Einführung in die Genetik und Humangenetik Teil 2 PDF

Einführung in die Genetik und Humangenetik Teil 2 BUF.01611UB Christoph Ruckenstuhl - IMB  DNA als Erbmaterial Nachdem die DNA als Träger der Erbinformation identifiziert war, mußte der Mechanismus der Informationsspeicherung, der Vermehrung und der U...

Einführung in die Genetik und Humangenetik Teil 2 BUF.01611UB Christoph Ruckenstuhl - IMB  DNA als Erbmaterial Nachdem die DNA als Träger der Erbinformation identifiziert war, mußte der Mechanismus der Informationsspeicherung, der Vermehrung und der Umsetzung in Proteine aufgeklärt werden. Chemische Analysen ergaben, daß immer gleichviel der Basen Adenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin in der DNA vorhanden waren (Chargaff 1950). Rückblickend ein starker Hinweis auf die Paarung der Basen - aber die Forscher experimentierten lange mit Modellen wie einem Dreifachstrang. 2  Die DNA-Doppelhelix 1953 entwickelten James Watson und Francis Crick, basierend auf Strukturuntersuchungen (Röntgenbeugungs- daten) von Rosalind Franklin, ein Strukturmodell der DNA: ein rechtsgewundener Doppelstrang, bei dem die beiden Einzelstränge gegenläufig sind (antiparallel) und in dem jeweils Guanin (G) mit Cytosin (C) und Adenin (A) mit Thymin (T) paart („Watson-Crick-Paarung“). Die Basenpaarung erfolgt über Wasserstoffbrücken, G und C ist ein komplementäres Paar, ebenso A und T. Eine Umdrehung der Doppelhelix enthält etwa 10 Basenpaare. Diese Form der DNA heißt auch „B-Form“. 3  Zur Erinnerung: die Bausteine der DNA Purinbasen Adenin und Guanin Pyrimidinbasen Cytosin und Thymin* * In der RNA: Uracil 4  Zur Erinnerung: die Bausteine der DNA Nucleosid (Base + deoxy Ribose) Adenosin, Guanosin§ Cytidin, Thymidin* 5 1 4 *In der RNA: Uridin 2 3 Hier fehlt der Sauerstoff -> deswegen de-oxy Ribose Nukleotid (inkl. (in DNA) PO4-Gruppe) §Achtung, Guanidin ist etwas ganz anderes (sehr basisches kleines Molekül, Teil der AS Arginin) 5 Zur Erinnerung: die Bausteine der DNA 6  Die DNA-Doppelhelix  Adenin und Thymin über zwei (Bindung ist somit weniger fest)  Guanin und Cytosin sind über drei Wasserstoff- brücken verknüpft 7 Die DNA-Doppelhelix 8  Die DNA-Doppelhelix Außen liegt das „Zucker- Phosphat- Rückgrat“ (Backbone). Innen die gepaarten Nukleotidbasen 9  Struktur der DNA-Doppelhelix Die Basen liegen im Inneren der „Wendeltreppe“ wie flache Stufen, die übereinander liegenden Basen sind durch elektronische Wechselwirkungen aneinander gebunden und stabilisieren so die Struktur („stacking Kräfte“). Zwischen den Strängen verlaufen zwei Furchen, die kleine (minor groove) und die große (major groove) entlang der Doppelhelix. In diese Furchen binden Proteine, z.B. zur Genanschaltung oder zum Verpacken der DNA. 10 Die DNA-Doppelhelix Die gleiche Struktur in untersch. Darstellung:  links im Drahtmodell wird die Lage der flachen Basen gut sichtbar  rechts im Kalottenmodell die Raumausfüllung Die „normale“ Form wird auch B-Form genannt 11  Die DNA-Doppelhelix: Länge und Verpackung Die Länge der DNA einer menschlichen Zelle als ausgestreckte Doppelhelix betrüge fast 2 Meter! Damit dieser Faden in die Zelle paßt, muss er sehr kompakt gefaltet sein. Andererseits muss sichergestellt sein, daß die genetischen Informationen auch zum Ablesen erreichbar sind! 12  Die DNA-Doppelhelix: Nukleosomen Die DNA ist bei Eukaryonten um einen „Core“, Kern basischer Proteine gewickelt, den Histonen. Die dadurch gebildeten Nukleosomen sehen im elektronenmikro-skopischen Bild wie Perlen an einer Kette aus. Die histonfreien DNA-Stücken zwischen den Perlen heißen „Linker“, Verbindungsstücke. 13  Die DNA-Doppelhelix: Nukleosomen Nukleosomen und „Linker“ ergeben die „Perlenkette“ 14  Die DNA-Doppelhelix: Nukleosomen Durch die zweifache Umwicklung des Nukleosomenkerns (aus je 2x Histon H2A, H2B, H3, H4) ist die DNA gegenüber der gestreckten Form etwa 7fach verkürzt. Die argininreichen Histone H3 und H4 sind evolutionär hochkonserviert, die lysinreichen Histone H2A und H2B sind variabler. 15  Die DNA-Doppelhelix: Nukleosomen Das extrem lysinreiche Histon H1 (das evolutionär sehr variabel ist) „versiegelt“ das Nukleosom von außen. Bei hoher Transkriptionsaktivität (Ablesen der DNA) löst es sich ab, und das Nukleosom faltet sich etwas auf. 16  Die DNA-Doppelhelix: Solenoide Zur weiteren Verkürzung der DNA (um das 5fache) ist die 10 nm dicke Nukleosomenkette helixartig zu einer 25-30 nm dicken Fibrille aufgewickelt, dem Solenoid. Histon H1 stabilisiert diese Struktur. Zur Erinnerung 1 Å (Ångström) = 0,1 nm 17 Die DNA-Doppelhelix: Chromosomen Weitere Kompaktierung ist notwendig, um auf Chromo- somengröße zu kommen (z.B. von 5 cm DNA-Helix auf 5 µm: 10.000fach). Dabei werden offenbar ähnlich zusammen- gesetzte DNA-Bereiche (viel A+T) zusammengepackt. Wie das geschieht, ist ungeklärt. 18 Die DNA-Doppelhelix: Chromosomen Das Chromonema stellt dann diese höchste Kompaktierung (während der Mitose/Meiose) dar. Kubalová et al., 2023, Nucleic Acids Research, Helical coiling of metaphase chromatids. https://doi.org/10.1093/nar/gkad028 Weiterführende Literatur: C.Y. Zhou and R. Heald, 2020, Current Opinion in Cell Biology, Emergent properties of mitotic chromosomes. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2020.02.003 19  Die DNA-Doppelhelix und Chromosomen Wie kompakt DNA gefaltet ist, wird aus einem Rechen- beispiel klar: Das Genom aller Menschen zusammen (also von einem Zellkern pro Person) würde in zwei Stecknadelköpfen Platz finden. Aufgefaltet würden die aneinandergelegten Doppelhelices 62x von der Erde zum Mond reichen. 20  Chromosomen Durch diese Zusammenlagerung zeigen die Endprodukte der DNA-Faltung, die Chromosomen, ein immer gleiches Bandenmuster nach Anfärbung (mit G Giemsa, Q Quinacrin AT-reiche Bereiche, mit Acridinorange GC-reiche Bereiche: „reversed bands“ R), an denen sie eindeutig zu identifizieren sind (hier: die Chromosomen des Menschen). 21 Chromosomensatz des Menschen Autosomen Autosomen Gonosomen 22  Geschlechtschromosomen des Menschen Neben den 44 Autosomen (im diploiden Chromosomensatz!) gibt es noch die 2 Gonosomen (Gechlechtschromosomen) X und Y. Je nach Geschlecht tragen Körperzellen zwei X (weiblich) Chromosomen oder ein X und ein Y (männlich) Chromsom. 23  Chromosomen Die beiden Chromatiden eines Chromosoms sind am Centromer verbunden. Die Lage des Centromers ist ebenfalls charakteristisch. Die (linearen!) Enden der Chromsomen werden Telomere genannt. http://www.chemgapedia.de/ Zur Erinnerung in Bakterien liegt eine ringförmig geschlossenes Bakterien- chromosom vor -> keine Enden! 24  Centromere Position: Liegt das Centromer in der Mitte des Chromosoms, spricht man von einem metazentrischen Centromer, liegt es nahe der Mitte, submetazentrisch, liegt es nahe einem Ende, heißt es akrozentrisch, liegt es (scheinbar) am Ende, telozentrisch (tatsächlich sitzt es nie ganz am Ende). 25  Centromere Das Centromer hat bei der Chromosomenverteilung bei Mitose und Meiose eine wichtige Rolle: dort binden die Spindelfasern ans Chromosom, genauer gesagt am Kinetochor (seitlich aufgelagerte Struktur), die die beiden Chromatiden auseinanderziehen. Fehler bei diesem Prozess führen zu einer ungleichen Chromosomenverteilung, der Aneuploidie. Durch Auszählen der Chromosomen einer Zelle lassen sich die Ergebnisse solcher Fehlverteilungen feststellen. Bekannteste Ausprägung ist das Down-Sydrom: hier liegt Trisomie 21 (Chromosom 21 ist dreifach vorhanden) vor. 26  Trisomie 21 Zum Verständnis: hier wird ein nicht-replizierter diploider Chromosomensatz gezeigt in dem die homologen Chromosomenpaare (von Vater und Mutter )nebeneinander gezeigt werden 27 Chromosomenpaar vs. repliziertes Chromosom https://www.youtube.com/watch?v=WG5IuP8T8lM 28 Epigenetik – Histon- und DNA-Modifikationen Die basischen Histone ziehen die negativen Ladungen der DNA an. Der dichte Komplex erschwert das Abschreiben („Silencing“). Durch Acetylierung (Essigsäurereste an die basischen Aminosäuren) wird die Bindung schwächer, die DNA lockerer und besser abschreibbar. Methylierung der Histone verhindert die Acetylierung und fixiert so das Silencing. Methylierung der Base Cytidin (in „CG-Paaren“ bzw. „CpG- Islands“ der DNA) bewirkt ebenfalls Silencing. Bei der Replikation (DNA-Verdopplung) werden auch diese Acetylierungs- und Methylierungszustände weitergegeben, sind also quasi erblich (epigenetische Fixierung). 29 Epigenetik – Histon- und DNA-Modifikationen Euchromatin Heterochromatin 30  Epigenetik – Regulationsbeispiele Bei der Zelldifferenzierung im Embryo, wenn aus der Eizelle die Stammzellen für Organe werden, kommt es zum Silencing, um nichtbenötigte Gene auszuschalten (wozu braucht z.B. eine Nervenzelle Gallensäuren). Um aus Körperzellen (differenzierte Zellen) wieder Keimzellen zu machen), müssen die epigenetischen Veränderungen gelöscht werden (z.b. bei Klonschaf Dolly). Ob bzw. welche epigenetischen Veränderungen auch von Eltern zu Kind oder gar Enkel vererbt wird, ist umstritten. 31 Exkurs: Chromosomen identifizieren mit FISH Durch Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH) kann man Chromosomen und Chromosomenbruchstücke leicht und eindeutig erkennen. Tauchen Stücke eines Chromosoms auf einem anderen auf, weist das auf schwere Erbkrankheiten hin. Die Zellen hier sind HeLa-Zellen: menschliche Krebs-Zellen, die seit Jahrzehnten im Labor weitergezüchtet wurden, und dadurch voller Abnormitäten sind. 32  Bakterielle DNA In Bakterien kommen keine Histone und Nukleosomen vor, auch ist keine Chromosomen- struktur zu erkennen. Aber auch dort ist die DNA mit basischen Proteinen komplexiert und kompaktiert (auflösbar durch Proteasen-verdau). Eine zentrale Struktur aus RNA organisiert die DNA von E. coli in etwa 50 Schleifen, die sich nach RNAse-Verdau zu einer großen Schleife öffnen. 33  Denaturierung der DNA-Helix Durch Erwärmen kann man die DNA „aufschmelzen“ (reversibel denaturieren), wobei sich die Wasserstoff- brücken lösen und die beiden Stränge trennen. Dabei steigt die UV- Absorption (Messmöglichkeit da die Basen UV-Licht absorbieren). GC-reiche DNA hat einen höheren Schmelzpunkt als AT-reiche. 34  Renaturierung der DNA-Helix Beim Abkühlen „finden“ sich die passenden Strangpaare allmählich wieder und bilden Doppelstränge aus. Dabei finden sich nicht immer perfekt passende Paarungen. Es kann auch eine Heteroduplex entstehen, die Fehlpaarungen enthält. Ihr Schmelzpunkt (bei dem 50% der DNA denaturiert ist) liegt tiefer als bei perfekt passenden Strängen. Im Genom gibt es große Bereiche aus hochrepetitiver DNA, bei der immer dieselbe (kurze: 5 - einige hundert Bp) Sequenz wiederholt ist, oft viele tausend Mal. Solche Bereiche renaturieren viel schneller als nur einmal vorkommende Sequenzen (unique sequences), weil sie viel leichter passende Partner-stränge finden. Aus der Geschwindigkeit der Renaturierung lässt sich also ablesen, ob eine DNA viele Wiederholungen (und damit wenig Information) enthält, oder nicht. 35  Exkurs: DNA-Hybridisierungs-Methoden Die Fähigkeit der DNA, nach Hitzedenaturierung wieder zum Doppelstrang zusammenzufinden, wird zum Identifizieren von DNA im „Southern-Blot“ (oder auch beim FISH) benutzt. Dabei findet eine markierte (z.B. radioaktiv od. Fluoreszenz) DNA- Sonde (mit bestimmter bekannter Sequenz) aus einer DNA- Mischung den passenden Partner. Auch die Ähnlichkeit verschiedener Gene (oder des gleichen Gens aus verschiedenen Organismen) lässt sich durch Hybridisierung ermitteln. Eine Doppelstrangbildung schon bei hoher Temperatur weist auf große Sequenzähnlichkeit hin (Heteroduplex mit wenig Fehlpaarungen), bilden sich erst bei niedriger Temperatur gemischte Doppelstränge, sind die Sequenzen nicht sehr ähnlich. 36 DNA-Replikation 37  Replikation der DNA-Doppelhelix Aus der Struktur der DNA als Doppelhelix mit festgelegten Basenpaarungen ergab sich logisch die Art der Informationsspeicherung und ihre Vermehrung (Replikation). Die Basen sind die Informationseinheiten, die Verdopplung erfolgt semikonservativ (halbbewahrend): Die Elternstränge trennen sich, jeder der beiden kann als Matrize (engl.: template) für einen neuen Tochterstrang dienen. Danach müsste die neuentstandene DNA je einen alten und einen neuen Strang enthalten. 38  Replikation der DNA-Doppelhelix Theoretisch wäre neben der semikonservativen Replikation auch eine konservative denkbar, bei der ein nagelneuer Doppelstrang als Kopie des alten Originals entspricht (Computerdaten werden konservativ vermehrt, auch ein Photokopierer arbeitet konservativ), oder eine disperse mit Zufallsmischung alter und neuer Sequenzen. 39  Replikation der DNA-Doppelhelix Die semikonservative Vermehrung wurde von Meselson und Stahl 1958 experimentell nachgewiesen. Sie vermehrten E. coli in Nährmedium mit schwerem Stickstoffisotop (15N statt normalem 14N), dadurch entsteht DNA mit hoher Schwebedichte (sinkt in der CsCl- Dichtegradientenzentrifugation weiter nach unten). Züchtet man dann E. coli auf normalem Medium weiter, verschwindet die sehr schwere DNA, es entsteht mittelschwere DNA. Nach weiteren Generationen wird der Anteil mittelschwerer DNA immer weniger auf Kosten leichter DNA. Offenbar wurde ein leichter Strang an einen schweren neusynthetisiert, sodass die mittelschwere Form entstand. 40 Experimente zur Replikation Aus „schwerer“ DNA wird „mittelschwere“ DNA, die aus einem schweren und einem neugebildeten leichten Strang besteht. 41  Experimente zur Replikation II Taylor wies die semikonservative Replikation 1957 durch ein radioaktives Isotop nach. Er züchtete Hyazinthenzellen in 3H-Thymidin (3H superschwerer Wasserstoff = Tritium, schwerer Wasserstoff 2H = Deuterium ist nicht radioaktiv, ebenso wie normaler 1H Wasserstoff), das nur in DNA eingebaut wird. Die radioaktiven Chromosomen schwärzen fotografischen Film (Autoradiographie). Nach zwei Zellverdopplungen war meist nur ein Chromatid eines Chromosomenpaares radioaktiv markiert. Es hatte einen Strang der ursprünglichen DNA erhalten, das andere Chromatid den in der ersten Verdopplung neugebildeten, unmarkierten Strang. 42  Experimente zur Replikation II Manche Chromatide waren nur stückweise radioaktiv markiert. In diesen Fällen waren am anderen Chromatid gerade die entsprechenden Bereiche unmarkiert, der Rest markiert. Offenbar hatte sich der Ursprungsstrang auf die beiden neuen Stränge verteilt. Dies war zugleich ein Nachweis der Rekombination (Neukombination von Erbgut) durch „crossing over“! 43  Experimente zur Replikation II Durch „crossing over“ tauchen Fragmente des Ausgangsstranges auf beiden Strängen der neuen DNA auf. 44  Semikonservative Replikation der DNA Die DNA-Replikation ist ein komplexer Prozess, bei dem die 2 alten DNA- Stränge als Matrize für die Synthese der neuen Stränge dient. Der Prozess lässt sich in verschiedene Abschnitte einteilen, an denen viele Faktoren mitwirken. Am besten untersucht ist die Replikation bei E. coli. 45 DNA Replikation bei E. coli 46  Initiation der Replikation Damit ein neuer Strang in Paarung mit einem alten gebildet werden kann, muss als erstes die vorhandene Doppelhelix an einer Stelle geöffnet werden. Dieser Ort des Replikationsstarts heißt Replikationsursprung oder Origin. Auf dem Genom von E. coli befindet sich nur ein Origin (oriC). Das Enzym Helikase (DnaB) trennt die Stränge und verbraucht dabei pro Basenpaar zwei ATP, die zu AMP abgebaut werden, also 4 Energie-Einheiten! Die gebildeten Einzelstränge werden durch „Single-strand binding proteins“, Einzelstrang-bindende Proteine, geschützt und stabilisiert, damit sie nicht gleich wieder paaren. Sie sind die Matritzenstränge für die folgende Replikation. 47  Replikation DNA-Polymerasen können nur vorhandene Stränge verlängern, keine neuen starten: sie brauchen einen Primer. RNA-Polymerasen können einen neuen Strang beginnen, daher wird zunächst von einer speziellen RNA-Polymerase, der Primase, ein kurzes RNA-Stück (4- 13 Nukleotide) gebildet, das dann von der DNA- Polymerase III verlängert wird. Der Gesamtkomplex, der den Primer synthetisiert, das Primosom, enthält neben der Primase auch Helikase DnaB. 48  Replikation Wichtig: Alle matrixabhängigen DNA- und RNA- Polymerasen arbeiten in 5‘-3‘ Richtung, d.h., sie hängen das neue Nukleotid (Phosphat-Rest) an das 3‘-OH des letzten Zuckers der Kette an! 49 Replikation in 5‘-3‘ Richtung Das passende Nukleosid-Trip- hosphat (NTP) wird eingepaßt, dabei wird Pyrophosphat abgespalten und das Nukleosidmono- phosphat (= Nucleotid) eingebaut. * *T nur bei synthe- tischen DNA-Primer, U bei RNA Primer! 50  Replikation – Leading strand Ausgehend von Origin, kann einer der Stränge daher kontinuierlich neu-synthetisiert werden, er wird Leitstrang (leading strand) genannt. 51  Replikation – Lagging strand Der andere Strang müsste eigentlich „verkehrt herum“ gebildet werden. Der Ausweg: Es werden kurze Stücke in der richtigen Richtung gebildet, die bei E. coli etwa 1000 Nucleotide lang sind und nach ihrem Entdecker Okazaki-Fragmente heißen. (Exkurs: bei Eukaryonten sind sie nur 100-200 Nukleotide lang. Jeder dieser kurzen Stränge braucht einen eigenen RNA-Primer.) Läuft die DNA-Polymerase III auf das nächste Strangfragment auf (RNA-Primer des vorherigen Fragmentes), löst sie sich ab. 52  Replikation – Lagging strand Die DNA-Polymerase I setzt hier an und baut zunächst das dortige RNA-Ende mit Hilfe ihrer 5‘-3‘ Exonukleaseaktivität ab und schließt dann die entstandene Lücke*. Schließlich verknüpft eine DNA-Ligase die Fragmente zu einem Strang, dem „zurückbleibenden“ Strang, Folgestrang (lagging strand)*. Die Ligase benötigt Energie: Sie spaltet bei der Verknüpfung ATP (beim Phagen T4) zu AMP und PP (Pyrophosphat) oder (bei E. coli) NAD+ in NMN+ (Nicotinamid-Mononucleotid) und AMP. *Auch beim leading strand sind am Schluss Pol I und Ligase notwendig- Wieso? 53 Replikation – Überblick 54  Replikation: Prozessivität Während DNA-Polymerase I nach wenigen Syntheserunden von der DNA abfällt (was auch ihre Fehlerrate erhöht), kann DNA-Pol III viele tausend Nukleotide nacheinander anbauen (hohe Prozessivität). Das wird durch eine molekulare Klammer (clamp) um die DNA erreicht, an die die Pol III fest bindet. Die Pol III kann so 500-1000 Nukleotide pro Sekunde an den wachsenden DNA-Strang anfügen, Pol I nur 10/s. 55 Replikation: Prozessivität Die molekulare Klammer umschließt den DNA-Strang. Sie besteht aus 2 gleichen Untereinheit und bildet als funktionale Klammer ein Homo-Dimer aus. Es ist Teil des Holoenzym- Komplexes der Polymerase III. 56  Replikationsgabel Die Struktur mit „leading“ und „lagging strand“, ausgehend vom Origin, wird Replikationsgabel genannt. Da die Replikation am leading strand sehr viel schneller vonstatten geht und das zwangsläufig zu Problemen mit der langsameren Replikation des lagging strad führen würde benötigt dieser Prozess eine Koordination! 57 Koordination von leading und lagging strand Die Synthese der beiden Stränge läuft dabei nicht unabhängig voneinander. An der Helikase DnaB in der Gabelung der DNA hängen die Pol IIIs für leading und lagging strand. Während die „leading“ Polymerase der voranschreitenden Gabel folgt, fädelt die „lagging“ Polymerase die replizierte DNA als Schleife an sich vorbei. Trifft sie auf einen Strangbruch (den nächsten Primer), fällt ihre Klammer ab und verlässt den Strang. Nahe am Gabelursprung bildet sich erneut eine Klammer und fängt die Pol III wieder ein, für das nächste Okazaki-Fragment. 58 Replikation: Start eines Okazaki-Fragments 59 Replikations-Koordination / Okazaki-Fragment Replikations-Koordination: Die beiden Pol III-Unter-einheiten sind fest verbunden (über ein Dimer der Untereinheit t). Die „lagging“-Pol III bleibt so an der Gabel und kann sofort an die neue Klammer binden um am Primer für das nächste Fragment die Synthese zu starten. Start eines Okazaki-Fragmentes: Der „Klammerlader“ (Clamp Loader, DnaG) hat eine neue Klammer vorbereitet. Wenn die „lagging“-Polymerase das vorige Okazaki- Fragment erreicht, wird die neue Klammer auf die DNA geladen und die Polymerase von der alten Klammer ab- und auf die neue Klammer aufgeladen. 60  Replikationsgabel Wie oben bereits erwähnt nennt man die Struktur die bei der Replikation ausgehend vom Origin gebildet wird die Replikationsgabel. Von einem Origin kann eine Gabel starten, oder je eine in beide Richtungen (bidirektionelle Replikation). Selbst bei bidirektioneller Replikation dauert eine volle Replikationsrunde bei E. coli mindestens 40 Minuten. Um eine Generationszeit von nur 20 Minuten zu ermöglichen, startet bei guten Wachstumsbedingungen ein weiterer Replikations-Zyklus, während der erste noch läuft. Man nennt das dichotome Replikation. 61 Dichotome Replikation 62  Replikation bei Eukaryonten Eukaryonten besitzen zahlreiche Origins im Genom (das Bild zeigt die neugebildete, radioaktive DNA in mehreren „Replikons“, Replikatonseinheiten um je ein Origin). 63  Replikation bei Eukaryonten Die Origins werden nicht auf einmal aktiv. Früh wird das „Euchromatin“ repliziert, spät das repetitive und besonders dicht gepackte „Heterochromatin“. Welche Bereiche zuerst verdoppelt werden, hängt auch vom Zelltyp ab. Euchromatin stellt den weniger dicht gepackten, reich an Genen und Genaktivitäten, Teil der DNA dar. Es befindet sicher eher im inneren des Karyoplasmas während sich Heterochromatin eher im Randbereich befindet (dies ist aber Zelltypabhängig!) 64  Replikation bei Eukaryonten Das haploide menschliche Genom enthält etwa 20.000 - 100.000 Origins (also eventuell mehr als es Gene enthält - davon haben wir nur gut 20.000-25.000). Ihr durchschnittlicher Abstand liegt bei 15 - 30 µm, entsprechend 45.000 - 90.000 Nukleotiden (45 – 90kBp) Die Replikationsgeschwindigkeit ist langsamer als bei Bakterien (E. coli 50.000 Bp/min, Hefe 3.600), durch die hohe Zahl der Origins (Hefe ca. 500) kann die Replikation aber kürzer brauchen. 65  Replikation bei Eukaryonten Die auseinanderlaufenden Replikationsgabeln bilden Replikationsblasen (bubbles). 66  Replikation bei Eukaryonten (zur Übersicht) Komponenten des eukaryontischen Replikationsapparates (u.a.): DNA-Polymerase α/Primase-Komplex (Primersynthese: erst 6-10 RNA-Nucleotide, dann 20 DNA-Nucleotide) DNA-Polymerase δ (am lagging-strand, bindet PCNA) und DNA-Polymerase ε (am leading strand, mit/ohne Klammerbindung) PCNA (Klammerstruktur, erhöht Prozessivität) Topoisomerasen I und II (entknoten die Elternstränge nach der Replikation) FEN1 (MF1) (Flap-Endonuclease 1) (entfernt RNA-Primer) DNA-Ligase I (schließt DNA-Brüche) Anders als bei E. coli schließt die DNA-Polymerase δ auch die Lücken der entfernten Primer. 67 Replikation bei Eukaryonten 68  Replikation bei Eukaryonten Anders als bei Bakterien, enthalten die eukaryontischen Chromosomen lineare DNA-Stränge. Dadurch ergibt sich das Problem, wie die Enden repliziert werden. Der „leading strand“ kann die Mutter-DNA bis zum letzten Nucleotid lesen und verdoppeln („run off“, replizieren bis zum Runterfallen). Der „äußerste“ RNA-Primer des „lagging strand“ kann aber nicht von „noch weiter außen“ durch DNA ersetzt werden. 69  Replikation bei Eukaryonten – Telomere Eukaryonten schützen ihre Chromosomenenden mit einer speziellen Struktur, den Telomeren Bestehen aus Proteinen und spezifischen DNA- Sequenzen: kurze, vielfach wiederholte Motive, z.B. CCCTAA beim Menschen und CCACACA bei Hefe. Zum einen verhindern Telomere den Abbau der DNA von den Enden her (durch Exonukleasen). Freie DNA-Enden (entstehen z.B. beim Zerbrechen von Chromosomen) sind außerdem „klebrig“ und hängen das DNA-Fragment an andere Chromosomen an, Telomer-Enden sind nicht „klebrig“. 70 Replikation der Telomere Zum anderen können die DNA-Enden der Telomerregion von einem Enzym „Telomerase“ wieder verlängert werden, dürfen also bei der Replikation ohne Schaden verkürzt werden. Das Enzym enthält eine RNA mit einem Duplikat des Sequenzmotivs, mit der als Matrix verlängert sie das Chromosomenende. (Sie ist damit eine „Reverse Transkriptase“, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase). 71  Telomere – Altern und Krebs In somatischen Zellen des Menschen ist die Telomerase ausgeschaltet, bei jeder Zellverdopplung verkürzt sich daher die Telomerregion. Das begrenzt die Zahl der möglichen Teilungen und ist eine Art Zähler für das Alter der Zelle. -> Seneszente Zellen In vielen Krebszellen (die ja aus somatischen Zellen entstanden sind) ist die Telomerase wieder aktiv und macht die Zelle „unsterblich“. 72 Replikation linearer DNA (und RNA) bei Viren Das Problem stellt sich auch bei linearen Virengenomen, die unterschiedliche Lösungen dafür entwickelt haben. Bei den Phagen T4 und l (Lambda) verknüpfen sich die Einzelgenome zu Multimeren oder zu Ringen, die Produkt-DNA wird später in Monomere zerteilt. Adenovirus und Poliovirus (ein RNA-Virus) benutzen ein Protein als Primer, das an das 5‘-Ende des äußersten Nukleotids gehängt wird und an dem der neue Strang startet. 73 Replikationsfehler und ihre Korrektur 74  Replikationsfehler Bei der Replikation kann es auch zum Einbau falscher Nukleotide kommen. Das geschieht mit einer Wahrscheinlichkeit von 10-4, also eine von 10.000 Basen ist zunächst fehlerhaft. Die (bzw. „Eine“ bei Eukaryonten) DNA-Polymerase selbst erkennt 99% dieser Fehler und kann sie durch ihre 3‘-5‘ Exonukleaseaktivität ausschneiden und korrigieren (Korrekturlesereparatur – proof-reading). Die Restfehlerrate (10-6) wäre bei E. coli noch 8 Mutationen bei jeder Verdopplung, beim Menschen 5.500!! (Nach Lewin, Genes VI, sind die Raten 10-6 ohne und 10-9 mit Korrekturlesen für Pol III.) 75  Replikationsfehler Ein Reparatursystem erkennt und repariert aber weitere Fehler (= falsche Basenpaarungen - Mismatch repair). Dazu muss es alten und neuen DNA-Strang unterscheiden können. Bei Bakterien geschieht das über die Methylierung (-GATC-) der alten DNA, beim Menschen sind dafür wahrscheinlich die natürlich entstehenden 5´und 3´-Termini zuständig. Bei E. coli liegt die Mutationsrate nur bei 10-8 pro Gen, damit kommt es nur alle 33.000 Zellzyklen zu einer Mutation durch Replikationsfehler. Die verbleibende Fehlerrate liegt beim Menschen bei 10-5 bis 10-7 pro Teilung für jedes Gen (Hot-spots häufiger betroffen), also hat (bei 10-6) bei ca. 25.000 Genen im haploiden Genom jede 40ste Eizelle/ Spermatozoe eine Mutation, bzw. jede 20. diploide Körperzelle. 76  Unterschiedliche Reparatursysteme Neben der Replikation passieren „Fehler“ in der DNA (miss-match bzw. miss-pairing) auch bei Rekombinations- vorgängen (crossing-over) und durch Chemikalien und Strahlung (auch Strangbrüche). Reparatursysteme: Korrekturlesereparatur – Proof-reading (Post- und Co- Replikativ) siehe vorherige Folien Fotoreparatur Exzisionsreparatur (Basen- und Nucleotid-) Rekombinationsreparatur SOS-Reparatur 77  Fotoreparatur Ultraviolette Strahlung schädigt DNA, insbesondere durch Bildung von Thymindimeren (benachbarte Thyminreste binden kovalent aneinander). An solchen Stellen wird die Replikation weitgehend blockiert. Überraschenderweise fand man, dass das Überleben UV- bestrahlter Bakterien besser ist, wenn die Zellen nicht im Dunkeln weitergezüchtet werden, sondern unter sichtbarem Licht. Das Reparaturenzym bindet zwar schon im Dunkeln an das Dimer, wird aber erst nach Lichteinstrahlung aktiv (fotoreaktivierendes Enzym) und spaltet das Dimer wieder in die zwei Thyminreste. Dimerisierungsreaktionen durch UV geschieht bei allen Pyrimidinen (C-T, C-C), ist aber als T-T am häufigsten. 78 Thymin-Dimere und Fotoreparatur 79  Fotoreparatur Entdeckt wurde die Fotoreparatur von Aziz Sancar (Nobelpreis 2015) bei Bakterien. Unterdessen kennt man Photolyasen auch bei verschiedenen Tieren, bei Menschen nur die Sequenz- ähnlichen Cryptochrome… also nach dem Sonnenbrand besser im Schatten bleiben... 80  UV-Schäden Andere Schäden durch UV-Licht sind die Dimerisierung von Guaninresten zwischen den beiden Strängen (bei Sequenz- folgen GC und CG) sowie Einzel- und Doppelstrangbrüche der DNA. Thymindimer 81  Exzisionsreparatur UV-Schäden (incl. Thymin- dimere) können auch ohne Lichteinfluß repariert werden. Bei der „Excisionsreparatur“ wird der geschädigte DNA- Strang von Endonuclease II (bei E. coli: uvr A/uvr B/uvr C) aufgeschnitten und durch die 5‘- 3‘ Exonuclease-aktivität der DNA-Polymerase I über die geschädigte Stelle hinweg abgebaut. DNA-Polymerase I füllt dann die Lücke auf und DNA-Ligase schließt den Strangbruch. 82  Reparatur-Nobelpreis Der Nobelpreis für Chemie ging 2015 an drei Reparaturforscher, Aziz Sancar hat sowohl die Photoreparatur als auch die „Nucleotide Excision Repair“ aufgeklärt, Paul Modrich die „Mismatch Repair“ (siehe Replikationsfehlerkorrektur – proof-reading) und Tomas Lindahl die „Base Excision Repair“, bei der bei „gealterter“ DNA eine verlorengegangene Base ersetzt wird. 83  Rekombinationsreparatur Trifft die Pol III bei der Replikation auf ein nicht- getrenntes Thymin-Dimer, stoppt die Replikation für mehrere Sekunden. Dann setzt der Replikationsprozess weiter hinten auf dem Strang wieder ein, es bleibt eine Lücke von ca. 1000 Nucleotiden zurück. Diese wird durch Einbau der homologen (entsprechenden) Sequenz des ursprünglichen Gegenstranges geschlossen (Rekombinationsreparatur). 84  Rekombinationsreparatur Der Einbau der homologen Sequenz des ursprünglichen Gegenstranges erfolgt durch das Enzym RecA (in E. coli). Homologe dieses Proteins finden sich in allen Lebewesen (z.B. Rad51 beim Menschen und RadA bei Archaea). Die nun im Mutterstrang vorhandene Lücke wird durch Reparatursynthese vom neuen Gegenstrang durch DNA- Pol I und Ligase geschlossen. Das Thymindimer bleibt erhalten und muss später repariert werden. 85  Rekombinationsreparatur Funktionsweise von RecA RecA besitzt sowohl eine Bindestelle für Einzelstrang-DNA (single strand DNA) als auch Doppelstrang-DNA (dsDNA). Viele Exemplare des Proteins RecA binden den Einzelstrang (Nukleoproteinfilament) und durchsuchen die Umgebung nach einem passenden Doppelstrang, strecken ihn (conformational proofreading ), schmelzen ihn und hybridisieren „ihren“ Strang mit dem passenden Gegenstrang (Heteroduplex DNA durch branch migration). Der freigesetzte, ungeschädigte Einzelstrang kann dann wieder zum Doppelstrang ergänzt werden. → zentrale Rolle in allen Vorgängen die eine homologe Rekombination beinhalten! 86  SOS-Reparatur Versagen alle anderen Reparatursysteme, benutzt die Zelle das SOS-System. Dabei wird das Korrektur-Lesen der DNA-Polymerasen ausgeschaltet. So können Bereiche voller Dimere oder mit chemisch modifizierten Basen repliziert werden, es werden dabei aber Fehler in Kauf genommen. Dieses System wird daher auch als „error prone repair“ (zu Fehlern neigende Reparatur) genannt. Normalerweise ist dieses System (durch den Repressor LexA) reprimiert, erst bei starker UV-Schädigung (Notsituation) wird es ausgebildet. Auch hier spielt RecA eine entscheidende Rolle als Co- Protease der autokatalytischen Spaltung von LexA (sozusagen der Kontrolleur). 87 Replikation und Zellzyklus 88  Replikation und Zellzyklus Bei Pro- wie bei Eukaryonten ist die Verdopplung der DNA durch Replikation Teil des Prozesses, bei dem aus einer Zelle zwei werden, des Zellzyklus samt Zellteilung. Bei Prokaryonten können Replikation und Zellteilung unabhängig voneinander gestartet werden, das erlaubt der Zelle, kürzere Zellteilungszyklen zu durchlaufen, als die Replikation dauert (E. coli 20 min Zellzyklus, 40 min Replikation; -> dichotome Replikation). Bei Eukaryonten sind sie strikt gekoppelt. 89  Replikation und Zellzyklus - Prokaryonten Die Verteilung der DNA erfolgt bei Prokaryonten über eine Anheftung an die Zellmembran, durch das Längenwachstum werden die beiden DNA-Helices auseinandergezogen. Dabei liegt die Fehlerquote (Fehlverteilung, dass eine Zelle ohne Chromosom entsteht) unter 1:10.000. Mutanten im Verteilungsprozess verursachen viel häufiger eine Fehlverteilung -> so wurden auch die daran beteiligten Gene/Proteine identifiziert! 90  Bakterieller Zellzyklus Bei Bakterien werden die Verdopplung der DNA (Replikation) und die Teilung von DNA (Segregation) und Zelle unabhängig voneinander reguliert. Die Replikation wird vom Volumen der Zelle gesteuert, Segregation und Zellteilung von der Länge der Zelle. Schnell wachsende E. coli-Zellen sind dicker (-> mehr Volumen bei gleicher Länge) und enthalten dadurch mehrere Chromosomenkopien. Dadurch sind Bakterien auch in der Lage, die Zelle schneller zu verdoppeln, als eine Verdopplung ihres Chromosoms dauert (E. coli 20 min Generationszeit vs. 40 min Replikationsdauer). Dabei laufen mehrere Replikationszyklen simultan. 91 Verteilung der DNA bei Bakterien 92  Septenbildung bei der Zellteilung Die Zellteilung wird durch Anlagerung des kontraktilen FtsZ-Proteins (Homologes des eukaryontischen Tubulins) an der Septationsstelle zwischen den periseptalen Annuli eingeleitet. 93  Bakterieller Zellzyklus Diese Anlagerung (an die periseptalen Annuli – PSA) wird durch die Nähe des Nucleoids verhindert, geschieht also erst, wenn die DNA durch Längenwachstum der Zelle entfernt wurde. Ist das (in Mutanten) nicht möglich, werden die Septen an den falschen Annuli gebildet und schnüren Minizellen ohne DNA- Gehalt ab. 94  Eukaryontischer Zellzyklus: Mitose Der Prozess, durch den aus einer Zelle zwei Zellen werden - der Teilung des Erbmaterials mit anschließender Zellteilung - läßt sich in Eukaryonten in vier Abschnitten unterteilen: Mitose (so wird auch der gesamte Zellzyklus genannt), die Verdopplung der DNA (Replikation, S-Phase für Synthese-Phase) und die „Lücken“ (gaps: G-Phasen 1 u. 2) dazwischen, in denen nichts außer Größenwachstum zu sehen ist. Die 3 Phasen G1, S u. G2 werden auch als Interphase bezeichnet.* *„Interphasechromosomen“ 95  Eukaryontischer Zellzyklus und Ploidie Eukaryontische Zellen kommen mit einfachem (haploidem, „n“ Chromosomen) oder doppeltem (diploidem, „2n“ Chromosomen) Chromosomensatz vor. Die beiden Chromosomensätze bei Diploiden sind nicht identisch, einer stammt vom Vater, der andere von der Mutter. Zur Erinnerung: Haploide Zellen sind die Geschlechtszellen (Gameten) der Keimbahn. Aus ihnen entsteht bei der Befruchtung die diploide Zygote und in Folge die diploiden Körperzellen. 96  Eukaryontischer Zellzyklus und Ploidie In der Replikation werden die vorhandenen Chromosomen verdoppelt, d.h. die beiden jeweils entstehenden Chromatiden hängen bis zur Mitosephase zusammen. Dabei wird also nicht aus einer haploiden eine diploide Zelle! https://www.youtube.com/watch?v=WG5IuP8T8lM 97  Replikation und Zellzyklus Bei Eukaryonten ist die gleichmäßige Verteilung des Chromosomensatzes, die der Teilung der Zelle vorausgeht, ein komplizierter Prozess, die Mitose. Ein spezielles Organell, das Centrosom (Cm), dient der Ausbildung der Verteilungsmaschinerie. Es liegt außerhalb des Zellkerns (Zk), zu Beginn der Mitose (Prophase) werden aus einem Centrosomen-„Punkt“ zwei, die auseinanderwandern, verbunden durch Bündel aus Mikrotubuli. In dieser Phase kondensieren die Chromosomen*. *Prophase- bzw. Metaphase-Chromosomen 98  Phasen der Mitose Prophase Metaphase Anaphase Telophase 99  Phasen der Mitose In der Metaphase löst sich die Kernmembran auf, und die Chromosomen wandern in eine Ebene, die Metaphaseplatte. Die Centrosomen wandern an die entgegengesetzten Seiten der Zelle, so dass die sie verbindenden Mikrotubuli durch den Kernbereich verlaufen. Einige der Mikrotubulibündel heften sich an die Centromere an, die Bereiche der Chromosomen, an denen die Schwesterchromatiden verbunden sind. 100  Phasen der Mitose In der Anaphase ziehen die sich verkürzenden Mikrotubuli die Chromatiden auseinander, auf die Centrosomen zu. In der Telophase werden neue Kernhüllen ausgebildet (vom ER ausgehend). Anschließend dekondensieren die Chromosomen wieder (-> Interphasechromosomen entstehen). Es folgt die Teilung der Zelle. 101  Replikation und Zellzyklus bei Hefen Pilze (und damit Hefen) weisen einige Besonderheiten auf. Bei ihnen löst sich die Kernhülle in der Mitose nicht auf („geschlossene Mitose“, im Gegensatz zur oben beschriebenen „offenen“ Mitose). Die spindelorganisierenden Zentren, die hier Spindelpolkörper (spindle pole bodies, SPB) genannt werden, sind in die Kernhülle eingebaut, so daß ihre Mikrotubuli die Chromosomen trotz intakter Membran erreichen können. Nach der Chromosomentrennung schnürt sich der Kern durch (auf die Kernteilung folgt die Zellteilung). 102