiento de RNA y la formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos). ✓ Los diversos mecanismos usados por las enzimas dependen del arreglo de los grupos funcionales en una región llamada sitio activo, donde ocurre la catálisis de la reacción. ✓ Sustrato es el ligando que se enlaza al sitio activo de la enzima. -Las enzimas contienen bolsas o hendiduras (sitio activo), el cual contiene cadenas de aminoácidos que participan en la unión del sustrato y la catálisis. La unión E y S causa un cambio en conformación. E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P  Diferencias entre Catálisis Enzimática y Catálisis Química La catálisis enzimática exhibe las siguientes diferencias: 1. Rapidez de Reacción Mayor – la catálisis enzimática usualmente es de 106 a 1012 veces mayor que la reacción no-catalizada, y como dos órdenes de magnitud (102 veces) mayor que la reacción químicamente catalizada.  Diferencias entre Catálisis Enzimática y Catálisis Química 2. Condiciones de Reacción no tan Extremas – tales como temperaturas menores que 100ºC, presión cercanas a la atmosférica, y pH cercano al neutral.  Diferencias entre Catálisis Enzimática y Catálisis Química 2. Condiciones de Reacción no tan Extremas – tales como temperaturas menores que 100ºC, presión cercanas a la atmosférica, y pH cercano al neutral.  Diferencias entre Catálisis Enzimática y Catálisis Química 3. Especificidad Mayor – las enzimas reconocen sus sustratos con mucha especificidad. 4. Capacidad para Regulación – las actividades catalíticas de muchas enzimas varían en respuesta de las concentraciones de sustancias que no son los sustratos.  Enzimas La catálisis enzimática usualmente es de 106 a 1012 veces mayor que la reacción no-catalizada. Anhidrasa carbónica es una enzima presente en los eritrocitos: CO2 + H2O ⇌ H+ + HCO3ˉ  Algunas Enzimas Requieren Cofactores Grupos funcionales de enzimas pueden participar de reacciones ácido-base, formar enlaces covalentes transientes, y participar de interacciones electrostáticas, pero no pueden catalizar reacciones redox o de transferencia de grupos. apoenzima (inactiva) + cofactor ⇌ holoenzima (activa) Molécula orgánica Cu2+, Fe2+,3+, Zn2+ NAD+, NADP+ Grupo Hemo transientemente permanentemente Las enzimas requieren Cofactores (ion de metal o molécula orgánica requerida para la actividad catalítica de una enzima) para realizar reacciones redox o de transferencia de grupos.  Ejemplo de Enzima con Cofactor NAD+ NAD+, cofactor de la enzima Alcohol deshidrogenasa (ADH), es el agente oxidante (oxida a otra molécula porque NAD+ se reduce) de la conversión de Etanol a Acetaldehido. O─H (Cadena lateral en sitio activo de la enzima) CH3CH─H Luego de la abstraccion de H+, se transfirió un hidruro (H:ˉ ) al NAD+ formando NADH. El Cofactor NADH debe ser regresado al estado original para completar el ciclo catalítico mediante una reacción mediada por otra enzima.  Fuerzas Envueltas en Especificidad Enzima–Sustrato 1. Interacciones hidrofóbicas “lock- “induced 2. Interacciones dipolo-dipolo, and-key” fit” model dispersión model 3. Puentes de Hidrógeno 4. Interacciones electrostáticas Moléculas con diferente forma o distribución de grupos Estas fuerzas producen: funcionales no se enlazan eficientemente a la Enzima. Complementaridad Geométrica: aquella mediada por la forma de las moléculas. Complementaridad Electrónica: aquella mediada por la distribución de los grupos funcionales.  Teoría del Estado de Transición Ayuda a explicar cómo las enzimas catalizan reacciones. Modelo que establece que la Energía de Activación (Ea) es necesaria para debilitar los enlaces en los Reactantes para que lleguen al Estado de Transición. Estado de Transición (o Complejo Activado) – es una especie química extremadamente inestable (de alta Energía Potencial) formada en un choque efectivo entre Reactantes, y que puede revertir a Reactantes o formar Productos. El Estado de Transición se representa como una especie química que contiene enlaces parcialmente formados y enlaces parcialmente rotos.  Energía de Activación Estado de Transición (Complejo Activado) DG < 0 Exergónico Espontáneo DG = Gprod − Greact A mayor Ea, menor Rapidez de Reacción  Efecto del Catalizador en el Diagrama del Estado de Transición Para una Reacción El catalizador El catalizador baja la NO puede energía de alterar la activación de termodinámica la reacción (el DG, DH) directa y de de la reacción. la inversa. Si DGrxn < 0, la reacción directa (hacia productos) es espontánea. Si DGrxn > 0, la reacción inversa (hacia reactivos) es espontánea.  + A+B AB+ C+D Reacción Exergónica Reacción Endergónica Las enzimas alteran las rapideces de reacción pero NO el equilibrio químico E + S ES EP E + P Reacción enzimática - Las enzimas incrementan la rapidez de la reacción. - No afectan el equilibrio químico. - Las enzimas cambian químicamente durante el proceso de catálisis y luego se regeneran. - La enzima es liberada al final de la reacción. - La enzima No se consume en el proceso.  Poder Catalítico y Especifidad de las enzimas La formación del complejo ES es promovido por puentes de hidrógeno, interacciones iónicas e interacciones hidrofóbicas. La formación de las interacciones débiles entre E y S, libera una pequeña cantidad de energía libre (Energía de unión, ΔGB), lo cual estabiliza la interacción. La energía de unión es la fuente principal de energía libre de las enzimas para disminuir la EA.  Nomenclatura de las Enzimas Para asignar el nombre común de una enzima, se le añade el sufijo ‘asa’ al nombre del sustrato de la enzima, o a la frase que describe la acción enzimática. Ejemplos: ureasa – cataliza la hidrólisis de urea alcohol deshidrogenasa – cataliza la oxidación de alcoholes primarios y secundarios, removiendo hidrógeno. El nombre sistemático establecido por IUBMB (“International Union of Biochemistry and Molecular Biology”) minimiza ambiguedades en la nomenclatura.  Para asignar el nombre sistemático (IUBMB), se nombra el sustrato seguido de una palabra que termina en ‘asa’ y un número de clasificación EC de cuatro dígitos. Ejemplo: Aconitasa o Aconitato hidratasa EC 4.2.1.3 EC 4.2.1.3 – “Enzyme Commission” clase, subclase, sub-subclase, número de serie (http://expasy.org/enzyme/)  Catalizan reacciones de oxido-reducción Hidruro Se necesita de coenzimas como NAD+, NADP+, FAD  Transferencia de grupos conteniendo C, N o P Participan en procesos de interconversión de aminoácidos, monosacáridos. THF= tetrahidrofolato  Escisión de enlaces mediante la adición de agua Convierten polímeros en monómeros  Rompimiento de enlaces C-C, C-S, C-N por vías distintas a hidrólisis u oxidación Catalizan reacciones donde eliminan CO2, H2O y NH3 Catalizan procesos de isomerización  Formación de enlaces C-C, C-S, C-O, C-N mediante reacciones de condensación acopladas al rompimiento del ATP  Mecanismos de Catálisis Enzimática Son similares a los mecanismos usados por catalizadores químicos. La diferencia en efectividad de las enzimas se debe a que éstas enlazan sus sustratos con especificidades alta, y que tienen los grupos catalíticos arreglados eficientemente alrededor del sustrato. Tipos de Mecanismos Catalíticos usados por las Enzimas: 1. Catálisis Ácido-Base 2. Catálisis Covalente 3. Catálisis Ion Metálico 4. Efecto de Proximidad y Orientación 5. Enlace Preferencial al Estado de Transición 1. Catálisis Ácido-Base envuelve Transferencia de Protón Proceso en donde un H+ es donado por un ácido o abstraído por una base, acelerando la reacción. Rxn catalizada por Ácido Protón donado acelera la reacción. Rxn catalizada por Base Protón abstraído acelera la reacción.  Actividad Enzimática Depende de pH La mayoría de las enzimas son activas en un intérvalo de pH 5-9. El pH afecta los siguientes factores: 1. Enlace del sustrato a la enzima. 2. Estados de ionización de los residuos de aminoácidos en el sitio activo. 3. Ionización del sustrato. Residuos de aminoácidos importantes en la catálisis ácido-base: Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys.  2. Catálisis Covalente La catálisis covalente acelera la reacción mediante la formación temporera de un enlace covalente entre catalizador y sustrato. Usualmente, el catalizador tiene grupo nucleofílico y el sustrato tiene grupo electrofílico. Residuos de aminoácidos importantes en la catálisis covalente: Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys, Ser.  3. Catálisis Ion Metálico Los iones metálicos pueden participar del proceso catalítico mediante tres formas principales: 1. Enlazan el 2. Cambian de sustrato para estado de orientarlo oxidación apropiadamente reversiblemente para la reacción. en reacciones Agua enlazada redox. al ion metálico se vuelve más ácida. 3. Estabilizan o apantallan cargas eléctricas negativas mediante interacciones electrostáticas. Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Mn2+, Co2+  4. Efecto de Proximidad y Orientación Envuelve el que los sustratos se encuentren próximos a los grupos catalíticos y con la relación espacial apropiada (orientación) para que ocurra la reacción.  Maneras en que las Enzimas Catalizan una Reacción al Enlazar sus Sustratos 1. Traen los sustratos en contacto con los grupos catalíticos. Este efecto de proximidad aumenta la rapidez de reacción por no más de un factor de ~5. 2. Enlazan los sustratos en la orientación apropiada para que ocurra la reacción. Este efecto de orientación puede aumentar la rapidez de reacción por hasta un factor de ~100. 3. Tienen una distribución de carga alrededor del sitio activo que ayuda a estabilizar el estado de transición (catálisis electrostática). 4. Reducen el movimiento translacional y rotacional de sus sustratos y grupos catalíticos. Esto es importante ya que en el estado de transición los grupos reactivos tienen poco movimiento. 5. Enlace Preferencial al Estado de Transición Mientras más fuertemente una enzima enlaza y estabiliza el estado de transición, mayor será la rapidez de la reacción. Un buen sustrato es aquel cuyo estado de transición se enlaza con alta afinidad a la enzima.  Catálisis Covalente, Ácido-Base y Enlace Preferencial al Estado de Transición PM= 25,191 Quimiotripsina (Phe, Trp, Tyr (C))  Catálisis Covalente, Ácido-Base y Enlace Preferencial al Estado de Transición Mecanismo de Quimiotripsina(Phe, Trp, Tyr) 1. Envuelve ataque nucleofílico de Ser al carbonilo susceptible Oxianión 2. Un intermediario tetraedral 3. Un intermediario acilo-enzima 4. Liberación del primer fragmento 5. Ataque del agua 6. Otro intermediario tetraedral 7. Liberación del otro fragmento 8. Regeneración de la enzima. Oxianión  Mecanismo de Quimotripsina: Catálisis Básica, Covalente, Electrostática Paso 1 La enzima estabiliza este intermediario en el hueco del oxianión. First Oxianión La His 57 abstrae un protón de la Ser 195 (catálisis básica), que ataca nucleofílicamente al carbonilo susceptible (catálisis covalente) para formar el primer intermediario tetraedral. El carboxilato del Asp 102 ejerce un efecto estabilizante (catálisis electrostática). Mecanismo de Quimotripsina: Enlace Preferencial al Estado de Transición Oxianión ES ES‡ menos estable más estable La distorsión conformacional que ocurre al formarse el intermediario tetraedral, hace que la especie aniónica se mueva más adentro del sitio activo, ocupando una posición (el hueco oxianión) que antes estaba desocupada (catálisis via enlace preferencial al estado de transición).  Paso 2 Mecanismo de Quimotripsina: Catálisis Ácida El intermediario tetraedral forma el intermediario Oxianión acilo-enzima, con la intervención de la His 57 que dona un protón al grupo amino del polipéptido (catálisis ácida). Mecanismo de Quimotripsina: Liberación del Primer Producto y Entrada de Agua Paso 3 El nuevo N-terminal del polipéptido hidrolizado es liberado de la enzima y una molécula de agua ocupa su posición.  Paso 4 Mecanismo de Quimotripsina: Ataque Nucleofílico del Agua La His57 cataliza el que agua ataque nucleofílicamente el carbonilo del intermediario acilo-enzima, formando el segundo intermediario tetraedral, que es estabilizado por la Quimotripsina. Second Oxianión Mecanismo de Quimotripsina: Liberación del Segundo Producto Paso 5 Second El segundo intermediario tetraedral forma el nuevo C-terminal del polipéptido hidrolizado, y Ser 195 abstrae un protón de la His 57, regenerando la enzima.  Fármacos: Penicilina y Derivados Interfiere en la síntesis de peptidoglicanos (componente de la pared celular bacteriana que la protege de la lisis osmótica). Peptidoglicanos consisten de secuencias alternantes de: N-acetil-glucosamina Acido N-acetilmurámico Los peptidoglicanos se generan por la Reacción de la Transpeptidasa. 1. Envuelve ataque nucleofílico de Ser al carbonilo susceptible (Catálisis covalente) 2. Se elimina un residuo D- aminoácido. 3. Ataque nucleofílico de un grupo amino de un segundo peptidoglicano al carbonilo susceptible. 4. Eliminación de la enzima transpeptidasa. Esta reacción es inhibida por penicilina y derivados  Estructura de Penicilina y Derivados La primera aislada pero se degrada por el ácido del estómago. Se administra por inyección. Serina ataca al carbonilo del anillo ß-lactámico (catálisis covalente), resultado un producto covalente “acil-enzima” La hidrólisis del producto es muy lenta y se considera que la reacción es irreversible, generando una transpeptidasa inactiva Bacterias resistentes expresan ß-lactamasas (promueven el rompimiento del anillo ß- lactámico), inactivando al antibiótico. “acil-enzima” Acido clavulánico actúa como un inhibidor suicida; creando una especie reactiva en el sitio activo. Esta especie reactiva es atacada por grupos en el sitio activo generando una acilación de la enzima ß-lactamasa de forma irreversible. Augmentin (Amoxicillin + clavulanic acid)  Cinética Química Cinética química es el estudio de la rapidez de reacción, los factores que afectan esa rapidez, y el mecanismo de la reacción. Cinética enzimática es una rama de la cinética química que estudia la rapidez de la reacción catalizada por enzimas. Rapidez de Reacción (r) es el cambio en concentración de reactantes (o productos) que ocurre en un intérvalo de tiempo. ± D[X] Dt En muchos casos, la data cinética, junto con la información sobre la estructura de la enzima y el mecanismo catalítico, provee información útil para descifrar la función de la enzima.  Cinética Química – Repaso Ley de Rapidez– expresión matemática entre la rapidez (r) y las concentraciones de los Reactantes. Tiene la forma general: r = k [A]m [B]n donde m y n son los órdenes de la reacción. Orden cero -------------- r = k [A]0 = k M.S-1 (unidades de k) Primer orden------------ r = k [A] S-1 (unidades de k) Segundo orden--------- r = k [A]2 M-1.S-1 (unidades de k) Mecanismo de Reacción – serie de pasos o reacciones elementales por los cuales los Reactantes forman los Productos, y que es consistente con la Ley de Rapidez determinada experimentalmente.  Cinética Química – Repaso Reacción elemental – reacción simple que describe un evento molecular; su Ley de Rapidez se deduce de los coeficientes estequiométricos del paso elemental. H2(g) + 2 ICl(g) → 2 HCl(g) + I2(g) 1) H2(g) + ICl(g) → HCl(g) + HI(g) Rate = k1[H2][ICl] 2) HI(g) + ICl(g) → HCl(g) + I2(g) Rate = k2[HI][ICl] Reacción 1 y 2 son pasos elementales (Silberberg, 8ta ed)  Cinética Química – Repaso Elementary Step Molecularity Rate Law k A product Unimolecular Rate = k [A] k Bimolecular 2A product Rate = k [A]2 k A+B product Bimolecular Rate = k [A][B] k 2A + B product Termolecular Rate = k [A]2[B] Molecularidad – el número de partículas reaccionantes en cada paso elemental. (Silberberg, 8ta ed)  Cinética Química – Repaso Paso Determinante de la Rapidez – paso elemental que es el más lento del mecanismo y que determina la Rapidez de la Reacción. La ecuación de Rapidez del paso lento será la ecuación de Rapidez para la reacción total. Intermediario de una Reacción – sustancia que se forma en un paso pero que reacciona en un paso subsiguiente; por tanto, no aparece en la reacción total.  Repaso Determine la Ley de Rapidez de la siguiente reacción: NO2(g) + CO(g) NO(g) + CO2(g) rate = k[NO2]m[CO]n Experiment Initial Rate (M/s) Initial [NO2] M Initial [CO] M 1 0.0050 0.10 0.10 2 0.080 0.40 0.10 3 0.0050 0.10 0.20 1. Determinar el orden de reacción con respecto a NO2: Escoger dos experimentos en el cual [CO] sea constante y la concentración de [NO2] varie. (Silberberg, 8ta ed) rate 2 0.080 M/s k (0.40)m (0.10) n Repaso rate 1 = 0.0050 M/s k (0.10) m (0.10) n 16 = 4 m La reacción es de segundo m = log 16/ log 4 orden para NO2. rate 3 0.0050 M/s k (0.10)m (0.20) n = rate 1 0.0050 M/s k (0.10) m (0.10) n La reacción es de 1 = 2n n=0 orden cero para CO. rate = k [NO2]2[CO]0 = k [NO2]2 Experiment Initial Rate(mol/L*s) Initial [NO2] (mol/L) Initial [CO] (mol/L) 1 0.0050 0.10 0.10 2 0.080 0.40 0.10 3 0.0050 0.10 0.20  Determine la Ley de Rapidez de la siguiente reacción: Repaso 4A (g) + 3B(g) 2C (g) Experiment Initial Rate (M/s) Initial [A] M Initial [B] M 1 5.00 0.100 0.100 2 45.0 0.300 0.100 3 10.0 0.100 0.200 4 90.0 0.300 0.200 Indicar el orden de reacción total y la k usando el Exp.1 (Silberberg, 8ta ed) rate 2 45.0 M/s k (0.300)m (0.100) n Repaso rate 1 = 5.00 M/s k (0.100) m (0.100) n 9 = 3m m=2 La reacción es de segundo orden para A. rate 3 10.0 M/s k (0.100)m (0.200) n = rate 1 5.00 M/s k (0.100) m (0.100) n 2 = 2n n=1 La reacción es de primer orden para B. rate = k [A]2[B]1 5.00 M/s = k (0.100 M) 2 (0.100 M) 1 k = 5000 M-2 S-1  La ley de Rapidez Integrada ✓ Permite determinar el tiempo necesario para llegar a una determinada concentración de reactante (determinar la concentración después de un tiempo determinado).  Repaso Ley de Rapidez Integrada – Reacción Elemental de Cero Orden [A]t = −kt + [A]0 [A]0 = Concentración inicial (a t = 0) [A]t = Concentración a tiempo t Tiempo de Media Vida (t½): Es el tiempo necesario para que la concentración de un Reactante llegue a la mitad de lo que era inicialmente. t½ = [A]0 / 2 k  Repaso Ley de Rapidez Integrada – Reacción Elemental de Primer Orden ln[A]t = −kt + ln[A]0 t½ = ln 2 / k  Repaso Ley de Rapidez Integrada – Reacción Elemental de Segundo Orden 1/[A]t = kt + 1/[A]0 t½ = 1 / k [A]0 Para la siguiente reacción de descomposición: AB (g) A (g) + B (g) ¿Cuánto tiempo tomará para que [AB] llegue a 1/3 de su concentración inicial?. K = 0.2 M-1S-1 [AB]0 = 1.5 M. Exprese su resultado con 1 c.s. 1/[A]t = kt + 1/[A]0 Solución: 1 1 = (0.2 M-1S-1 ) (t) + 0.5 M 1.5 M t = 6.666 s = 7 segundos La descomposición radioactiva es un proceso de primer orden. La concentración inicial del isótopo radioactivo 32P es de 10 mmol y tiene un t1/2 = 14 días. Determine la concentración de 32P a los 7 días (a) y 14 días (b). Exprese sus resultados con 1 c.s. t½ = ln 2 / k Ln[A]t = −kt + ln[A]0 Solución: k = ln 2 / 14 días = 0.049510513 días-1 Ln [A]t = (- 0.049510513 días-1 ) (7 días) + Ln [10 µmol) = 7 µmol Ln [A]t = (- 0.049510513 días-1 ) (14 días) + Ln [10 µmol) = 5 µmol La constante de rapidez para la desintegración del Tc-99 es 1.0 x 10-13/s. ¿Cuál es la vida media de este isótopo en años?. Exprese su resultado con 2 c.s. t½ = ln 2 / k Solución: t 1/2 = ln 2 / 1.0 x 10-13 s = 6.931471806 x 1012 s 6.931471806 x 1012 s 1 min 1 hora 1 día 1 años = 60 s 60 min 24 h 365 días t 1/2 = 2.2 x 105 años  La siguiente reacción tiene una k de 7.0 x 109 M-1 S-1 I (g) + I (g) I2 (g) a) Si la concentración inicial de I es 0.086M, calcule la concentración después de 2.0 min. b) Determine t1/2 cuando la concentración inicial de I es 0.60M. Solución: a) 1/[A]t = (7.0 x 109 M-1 S-1 ) (120 s) + 1/[0.086 M] [A]t = 1.2 x 10-12 M b) t 1/2 = 1/ [(7.0 x 109 M-1s-1) (0.60 M)] t 1/2 = 2.4 x 10-10 s  La descomposición térmica de la fosfina (PH3) es una reacción de primer orden. La t1/2 es 35.0 segundos. Calcule k y el tiempo necesario para que se descomponga el 95% de fosfina. Exprese sus resultados con 3 c.s. Solución: t½ = ln 2 / k ln[A]t = −kt + ln[A]0 a) k = ln 2 / t 1/2= 0.01980420516 s-1 = 0.0198 s-1 b) (ln[A]t - ln[A]0)/ (-k) = t (ln[0.05 A 0] - ln[A 0])/ (-k) = t (ln0.05 + ln A 0 – ln A 0)/ (- 0.01980420516 s-1 ) = 151 s  Cinética Michaelis-Menten Para el siguiente proceso enzimático: k1 k2 E + S ⇌ ES → P + E k-1 Vmax [S] n0 = KM + [S] Para poder usarla se considera lo siguiente: ✓ [E] es constante y [S] >>>> [E] ✓ La reacción en reversa es descartable ✓ [ES] se mantiene constante durante toda la reaccion (Teoría del estado estacionario) ✓ En el análisis de reacciones enzimáticas se usan las rapideces iniciales de reacción (Vo). La Vo se mide en cuanto se mezcla la enzima y el sustrato. ✓ Modelo útil para enzimas no alostéricas  Las medidas de actividad enzimática se hacen siempre en condiciones óptimas de pH y temperatura y en presencia de los cofactores necesarios. No es necesario purificar la enzima Se mide siempre la velocidad inicial (v0) de la reacción (se consume