Bloque 2 BAAC - Proteínas Plasmáticas - PDF

UB Ángela García Pelayo BLOQUE 2 TEMA 1. La sangre en los análisis clínicos. El laboratorio de hematología. La sangre es la muestra que más se utiliza en los aná...

UB Ángela García Pelayo BLOQUE 2 TEMA 1. La sangre en los análisis clínicos. El laboratorio de hematología. La sangre es la muestra que más se utiliza en los análisis clínicos. Sus funciones principales son: - Transporte de sustancias libres o ligadas a proteínas del plasma: nutrientes, agua, sales, metabolitos celulares, gases, moléculas reguladoras (hormonas), vitaminas, cofactores… - Mantenimiento de la temperatura (calor). - Defensa frente a patógenos: anticuerpos, sistema complemento, proteínas de fase aguda... - Coagulación (hemostasia): activa el fenómeno de coagulación cuando hay una hemorragia. - Mantenimiento del medio interno. La sangre constituye un 6-8% del peso del cuerpo: un hombre adulto tiene 5-6 litros de sangre; mientras que una mujer adulta tiene unos 4,5-5,5 litros de sangre. La sangre es un tejido conectivo formado por un 55% de plasma y un 45% de células: - 55% plasma: es la parte líquida de la sangre que obtenemos después de realizar una centrifugación. De este, el 93% es agua, el 6% son solutos orgánicos (proteínas, hormonas esteroideas, lípidos, glúcidos) y un 1% son solutos inorgánicos (sodio, potasio, bicarbonato, sales, gases)... - 45% células: eritrocitos, plaquetas, leucocitos… La muestra de sangre se recoge con anticoagulante (EDTA, citrato o heparina). Se puede centrifugar y se separa en: plasma (arriba), eritrocitos (abajo) y una interfase de leucocitos y plaquetas. El suero se obtiene después de centrifugar sangre que se ha dejado coagular 30 min a temperatura ambiente. Por tanto, el suero tiene menos proteínas que el plasma (le faltarán las proteínas de coagulación, sobre todo el fibrinógeno, que son unos 6-8g/L). 1. Proteínas plasmáticas - Residentes: ejercen su función en la sangre (plasma) y son las mayoritarias (aprox. 70%). Son de origen fundamentalmente hepático y linfocitario. Se encargan del transporte (albúmina), hemostasia, defensa (Ig), mantenimiento pH, mantenimiento del volumen intravascular… - Transitorias: circulan desde un tejido secretor a otro tanto (hormonas como la insulina, el glucagón…). - Ocasionales: son marcadores que indican “desgracia”, pues no deben estar en la sangre en condiciones normales. Así, nos informan sobre qué tejido puede estar dañado. Por ejemplo, las transaminasas en sangre son marcadoras de daño hepático. 1 UB Ángela García Pelayo La concentración de proteínas en plasma es de 57-80 g/L (muy elevada), las cuales se distribuyen en 20 proteínas diferentes (no son muy variadas), siendo la más abundante la albúmina (50%); seguida de la IgG (25%). Algunas funciones de las proteínas del plasma son: - Coagulación: fibrinógeno - Proteínas de fase aguda: su expresión aumenta en un estado inflamatorio. - Transporte por parte de la albúmina de calcio, medicamentos, drogas, bilirrubina... - Albúmina: además del transporte, se encarga del mantenimiento del pH y del volumen intravascular (evita que la sangre sala de los vasos). - Hemopexina (transporta hemo). - Transferrina (Fe+3), - Lipoproteínas (transportan lípidos) - Antiproteasas (inhiben proteasas) 1.1 Homeostasis proteinemia La concentración total de proteínas en plasma depende de la tasa de síntesis y degradación tisular de estas, así como de la pérdida de proteínas que podemos tener por el filtrado glomerular (las proteínas pequeñas, NO las grandes, pueden ser filtradas). Aun así, la concentración de proteínas en la orina es prácticamente nula, pues estas son endocitadas por las células epiteliales de las nefronas, usándolas como fuente de AA. En la orina de un individuo sano NO hay proteínas, sí hay es que sufre alguna alteración en la estructura del glomérulo, habiendo así un filtrado glomerular anormal (alteración renal). Mirar esquema, aunque no ha dicho casi nada. 2 UB Ángela García Pelayo Si hay cambios de los niveles de proteína en plasma y estas, por ejemplo, disminuyen, puede implicar que el individuo en cuestión sufre desnutrición (poca ingesta de proteínas), una alteración renal, una alteración hepática o algún problema linfocitario (disminuyen células linfoides y, por tanto, disminuyen Ig). Destacan las quemaduras, pues hacen que disminuyan mucho los niveles de proteínas, ya que se pierde mucho líquido intersticial y con ello, albúmina, que también está en este medio En cambio, si aumentan puede ser debido a un linfoma (Gammapatía monoclonal y policlonal), a una infección, a una inflamación o a una deshidratación (falta agua y aumenta la concentración de proteínas). *Gammapatía monoclonal: hiperproducción de un anticuerpo o cadenas de un anticuerpo por hiperproliferación de un clon de linfocitos B. *Gammapatía policlonal: aumento en proporciones variadas de las tres inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM. 1.2 Métodos para cuantificar los niveles totales de proteínas en plasma - Método Kjeldahl (valoración de N). - Absorbancia de luz UV (280 nm). - Método de Bradford (Coomassie Brillant Blue) - Método de Biuret (540 nm) i Método de Lowry (750 nm). Método de Biuret y método de Lowry. Son métodos de referencia. Ambos tienen un fundamento químico y miden la espectrofotometría de absorción. 1) Se basa en una primera reacción con el reactivo de Biuret, donde los iones de cobre reaccionan con los enlaces peptídicos, formando unos complejos de color púrpura. (Hasta aquí es el método Biuret). 2) Si se le añade un segundo reactivo, el Folin-Ciocalteu, pasamos al método de Lowry. Este reactivo tiene molibdeno y da lugar a una tinción azul. Método de Bradford. También se basa en la espectrofotometría de absorción. En este método se emplea el Azul de comassie, que es de color marrón pero cuando se une a una proteína, cambia a azul. Esto permite medir la absorbancia a 595nm. Valores de referencia: 57-80 g/l Todos estos métodos no son muy sensibles para detectar una enfermedad, pues debe de haber cambios muy severos en los niveles de proteínas para que puedan ser detectables. 3 UB Ángela García Pelayo Métodos para cuantificar albúmina en plasma o suero. Existen diferentes métodos: - A la albúmina le cuesta mucho precipitar, siempre es la última. Así, un método para medir la cantidad de albúmina es haciéndola precipitar en un medio salino y tomar el sobrenadante. - Mediante una electroforesis. - Mediante el uso de colorantes específicos que reaccionan específicamente con la albúmina a bajo pH (colorantes Verde o Púrpura de Bromcresol, los cuales desplazan el espectro de absorción cuando se unen a la albúmina, es decir, cambian la absorbancia). 1.3 Proteinograma del suero El proteinograma es un método semicuantitativo de análisis que, mediante una electroforesis, permite la separación de las proteínas en distintas bandas. Se basa en una electroforesis no desnaturalizante sobre un soporte sólido (acetato de celulosa, agarosa, electroforesis capilar...) a pH básico (8,6) y a baja fuerza iónica (pocas sales). A pH básico, las proteínas estarán cargadas negativamente (mucho -OH) y migrarán al polo positivo o ánodo (excepto las inmunoglobulinas, que son positivas y permanecerán quietas o irán hacia el cátodo). La proteína que llega más lejos es la albúmina, puesto que tiene un peso molecular de 60kDa y muchas cargas negativas (debido a su punto eléctrico (4,8) se encontrará muy cargada negativamente). Después de la electroforesis, se realiza una tinción inespecífica de las proteínas y se cuantifica por densitometría. Así, obtendremos diferentes picos: - Albúmina - Alfa1 globulinas - Alfa 2 globulinas - Beta globulinas (a veces lo separan en beta 1 y beta 2) - Gama globulinas Actualmente, en lugar de hacer la electroforesis en medios sólidos, en los laboratorios suelen hacer electroforesis capilar (en un medio líquido). El resto de la medición es igual. 4 UB Ángela García Pelayo Los picos son las sumas de cada una de las señales que han emitido las diferentes proteínas que forman parte del grupo en cuestión. Es decir, cada pico detectado procede de un grupo de proteínas concreto. Por ejemplo, en el pico de las alfa1, encontramos diferentes proteínas que forman parte de este grupo como la antitripsina, la HDL, la protrombina… Esto permite deducir algunas patologías. Por ejemplo, si queremos analizar las lipoproteínas, para verlas hay que teñir de forma diferente (usando el colorante de lípidos Negro de Sudan), el resto de la electroforesis es igual. - HDL (alfa lipoproteína) - VLDL y LDL (betas lipoproteínas) - QM (gamma proteínas) Alteraciones en el proteínograma permite diagnosticar diferentes patologías, especialmente permite detectar gammapatías. También permite detectar inflamación, infección, cirrosis, problemas nefróticos… Algunos ejemplos son: o El punteado indica nefrosis. En esta enfermedad la albumina baja y las alfa2 aumentan, pues en esta fase hay una proteína (“que es un elefante”) que es la alfa2-macroglobulina, la cual provoca un aumento de esta fracción. o Hipogammaglobulinemia: faltan las gammas, debido a que hay una alteración a nivel de los linfocitos. 5 UB Ángela García Pelayo o Cirrosis: disminuye albúmina (pues el hígado está alterado). Aumentan las betas y las gammas, y se ve lo que se conoce como el puente beta-gamma. Indica problema hepático, aunque también suele aparecer en enfermedades inflamatorias. o Gammapatía monoclonal, hay mucho de un determinado anticuerpo. La albúmina disminuye, pero con respecto al total. Si la gammapatía es policlonal, el pico es muy amplio, no estrecho.* o Si falta hierro (ferropenia), aumenta la transferrina (incremento banda beta). o En inflamación aguda la albúmina puede mantenerse normal o bajar y alfa1 y alfa2 suben. Si la inflamación es crónica, además de todo ello también aumentan las gamma globulinas. *Gammapatía monoclonal (o paraproteinemia) por mieloma (entre otras enfermedades). Aparición de una banda nítida e intensa en la región gamma o beta (más raramente alpha-2) debida a la sobreproducción de un solo tipo de anticuerpo (monoclonal) entero o a fracciones de los mismos (cadenas ligeras libres o más raramente pesadas). El anticuerpo (llamado proteína M) es habitualmente IgM, menos a menudo IgG o IgA. Las células anormales pueden producir Igs con secuencias modificadas y producir dos o más clases de cadena pesada; mientras que la cadena ligera sobreproducida es κ o λ (nunca ambas). *Gammapatía policlonal que puede deberse a una infección crónica, inflamación crónica, enfermedad hepática, enfermedades del tejido conectivo, amiloidosis o enfermedades autoinmunes, entre otros. Aumento de la banda gamma, de forma ancha y difusa, que típicamente refleja un aumento en anticuerpos variados (policlonales). 1.4 Método para cuantificar específicamente una (X) proteína: Nefelometría La nefelometría permite medir proteínas concretas. Esta técnica consiste en incubar una pequeña cantidad de plasma con un anticuerpo contra la proteína que queramos medir. Seguidamente, al cabo de unas horas, se irradia la solución con luz y se mide la desviación de esta (dispersión), la cual es proporcional a la cantidad de complejos antígeno(proteína)-anticuerpo. También se puede usar orina u otras muestras. Hay que tener en cuenta que, si tienes una lipemia (turbidez de la muestra causada por la acumulación de lipoproteínas) o infección 6 UB Ángela García Pelayo microbiana (turbulencia en orina), habrá una desviación de la luz que no es causa de los complejos Ag-Ac, sino de estos otros elementos. Por ello, es muy importante asegurarnos de que la muestra no está contaminada. 2. Proteínas del plasma 2.1 Albúmina Características: - Es la proteína más abundante del plasma humano (3,5 - 5 g/dL), representando el 60% del total de las proteínas plasmáticas. - De toda la albúmina que hay en el organismo, un 40% se encuentra en el plasma y un 60% en el espacio extracelular. - Su vida media es de unos 20 días. - El hígado sintetiza 12gr de albúmina al día (lo que supone el 25% del total de todas las proteínas sintetizadas por el hígado). - Tiene 585 Aa y 17 puentes disulfuro que le confieren una forma elipsoidal. Esto hace que no aumente la viscosidad del plasma (el fibrinógeno, al ser alargado, sí que aumenta la viscosidad del plasma). - Tiene un bajo peso molecular (69 kDa) y un punto isoeléctrico de 4,7 (también bajo). Por todo ello es la que más corre en el proteinograma, ya que migra muy rápido en electroforesis a pH alcalino y precipita al final en métodos de salinización. Funciones: - Mantiene la presión osmótica, pues mantiene al agua dentro de los vasos (presión oncótica), contrarrestando a la presión hidrostática (que hace que el agua tienda a salir de los vasos). Esto se debe a su gran abundancia en plasma y a su bajo peso molecular. Cuando baja la cantidad de proteína en plasma, sale agua al espacio intersticial y se forma un edema. Hay diferentes niveles de edema, en función de cómo se hunda el dedo al palpar, distinguiremos su gravedad y grado. Hay dos tipos de malnutrición donde se ve implicada la albúmina: o Marasmo: sufren défcit de carbohidratos y proteínas. o Kwashiorkor: tiene una gran deficiencia de proteínas, por eso tienen abdomen hinchado (edema). 7 UB Ángela García Pelayo - Es la proteína transportadora por excelencia, transporta ácidos grasos no esterificados, calcio, cobre, bilirrubina… También drogas y fármacos como la penicilina, aspirina… Ejemplos de casos donde la albúmina juega un papel muy importante: Cuando hay hemólisis, aumentan los niveles del grupo hemo, aumentando los niveles de bilirrubina, la cual se ha de unir a la albúmina e ir al hígado, donde pasará a ácido glucurónico y podrá ser eliminada por la bilis. Si no se une a la albúmina, la bilirrubina libre puede ir al SN, causando graves daños. El tratamiento de emergencia en bebes al nacer (que sufren mucha hemólisis) es inyectar HSA (Human Serum Albumin) en sangre. En sangre se puede encontrar una fracción de calcio libre (que es el fisiológicamente activo) y otra ligada a albúmina. Para saber si los niveles de calcio son patológicos, tienes que mirar los niveles de albúmina. Por ejemplo, si tienes niveles altos de calcio y de albúmina, no pasa nada, pues estará unida a esta. En cambio, si los niveles de calcio son altos pero los de albúmina no, puede que el paciente esté sufriendo alguna patología. Por tanto, para analizar el calcio siempre tienes que tener también presente el nivel de albúmina. - Función nutritiva, pues para muchas células la albúmina supone una fuente de AA. - Función tamponadora debido a su concentración y a la gran cantidad de residuos histidina que presenta, los cuales contribuyen a mantener el balance ácido-base. - Viscosidad: debido a su forma elipsoide disminuye la viscosidad del plasma. Algunos motivos por los que se puede dar una hipoalbuminémia son: Cirrosis/alteración hepática Malnutrición Síndrome nefrótico (se pierde albúmina por orina). Quemaduras Mala absorción de proteínas Analbuminemia congénita: enfermedad genética donde NO hay albúmina, por lo que se administra parenteralmente. La hiperalbuminémia se suele dar en condiciones de depleción de líquido o deshidratación. 2.2 Globulinas Por electroforesis, las globulinas las podemos separar en: - α1-globulinas: α1-antitripsina, Orosomucoide (α1-acid glycoprotein), α1-fetoproteína. - α2-globulinas: Haptoglobina, Ceruloplasmina, α2-macroglobulina. - β-globulinas: Transferrina, C-reactive protein, Haemopexina, Complemento C1q - Y-globulinas: Inmunoglobulinas (A, M, G, E). Ante un estímulo inflamatorio, se activa el sistema inmunitario y se comienzan a liberar citoquinas (IL-6, TNF-a…). Estas actúan como reguladores transcripcionales a nivel hepático, haciendo que este 8 UB Ángela García Pelayo órgano aumente/disminuya la síntesis de determinadas proteínas. Así, aumenta la síntesis de las proteínas reactivas de fase aguda (globulinas) y disminuye las de la albúmina y transferrina. De las proteínas reactivas de fase aguda destacan sobre todo la proteína C-Reactiva y la Serum amiloide A, pues son las que más aumentan (las demás también lo hacen, pero un poco menos). Entre todas estas proteínas hepáticas y las citoquinas, habrá una respuesta sistémica: fiebre, movilización de proteínas musculares, leucocitosis (aumento de las células leucocitarias), caída del hierro circulante (la gente con inflamación crónica sufre anemia)... La bajada del hierro es un mecanismo de defensa, pues muchas bacterias utilizan hierro para su metabolismo. Por tanto, cuando hay un estímulo inflamatorio fuerte (infección, necrosis, cáncer, enfermedades inmunitarias…), hay cambios sustanciales en los niveles de proteínas. Además, también hay cambios (pero moderados) en ejercicio, estrés térmico...; y cambios pequeños en situaciones estresantes. Las técnicas que se emplean para la medición de estas proteínas suelen ser técnicas inmunohistoquímicas como el ELISA, radioinmunoensayo (RIA) o nefelometría. Ahora vamos a enumerar algunas de estas proteínas: A) Alfa-1 globulinas 1) α1-antitripsina (AAT) Es una antiproteasa que inhibe a la tripsina y a casi todas las proteasas circulantes (tripsina, elastasa, trombina, plasmina, catepsina…). Es de las mayoritarias del grupo de las alfa1 (90%). A los asmáticos se les mide esta proteína, pues es un marcador de esta enfermedad (baja en asma y aumenta en inflamación). Los alveolos, que están en contacto con el aire, presentan un gran número de neutrófilos que liberan elastasas para que ataquen a los microorganismos que pueda haber. Así, la función de la a1-antitripsina es proteger a al epitelio alveolar de estas elastasas, a las que inhibe. El genotipo normal de esta proteína es MM. Sin embargo, encontramos una isoforma patológica que es la ZZ, la cual no sale del hígado, donde se acumula y termina provocando cirrosis. Como no sale del hígado, el pulmón también se queda sin esta proteína. Bien, pues al perder el epitelio alveolar este recubrimiento de AAT, la elastasa destruye el tejido pulmonar, provocando enfisema y otras EPOCs. Se ha visto que, según el tipo de isoforma, son más (ZZ) o menos (MM) sensibles a la oxidación. EL humo del tabaco puede oxidar a estas isoformas, favoreciendo la aparición de patologías pulmonares. A la gente con EPOCs se les miran los niveles de alfa1-antitripsina y, si presentan niveles bajos, se les hace terapias donde se les administra. 2) Orosomucoide (α1-acid glycoprotein, AAG) Es una glicoproteína (un 41% de su peso molecular son carbohidratos, “tiene mucho azúcar”) sintetizada por el hígado. Es un marcador de inflamación, ya que su promotor tiene elementos de respuesta a glucocorticoides, interleuquinas, TNF... por lo que aumenta su expresión en este estado. Su función es acumular carbohidratos en los lugares donde se encuentra la lesión. También es un marcador de colitis ulcerosa y de enfermedades hepáticas. 9 UB Ángela García Pelayo 3) α1-fetoproteína (AFP) La concentración en plasma de esta proteína en un adulto debería ser baja. Sin embargo, los niveles de esta proteína aumentan mucho durante el embarazo. Además, en embarazos múltiples (gemelos), aumentarán aún más los niveles. Por otro lado, si encontramos niveles elevados de esta proteína en una persona que NO está embarazada, actúa como marcador tumoral (concretamente permite el diagnóstico de carcinomas hepatocelulares). Los niveles de AFP son muy bajos en Síndrome de Down. B) Alfa-2 globulinas 1) Haptoglobulina (Hp) Su función es ligar la hemoglobina extracorpuscular (la que está fuera de los eritrocitos), pues el grupo Hemo2+ es muy reactivo, pudiendo desencadenar ciertas reacciones peligrosas que dañen el tejido Así, esta proteína se encarga de unirse al grupo hemo (hierro) en situación de hemólisis. Además, los niveles de hierro son bajos en el organismo, por lo que es necesario recuperarlo (hay que impedir que se elimine por la orina, por lo que esta proteína evita que se elimina por el riñón). Concretamente, el complejo Hemo-Haptoglobulina tiene 155kDa y no puede ser filtrado por el riñón; mientras que el grupo hemo solo (65kDa) sí puede ser eliminado, por lo que esta proteína ayuda a la conservación del hierro además de evitar su efecto nocivo en sangre. Cuando ambos están unidos, el complejo del grupo Hemo+haptoglobulina es reconocido por un receptor del hígado y por macrófagos, quienes recuperan el hierro y lo almacenan. En inflamación esta proteína aumentada y cuando hay anemia hemolítica, disminuye. Esto es debido a que, cuando está unida a la hemoglobina, su vida media es de 90min (mucho menos que de normal, que son unos 5 días), por lo que, en una anemia, como es necesaria tanta haptoglobulina (hay que absorber todo el hierro que sea posible), no da tiempo a que se sintetice cuando ya se ha eliminado. 2) Ceruloplasmina Contiene (pero no transporta) el 90% del cobre del plasma (la que transporte el cobre es la albúmina). La ceruloplasmina es una oxidasa dependiente de cobre que aumenta en inflamación. Oxida al hierro, pasándolo de su forma Fe+2(ferroso) a Fe+3(férrico), por lo que ayuda a que se pueda unir a la transferrina, la cual solo puede transportar el hierro en plasma en su estado férrico (cuando el hierro sale de la célula lo hace en Fe+2, pero a la transferrina se une en la forma Fe+3, por lo que se ha de transformar). También presenta funciones como la oxidación de histamina, serotonina, epinefrina y norepinefrina. Así, se dice que es una ferroxidasa, cobreoxidasa e histaminasa. El cobre se absorbe en el intestino, llega al hígado y se incorpora al Golgi. De todo ello, una gran parte 10 UB Ángela García Pelayo servirá para formar ceruloplasmina (y otros elementos) y otra parte será eliminada por los lisosomas (vía biliar). Sin embargo, la concentración de cobre no suele descender y se elimina muy poco por orina. En la enfermedad de Wilson no hay esta proteína circulante debido a que la bomba ATPasa que introduce al cobre en el Golgi está alterada, por lo que no puede adquirir al cobre en su síntesis. Esto hace que haya un aumento de los niveles de cobre en el organismo: el ojo adquiere una coloración verde debido a esto, hay una gran acumulación de cobre en el hígado, riñón, corazón (que provoca graves consecuencias), alteraciones del SNC… En estos pacientes también existen problemas con el hierro, que se acumula en el hígado y disminuye en circulación (ya que no se puede pasar el Fe+2 a Fe+3). En estos pacientes se aplican dietas bajas al cobre, agentes quelantes en sangre… Otra enfermedad característica es la Enfermedad de Menkes (también hereditaria) que consiste en la acumulación excesiva de cobre en el hígado y se caracteriza por piel arrugada en el cuello y cabello escaso y descolorido. 3) α2-Macroglobulina Es el mayor componente de las proteínas α2. Tiene un peso molecular muy grande (725.000, “proteína elefante”) y comprende del 8% al 10% de las proteínas plasmáticas totales de los humanos. Es una proteína tetramérica fabricada por hepatocitos y macrófagos. Su función es inactivar a todas las proteasas, por eso es un anticoagulante muy importante in vivo. Además, también actúa como transportador de factores de crecimiento. Su concentración aumenta mucho en el síndrome nefrótico, pues las proteínas pequeñas se pierden (se filtran), pero ella, al ser tan grande, no. C) β-globulinas 1) Transferrina La transferrina transporta Fe+3 desde el intestino hasta aquel lugar donde lo necesitamos (médula, macrófagos, hígado…). Diariamente, 200 billones de eritrocitos (aproximadamente 20ml) se procesan cada día, lo que supone unos 25mg de hierro circulante y para ello se necesita esta proteína. Su saturación normal es del 30% aprox (2 moles de Fe+3, transformados por la ceruloplasmina). La transferrina se une a receptores (TfR1 y TfR2) y se internaliza por endocitosis mediada por clatrina. En el compartimento endosomal, el hierro pierde afinidad por la transferrina debido al bajo pH y se separa de ella. Así, el receptor volverá a la membrana 11 UB Ángela García Pelayo con la transferrina unida. Seguidamente, el hierro saldrá al citosol por un transportador y se incorporará a la síntesis de la hemoglobina o de ferritina (almacén de hierro). La concentración de transferrina disminuye en inflamación y aumenta cuando hay ferropenia (anemia, bajos niveles de hierro). En este último caso, su porcentaje de saturación baja mucho (hay poco hierro y mucha transferrina). En cambio, en la hemocromatosis (sobrecargada de hierro) hay una sobresaturación (70%), apareciendo en el proteinograma el pico beta muy aumentado. Si hay enfermedad hepática, disminuyen sus niveles. 2) Proteína C-reactiva (podemos encontrarla como β o γ GLOBULINA) Está formada por 5 subunidades idénticas. Aumenta en inflamación (a las 6-12 horas sube y llega al pico a las 48h), pero sobre todo está relacionada con la estimulación de la actividad del complemento y los macrófagos. Se llama así ya que reacciona con un C-polisacárido de la cápsula de los neumococos. Aumenta más con infecciones bacterianas que con infecciones víricas. También se relaciona con riesgo de enfermedad coronaria. 3) Fibrinógeno / Factor de coagulación 1 Participa en la coagulación. No debería de haber en suero, pero en plasma sí. De hecho, constituye un 4-6% de la proteína del plasma. Sus cargas negativas contribuyen a su solubilidad en plasma y evita la agregación debido a las repulsiones electrostáticas entre las moléculas de fibrinógeno. Da viscosidad a la sangre (debido a su forma alargada). 4) Serum amiloide Aumenta mucho después un estímulo inflamatorio, a las 4-6 horas. De hecho, puede aumentar hasta 1000 veces durante la inflamación. Su función es a nivel del SI, ya que atrae a los neutrófilos e induce la síntesis de diferentes citoquinas (actividad quimiotáctica). Además, une HDL. *Serum amiloide A + Proteína C reactiva à proteínas de fase aguda tempranas. Tabla: mirar sobre todo quien aumenta/disminuye en inflamación J. 12 UB Ángela García Pelayo 3. Test de velocidad de sedimentación de los eritrocitos Test que consiste en poner una muestra de sangre en un tubo calibrado y medir los mm recorridos por los eritrocitos sedimentados. Concretamente, a la sangre se le añade un anti- coagulante (EDTA) y se deja en reposo en un tubo en vertical. Cuando los eritrocitos sedimentan, mides como lo han hecho en mm/h (velocidad de sedimentación). En inflamación la velocidad de sedimentación de la sangre aumenta debido a que las proteínas reactivas de fase aguda se unen a los eritrocitos, favoreciendo así la formación de agregados que sedimentan muy rápido. De esta forma, al aumentar la concentración de proteínas de fase aguda, aumenta la velocidad de sedimentación. Los valores normales son 11mm/h en hombres y 20 mm/h para mujeres. Si la Vsed es alta, esto implica que las globulinas también están altas, por lo que normalmente significa que hay inflamación. Así, en inflamación la relación albúmina/globulina se ve disminuida. Cuando falla el hígado, la albumina baja, pero las globulinas procedentes de los linfocitos NO. Para hacer proteómica del plasma hay que extraer a las proteínas más abundantes, ya que la mitad de los péptidos serán albúmina e IgGs. Actualmente, se venden kits que sirven para deplecionar el plasma de las 20 proteínas más abundantes. Concretamente, se usan unas columnas donde hay unidos anticuerpos que reconocen a las proteínas que queramos extraer de la sangre. Posteriormente, se hace espectrometría de masas y partir de ahí, se identifican los péptidos. Info extra. A partir del plasma, cuando hacemos una donación, se hacen ciertos preparados terapéuticos como el FFP o el PF24: - El Fresh Frozen Plasma (FFP) es el producto plasmático más conocido y el más solicitado por los médicos. Puede prepararse a partir de recolecciones de sangre completa o aféresis (modelo especial de donación en la que al donante se le extrae de manera selectiva uno o varios componentes sanguíneos (glóbulos rojos, plasma o plaquetas) y debe congelarse a -18 ℃ dentro de las 8 horas posteriores a la recolección. Este corto 13 UB Ángela García Pelayo intervalo de tiempo es crítico para preservar la función de los factores de coagulación más lábiles (Factor V, Factor VIII). Después de la congelación, el PFC se puede almacenar hasta por 1 año a ≤−18ºC. Una vez descongelado, su vida útil se reduce a 24 horas si se almacena entre 1 y 6 ℃, o a 4 horas si se almacena entre 20 y 25 ℃. También se puede convertir en plasma descongelado y almacenar durante un total de 5 días a entre 1 y 6 ℃ si el producto se preparó en un sistema cerrado. El PFC contiene niveles adecuados de todos los factores de coagulación, incluidos el factor V y el factor VIII, así como antitrombina y ADAMTS13. - Plasma frozen within 24 hours after phlebotomy (PF24). Se define como plasma que se almacenó entre 1 y 6 ℃ dentro de las 8 horas posteriores a su recolección y se congeló a -18 ℃ entre 8 y 24 horas después de su recolección. Puede prepararse tanto a partir de plasma derivado de sangre total como de plasma de aféresis, y se produce cuando existen limitaciones logísticas, técnicas o de transporte que impiden la congelación en un plazo de 8 horas. Este producto también se puede volver a etiquetar como Plasma Descongelado y almacenar durante 4 días más a 1-6ºC. En comparación con el FFP, el PF24 contiene niveles reducidos de factores V y VIII, así como de proteína C, pero por lo demás es equivalente. Cuando te hacen una transfusión de sangre solo te inyectan las células: eritrocitos y plaquetas. El plasma lo separan para obtener diferentes productos (como a alguien que ha tomado Sintrom y necesita fibrinógeno). También se pueden purificar otros elementos como albúmina (en un litro de plasma hay 25gr de albúmina), las alfa-anti-tripsina para los EPOC, factores de coagulación…*Cuando fue la pandemia del sida, sufrieron mucho los hemofílicos, que recibían plasma con factores coagulantes y también el sida J. 14 UB Ángela García Pelayo TEMA 2. Proteínas plasmáticas ocasionales Las proteínas solubles ocasionales son aquellas que están en plasma, pero que no deberían (“indican desgracia”). Cuando se altera la integridad celular, parte de estas células pasan a la sangre. La cantidad de proteína que haya en sangre siempre irá relacionada con la lesión: a más proteína, más grave es la lesión. Cuando la lesión se repara, los niveles de proteína se reestablecen. Además, mientras de “más adentro de la célula” sea la proteína, si la encontramos en plasma, indica alteraciones más graves. Es decir, es más grave encontrarse una proteína de la mitocondria en plasma que una de la membrana, pues la lesión celular producida es mayor. De esta forma, las proteínas que podemos encontrar circulando son: - Intracelulares (citosólica, mitocondrial...): liberadas por perturbación o destrucción celular. - De membrana: o Conectadas a la membrana por glicosilfosfatidilinositol (GPI) y liberadas enteras, por solubilización por ácidos biliares o hidrólisis por fosfolipasas. Ejemplo: la fosfatasa alcalina está unida por GPI a la membrana. o Proteínas transmembrana: liberadas en fragmentos solubles resultantes de la proteólisis enzimática del dominio expuesto en el espacio extracelular (ectodomain shedding). Ejemplo: formas solubles de receptores liberadas por derrame proteolítico, como es el sRTF (soluble transferrin receptor). Además, la identidad de la proteína permite informarnos sobre el origen de la lesión, ya que muchas proteínas e isoformas son específicas de tejido. Hay que tener en cuenta que una pequeña cantidad de proteína tisular siempre estará circulando debido al propio recambio celular y proliferación; es cuando los valores aumentan mucho cuando existe una lesión. Los marcadores de lesión tisular tienen una función importante en la ventana temporal de diagnóstico, que es el intervalo de tiempo después de un episodio de lesión en un tejido durante el cual el marcador aumentado está circulando, demostrando así la presencia de la lesión. El tiempo que puedes encontrar circulando a un marcador después de una lesión depende principalmente de su salida y de lo que este tarde en eliminarse (de su vida media en sangre). La salida depende de la gravedad de la patología, de su localización (mitocondria -citoplasma) y de su PM (las más pequeñas salen antes). Una misma enfermedad puede tener diferentes marcadores según el tiempo que haya pasado desde que la lesión se ha producido. Por ejemplo, en un infarto de miocardio no encontraremos las mismas proteínas en plasma dos días después de que este se haya producido que en dos semanas. Los marcadores históricos siempre han sido las enzimas, ya que durante mucho tiempo se medían actividades enzimáticas, pero no proteínas. Realmente, no fue hasta que aparecieron los 15 UB Ángela García Pelayo anticuerpos cuando se empezó a detectar proteínas. Es por este motivo por el que actualmente muchos marcadores de lesión son enzimas y no proteínas, por la simple historia de la investigación/medicina. Así, las medidas de estos marcadores permiten realizar un diagnóstico diferencial de una determinada enfermedad, su pronóstico, así como una definición se su evolución y respuesta a tratamientos. Para medir la actividad enzimática se establecen condiciones saturantes: niveles de sustrato super saturantes nos asegura que la enzima está trabajando al máximo, lo que nos permite ver su actividad total. Para ello, se mide o bien la disminución de sustrato o bien la cantidad de producto formado. Si no se puede detectar directamente el producto, se hacen dobles reacciones donde la 2ª enzima está mucho más concentrada que la primera (10 veces más), ya que se ha tenido que ensamblar una reacción más porque no se puede medir el primer producto, y para tener una medición correcta, es necesario que se asegure que todo este primer producto pasa a segundo producto. La unidad internacional (U) es la unidad de medida de la actividad enzimática que se emplea actualmente. Se define como la actividad catalítica responsable de la transformación de un micromol de sustrato por minuto a 25ºC, en una concentración de sustrato saturante y a un pH definido según la enzima (el óptimo dependiendo el caso). Sin embargo, la unidad internacional (U) no es la unidad del sistema internacional (SI), que es el Katal (que es la actividad que transforma un mol de sustrato por segundo). El katal prácticamente no se usa. 1 U = 1/60 micro katal = 16,67 nkatal (nanokatal) 60 x 106 U equivalen a un katal Para muchos tejidos lo que se hace es un perfil enzimático en función de la enfermedad (mirar tabla para ejemplos). Además, muchas veces se miran un conjunto de enzimas (no sólo una), para el diagnóstico de una enfermedad (cuando se miran varías se puede concretar más). *Ahora para diagnosticar al cáncer de próstata se utiliza el antígeno prostático específico (PSA), pero antes se usaba la fosfatasa ácida. 16 UB Ángela García Pelayo 1. Proteínas plasmáticas ocasionales 1) Lactato deshidrogenasa (LDH) Es una enzima ubicua con diferentes isoformas. Es un tetrámero con 2 tipos de subunidades H (heart) / M (músculo): - Isoforma H4 → corazón - Isoforma M4 → músculo e hígado - Formas intermedias. Por ejemplo, de normal en plasma encontramos algo de la forma H3M1 de eritrocito. La forma M4 no se inhibe por piruvato, pero la H4 sí. Cuando se rompe una célula, libera la LDH, por lo que se considera un marcador de lisis celular. Así, si sabemos la isoforma de la LDH, se puede saber de dónde procede. Los eritrocitos tienen mucha cantidad de LDH (casi 10 veces más) por lo que, si al extraer sangre se produce hemólisis, los niveles de LDH y hemoglobina subirán mucho, pero esa muestra será un falso positivo, pues realmente el paciente no sufre lisis celular. Por otro lado, si realmente es el paciente el que sufre hemólisis (los eritrocitos se rompen dentro de los vasos) se verá mucha LDH, pero no hemoglobina, ya que está será recogida por la haptoglobulina. - Infarto de miocardio: aumenta la forma H4 entre 5 y 10 veces. - Problemas hepáticos: aumenta la forma M4. - Distrofias musculares y rabdomiólisis: aumenta M4. 2) Creatina kinasa (CK) La creatina kinasa es una reserva energética presenten en el músculo esquelético, cardíaco y cerebro (presenta un enlace rico en energía). Sus niveles son mayores en hombre que en mujeres debido a que estos presentan mayor cantidad de masa muscular. La CK es un dímero con diferentes isoformas: - BB: brain - MB: corazón - MM: músculo. Es muy buen marcador de infarto de miocardio, pues después de que este se de los niveles de CK aumentan mucho (aun cuando en el electrocardiograma no se aprecia nada del infarto o es ambiguo). Es específica de músculo y no hay en eritrocitos. En enfermedades musculares aumenta mucho, pudiéndose apreciar distrofias. Sin embargo, cuando la distrofia está muy avanzada, los niveles de CK bajan, pues el músculo ya está muy deteriorado. Para detectar los niveles de CK se incuba al plasma con un anticuerpo contra la isoforma MM (antiCKMM) ya que esta es mayoritaria y dificulta la medición de la MB y BB. 17 UB Ángela García Pelayo Cuando hay un ataque al corazón, aunque aumente la forma MB, esta sigue siendo minoritaria, por lo que quizás no se vería ningún cambio relevante. En cambio, si se depleciona la forma MM, se puede apreciar un aumento más marcado. Esto es lógico ya que, si comparamos la proporción de músculo cardíaco respecto a la de todo el músculo corporal, por poca MM que se libere, seguiría tapando la poca cantidad de MB que haya. Además, al medir la actividad enzimática, en principio lo que sale representado es la actividad de MB, porque si una persona ha tenido un accidente cerebrovascular, habrá otros parámetros que lo indicarán de forma más óptima que la BB. 3) Aspartato amino-transferasa (AST) Esta transaminasa transfiere el grupo amino de un Aa al oxalacetato, formando aspartato y α- cetoglutarato. La AST está en hígado, pero también en otros tejidos (músculo esquelético, riñón, eritrocitos, corazón). Presenta dos isoformas: la isoforma citosólica (20%), de vida media corta (17h) y la isoforma mitocondrial (80%), de vida media larga (87h). La AST aumenta marcadamente en infarto de miocardio, en enfermedades hepáticas (en problemas crónicos de hígado aumenta, pero no mucho), musculares, episodios hemolíticos... Así, aunque es un buen marcador de daño hepático, es cierto que la alanina aminotransferasa es más específica (aumento marcado en alteraciones agudo, en crónico aumento moderado). Se utiliza mucho para monitorizar las terapias hepatotóxicas como la quimio. Antes de ponerle un nuevo tratamiento de quimioterapia a una persona con cáncer, se le miden los niveles de AST. Si estos niveles están 3 veces por encima de los niveles normales, no se administra aún la terapia. 4) Alanina amino transferasa (ALT) Es la enzima típica del hígado. Se puede encontrar pequeñas cantidades en el riñón o músculo esquelético, pero sobre todo se expresa en hígado. Es totalmente citosólica. - Niveles aumentados marcados indican problemas agudos de hígado (en problemas agudos de hígado aumenta más la ALT que la AST). - Aumento moderado: problemas hepáticos crónicos, cirrosis, infecciones víricas (ej. por mononucleosis)... 5) Alkalina fosfatasa (ALP o FA) Rompe un enlace fosfato a pH básicos. Tiene diferentes isoformas. La isoforma de los osteoblastos es muy conocida, pues para formar la matriz de los huesos utilizan este enzima. De hecho, se usa como marcador de los huesos (se encuentra muy elevada en niños, pues hay mucho crecimiento). Se nota un ligero aumento durante el embarazo, debido a la producción de isoenzima placentaria, así como en enfermedades hepáticas como hepatitis, hepatosis alcohólica o carcinoma hepatocelular. También se observan niveles muy altos en obstrucciones extrahepáticas o colestasis. La FA es producida por las células epiteliales de los canalículos 18 UB Ángela García Pelayo biliares y la obstrucción de los canales biliares, con la consiguiente irritación de las células epiteliales, conduce a la secreción de FA en el suero. También se observan niveles drásticamente altos de FA (10 a 25 veces el límite superior) en enfermedades óseas en las que aumenta la actividad osteoblástica, como la enfermedad de Paget, el raquitismo, la osteomalacia, el osteoblastoma, el carcinoma metastásico de hueso y el hiperparatiroidismo. 6) Gamma-glutamil transferasa (GGT) Transfiere un grupo glutamil. Se encuentra en riñón, páncreas, hígado y próstata. Se usa como marcador de alcoholismo, pues sus niveles aumentan mucho con el consumo de alcohol. Así, se utiliza para hacer seguimientos en personas alcohólicas. Cuando una persona requiere de un trasplante de hígado, se hace esta prueba. Si da positivo, es decir, si bebe alcohol, el trasplante no se realiza. 7) Fosfatasa ácida (ACP) Rompe enlaces fosfatos a pH ácido y degrada la matriz ósea (en osteoporosis sus niveles están muy elevados). También encontramos la isoforma próstatica, la cual es inactivada por el ácido tartárico. Los niveles de ACP se encuentran muy altos en cáncer de próstata y hueso, por lo que es un importante marcador de cáncer. También es secretada por plaquetas, eritrocitos y leucocitos. 2. Diagnóstico de un infarto de miocardio Un infarto de miocardio puede darse por la obstrucción de una arteria coronaria, normalmente por la rotura de una placa de ateroma, sufriendo la zona afectada una grave isquemia. Así, las células mueren por necrosis y liberan todo su contenido al exterior. Algunos marcadores tisulares en el serum/plasma son: 1) Enzimas (actividad total): o Creatina quinasa, CK (presente en músculo esquelético, cardíaco y cerebro). o Lactato deshidrogenasa, LDH (ubicua). o Aspartado aminotransferasa ,AST (abundante en músculo e hígado). 2) Mioglobina, la cual está presente en el músculo cardiaco (y esquelético). 3) Isoformas CK y LDH 4) Troponinas cardíacas, son proteínas estructurales No todas aparecen igual y al mismo tiempo: - Creatina kinasa (80kDa): incrementa a las 6h, pico a las 24 h y se normaliza al 2-3 día. - AST (90kDa): incrementa a las 12h, pico entre 1-2 días y se normaliza al 3-5 día. 19 UB Ángela García Pelayo - LDH (140kDa): incrementa a las 18h y el pico llega entre el 2-3 día. Sus niveles pueden estar elevados durante una semana. - Troponina: tarda semanas en normalizarse. De nuevo, los marcadores de lesión tisular tienen una función muy importante en la ventana temporal de diagnóstico, que es el tiempo en el que encuentras un marcador determinado en sangre después de un episodio patológico grave como infarto. El tiempo que puedes encontrar circulando a un marcador después de una lesión depende principalmente de su salida y de lo que este tarde en eliminarse (de su vida media en sangre). La salida depende de la gravedad de la patología, de su localización (mitocondria-citoplasma) y de su PM (las más pequeñas salen antes). 3. Vesículas extracelulares Dentro de las vesículas de secreción extracelular encontramos los exosomas y los ectosomas. Ambos, además de la función de vesículas de desecho clásica, son muy importantes para comunicación intercelular. Durante mucho tiempo se han considerado simples restos celulares o estructuras específicas de ciertas células. Ahora se considera un sistema de comunicación intercelular general, además de un sistema de eliminación de componentes tóxicos o de desecho. También constituyen un medio de diseminación de enfermedades. - Las microvesículas o ectosomas (shedding vesicles, micropartículas de membrana) son protuberancias directas de la membrana plasmática. La formación en reposo es muy baja y se activa en situaciones de estrés. Contienen proteínas de membrana y del citosol, RNA y miRNA, metabolitos presentes en el citoplasma y quizás DNA. Miden entre 0.1– 1.0 μm. - Los exosomas se forman por una doble invaginación de la membrana plasmática, como cuerpos mutlivesículares derivados de la vía endocítica y se liberan por fusión con la membrana plasmática. Se forman de forma constitutiva y en respuesta al estímulo de citoquinas y estrés oxidativo. Contienen lipid rafts*, proteínas de membrana y solubles, RNA y miRNA. El tamaño es de nanómetros (30-100 nm), por lo que son más pequeños que los ectosomas. 20 UB Ángela García Pelayo *Una balsa lipídica o lipid rafts es un microdominio de la membrana plasmática cuya fluidez es mucho menor a la de su entorno. Por otro lado, cuando hablamos de vesículas extracelulares, debemos mencionar a los cuerpos apoptóticos, los cuales se forman durante las últimas etapas de la muerte celular por apoptosis. Son vesículas de tamaños heterogéneos, pero mayores que las vesículas de secreción (0.5 - 4 μm, algunas del tamaño de las plaquetas). Contienen DNA, RNA, orgánulos, moléculas de membrana y citosólicas... La mayoría de los cuerpos apoptóticos son fagocitados por los macrófagos y eliminados localmente. Sin embargo, también se considera que constituyen una pequeña parte del conjunto de vesículas celulares circulantes, pudiéndose fusionar con otras células. Así, pueden pasarse orgánulos (ej: mitocondrias) y otros elementos. De hecho, una de sus funciones claves es la transferencia horizontal de oncogenes, DNA y RNAs. 3.1 Función y procesos en los que se han visto implicados las vesículas extracelulares - Infección: pueden actuar como sistemas de presentación de antígenos, estimular el sistema inmune, ser una forma de diseminar las infecciones… - Durante la gestación: pueden disminuir la respuesta inmunitaria de la madre y el feto, favorecen la tolerancia de la madre hacia el feto... - Las células madre liberan exosomas, que son muy importantes en la regeneración tisular. 21 UB Ángela García Pelayo - Corazón: cumplen con función protectora frente a un infarto, actúan como marcadores de enfermedades… - Sistema nervioso: intervienen en la diferenciación de neuronas, en enfermedades priónicas / alzehimer / parkinson… - Cáncer: las células cancerígenas los liberan para inhibir la respuesta inmunitaria, favorecer la metástasis, angiogénesis, transporte de oncogenes... Son muy buenos biomarcadores tumorales. - Además, las microvesículas existen en una variedad de fluidos biológicos, incluidos plasma, orina, leche materna, saliva, semen, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo y derrames malignos. Se cree que desempeñan funciones fundamentales en diversos procesos fisiológicos y patológicos, como la progresión tumoral, la vigilancia inmunitaria y el embarazo. Por tanto, los exosomas pueden circular o actuar sobre células vecinas (efecto local). La formación de exosomas está muy caracterizada y en ella intervienen muchas proteínas de la familia Rab. Todas las células son capaces de formar exosomas. Los exosomas proceden de una doble invaginación, en estas invaginaciones es cuando adquieren el contenido que van a transportar. Pueden ir a otras células o a la sangre, que es lo que nos interesada a nosotros, pues pueden servir como marcadores cancerígenos. Al hacer una doble invaginación, las proteínas de la membrana mantienen su orientación original (están igual colocadas/orientadas que en la membrana plasmática). Una vez el exosoma sale de la célula, interacciona con la diana de muchas formas: simple contacto de proteínas de superficies del exosoma con receptores en la célula diana; fusión; fagocitosis; macropinocitosis; entrada por endocitosis (receptor / raft mediated endocitosis) … Normalmente, los exosomas se dirigen a una diana que tiene proteínas de membrana que los reconocerán. Por tanto, es un sistema dirigido y de transporte de elementos muy concentrado (no se libera contenido a la circulación). Como 22 UB Ángela García Pelayo también se incorporan material genético, si una célula le manda a otra un RNA o un siRNA, modificará el patrón de expresión de esa célula. Esto nos muestra el potencial de los exososomas. 3.2 Vesículas extracelulares como medida de diagnóstico Las vesículas extracelulares se están utilizando como biomarcadores clínicos. Su reto más importante es definir protocolos adecuados para la recolección, procesamiento y análisis de muestras. Todos los tipos celulares pueden generar exosomas y existen en todas las muestras biológicas. Toma de muestras - Si queremos exosomas del plasma, por ejemplo, primero separamos las células, y seguidamente hay que eliminar a las plaquetas (no son células, sino fragmentos de células). Debemos asegurarnos de que no haya plaquetas en el plasma, por lo que para ello se realizan 2 centrifugaciones secuenciales. - Las muestras son congelables (-80ºC). - El anticoagulante puede afectar a la unión vesículas-células, así que hay que tener mucho cuidado con lo que tratamos a la muestra. Metodología de análisis - Número y tamaño de partículas: citometría de flujo de alta resolución o centrifugación diferencial (10000-20000 gs). - Captura de vesículas en función de marcadores moleculares de superficie (usando un anticuerpo contra un antígeno de superficie). También se emplean marcadores moleculares de superficie que precipitan con bolitas magnéticas. - Una vez tienes las vesículas capturadas, se procede al análisis de su contenido: preparación de extractos y aplicación de técnicas inmunoquímicas para la detección de proteínas específicas o técnicas para el análisis de RNA o DNA. Resumen (literalmente esto es lo que la profe ha dicho en clase): Si el análisis se hace a partir de una muestra de plasma, hay que eliminar a las plaquetas (no son células, son fragmentos de células). Así, se centrifuga dos veces para estar seguro de que no hay restos de plaquetas. Puedes hacer más centrifugaciones secuenciales hasta que, a muy alta velocidad, ya tienes pellet con exosomas. Concretamente, conforme se vayan haciendo centrifugaciones, primero aparecerán los cuerpos apoptóticos, luego las microvesículas y, por último, los exososomas. Estas centrifugaciones se hacen en ultracentrifugadoras (que son muy caras). También se puede hacer una centrifugación por gradiente de densidad. Posteriormente, podemos analizar sus medidas, proteínas, RNA, DNA… También se pueden usar bolitas magnéticas con anticuerpos unidos que detecten nuestras moléculas de interés. *ExoQUick-TC: es un kit para precipitar exosomas muy sencillo y que no requiere de ultracentrifugación. Consiste en tomar el medio donde se han descartado las células por centrifugación, ponerlo en 23 UB Ángela García Pelayo contacto con la solución y, al día siguiente, centrifugar. Así, obtendremos los exosomas en el pellet. Conclusiones: - Todas estas técnicas son difíciles de reproducir entre laboratorios, ya que los protocolos no están estandarizados. - Puede haber partículas que precipiten igual que los exosomas como virus, lipoproteínas… - También se pueden filtrar las preparaciones para obtener los exosomas, pero esto también puede dar problemas, puesto que se pueden romper con la presión o pueden alterar su composición. 3.3 Significado diagnóstico de las vesículas extracelulares presentes en el plasma En condiciones patológicas se puede producir: - Incremento en el número de vesículas. Las principales enfermedades en las que se han detectado niveles incrementados de vesículas de secreción plasmáticas son: - Alteración en la procedencia celular: detección de vesículas procedentes de otras células, como células musculares lisas o fibroblastos. Aunque se cree que las vesículas se forman en todas las poblaciones de células del cuerpo, su liberación a los fluidos biológicos para la mayoría de las células es muy limitado. - Alteración en la composición de las vesículas. Ejemplo: vesículas procedentes de células tumorales. - En cáncer: facilitan angiogénesis, factores de crecimiento, alteran el sistema inmun, modifican el microambiente favoreciendo su crecimiento… Los exosomas pueden atravesar la BHE. De esta forma, en sangre podríamos encontrar exosomas de tumores cerebrales, lo que puede ser una futura diana de diagnóstico. Además, los exososmas pueden tener una función terapéutica, pues actualmente se están utilizando también como sistema para administrar fármacos ya que: - Tienen una vida media alta en sangre. - Se pueden diseñar exosomas que vayan dirigidos a un tejido específico. - El sistema inmune no suele reconocer tanto a los exosomas como partículas extrañas. - La manipulación es sencilla. - Existen muchos sistemas para fabricar exosomas a partir de células en cultivo que después se administran a pacientes. 24 UB Ángela García Pelayo TEMA 3. Anemias y metabolismo del hierro La vida media de un eritrocito es de 120 días. Cada día destruimos unos 20ml de eritrocitos (100 billones aprox.) y los formamos de nuevo, es decir, se da un recambio constante. Los eritrocitos se forman a partir de los eritroblastos en la médula ósea roja y se destruyen en el bazo y en el hígado (extravascularmente) por macrófagos. El proceso de eritropoyesis se da en una serie de días en los que los eritrocitos van madurando: pierden el núcleo, sintetizan de forma masiva hemoglobina (de hecho, se conocen como bolsas de hemoglobina), captan hierro, pierden las mitocondrias (los eritrocitos hacen glucólisis anaeróbica) … Además, tienen forma bicóncava para aumentar la superficie de intercambio. A més, són molt elàstics i té sentit que no consumeixin oxigen si el transporten (falta de mitocondris i ribosomes) Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros. Normalmente representan un 1% en sangre, pero este valor suele aumentar en anemias pues, en estas situaciones, el organismo incrementa la producción de glóbulos rojos y los envía al torrente sanguíneo antes de que sean maduros. L’últim pas és el de l’eliminació del nucli. Para la eritropoyesis se necesita vitamina B12, folato, hierro, cobre, y zinc. De hecho, a las mujeres embarazadas les suelen dar suplementos de hierro, folato y vitamina B12 para evitar la anemia gestacional. En el proceso de eritropoyesis destaca la hormona eritropoytina (EPO), secretada por el riñón. La eritropoyetina se secreta en situaciones de hipoxia (pues el riñón lo detecta) y esta actúa sobre la medula ósea para inducir la formación de más eritrocitos. Esta respuesta homeostática es muy rápida (3-4 días). Así, la eritropoyetina aumenta cuando hay baja concentración de oxígeno en el aire (baja presión de O2). Por eso, los atletas se van a entrenar a sitios con altura, para aumentar el número de eritrocitos. El hematocrito (cantidad del volumen de sangre total ocupado por los eritrocitos) aumenta también en enfisema y en los atletas/deportista por el simple hecho de hacer deporte. 1. Hemoglobina La hemoglobina es un tetrámero formado por dos subunidades que contiene hierro Fe2+, el cual une de forma reversible el oxígeno (con Fe+3 no une O2). Hay diferentes genes que codifican para las globinas, los cuales se encuentran en el cromosoma 16 y 11. A lo larga de la vida hay diferentes tipos de hemoglobinas, pero siempre formadas por dos genes del cluster alfa (cromosoma 16) y por dos del cluster beta (cromosoma 11). Està format per dos gens del cluster alfa i dos del beta. Los genes de las globinas se expresan en eritroblastos y en reticulocitos. Los genes α (α1 y α2) están presentes en todos los estadios del desarrollo. El gen β solo en la edad adulta. La expresión del gen g disminuye progresivamente durante los primeros meses de vida (está presente solo en la etapa embrionaria y fetal). 25  UB Ángela García Pelayo *Los genes g A e g G difirieren solamente en el codón 136 Gly/Ala. En un individuo adulto, la forma predominante (85-98%) es la HbA (2α y 2β). También podemos encontrar HbA2 (2α y 2d), en un porcentaje un poco menor (2.5-3.5%); y HbF (2α y 2g), que es fetal y se puede encontrar en algunos adultos, pero en un porcentaje muy pequeño (