Tıbbi Biyokimya Uygulama Kitabı - I. PDF

İ.Ü CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA UYGULAMA DERSLERİ KİTABI-I CTF Tıbbi Biyokimya Dalı  2017 İ.Ü CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA UYGULAMA DERSLERİ KİTABI-I  CTF Tıbbi Biyokimya Dalı 2017 İ.Ü CERRAHPAŞA TIP FAK...

İ.Ü CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA UYGULAMA DERSLERİ KİTABI-I CTF Tıbbi Biyokimya Dalı  2017 İ.Ü CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA UYGULAMA DERSLERİ KİTABI-I  CTF Tıbbi Biyokimya Dalı 2017 İ.Ü CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ TIBBİ BİYOKİMYA UYGULAMA DERSLERİ KİTABI-I  CTF Tıbbi Biyokimya Dalı 2017 SEVGİLİ ÖĞRENCİLER Biyokimya Uygulama derslerimiz teorik bilgileriniz pekiştirilmesi, tıbbi biyokimya laboratuvarlarında kullanılan araç-gereç-cihaz ve yöntem konusunda temel bilgi yapısını oluşturma ve test sonuçlarının hastalıkların tanı, tedavi ve izlemindeki kullanımı konusunda bilgi, beceri ve tutum düzeyinde sizlere gerekli donanımı sağlama hedeflerimize yönelik hazırlanmıştır. Uygulama derslerimizin 1. kitabında ve ilgili ders kurul uygulamalarımızda temel laboratuvar kuralları, aminoasit, proteinler, karbohidrat ve lipidlerin yapılarına ilişkin deneyler, pH ve tampon sistemler, enzimlerin reaksiyonları, uygulama derslerimizde kantitatif analizlerde sıklıkla yararlanacağımız spektrofotometri ölçüm yöntemi ve cihazlarını ve bazı temel elementlerin ölçüm yöntemleri hakkında temel bilgiler bulunmaktadır. Uygulama kitaplarımızın basımına destek olan fakültemiz ve üniversitemiz yöneticilerine teşekkür ederiz. Teorik ve uygulama derslerimizin hekimlik pratiğinize katkıda bulunmasını dileriz. Başarılar… İÇİNDEKİLER DERS KURULU Sayfalar 1001 TIP BİLİMLERİNE GİRİŞ 1. Biyokimya Laboratuvarında Güvenlik ve Laboratuvarlarda Kullanılan Araç – Gereçler ve Çözeltiler 2. Karbohidratların Genel Reaksiyonları 3. Lipidlerin Genel Reaksiyonları ve Safra Asitleri  4. Amino asitlerin ve Proteinlerin Genel Reaksiyonları 1002 HÜCRE , DOKU VE ORGAN SİSTEMLERİ I 1. Spektroskopik analiz yöntemleri 2. pH, Tampon Sistemler ve Mide Özsuyu Analizi 3. Kalsiyum, İnorganik Fosfor ve Klor Analizi 4. Enzim Kinetiği ve Enzimatik Analiz BİYOKİMYA LABORATUVARINDA GÜVENLİK ve LABORATUVARDA KULLANILAN ARAÇ-GEREÇ VE ÇÖZELTİLER  Prof.Dr. Ezel USLU Öğrenim Hedefleri Laboratuvar çalışmaları sırasında uyulması gereken temel kuralları öğrenmek Laboratuvar çalışmaları sırasında karşılaşılacak kimyasal ve biyolojik zararları tanımlamak Laboratuvar kazalarından korunma yollarını öğrenmek Laboratuvarda kullanılacak araç , gereç ve aletleri tanıtmak, bu malzemelerin temizliğini öğrenmek ve temizliği yapmak Analizde kullanılacak çözeltileri sınıflamak, Çözelti hazırlanması için gerekli hesaplamaları öğrenmek Çözelti hazırlamak Uygulama sonunda araştırma veya rutin laboratuvar çalışmalarında güvenlikli ve doğru çalışabilmek için gerekli teorik bilgi ve deneyimlerini kullanabilme becerisi kazanmasınız hedeflenmektedir. BİYOKİMYA LABORATUVARINDA GÜVENLİK Laboratuvar çalışanlarının güvenlik konusunda eğitilmiş olması hem kendi sağlığını hem de çalışma arkadaşlarının sağlığını korumada önemlidir. Laboratuvar güvenliğinin tam olması için bazı temel kuralların bilinmesi ve yürütülmesi zorunludur. Temel Kurallar 1. Laboratuvarın öncelikle güvenli çalışma olanağı sağlayacak şekilde planlanmış, alt yapısının ve uygun çalışma sisteminin oturtulmuş olması gerekmektedir. 2. Laboratuvar malzemelerinin temizliğinin sağlıklı yapılacağı bulaşık yıkama düzenekleri ve kurutmak için etüv sistemi sağlanmış olmalıdır. 3. Laboratuvar kimyasallarının doğru şekilde etiketlenmesi ve depolanması gereklidir. Yanıcı parlayıcı ve zehirli kimyasallar uygun havalandırması olan ve yangın tertibatının bulunduğu ortamlarda saklanmalıdır.  4. Elektrik tesisatının tüm laboratuvardaki alt yapısının kapasiteli, topraklanmış, kesintisiz güç kaynağı ile desteklenmiş olması önemlidir. 5. Laboratuvar ortamının iyi şekilde havalandırılması, uçucu ve solunum yolu tahribatı yapabilen çözgenlerle işlemlerin çeker ocak ortamında yapılması önemlidir. 6. Uçucu ve yanıcı çözgenlerden dolayı, bek alevi gibi alev kaynaklarının sınırlı ve farklı bölümlerde bulunması, yangın söndürme tertibatının kolay ulaşılabilir kısımlara yerleştirilmesi de önemlidir. 7. Mikrobiyal numuneler için kontaminasyonu önleyici tedbirlerin alınması, biyolojik materyaller için özel atık sistemlerinin oluşturulması zorunludur. 8. Tüm bu benzeri kurallar ve planlarla ilgili laboratuvar personelinin bilgilendirilmesi ve kuralların okunabilecek kısımlara asılması zorunludur. Kimyasal ve Biyolojik Zarar Kimyasal maddeler, karsinojenler, korosivler, irritanlar, mutajenler, alerjenler, terotojenler, toksik maddeler olarak özetlenebilir. Kimyasal maddelerle en sık ortaya çıkan hasarlar ise, 1. Yanık ve deri hasarları: Kuvvetli asit ve alkali çözeltiler, formaldehit, hidrojen peroksit, kronik asitlerle oluşan hasarlar sayılabilir. 2. Zehirlenmeler: Ağız, solunum ve deriye temas ile zehirlenmeler söz konusudur. Örnek olarak metil alkol, siyanür bileşikleri, arsenik ve ağır metallerin bileşikleri sayılabilir. 3. Biyolojik zararlar: Çalışılan laboratuvara bağlı olarak canlı zehirleri, gıda toksinleri, kan ürünleri, kültür hücreleri, alerjenler, mikroorganizmalar, rekombinant ürünleri vs. sayılabilir. Burada doz, toksine maruz kalınan süre, bireysel duyarlılık vs. etkilenme derecesini belirler. Kimyasal ve Biyolojik Zararlardan Korunma Yolları Kimyasal zararlardan korunmak için zararlı kimyasalları tanımlayan ayrı etiketleme yapılması ve logo koyulması zorunludur. Zararlı kimyasalın etkisini gideren ilaç veya antidot varsa tanımlanmalıdır. Ağızla pipetleme yapılmaması, koruyucu eldiven, maske, gözlük kullanılması, yavaş ve protokole uygun işlem yapılması, uçucu ve yanıcılar için çeker ocak kullanılması, uçucuların uygun havalandırma yapılan ortamda depolanması, acil müdahale için duş sistemi, ecza dolabı ve yangın söndürme sistemi bulundurulması zorunludur. Biyolojik zarardan korunmada, koruyucu aşılanma, uygun havalandırmalı ortam sağlanması, kontaminasyonu önleyici özel kabin, buzdolabı, etüv ortamı sağlanmalıdır. Yiyecekler laboratuvar ortamından uzak tutulmalıdır. Bakteri ve virüslerin ortamdan uzaklaştırılması için uygun dezenfektanların periyodik uygulanması ve bu süreçlerin laboratuvar yöneticileri tarafından takip edilmesi, gerekli periyodik kontrollerin hastane enfeksiyon komitesi tarafından yapılması gereklidir.  TEHLİKE SEMBOLLERİ Patlayıcı Oksitleyici Yanıcı Toksik Aşındırıcı Kanser yapıcı Çevreye Radyoaktif Sağlığa zararlı zararlı LABORATUVAR GÜVENLİĞİ SEMBOLLERİ Elbise Kırılabilir Isı Biyolojik Kesici Kimyasal güvenliği güvenliği Tehlike Elektrik Yangın Hayvan Patlayıcı Zehirli LABORATUVARDA KULLANILAN ARAÇ - GEREÇLER A. Tüpler Deney Tüpleri: Silindir biçiminde, camdan yapılmış malzemedir. Sıcağa dayanıklı olanlar Jena veya Pyrex camından yapılır. Isıtma ve kaynatma işlemlerinde tüp ¼’den fazla doldurulmamalıdır. Bir deney tüpü ortalama 20 mL sıvı alır. Kantitatif olmayan deneylerde tüpü yarısına kadar doldurmakla 10 mL, dörtte birine kadar doldurmakla 5 mL kadar sıvı alınmış olur. Deney için ayrı bir tavsiyede bulunulmamış ise deneylerde kullanılan sıvıların (ayıraçlar, idrar vb.) toplamı tüpün dörtte birini aşmamalıdır. Uygulama 1. Tüpü ısıtmak için tercihen tahta maşa kullanılır, maşa yoksa tüp başparmakla üstten, işaret ve orta parmakla alttan olmak üzere ağzına yakın bir o yerden yaklaşık olarak 45 ‘lik bir eğimle tutulur. 2. Isıtma işlemi sıvının üst kısımlarına yakın yerden yapılır. 3. Isıtma sırasında tüp, çatlamaması ve sıvının fışkırmaması için, parmaklar arasında yuvarlanır gibi devamlı çevrilmelidir. 4. Tüpün ısıtma işlemi bek ile yapılır. Bek alevi 4 kısımdan oluşur. a) Bu kısımda yanma olayı yoktur. Temperatür düşük olup, yaklaşık % 62 hava içerir. b) a kısmının indirgen uç kısmıdır. Eğer hava yeterse bu uç kısım oluşmaz. c) Esas yanma olayının gerçekleştiği ve en sıcak kısmıdır. d) Alevin ışık vermeyen en uç kısmıdır.Burada oksijen konsantrasyonu fazla olduğundan oksidasyonlar olabilir. Santrifüj tüpleri: Laboratuvarda katı maddeleri sıvılardan ayırmak için kullanılırlar. Santrifüj basıncına karşı dayanıklı camdan yapılmışlardır. Konik ve silindiriktirler. B. Beher: Silindir şeklinde, içindeki sıvının kolay aktarılmasını sağlamak için üst yanında çıkıntısı bulunan, altları düz cam kaplardır. C. Erlen: Ağızları dar, konik cam kaplardır. Hacimleri çeşitlidir. D. Kadehler: Ağızları geniş, dipleri dar taksimatlı cam kaplardır. Genel olarak idrar örneklerinin alınmasında kullanılırlar. E. Ölçü silindirleri: Silindir şeklinde, çeşitli çap ve boyda, taksimatlı cam kaplardır. Kapaklı ve kapaksız olanları da vardır. Bunlara mezür adı da verilir.  F. Huniler: Sıvıların aktarılması, ya da çöken kısımların sıvıdan ayrılması için yapılan süzme işlemLerinde kullanılır. Çapları değişiktir. Süzme işleminde süzgeç kâğıtları kullanılır. Beher Erlen Huni Uygulama 1. Süzme işlemi için uygun büyüklükte ve kare şeklinde bir süzgeç kâğıdı alınır dörde katlanıp çeyrek daire şeklinde kesilir. 2. Bir tarafta bir kat, diğer yanda üç kat olmak üzere huni içine yerleştirilir. 3. İyi bir süzme yapmak için süzgeç kâğıdı huninin kenarlarını aşmamalı, biraz aşağıda kalmalıdır. 4. Sıvı da, süzgeç kağıdının seviyesini geçmemeli, birkaç milimetre daha aşağıda kalmalıdır. G. Kapsüller: Çeşitli büyüklükte, ağızları daha geniş, dip kısımları dar cam veya porselenden yapılmış kaplardır. H. Baget: Karıştırma, sıvı aktarma gibi işlemlerle kullanılan cam çubuklardır. Çeşitli boy ve çapta olurlar. I. Balon joje (Ölçü balonu) : Altı düz, ince kenarlı, boynu dar ve uzun, boyun kısmında bir işaretle belirli hacmi gösteren balonlardır. Çeşitli hacimde olurlar. Ayıraç hazırlamak, bir maddeyi belirli oranda seyreltmek gibi işlemlerde kullanılırlar. Kapsül Balon J. Piset: Gerektiğinde az miktardaki distile su gereksinimini karşılamakta kullanılan plastik kaplardır.  K. Pipetler: Belirli hacimde sıvı almaya yararlar. Cam ve otomatik pipetler kullanılmaktadır. Taksimatlı pipetler: Bunlara düz pipet adı da verilir. 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL ve 25 mL’likleri biyokimya laboratuvarında kullanılır. Bu pipetler maksimum kapasitelerinin altındaki hacimler için de kullanılabilir. Büllü pipetler: Bunların orta kısımları şişkin, uç kısımları ise ince ve uzundur. Üst kısmında bir çizgi bulunur. Pipetin en uç kısmı ile bu çizgi arasının kaç mL sıvı aldığı bülün üzerinde yazılıdır. Bazı büllü pipetlerde ise alt uçta da bir çizgi bulunur. O zaman pipetin üzerinde yazılı rakam bu iki çizgi arasındaki sıvının miktarı kadardır. Büllü pipetlerin 1 mL, 2 mL, 5 mL ve 25 mL’likleri çok kullanılır. Bir büllü pipet kaç mL’lik ise o kadar mL sıvı hassas olarak alınabilir. Üzerlerinde ayrıca taksimat bulunmadığından daha az veya daha çok almak mümkün değildir. Bu pipetler taksimatlı pipetlere göre daha hassastır. Çizginin bulunduğu kısım oldukça dar olduğundan çok az sıvı ile bu kısımda büyük seviye oynamaları meydana gelir. Uygulama 1. Pipetin uç kısmı alınacak sıvıya daldırılır. Bu esnada pipet üst uca yakın bir yerinden sağ elin başparmağı ile orta parmak arasında tutulmalı, işaret parmağı ise sıvı çekildikten sonra akmaması için üst ucu tıkamaya hazır şekilde serbest bulundurmalıdır. 2. Bu durumda artık pipet sıvıyı çekmeye hazırdır. 3. Üst uçtan sıvı pipetin en üst taksimatını aşıncaya kadar pipet dikkatle emilir. İşaret parmağı ile üst kısım kapatılır, pipet sıvı içinden çekilir. 4. İşaret parmağının basıncı hafifletilerek fazla sıvının üst taksimat hizasına gelmesi sağlanır. 5. Uç kısım süzgeç kağıdı ile kurulanır. 1. Pipetteki sıvı, işaret parmağının basıncı hafifçe kaldırılarak boşaltılır. Bu esnada işaret parmağı tamamen kaldırılmamalı, sıvı pipetten yavaş yavaş akmalıdır. Otomatik pipetler: Otomatik pipetler, günümüzde laboratuvarlarda sıklıkla kullanılan ve istenilen hacmi ayarlama olanağı veren pipet türleridir. Pipetin üst kısmında bulunan bir piston aracılığıyla sıvı alınıp geri verilir. Pipetin ucuna takılan plastik uçlar ise değiştirilebilir ve bir defa kullanılıp atılır. Bu pipetler, özellikle ardarda yapılan pipetleme ve seyreltme çalışmalarında, kullanımlarının pratikliği, hassasiyeti ve hızlı çalışmayı sağlamaları nedeniyle tercih edilmektedir. L. Biüretler: Titrasyon için kullanılır. Büretlerin içine konulan çözeltiler genel olarak normalitesi bilinen çözeltilerdir. Uygulama 1. Büret önce sıfır çizgisini aşacak şekilde doldurulur. 2. Alttaki musluk kullanılarak çözelti içinde hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir. 3. Alt musluk hafifçe açılarak sıvının üst yüzeyinin konkavlığı (çözelti renkli ise konveksliği) sıfır çizgisine teğet olacak şekilde yapılmalıdır. 4. Sağ elini kullananlar sol elin başparmağı ile musluğu önden, yine sol elinin işaret ve orta parmaklarının arası ile de arkadan tutmalıdır. 5. Musluk, sıvının damla damla akması için hafifçe açılırken sağ el ile boyun kısmından serbestçe tutulan titrasyon kabı dikkatle ve dairesel hareketlerle çalkalanır. M. Portüp: Deney tüplerinin konulmasında kullanılan tahta, metal veya plastikten yapılmış taşıyıcılardır. N. Süpor: Büret ve diğer bazı cam eşyaların tutturulması için kullanılan aletlerdir. O. Bek: Yanıcı gazlarla çalışan ve ısıtmayı sağlayan aletlerdir. Alt taraflarında bulunan metal bir disk sağa sola çevrilerek gazın çok veya az havalı yanması ayarlanabilir. Deney tüpü, alevin ısıtıcı bölgesi olan üst kısmında tutulur. Otomotik Pipetler Biüretler Bek P. Havanlar: Katı maddeleri ufaltıp toz haline getirmeye yarayan porselen veya cam kaplardır. R. Spatül: Katı halde bulunan maddeleri almak için kullanılan metal veya porselenden yapılmış gereçlerdir. S. Maşalar: Isıtılacak bir kabı emniyetle tutmaya yarayan metal veya tahtadan yapılmış gereçlerdir. T. Fırçalar: Tüp ve benzeri cam eşyaların temizliği için kullanılırlar. Dereceli silender LABORATUVARDA KULLANILAN  ÇÖZELTİLER Bir maddenin sıvıda çözülmesi ile elde edilen homojen karışımlardır. Çözünen madde ve çözücü birlikte çözeltiyi oluştururlar. Çözünen madde ve çözücü kimyasal yapıları bakımından ne kadar çok benzerlik gösterirlerse çözünürlük o kadar artar. Serum, plazma, idrar, beyin omurilik sıvısı, tükürük, ter, vb. sıvılar biyolojik çözeltilerdir. Biyolojik sıvılarda çözünmüş olan maddelerin niteleyici ve niceleyici analizlerinde kimyasal çözeltiler kullanılır. Konsantrasyon, doygunluk, kolligatif özellikler (osmotik basınç, donma noktası, kaynama noktası ve buhar basıncı) redoks potansiyeli, iletkenlik, yoğunluk, pH ve iyonik kuvvet çözeltilerin temel özellikleridir. Süspansiyon: Heterojen (iki fazlı) karışımlardır. Süspansiyon çözelti değildir, fazların yoğunlukları farklı olduğundan birbirinden kolaylıkla ayrılabilir (Su-tebeşir). Kolloid: Parçacıklar süspansiyondaki kadar büyük değildir. Kolloidler çözelti değildir fakat dışarıdan bakıldığında tek fazlı homojen karışım olarak görülür. Fazlar fiziksel yollarla birbirinden ayrılamazlar, ancak mikroskopik inceleme ile ayırt edilebilir. Konsantrasyon A. Yüzde Konsantrasyon 1. Hacimde ağırlıkça yüzde, % w/v (Ağırlık/Hacim): Çözünen madde katı, çözücü sıvı olduğunda çözelti konsantrasyonu bu şekilde belirtilir. Çözeltinin l00 mL’sinde 5 g çözünmüş madde bulunuyor ise yüzde konsantrasyonu %5 w/v dir. 2. Ağırlıkça yüzde, % w/w (Ağırlık/Ağırlık): Çözeltinin l00 gramında 5 g çözünmüş madde bulunuyor ise konsantrasyon % 5 w/w dir. 3. Hacimce yüzde, % v/v (Hacim/Hacim): Çözünen madde ve çözücünün her ikisi de sıvı olduğunda çözeltinin konsantrasyonu bu şekilde belirtilir. Çözeltinin l00 mL’sinde 5 mL çözünmüş madde bulunuyor ise konsantrasyonu %5 v/v’dir. B. Formalite: Bir litre çözücüdeki çözülmüş formül-gram sayısıdır C. Molar Konsantrasyon (Molarite): Atom, molekül veya iyonlar stokiometrik oranlarda reaksiyonlaştıklarından ve birçok kimyasal reaksiyon çözeltide gerçekleştiğinden çözünen partikül sayısını belirtmek üzere molar konsantrasyon terimi kullanılır. Çözeltinin l L’sinde l molekül gram (mol) çözünmüş madde bulunuyor ise çözelti konsantrasyonu l molardır. l M veya l mol/L olarak belirtilir. Bu çözeltinin l mL.’sinde l mmol çözünmüş madde bulunur (l mmol/mL). Bazı maddeler hidrate şekilde bulunur. Bu maddelerin molekül ağırlıkları hesaplanırken hidrat suyu da dikkate alınır. Çözelti miktarı hacimce belirtildiğinden molarite temperatürün bir fonksiyonudur. o o Örneğin 20 C ‘de hazırlanmış olan bir çözeltinin 25 C ‘da kullanılması durumunda o çözeltinin molaritesi 20 C daki molaritesinden daha düşüktür. D. Normal Konsantrasyon (Normalite): Çözeltinin l litresinde eşdeğer gram çözünmüş madde bulunuyor ise çözeltinin konsantrasyonu l normaldir ve l N olarak belirtilir. Eşdeğer gram molekül gram’ın etki değerine bölünmesi ile elde edilir. Etki değeri, maddenin çözeltinin kullanılacağı ortamdaki kimyasal davranışına göre değişir. + Örneğin HCl’in etki değeri bir proton (H ) verdiği için l’dir. Benzer şekilde NaOH’in etki değeri bir proton aldığı için l’dir. Redoks aktif maddelerin etki değerleri, alınan/verilen elektron sayılarına eşittir. Örneğin oksidan bir madde olan KMnO4 ‘ın etki değeri, 5 veya 3 olabilir. Eşdeğer gram sayısı = Molekül ağırlığı / Tesir Değerliliği Normalite = Etki değerliği x Molarite Eşdeğer gram esas alınarak hazırlanan ve konsantrasyonu “normalite“ cinsinden belirtilen çözeltiler, genellikle volumetrik analizde kullanılırlar. E. Molal Konsantrasyon (Molalite) ; Birçok uygulama için, temperatüre bağlı olarak değişkenlik göstermeyen bir konsantrasyon terimi kullanılmalıdır. Çözünen madde ve çözücünün her ikisinin de miktarları kütle olarak belirtilmelidir. Bu doğrultuda kullanılan konsantrasyon terimi molalitedir. Çözücünün l kilogramında l molekül gram (mol) çözünmüş madde bulunuyor ise çözelti konsantrasyonu l molaldir (l mol/kg ). F. Osmolar ve Osmolal Konsantrasyon (Osmolarite ve Osmolalite) Çözünmüş olan osmotik aktif birimLerin miktarı osmol cinsinden belirtilir. Eğer çözeltinin miktarı hacimce (L) belirtilirse konsantrasyon osmolarite, çözücünün miktarı kütle (kg )olarak belirtilirse konsantrasyon osmolalitedir. Osmolarite =osmol / L Osmolalite = osmol / kg l mol glukoz l L çözeltide çözünürse bu çözeltinin osmolaritesi l’ dir. 1 molekül gram NaCl l L çözeltide çözünürse bu çözeltinin osmolaritesi 2’ dir. Biyolojik örneklerde çözünen madde miktarı çok az olduğunda osmolalite ve osmolarite farklılığı ihmal edilebilecek düzeydedir. Sağlıklı erişkin bireylerde plazma osmolalitesi 285-319 mOsm/kg.H2O, idrar osmolalitesi, normal besin ve sıvı alım + - - koşullarında, 500-850 mOsm/kg H2O arasında değişir. Na , Cl ve HCO3 elektrolitleri plazma osmolalitesinin % 92’sinden daha fazlasını, diğer elektrolitler, serum proteinleri, glukoz ve üre ise osmolalitenin geri kalan % 8’ ini oluştururlar. G. ppm, (İng.: Parts per million) milyonda bir birime verilen isimdir. Herhangi bir karışımda toplam madde miktarının milyonda 1 birimlik maddesine 1 ppm denir. Derişim birimi olarak bilinir. 2000 g A çözeltisi içinde 2 mg B maddesi varsa; A içinde 1 ppm değerinde B maddesi bulunuyordur denir. Ayrıca şu yol ile kolayca hesap yapılabilir; pph - Yüzde bir ppm - (mg çözünen/kg veya litre çözelti); Bir litrede 1 mg çözünen madde miktarı olarak tanımlanır. Çözücü daima sudur, aksi takdirde yoğunluğun hesaplanması gerekir. ) ppb – (µg çözünen / kg veya litre çözelti parts per billion (milyarda bir). Bir litrede veya bir kiloda erimiş maddenin µg olarak miktarıdır. ppt : Binde bir (mili); (g çözünen / kg veya litre çözelti); Bir litrede 1 g çözünen madde miktarı olarak tanımlanır. E. Doymuş çözeltiler: Doygunluk, çözeltideki madde konsantrasyonu hakkında bilgi veren bir terimdir. Maddenin çözünürlük katsayısı temperatür ve başka iyonların varlığından etkilendiğinden çözeltinin doygunluk derecesi de bu etkenlere bağlı olarak değişir. Çözeltinin doygunluk derecesini seyreltik, derişik, doymuş ve aşırı doymuş terimLeri ile ifade edilir. Çözünmüş madde miktarı az ise çözelti seyreltik, çok ise derişiktir. Hazırlanabilecek en derişik HCl çözeltisi % 37, H2SO4 % 97, HNO3 % 70, NH3 ise % 25’ lik tir. Eğer çözünen madde çözeltide sabit sıcaklıkta çözünür olduğu konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonlarda bulunuyorsa bu durumda çözelti maddeyi çözünmemiş şekilde içerir- çözelti doymuş çözeltidir. Aşırı doymuş çözeltide madde konsantrasyonu doymuş çözeltide olduğundan daha fazladır. Aşırı doymuş çözelti termodinamik bakımdan kararsızdır, maddenin tek bir kristalinin katılması veya karıştırma sonucunda çözelti kristallenir. Kolligatif özellikler Osmotik basınç, donma noktası, kaynama noktası ve buhar basıncı çözeltilerin kolligatif özellikleri olarak tanımlanır. Bu özellikler çözeltide çözünmüş bulunan çeşitli moleküllerin rölatif sayılarına bağlı olarak değişir. Osmotik basınç, farklı osmolaliteli kompartımanlar arasındaki yarı geçirgen membrandan çözücü geçişini ve sonuçta osmotik dengenin kurulmasını sağlayan basınç olarak tanımlanır. Seyreltik bir çözeltinin osmotik basıncı çözeltideki moleküllerin konsantrasyonları ile orantılıdır. Bir çözücüde bir madde çözündüğünde donma noktası düşer, kaynama noktası yükselir, buhar basıncı azalır ve osmotik basınç artar. Osmolalitenin ölçümünde donma noktası ve buhar basıncındaki azalmadan yararlanılır. Çözeltilerin seyreltilmesi Derişik çözeltiler, çözücü ile seyreltilerek, istenilen konsantrasyonda seyreltik çözelti elde edilir. Çözeltiler seyreltilirken V1 x C1 = V2 x C2 eşitliğinden faydalanılır. V1 ve C1 : Derişik çözeltinin hacmi ve konsantrasyonu ; V2 ve C2 : Hazırlanması istenen seyreltik çözeltinin hacmi ve konsantrasyonu ise C1 konsantrasyonlu çözeltinin hacmi çözücü ilavesi ile V1’den V2’e arttırılarak, konsantrasyon C1’den C2’e azaltılır. 1/100 seyreltme için çözeltiden 1 birim alınarak 100 birime tamamlanır. Seri seyreltmeler Problem 1 % 60’lik TCA (Triklor asetik asit) çözeltisinden 240 cc %20’lik TCA nasıl hazırlanır? Yanıt: V1 x 60 = 240 x 20 V1 = (240 x 20)/ 60 = 80 mL 80mL %60’lık çözeltiden alınır, 240 mL’ye su ile tamamlanır. Çözeltinin daha derişik hale getirilmesi Problem 2  200 mL 0,3M HCL çözeltisinden 0,5 M çözelti oluşturmak için1M çözeltiden ne kadar kullanılmalıdır? Yanıt: 0,3M HCl /200mL çözeltisine 80mL 1M HCl eklendiğinde 280 mL 0,5M HCl elde edilir. Problemler 1) l00mL 0,09 g glukoz içeren çözeltiyi hazırlayınız. 2) l00mL % l0 HCl (v/v) içeren çözeltiyi hazırlayınız. 3) l00 mL %l0 HCl (w/v) içeren çözeltiyi hazırlayınız. 4) l55 mmol/L HCl çözeltisini hazırlayınız. 5) 0,l5 mol/L NaCl çözeltisini hazırlayınız 6) 0,l mol/L CuSO çözeltisini hazırlayınız. 4 7) 4 N NH çözeltisini hazırlayınız. 3 8) 0,1 N H SO çözeltisini hazırlayınız 2 4 Yanıtlar 1. 0,09 g (90 mg) glukoz tartılır, distile suda çözülerek l00 mL.lik balon jojeye aktarılır ve hacim l00mL’e distile su ile tamamlanır. % 0,09 ( w/v) olarak hazırlanan bu çözelti: 0,09 x l0/l80 mol/ L veya 0,09xl0xl03 /l80 mmol/L dir. 2. l0 mL derişik HCl ‘den alınır ve içinde bir miktar distile su bulunan l00 mL.lik balon jojeye aktarılır. Distile su ile son hacmine tamamlanır. 3. Derişik HCl çözeltisinin konsantrasyonu= % 37 (w/w) ve yoğunluğu= l,l9g/mL a. l00 g derişik HCl çözeltisi l00/l,l9 = 84 mL’dir. b. 84 mL derişik HCl çözeltisi 37 g HCl içerir. c. l0 g HCl ® l0x84/37=22,7 mL derişik HCl çözeltisinde bulunur. d. 22,7 mL derişik HCl ‘den alınır ve içinde bir miktar distile su bulunan l00 mL'lik balon jojeye aktarılır. Distile su ile son hacmine tamamlanır. 4. l55 mmol/L =0,l55mol/L=0,l55 M a. 0,l55M =36,5 x 0,l55= 5,657 g b. 5,657 g HCl ® 5,657 x 84/ 37 = l2,84 mL derişik HCl çözeltisinde bulunur. c. 12,84 mL derişik HCl ‘den alınır ve içinde bir miktar distile su bulunan 1L’lik balon jojeye aktarılır. Distile su ile hacmine tamamlanır. Pariyetal hücreler 155 mmol/L HCl salgılar. Bu salgının pH’ı yaklaşık 0,9 olup arteryal kan pH’ından 6,5 birim daha düşüktür. Paryietal hücre salgısı  + midede mukus, tükrük, besin maddeleri ile karıştığında sıvının H iyon konsantrasyonu 40 mmol/L ‘e düşer, pH’ı ise 1,5-3,5’a çıkar 5. NaCl’ün molekül ağırlığı=58,5g ; 0,l5 mol NaCl 0,l5 x 58,5 = 9 g’ dır. 9 g NaCl tartılır, distile suda çözülerek, çözeltinin hacmi bir litreye distile su ile tamamlanır.Konsantrasyonu 0,l5 mol/L (l50 mmol/L ) veya % 0,9 (w/v) olan NaCl çözeltisi biyokimya laboratuvarlarında “serum fizyolojik olarak adlandırılır. Bu çözeltinin osmotik basıncı serumun osmotik basıncına eşittir (izotonik). Eritrositleri hemoliz etmeden yıkamak için, serum veya plazma örneklerini seyreltmek için genellikle serum fizyolojik kullanılır. 6. CuSO 4 kristal yapısında hidrate şekilde bulunur: CuSO4.5H2O. CuSO4.5H2O’nün molekül ağırlığı 249.5 g dır. 24,95 g CuSO4.5H2O tartılır ve distile su ile litreye tamamlanır 7. Derişik NH3 çözeltisinin konsantrasyonu %25 (w/w) ve yoğunluğu d=0.91 g/mL dir. 25 g NH3, 100/0,91=109,91 mL derişik NH3 çözeltisinde bulunur. 1 Eşdeğer gram NH3 = 17 g NH3 4 Eşdeğer gram NH3 = 68 g NH3 68 x109,91 / 25= 299 mL NH3 alınır ve içinde bir miktar distile su bulunan l000 mL.lik balon jojeye aktarılır. Distile su ile son hacmine Tamamlanır. 8. Derişik H SO 2 4 çözeltisinin konsantrasyonu %97 (w/w) ve yoğunluğu d= 1,84 g/mL dir. H2SO4 ün eşdeğer gramı = molekül gram / 2 = 98 /2 = 49 g dir. 0,1 N H2 SO4 çözeltisinin 1 L’sinde 4,9 g H2SO4 bulunmalıdır. 97 g H2SO4 100/1,84 = 54,3 mL derişik H2SO4 çözeltisinde bulunur. 4.9 g H2SO4 → 4,9 x 54,3 / 97 = 2,7 mL derişik H2SO4 çözeltisinde bulunur. 2,7 mL derişik H2SO4 çözeltisinden alınır ve içinde bir miktar distile su bulunan l000 mL’lik balon jojeye aktarılır. Distile su ile son hacmine tamamlanır LABORATUVARDA KULLANILAN CAM MALZEMENİN TEMİZLENMESİ Tüplerin temizlenmesi 1. Tüp içeriği, açık musluk altında tüp fırçası da kullanılarak boşaltılır. 2. Tüpler %5’lik sodyum karbonat çözeltisi içine konur ve 25 dakika süreyle kaynatılır. 3. Tüpler, kaynatıldıkları kaptan musluk suyu geçirmek suretiyle soğutulur. 4. Tüpler, musluk suyu ve fırça ile iyice yıkanır. 5. Tüpler, % 2-5’lik HCl çözeltisinde 15 dakika bırakılır. 6. Tüpler, önce musluk suyu ile daha sonra distile su ile iyice durulanır. 7. Tüpler, üzerlerindeki su süzülmeye bırakılır ve daha sonra bir etüve konularak kurutulur.  Sodyum, potasyum, kalsiyum, kurşun, cıva gibi metal iyonlarının miktar tayinlerinde kullanılan cam malzeme iyice temizlendikten sonra %20’lik nitrik asit çözeltisinde 12-24 saat bırakılır; 3-4 defa distile su ile yıkanır; sonra sıcak etüve konularak kurutulur. Pipetlerin temizlenmesi 1. Pipetler, kullanıldıktan sonra serum, kan ve kimyasal çözelti kalıntılarının pipet içinde kurumaması için hemen musluk suyu ile dolu bir silindire konulurlar. 2. İçinde kan pıhtısı bulunan pipetler, %10’luk potasyum hidroksit çözeltisi içinde 12 saat, yağlı pipetler, bikromat temizleme çözeltisinde 12-24 saat bekletilir. 3. Pipetler, içlerinden musluk suyu geçirmek suretiyle iyice temizlenirler. Eğer otomatik pipet yıkayıcı varsa pipetler otomatik yıkayıcının taşıyıcısına boşaltma uçları yukarı gelecek şekilde konur ve pipet taşıyıcı da yıkayıcı kaba konur; bundan sonra musluk suyunun akışı yıkayıcı saatte 8 defa dolup boşalacak şekilde ayarlanır; 3-4 saat sonra pipet taşıyıcısı çıkarılır. 4. Pipetler distile su ile 3 defa durulanır. 5. Pipetlerin üzerlerindeki suyun akması için en az 10 dakika beklenir. 6. Pipetler, 90 C’lik bir etüvde yaklaşık 1 saat bırakılarak kurutulur. o Pipetler, kullanıldıktan sonra kan, serum ve kimyasal çözelti kalıntılarının içerisinde kurumaması için hemen musluk suyu ile dolu bir mezüre konulmalıdır. İçerisinde kan pıhtısı, serum artığı kalan cam malzemeler %10’luk potasyum hidroksit çözeltisi içinde 12 saat, yağ ve protein artığı kalan cam malzemeler, bikromat temizleme çözeltisinde 12-24 saat bekletilir. Sodyum, potasyum, kalsiyum, kursun, cıva gibi metal iyonlarının miktar tayinlerinde kullanılan cam malzeme temizlendikten sonra %20’lik nitrik asit çözeltisinde 12-24 saat bekletildikten sonra 3-4 defa saf su ile yıkanır, sonra sıcak etüve konularak kurutulur. Bikromat Temizleme Çözeltisinin Hazırlanması 1. Isıya dayanıklı 1000 mL’lik bir cam balona 500 mL su konur. 2. Cam balondaki su üzerine 250 mL konsantre sülfürik asit devamlı karıştırarak eklenir. 3. Cam balonun ağzı bir beherle kapatılır ve soğuyuncaya kadar üzerinden soğuk çeşme suyu geçirilir. 4. Balondaki karışıma 100 g potasyum bikromat eklenir ve tamamen çözülünceye kadar karıştırılır. 5. Su ile hacim 1000 mL’ye tamamlanır. STERİLİZASYON ALETLERİ Otoklav:Basınçlı buharla sterilizasyon işleminde kullanılan aletlerdir. Havagazı, petrol veya elektrikle çalışan ısı kaynağı ve bir kazandan ibarettir. Kapağı hava sızdırmaz. Sterilize olacak madde uygun şekilde ambalajlandıktan sonra, kapasitesine göre kazana su konur ve basınç ile zaman ayarı yapılarak uygulanmaktadır. Pasteur Fırını :Altındaki ısıtıcılar ile içinde yüksek ısıda kuru sıcak hava meydana gelir. Bu fırında yüksek ısıda bozulmayan aletler sterilize edilir. Kuru cam malzemenin sterilizasyonu için 175 °C de 1 saat süre ile bekletmek gereklidir. Filtreler:Isı, kimyasal yolla ve ışınlandırma ile steril edilemeyen çözeltilerin, sıvıların ve besiyerlerinin ayrılmasında kullanılır. (Berkefel, Chambarland, Pasteur, Seiltz ve Milipor filtreler) Cam pamuğu, toprak, cam tozu, porselen filtreler vardır. Su banyosu : (Benmari) Yuvarlak veya dört köse madeni bir kaptır. Elektrik ya da havagazıyla ısıtılır. Sürekli sabit ısıda tutma işleminde kullanılır. Farklı amaçlar için de kullanılmaktadır. U.V.Lamba : Ultraviyole ısınları ile sterilizasyonu sağlamada kullanılmaktadır. Sıvı maddelerin, malzemenin ve havanın sterilizasyonunda ve mutasyon (canlılardaki kalıtsal değişim) oluşturmak için kullanılmaktadır.  KARBOHİDRATLARIN GENEL REAKSİYONLARI Prof.Dr. Emel ZENGİN ULAKOĞLU Prof.Dr. Özlem BALCI EKMEKÇİ Öğrenim Hedefleri Karbonhidratları sınıflandırabilmeli Karbonhidratlar üzerine derişik asitlerin etkisini tanımlayabilmeli Bir çözelti içerisinde monosakkarid, ketoz ve pentozların varlıklarını deneyler ile gösterebilmeli Karbonhidratların aldehid ve keton gruplarının kondansasyon reaksiyonlarının prensiplerini tanımlayabilmeli Monosakkaridleri disakkaridlerden ayırt edebilmeli Karbonhidratların indirgeyici özelliğini gösteren deneyleri uygulayabilmeli Genel Bilgiler Karbohidratlar, yapılarında potansiyel olarak aktif aldehid ya da keton grupları içeren polihidroksialkoller olup genel formülleri (CH2O)n şeklindedir. Polihidroksialdehidler aldoz, polihidroksiketonlar ise ketoz olarak adlandırılmaktadır. Karbohidratlar başlıca dört grupta sınıflandırılırlar; Monosakkaridler: En basit ve hidroliz edilemeyen şekerlerdir. Karbon sayılarına ve içerdikleri fonksiyonel gruba (aldehid ya da keton) göre isimlendirilirler. Aldoz Ketoz Trioz (3C) Gliseraldehid Dihidroksiaseton Tetroz (4C) Eritroz Eritrüloz Pentoz (5C) Riboz, Ksiloz Ribüloz, Ksilüloz Heksoz (6C) Glukoz , Galaktoz, Mannoz Fruktoz Heptoz (7C) Sedoheptüloz Disakkaridler: İki monosakkarid biriminin birbirine farklı pozisyonlarda glikozid bağlarıyla bağlanması ile oluşan, klinik yönden önemli şekerlerdir. Hidroliz edildiklerinde kendilerini oluşturan monosakkaridlere ayrılırlar. Maltoz = Glukoz + Glukoz ( a 1® 4)  Laktoz ® 4) = Galaktoz + Glukoz (β1 Sakkaroz = Glukoz + Fruktoz (β1 ® 2) Sellobioz = Glukoz + Glukoz (β1 ® 4) İzomaltoz = Glukoz + Glukoz (a1 ® 6) Oligosakkaridler: 3-10 monosakkarid biriminden oluşurlar. Polisakkaridler: 10’dan daha çok sayıda monosakkarid biriminin birleşmesiyle oluşan karbohidratlardır. Yapılarında tek tip monosakkarid birimi içerenlere homopolisakkaridler (glikojen, nişasta, sellüloz, inülin), farklı tipte monosakkaridleri ve türevlerini bulunduranlara ise heteropolisakkaridler (heparin, hiyalüronik asit, kondroitin sülfat) adı verilir. Polisakkaridler hidroliz edildiklerinde kendilerini oluşturan monasakkarid birimlerine ayrılırlar. KARBOHİDRATLARA DERİŞİK ASİTLERİN ETKİSİ (FURFURAL OLUŞUMU Karbohidratlar, oksitleyici olmayan mineral asitlerle reaksiyona girdiklerinde üç molekül su kaybederek dehidrate olurlar ve furfural ya da hidroksimetil furfural ismi verilen bileşikler meydana getirirler. Bu türevler, çeşitli polifenollerle kondanse olarak renkli bileşikler oluştururlar. Bu renk reaksiyonları ile bir çözeltide bulunan karbohidratların tanı ve miktarlarının belirlenmesi mümkün olabilmektedir. DENEY-1 MOLISH DENEYI Prensip: Derişik H2SO4 etkisiyle meydana gelen furfural bileşiğinin alfa-naftol ile birleşerek renk oluşturması temeline dayanır. Bu deney genel karbohidrat reaksiyonu olarak bilinir. Özgül bir test olmasa da, negatif sonuç ortamda karbohidrat bulunmadığını gösterir. Karbohidrat ister serbest, isterse diğer organik maddelerle (örneğin proteinlerle) birleşik durumda bulunsun, bu reaksiyon karbohidrat içeren maddelerle pozitif sonuç verir. Karakteristik olan pozitif renk, kırmızı menekşe rengidir. Dört ve dörtten fazla karbon içeren monasakkaridler (glukoz, arabinoz, galaktoz, mannoz vb.), disakkaridler (sakkaroz, laktoz, maltoz vb.) ve polisakkaridler (glikojen, nişasta vb.) pozitif Molish deneyi verirler. Dörtten az karbon içeren monosakkaridlerle, türev monosakkaridlerden amino şekerler, bunlardan türeyen polisakkaridler ve dezoksipentoz bu reaksiyonu vermez ve idrarda şeker aranması için kullanılmazlar. Ayıraçlar α-naftol ayıracı (%10): 10g α-naftol 100 mL’lik alkolde (%95) çözülerek hazırlanır. Glukoz, laktoz, nişasta çözeltileri (%1) Derişik H SO2 4 Deneyin Yapılışı 1. Bir tüpe 2-3 mL şeker çözeltisi konur 2. Üzerine 2-3 damla α-naftol ayıracı katılarak iyice çalkalanır. 3. Bundan sonra tüp eğilerek kenarından, iki sıvı tabaka yapacak şekilde 2 mL kadar derişik H2SO4 sızdırılır.  4. İki sıvının dokunma yüzeyinde kırmızı menekşe renkli bir halkanın görülmesi reaksiyonun pozitif olduğunu gösterir. DENEY-2 SELİWANOFF DENEYİ Prensip: Ketozlara özgü bir deneydir. Ketozların HCI etkisiyle 4-hidroksimetil furfural oluşturması ve rezorsin ilavesi ile kırmızı renkli bir bileşik meydana getirmesi esasına dayanır. Ketoheksozlar, sıcakta HCI etkisi ile aldoheksozlara göre daha hızlı bir şekilde dehidrate olarak hidroksimetil furfural oluştururlar. Bu nedenle ketoheksozlar, aldoheksozlara göre daha hızlı renk oluşumuna neden olurlar. Ayıraçlar Glukoz çözeltisi (%1) Fruktoz çözeltisi (%1) Derişik HCI Katı rezorsin Deneyin Yapılışı 1. 5'er mL fruktoz ve glukoz çözeltileri üzerine 1’er mL derişik HCI konularak karıştırılır. 2. Kaynar su banyosunda 2-3 dakika bırakılır. 3. Sonra üzerine spatülle az miktarda rezorsin katılır. 4. Fruktozlu tüpte kırmızı bir renk oluşuncaya kadar kaynar su banyosunda tutulur. 5. Aynı koşullarda glukozlu tüpte kırmızı renk görülmez. Seliwanoff deneyi sakkaroz çözeltisi ile yapılırsa, sakkaroz hidroklorik asitle sıcakta kolayca hidroliz olarak fruktoz açığa çıktığı için pozitif sonuç alınır. DENEY-3 BIAL DENEYI Prensip: Pentozlara özgü bir deneydir. Derişik HCI etkisiyle oluşan bozulma ürünlerinin orsinol ile birleşmesiyle renkli bileşiklerin oluşması esasına dayanır. Ayıraçlar Bial ayıracı: 2 g orsinol (3,5 dihidroksitolüen) 1000 mL derişik HCI içinde çözülür ve üzerine 2,5 mL FeCI3 (%10) katılarak hazırlanılır. Deneyin Yapılışı 1. Bir deney tüpüne 5 mL Bial ayıracı, üzerine 2 mL pentoz çözeltisi konur. 2. Kaynayıncaya kadar dikkatle ısıtılır. Soğutulur. 3. Çözeltide gözlenen yeşil renk deneyin pozitif olduğunu gösterir.  KARBOHIDRATLARDAKI ALDEHİD VE KETON GRUPLARININ DERİŞİK ALKALİ VE ISI ETKİSİYLE KONDANSASYONU (REÇİNELEŞME) DENEY-4 - MOORE DENEYİ Prensip: Isı etkisiyle alkali ortamda glukoz ve fruktoz gibi şekerlerin serbest aldehid ve keton gruplarının birleşmesiyle oluşan yüksek molekül ağırlıklı polimer yapıdaki maddelerin renk değişikliğine neden olması esasına dayanır. Farklı tondaki koyu renkler ve karamel kokusu birleşme sırasında bazı moleküllerin parçalanmasından ileri gelir. Fruktoz ve glukozla Moore deneyi çok hızlı ve şiddetli pozitif olduğu halde pentoz, maltoz ve laktoz ile yapıldığında daha yavaş ve hafif bir renk oluşur. İndirgen olmayan disakkaridler ve polisakkaridler bu deney ile pozitif reaksiyon vermezler. Ayıraçlar Glukoz çözeltisi %1 Fruktoz çözeltisi %1 NaOH (% 40) Deneyin Yapılışı 1. Bir deney tüpüne bir miktar şeker cözeltisi konur, üzerine yarısı kadar derişik alkali katılarak iyice karıştırılır. 2. Tüp üst kısmından iyice kaynatılır. 3. Çözeltinin renginin önce sarardığı sonra koyulaştığı, kaynatma sürdürüldüğünde ise rengin kahverengi hatta siyaha döndüğü görülür. 4. Bu sırada şekerin karamelleşmesinden ileri gelen karamel kokusu da duyulur. Bu koku asit katılmasıyla daha da kuvvetlenir. KARBOHİDRATLARDAKİ ALDEHİD VE KETON GRUPLARININ FENILHİDRAZİNLE REAKSIYONU (OZAZON OLUŞUMU) DENEY-5 Prensip: Serbest aldehid ve keton grubu taşıyan şekerler, fenilhidrazinle aralarından bir su molekülü çıkarak birleşirler. Bu birleşme şekerin hem birinci hem de ikinci karbonları arasında olur. Moleküle bir mol fenilhidrazin girmesiyle hidrazon, üç mol fenilhidrazin girmesiyle ozazon oluşur. Ozazonların kristal şekilleri ve renkleri bazı şekerler için tipiktir. Ayrıca kristallerin erime noktaları da farklıdır. Böylece şekerlerin türü belirtilebilir ve birbirlerinden ayırt edilmesi sağlanır. Şekere bir molekül fenilhidrazinin girişi ile meydana gelen hidrazonlar renksizdir ve suda kolay çözünürler. Tanı bakımından önemsizdirler. İkinci molekül fenilhidrazinin girişi aldozlarda 2. karbonu, fruktozda 1. karbonu oksitleyerek keton grubu oluşturur. Bundan sonra şekere bir molekül fenilhidrazin daha bağlanarak ozazonlar meydana gelir. Bunlar suda çözünmezler. Ozazon oluşumu için toplam olarak üç molekül fenilhidrazin reaksiyona girmektedir. Ayıraçlar Katı fenilhidrazin klorhidrat  Katı sodyum-asetat Asetik asit (%30) Glukozlu veya laktozlu örnek %1 Deneyin Yapılışı 1. Bir miktar örnek alınır, damla damla asetik asit katılarak asitlendirilir. 2. Ayrı bir tüp içine 1cm kalınlığında katı sodyum-asetat, onun üzerine 1cm kalınlığında katı fenilhidrazin klorhidrat konur. 3. Bunun üzerine tüpün yarısına kadar asitlendirilmiş örnek katılarak ısıtılır ve katı maddeler eritildikten sonra 30 dakika kaynar su banyosunda tutulur. 4. Tüp sudan çıkarılarak soğumaya bırakılır. 5. Dipte toplanan kristallerden alınan örnekler mikroskopta incelenir. Bu deney çok duyarlı olduğundan şekerlerin türünü ayırt etmek amacıyla yapılır. Örneğin, idrarda indirgen bir şekerin glukoz mu yoksa laktoz mu olduğu bu yolla saptanabilir. Glukozazon kristalleri yelpaze şeklinde ya da çam dalları görünümünde ince iğneler; laktozazon kristalleri ise ortaları koyu kahverenginde, saçakları açık ve parlak iğneler şeklinde görünürler. Ozazon kristallerinin erime noktalarının belirtimi şekerlerin birbirlerinden ayırt edilmesinde daha yararlı olur. Ozazonların erime noktaları aşağıda gösterilmiştir. Glukozazon.......................... 205 Laktazazon........................... 203 Galaktozazon....................... 188 Maltozazon.......................... 202-208 Çeşitli pentozazonlar........... 165-167 MONOSAKKARİDLERIN DİSAKKARİDLERDEN AYRILMASI DENEY-6- BARFOED DENEYI Prensip: Bu deney, monosakkaridlerin, disakkaridlerden ayırt edilmesine olanak sağlar. Hafif asit ortamda, kolay indirgenen monosakkaridlerin, daha zor indirgen disakkaridlerden ayrılması temeline dayanır. Ayıraç Barfoed ayıracı: 9 g bakır asetat 100 mL suda çözülerek üzerine 1.2 mL glasial asetik asit katılır ve karıştırılır. Deneyin Yapılışı 1. Monosakkarid (glukoz, galaktoz) ve disakkarid (sakkaroz, laktoz) çözeltilerinden 1’er mL alınıp tüplere konur 2. Daha sonra tüplerin üzerine Barfoed ayıracından 3’er mL konup, tüpler aynı anda kaynar su banyosuna daldırılır.  3. Bir dakika ya da gerekiyorsa indirgeme görülünceye kadar daha uzun süre banyoda tutulur. 4. Kırmızı-turuncu rengin (ya da çökeleğin) görülmesi şekerin monosakkarid olduğunu gösterir. 5. Aynı koşullardaki disakkarid içeren tüpün renginde ise bir değişiklik görülmez. Uzun süre su banyosunda tutulan disakkarid çözeltisi de hidrolizle monosakkaridlere ayrıldığında bu deney ile pozitif reaksiyon elde edilebilir. KARBOHİDRATLARA ÖZGÜ İNDİRGEME DENEYLERİ Prensip: Şekerlerin yapısında bulunan serbest aldehid ya da keton gruplarının indirgeyici özelliğine dayalı deneylerdir. Alkali ortamda, ısı etkisiyle bu gruplar, ortamda bulunan ağır metal iyonlarını 2+ 3+ (Cu , Bi , vb.) indirgerler. Bu indirgeme olayı, renk değişikliği ile beraberdir. Şekerlerin serbest aldehid ya da keton grupları ise karboksilik aside oksitlenerek şeker asitlerinin oluşmasına yol açarlar. Monosakkaridlerin tamamı, disakkaridlerdeki serbest aldehid ya da keton grubu içerenler (maltoz, laktoz) bu tür reaksiyonlarla pozitif sonuç verirler. Sukroz ve polisakkaridlerle indirgeme olayı gerçekleşmez. İndirgeme deneyleri (Fehling, Benedict, Trommer, Nylander)içinden özellikle Benedict idrarda şeker aranması için kullanılır. DENEY-7- FEHLING DENEYI Prensip: Bu deney oksido–redüksiyon olayına dayanır. Şekerin indirgen karbonil grupları (aldehid ve keton grupları) alkali ortamda ve ısı etkisiyle +2 değerlikli bakır iyonunu, +1 değerlikli bakır hidrokside (CuOH) veya daha fazla kaynatılırsa +1 değerlikli bakır okside (Cu2O) indirger. Bu arada şekerin kendisi de oksitlenir. Örneğin glukozdan glukonik asit oluşur. Bakırın, hidroksit olarak çökmesini önlemek için tartarat ilave edilip kompleks oluşturulması gerekir. Fehling ayıracı, idrarda bulunan ürik asit ve kreatinin gibi diğer indirgen maddelerle yalancı-pozitif sonuç verebilir. Ayıraçlar Fehling I çözeltisi: (%7 CuSO 4. 5H2O) 34,6 g kristal bakır sülfat yaklaşık olarak 300 mL distile suda hafifçe ısıtılarak çözülür. Sonra distile su ile 500 mL’ye tamamlanır. Fehling II çözeltisi: 35g sodium-potasyum tartarat ve 10g NaOH bir miktar distile suda çözülür ve 100 mL'ye tamamlanır. Deneyin Yapılışı 1. Bir deney tüpüne eşit miktarda Fehling I ve Fehling II çözeltisi konur ve çalkalanır. 2. Koyu mavi renkli bir çözelti meydana gelir. Bu iki çözelti karışımı “Fehling ayıracı” adını alır. Açık alevde kaynatılır. Rengi değişmezse ayıraç temizdir. İçinde indirgen maddeler bulunmuyor demektir. 3. Bu kontrol yapıldıktan sonra üzerine damla damla incelenecek örnek (örn: idrar) katılarak kaynatma sürdürülür. 4. Fazla miktarda şeker varlığında sarı bulanıklık ya da çökelti görülür. 5. Şeker az miktarda ise, Fehling ayıracının hacmine eşit olacak miktarda  örnek katılır. 6. Sarı ya da kırmızı bir çökelti oluşursa şeker vardır. 7. Eğer çökelti oluşmazsa incelenen örnekte şeker olmadığı kesinleşir. DENEY-8- BENEDİCT DENEYİ Prensip: Reaksiyonun prensibi, Fehling deneyinde olduğu gibi oksido-redüksiyon temeline dayanır. Ancak Fehling deneyine bir üstünlüğü; uygun olarak yapıldığında meydana gelen çökeltinin renginden, incelenen örnekteki (örn: idrar) şeker miktarını kabaca belirtme olanağı (yarı kantitatif) vermesidir. Şekerin serbest aldehid ya da keton grupları, alkali ortamda, ısı etkisiyle 2+ karboksilik asite oksitlenirken, Benedict çözeltisinde bulunan mavi renkli Cu iyonları 1+ (bakır sülfat), indirgen şekerler ile Cu ’e indirgenerek kırmızı renkli Cu2O oluşur. Arada oluşan bakır hidroksidin çökelmesinin önlenmesi için sitrat ile kompleks oluşturulması gerekir. (Fehling’de tartaratın oynadığı rol). Örnekte şeker yoksa çözelti berrak ve mavi renkli olarak kalır. Ayıraçlar Benedict Çözeltisi: a- 8,65g bakır sülfat 50 mL distile su içinde, sıcakta bir beherde çözünür. b- 500 mL' lik bir beherde 86,5g sodyum sitrat ve 50 g susuz sodyum karbonat yaklaşık olarak 300 mL distile su ile sıcakta çözülür. Üzerine A’daki bakır sülfat çözeltisi yavaş yavaş ve sürekli karıştırılarak ilave edilir. Beherdeki bakır sülfat kalıntıları az miktardaki distile su ile yıkanarak alınır, soğutulur. Distile su ile balon jojede 500 mL’ye tamamlanır. Deneyin Yapılışı 1. Bir deney tüpüne 5 mL Benedict ayıracı konur. 2. Üzerine 8-10 damla incelenecek örnek katılır, çalkalanır. 3. 1-2 dakika iyice kaynatılır. 4. Şeker varsa, bulunan miktar ile orantılı olarak, mavi rengin yeşil, sarı ya da kırmızıya değiştiği görülür. 5. Soğumaya bırakılır; sarı ya da tuğla kırmızısı bir çökelti dibe çöker. İdrarda şeker yoksa çözeltinin mavi rengi değişmez. Glukoz miktarının çok düşük olması durumunda bile çökelti meydana gelir. Pozitif deneylerde çökeltinin miktarına göre idrardaki şeker miktarı hakkında kabaca bilgi edinilebilir. Sıvı yeşil bir renk almışsa eser miktar, sarı renkli ise az miktarda, kırmızı renkli ise çok miktarda şeker var demektir. Bu deneyde az idrar kullanmak ve iyi kaynatmak esastır. Fazla idrar katılmasının sakıncası, çöken fosfatların çökeleğin rengini örterek sonucu şüpheli hale getirmesidir. Hatta bazen 8 damla bile fazla gelebilir. Şeker miktarının az olduğu durumlarda çökeleğin iyice dibe çökmesi için 10-15 dakika beklemek gereklidir. Benedict ayıracı, idrarın diğer indirgen maddeleri olan ürik asit ve kreatinin ile Fehling ayıracında olduğu kadar yalancı-pozitif sonuç vermez. İndirgeme Deneylerinin Karşılaştırılması Karbohidratların çoğu serbest aldehid ve keton grupları içerir. Şekerlere indirgen olma özelliği veren bu gruplardır. Her aldehid grubu indirgen özellik gösterdiği halde, her keton grubu indirgen değildir. Karbohidrat olmayan basit bir aldehid, örneğin formaldehid indirgen olduğu halde basit bir keton olan aseton indirgen değildir. Buna karşılık dihidroksiaseton indirgendir. O halde keto grubuna komşu karbonlarda -OH grupları bulunması keto grubunun indirgen özelliğinin ortaya çıkması için gereklidir. İndirgeme (redüksiyon) ile yükseltgenme (oksidasyon) reaksiyonları daima beraberdir. Bir madde, karşısındaki maddeyi indirgerken kendisi oksitlenir. Böylece renk değişikliği oksido-redüksiyon olayının bir sonucu olarak meydana gelmektedir. Deneylerdeki kompleks oluşumu; bakır ile şekerin –OH grupları arasında olur. Kompleks yapmış bakır, reaksiyona daha kolay girdiğinden şeker arama deneylerinde bir çok değişikliğin yapılması gerekmiştir. Örneğin Fehling deneyinde sodium- potasyum-tartarat (Seignette tuzu), Benedict deneyinde sodium sitrat, kompleks oluşturucu madde olarak kullanılmaktadırlar. Bu kompleks yapıcı maddelerin ortak özellikleri yapılarında çok fazla hidroksil grubu içermeleridir. LİPİDLERİN GENEL REAKSİYONLARI VE SAFRA ASİTLERİ Prof.Dr. Emel ZENGİN ULAKOĞLU Prof.Dr. Özlem BALCI EKMEKÇİ Öğrenim Hedefleri Lipidlerin emülsiyon oluşturabilme ve çözünürlüklerini gösteren deneyleri uygulamalı Lipidlerden sabun elde etme reaksiyonunu uygulayabilmeli Doymuş/doymamış yağları ayırt edebilmeli Kalitatif kolesterol tayini yapabilmeli Serbest ve ester kolesterolün yapısal farkını deneyler ile açıklayabilmeli İdrarda safra asitlerini kalitatif olarak tayin edebilmeli Biyolojik yaşamda önemli fonksiyonlar üstlenen lipidler; genel olarak suda çözünmeyen ancak eter, kloroform, benzen, aseton gibi organik çözücülerde kolayca çözünen heterojen bileşiklerdir. Bazı lipidlerin içerdiği –COOH, OH ile siyalik asit, fosfat, amin veya sülfat gibi lipid olmayan ek gruplar lipid molekülüne suda çözünürlük kazandırırlar. Plazma lipidlerini; kolesterol, kolesterol esterleri, trigliseridler (triaçilgliseroller), fosfolipidler ve esterleşmemiş (serbest) yağ asitleri oluşturur. Yağların Emülsiyon Oluşturması: Yağlar emülsiyon oluştururlar. Emülsiyon, kendi aralarında çözünmeyen iki veya daha fazla maddenin emülsiyon yapıcı bir ortamda oluşturduğu süspansiyondur. Kendi aralarında çözünmeyen yağ ve suyun bu yolla kısa süreli ve geçici emülsiyon oluşturması mümkündür, ancak bir süre sonra iki faz birbirinden tekrar ayrılır. Buna karşılık süt ve krema kalıcı bir emülsiyon oluşturur. DENEY-1 YAĞLARIN ÇÖZÜNÜRLÜK DENEYİ; Özellikle bir lipidin çözünürlüğünü incelemek için lipidin çok az miktarı, birkaç mikrolitre çözücü ile karıştırılır. Bir kibrit ucu miktarındaki yağ ve bir damla ayçicek yağını birkaç mL etil alkole, etere ve kloroforma katarak çözünürlüğü gözlenir. Yağların Sabunlaşma Reaksiyonları: Trigliseridlerden yağ asitlerini (veya sabunları) oluşturmak için kovalent oksijen-karbon bağlarının hidrolizi gereklidir. Tam hidroliz için sıcak ve alkali ortam şartı vardır. Bir trigliserid molekülü 3 ekivalan alkaliyi nötralize eder; bu olaya sabunlaşma denir (Şekil 1). - + CH2OCOR1 CH2OH R1 COO Na ½ t ½ CHOCOR2 + 3 NaOH « CHOH + R1 COO Na - + ½ Alkali ½ - + CH OCOR CH OH R COO Na 2 3 2 1 Trigliserid Gliserol Sabunlar Şekil 1. Trigliseridlerin Alkali Ortamda Sabunlaşma Reaksiyonu YAĞLAR Katı ve sıvı yağlar farklı trigliseridlerin kompleks karışımı halinde bulunurlar. Yapılan ayırma ve analiz yöntemlerine göre belli kaynaktan elde edilen yağların trigliseridleri çeşitlilik gösterir. Sabunlaşma ile trigliserid karışımından hidroliz edilen yağ asitlerinin molekül ağırlığının ortalamasını tayin etmek mümkündür. Miktarı belli olan yağ, sıcak alkali ortamda reaksiyona sokulup, sabunlaşma sağlanır. Daha sonra alkalinin fazlası asit ile titrasyonla hesaplanır, toplam sabun miktarından çıkarılır ve böylece yağ asidinin ortalama molekül ağırlığı hesaplanabilir. Birçok hayvansal ve bitkisel yağ, 16C (palmitata) ve 18 C (stearat, oleat, linoleat, linolenat) sayılıdır ve molekül ağırlıkları ortalama 280 civarındadır. Buna karşılık tereyağı, çoğunlukla karbon sayısı 4 olan yağ asidini (butirik asit) içerir ki; bunun molekül ağırlık ortalaması 235 gibi daha düşük değerdedir. Sabunlaşma reaksiyonu doymuş yağlar (tereyağ ve margarin) için gerçekleştirilir ve ortalama molekül ağırlığı bulunduğunda, bu iki tip yağı birbirinden ayırt etmek mümkün olur.  DENEY-2 YAĞLARIN HİDROLİZİ DENEYİ Ayıraçlar %40 etil alkolde çözülmüş NaOH (%20) Asetik asit (seyreltik) Turnusol kağıdı Tereyağ Deneyin Yapılışı 1. 5g (1 kesme şeker büyüklüğünde ) tereyağı deney kabında ısıtılarak eritilir. 2. Üzerine 10 mL etil alkolde çözülmüş NaOH ilave edilir. 3. Buhar banyosunda ısıtılır. 4. Sabunlaşma tamamlandığında bu çözeltinin az bir kısmı, içinde su bulunan deney tüpüne alınır ve yağ damlacıkları oluşmadığı gözlenir. 5. Daha sonra alkolün tamamı uçurulur. 6. Oluşan sulu sabun çözeltisinin 5mL’si deney tüpüne alınır ve seyreltik asit kullanılarak bu çözelti asitlendirilir. 7. Butirik asidin ve diğer ucucu yağ asitlerinin kokusu not edilir. 8. Yağlı bir tabakanın yüzeyde olup olmadığına bakılır. DENEY-3 DOYMAMIŞ YAĞLARIN VARLIĞININ GÖSTERİLMESİ DENEYİ Prensip: Bir lipid molekülündeki çift bağların varlığı, çift bağlara halojen katılma reaksiyonu ile gösterilebilir. Lipidlerdeki doymamış yağ asitlerinin içeriğini belirlemek için -CH = CH- bağına iyot ilave edilmesi, deneyin esasını oluşturur (Şekil 2). Katı ve sıvı bir yağın doymamışlık miktarı, yağ asidindeki -CH = CH- bağlarının sayısıyla orantılı olduğu için, lipid tarafından tutulan iyot miktarı, doymamışlık düzeyini belirlemede kullanılabilir. I I | | -CH = CH - + 2I - ® -C- C- | | H H Şekil 2. Halojenlerin Çift Bağlara Katılma Reaksiyonu Ayıraç Hübl’ün iyot çözeltisi: A-çözeltisi: 26 g iyod, 500 mL alkol (%95) içerisinde çözülür. B- çözeltisi: 30g cıva klorür, 500 mL alkol (%95) içerisinde çözülür. İki çözelti karıştırılır ve gerekiyorsa süzülür. Deneyin Yapılışı  1. Az miktardaki zeytin yağını, katı yağı ve hayvansal katı yağı, üç farklı kuru deney tüpünde kloroform içerisinde çözün. Hacimleri mümkün olduğu kadar birbirine yakın miktarlar kullanmaya çalışın (deney tüpünün yuvarlak dibini dolduracak kadar yağ kullanılmalıdır). 2. İki veya 3 damla Hübl’ün çözeltisinden ilave edilir. 3. Tüpler çalkalanır. 4. Eşit miktarlarda kloroform ve daha sonra Hübl’ün çözeltisinden her seferinde çalkalayarak ilave edilir. 5. Rengin kaybolup kaybolmadığını gözlenir. İyot Sayısının Belirlenmesi: Bir yağın doymamışlık derecesi, iyodla reaksiyona girmesi sağlanarak ölçülebilir. Bir yağ asidindeki her bir çift bağ bir molekül iyodla tepkimeye girer. Moleküler düzeyde, 100g yağ ile reaksiyona giren iyodun mol sayısı hesaplanabilir ve eğer bileşenlerin yani trigliserid veya yağ asidi moleküllerinin ortalama molekül ağırlığı biliniyorsa (örn; kantitatif sabunlaşma ile), yağ asidi molekülü başına çift bağların ortalama sayısı hesaplanabilir. KOLESTEROL DENEYLERİ İnsan ve hayvan dokularında bulunan temel sterol kolesteroldür. Amfipatik yapıya sahip olan kolesterol, polar bir baş ve apolar hidrokarbon gövdeden oluşmuştur. Kolesterolun polar ucunda bulunan 3. karbondaki –OH grubu ve 5-6. C’lar arasındaki çift bağ, kolesterolün reaktif kısımlarıdır. 10. ve 13. C’larında –CH3 grubu, 17. C da ise 8 C’lu alifatik yan zincir bulunur. Kolesterolün 3.C’unda bulunan –OH grubu yağ asitleri ile esterleştiğinde, ester kolesterol meydana gelir. DENEY-4- SALKOWSKİ DENEYİ Prensip: Kolesterol kanda serbest ve esterleşmiş şekilde bulunan bir steroldür. Kolesterolü yaklaşık olarak hesaplamaya yarayan tüm yöntemler; iki ya da daha fazla çift bağ içeren herhangi bir sterol veya steroidin, karakteristik bir renk vermek üzere derişik sülfirik asit ile reaksiyona girmesi prensibine dayanır. Bu steroidler; dehidratasyona, polimerizasyona ve sülfatasyona uğrayarak renk reaksiyonu meydana getirirler. Ayıraçlar Kolesterol çözeltisi (% 0,1 kloroformda) Ergosterol çözeltisi (% 0,1 kloroformda) Derişik sülfürik asit çözeltisi Deneyin yapılışı 1. Kolesterolün ve ergosterolün % 0,1 kloroformdaki çözeltileri eşit hacimdeki derişik sülfürik asit ile karakteristik bir renk reaksiyonu oluşturur. 2. Kolesterolden elde edilen sarı-pembe halkayı ve ergosterolden elde edilen koyu turuncu-kırmızı halkayı gözleyin. 3. Ergosterolün üst katmanında aynı zamanda yeşil bir floresans da  oluşabilir. Diğer sterolleri de deneyin. DENEY-5 LİEBERMANN BURCHARD DENEYİ Prensip: Kolesterol, kloroformlu ortamda sülfat asiti ve asetik asit anhidridi ile yeşil renk vermesiyle tanınabilir. Kolesterolün asitli ortamda verdiği bu renkli maddelere “Halokrom” adı verilir. Bu reaksiyonların genel prensibi, kolesterolün polimerleşmesi sonucunda yüksek molekül ağırlıklı renkli maddelerin oluşmasıdır. Asetik anhidrid sülfürik asit için bir dilüent (seyreltici) olarak görev yapar ve H2SO4 / asetik anhidrid oranı yükseldiği zaman kırmızı Salkowski rengi oluşur. Bu oran düşük olduğu zaman yeşil Liebermann Burchard rengi meydana gelir. Klinik biyokimyada Liebermann Burchard reaksiyonu genellikle Salkowski reaksiyonunun kontrolü güç olduğu için kullanılır. Ayıraçlar Kolesterol çözeltisi (% 0,02 kloroformda) Ergosterol çözeltisi (% 0,02 kloroformda) Asetik anhidrid Derişik sülfürik asit çözeltisi Deneyin yapılışı 1. Bu deneyde nemden kesinlikle kaçınılmalıdır. İki ayrı kuru tüpe ergosterol ve kolesterolün seyreltik çözeltilerinden 2 mL konur. 2. Üzerine 15 damla asetik anhidrid ilave edilir, çalkalanır ve ardından soğutulur. 3. Daha sonra 5 damla derişik sülfürik asit eklenir, karıştırılır ve renk değişimleri not edilir. 4. Her iki tüpte de koyu mavi-yeşil renk oluşur, ancak ergosterolün bulunduğu tüpte kısa bir süreliğine kırmızı renk oluşumu gözlenir. 5. Kolesterolde maksimum renk oluşumu için 15-20 dakika gerekirken, ergosterolde bu süre 3 ile 5 dakika arasındadır. 6. Bu reaksiyon; sıcaklığın, zamanın ve reaktiflerin miktarının kontrol edilmesi ile kantitatif olarak da yapılabilir. ESTER VE SERBEST KOLESTEROL TAYİNLERİ Biyolojik materyallerdeki serbest kolesterol (esterleşmemiş kolesterol) digitonin ile çöktürülür. Çöken kolesterol-digitonin bileşiği tartılır. Bu miktardan bilinen digitonin miktarı çıkarılarak serbest kolesterol miktarı gravimetrik olarak hesaplanır. Ayrıca serbest kolesterolü çöktürdükten sonra üstteki fraksiyonda ester kolesterol tayini yapılır. DENEY-6 STEROLLERİN DİGİTONİN İLE ÇÖKTÜRÜLMESİ Prensip: Non-polar (polar olmayan) çözücülerde, digitonin eşit hacimdeki kolesterol ve kolesterol türevi olan sterollerle karıştırıldığında çözünmeyen bir kompleks (kolesterol-digitonin kompleksi) oluşturarak çöker. Ayıraçlar  Kolesterol Aseton / mutlak etanol (1:1) Digitonin (% 0,5), % 50 etanolde Deneyin Yapılışı 1. Bir miktar kolesterolü, aseton ve mutlak alkol (l:l) içerisinde çözülür. 2. % 50 etanoldeki % 0,5 digitoninden üç hacim ilave edilir. 3. Bir saat ılık buhar banyosunda bekletilir. 4. Çökelti oluşumu incelenir İDRARDA SAFRA ASİTLERİ İNCELENMESİ Kolesterol yıkım ürünlerinden biri olan safra asitlerinin, feçesteki günlük miktarı 0.8g kadardır. Safra ile barsaklara atılan safra asitleri ince barsaklarda tekrar emilir ve günde birkaç kez entero-hepatik (barsak-karaciğer arası) dolaşıma girerler. Besinlerle alınan yağ miktarının günlük safra asitlerinin yapımı üzerine etkisi vardır. En önemli safra asidi, kolik asittir. Safra asitleri glisin ve taurinle peptid bağı oluşturarak birleşirler (glikokolik asit ve taurokolik asit). Serumda normal durumda çok az miktarda (% 1-2 mg) safra asidi bulunur. Tıkanma sarılıkları (mekanik sarılıklar) ve parankimatöz sarılıklarda (hepatoselüler sarılıklar) bu miktar % 40 mg’a kadar yükselebilir ve bu gibi durumlarda, idrara geçerler. Safra asitlerinin yağların sindirimini yapan pankreas lipazını aktive etmek ve yağları ince emülsiyon haline getirmek gibi emilimde büyük görevleri vardır. Safra asitlerinin kanda artmasının kaşıntı ve bradikardi (kalp vuruş sayısının azalması = nabzın yavaşlaması) yaptığı eskiden beri bilinmektedir.Klinikte serumda safra asidi belirlenmesi çok zaman alıcı olduğundan genellikle idrardaki analizi yeterlidir. DENEY-7 HAY DENEYİ Prensip: Safra asitlerinin idrarın yüzey gerilimini azaltması esasına dayanır. Ayıraç: Kuru, ince kükürt tozu. Deneyin Yapılışı 1. İki idrar kadehi alınır. 2. Birine normal idrar, diğerine safra asitleri aranacak idrar konur. 3. Her ikisinin üzerine bir tülbent içinde bulunan kükürt tozu, birkaç santimetre yükseklikten yüzeyi kaplayacak şekilde serpilir. 4. Safra asitleri bulunan kadehte kükürt tozu kabın dibine doğru çöker. Normal idrar bulunan kadehte ise yüzeyde toplanır ve çökmez. Ekstrahepatik ya da intrahepatik safra salgısının arttığı durumlarda idrarda safra asitleri bulunur. Hay deneyi çok duyarlıdır. 100 mL idrarda 2,5 mg safra asidi bulunsa bile pozitif sonuç elde edilir. Deney duyarlı olmakla beraber safra asitleri için özgül değildir. Nefrit vb. gibi bazı böbrek hastalıklarında ve idrarda koruyucu olarak katılan timol ile de pozitif sonuçlar saptanır. DENEY-8  PETTENKOFER DENEYİ Prensip: Asit etkisiyle sakkarozdan furfural meydana gelmesi ve bunun da safra asitleriyle birleşerek kırmızı bir renk oluşturması esasına dayanır. Ayıraçlar Sakkaroz çözeltisi (% 5) Derişik H SO 2 4 Deneyin Yapılışı 1. Bir deney tüpüne 5 mL idrar konur. 2. Üzerine 5 damla sakkaroz çözeltisi katılır. 3. Sonra tüpün kenarından 2-3 mL derişik H SO sızdırılır. 2 4 4. İdrarda safra asitleri varsa sülfürik asitle sakkaroz çözeltisinin temas yüzeyinde kırmızı bir halka oluşur. 5. Eğer tüp çalkalanacak olursa, bütün sıvı kırmızı bir renk alır.  AMİNO ASİTLERİN VE PROTEİNLERİN GENEL REAKSİYONLARI Prof. Dr. Gülnur ANDİCAN Öğrenim hedefleri Amino asitlerin genel yapısını ve peptid bağının özelliklerini açıklayabilmeli Tüm amino asitlerin verdiği genel reaksiyonu tanımlayabilmeli Kükürt grubu içeren aminoasitlerin verdiği reaksiyonları tanımlayabilmeli Aromatik amino asitlere özgü reaksiyonları tanımlayabilmeli İmidazol halkasına sahip amino asitlere özgü reaksiyonları tanımlayabilmeli Biüret reaksiyonunun önemini kavrayabilmeli ve uygulayabilmeli Metallerin ve asitlerin etkisi ile proteinlerin çöktürülmesini açıklayabilmeli Proteinler tüm hücrelerde en çok bulunan biyolojik makramoleküllerdir. Proteinlerin yapı taşı amino asitlerdir ve doğada 300’den fazla amino asit bulunmasına rağmen sadece 20 amino asit memeli protein yapısında bulunur. Amino asitler, peptid bağları ile kovalent bağlanarak protein molekülünü oluştururlar. Peptid bağları bir amino asidin amino grubu ile diğer amino asidin karboksil grubu arasında bir su molekülü çıkışı ile oluşur. Proteinler bir veya daha fazla polipeptid zincirinden oluşurlar. Her bir zincirde bir amino ve bir karboksil uç bulunur. Amino ucunu zincirdeki ilk amino asit oluşturur ve serbest amino grubu içerir. Karboksil ucunu zincirdeki son amino asit oluşturur ve serbest karboksilat grubu içerir. 20 amino asidin farklı kombinasyonlar ve farklı diziler halinde birleşmesiyle çok sayıda farklı özellik ve aktivite gösteren proteinler oluşur. Proteinler bir veya daha fazla polipeptid zincirinden oluşurlar. Bu şekilde bu amino asitlerden enzimler, hormonlar, antikorlar, taşıyıcılar, kas, gözün lens proteini ve süt proteinleri gibi klinik olarak önemli birçok farklı özelliği olan proteinler sentezlenebilmektedir. Amino asit ve türevleri protein yapısında yer aldıkları gibi melanin, porfirin, pürin, pirimidin ve üre gibi çeşitli moleküllerin yapısına da katılmaktadır. Amino asitlerin kısa polimerleri olan peptidlerin, nöroendokrin sistemde hormonlar, hormon serbestleştirici faktörler, nöromodülatörler veya nörotransmitterler olarak da önemli görevleri bulunmaktadır. Doğal proteinlerin yapısında yer alan amino asitler α-amino asitlerdir. Her amino asit α-karbon olarak adlandırılan merkezi bir karbon atomu içerir. α-karbon atomuna bağlı bir amino grup, bir karboksil grup ve bir hidrojen atomu bulunur. α-karbon atomunun dördüncü bağında ise her amino asit için değişebilen R ile gösterilen yan zincir bulunur. Yan zincirler amino asitlerin yapısal ve kimyasal özellikler açısından birbirlerinden ayrılmasını sağlar (Şekil 1). Şekil 1. Amino asit yapısı Amino asitler sulu ortamda çözündüğünde dipolar iyon (zwitterion) halinde bulunur. Dipolar iyonlar proton vericisi ve proton alıcısı olarak fonksiyon gösterirler. İki özelliği bir arada taşıyan maddeler amfolit olarak adlandırılır. Ortamın pH’ına göre amino asitler (+), (-) veya her iki yükü taşıyabilirler. Amino asitlerin (+) ve (-) yükleri eşit olduğunda yani amino asit yüksüz olduğunda ki pH değerine amino asitin izoelektrik noktası denir. İzoelektrik noktada aminoasitler elektriksel alanda göç edemezler. Şekil 2. Amino asidin iyonize olmamış (a) ve iyonize (zwitterion) formu (b) İnsan proteinlerin yapısında bulunan amino asitlerin glisin dışındakilerin tümü L- amino asittir. Bununla birlikte son yapılan çalışmalarda beyinde D-Serin ve D-aspartat varlığı gösterilmiştir. Ayrıca D-amino asitlerin bazı peptid yapılı antibiyotiklerin ve bakteri hücre duvarında bulunan küçük peptidlerin yapısında da bulunduğu saptanmıştır. Glisinde ise asimetrik karbon atomu yoktur. Şekil 3. Alanin amino asidinin L ve D izomerleri Amino asitlerin bazıları organizmada sentez edilebilirler ve besinlerle alınması zorunlu değildir. Bunlara esansiyel olmayan amino asitler” veya endojen amino asitler” denir. Bazıları ise organizmada sentez edilemezler ve besinlerle dışardan alınmaları zorunludur. Bunlar “esansiyel amino asitler” veya “ekzojen amino asitler” olarak adlandırılır. Fenilalanin, histidin, valin, lösin, izolösin, lizin, metiyonin, arjinin, treonin ve triptofan gibi aminoasitler esansiyel amino asitlerdir. Bu grupta yer alan aminoasitlerden histidin ve arjinin bebeklikte esansiyeldir. Bunlara yarı esansiyel amino asitler denir. DENEY-1 NİNHİDRİN REAKSİYONU Prensip: Aminoasidleri mikrogram düzeyinde saptamak ve ölçmek için en sık kullanılan yöntemdir. Aminoasidler ninhidrin (triketohidrinden hidrat) ile reaksiyona girerek amonyak ve karbondioksid açığa çıkarır ve mavi-menekşe renkli bir aldehid oluştururlar (Şekil 4). Prolin ve hidroksiprolin ise sarı renk oluşturur. Ninhidrin, güçlü bir organik oksidandır. Amino asitler, ninhidrin etkisiyle oksidatif deaminasyona ve dekarboksilasyona uğrarlar; amino asitten aldehit, amonyak ve karbondioksit oluşurken ninhidrin indirgenir. İlk aşamada oluşan indirgenmiş ninhidrin de, indirgenmemiş ninhidrin ve amonyak ile reaksiyona girerek mor renkli bir kompleks oluşturur. Kuvvetli amonyum bileşikleri, aminler, peptidlerin ve proteinlerin çoğu da amonyak ve karbondioksid oluşturmamalarına rağmen aynı şekilde reaksiyon verirler. Ayıraçlar Amino asit çözeltileri Ninhidrin (aseton içinde % 0,1 ) Whatmann filtre kağıdı Deneyin Yapılışı 1. Filtre kağıdının üzerine her bir amino asit çözeltisinden bir damla konur. 2. Kuruması beklenir. 3. Sonra çok kısa bir süre ninhidrin çözeltisi içine daldırılır. 4. Filtre kağıdı kururken herbir amino asidin karakteristik lekeleri gözlenir. Şekil 4. Ninhidrin reaksiyonu  KÜKÜRT VARLIĞININ GÖSTERİLMESİ DENEY-2 KURŞUN ASETAT REAKSİYONU Prensip: Bu deney, proteinlerde kükürt varlığının gösterilmesi için kullanılır. Yapısında tiyol (−SH) veya disülfit (−S−S−) grubu bulunan amino asitler NaOH ile kaynatıldığında H2S veya Na2S oluşur; ortama kurşun asetat çözeltisi ilave edildiğinde siyah renkli PbS çöker. Ayıraçlar Kurşun asetat çözeltisi Sodyum hidroksit (%20) Deneyin Yapılışı 1. İki deney tüpü alınıp; ikisine de eşit miktarda serum konur. 2. Her ikisine de aynı miktarda NaOH eklenerek alkalilendirilir. 3. Tüplerden birine kurşun asetat çözeltisinden birkaç damla eklenir. 4. Her iki deney tüpü de kaynatılır. 5. Kurşun asetat eklenen deney tüpünde siyah renkli bir çökelek oluşur. DENEY-3 SODYUM –NİTROPÜRİSSİYAT REAKSİYONU Prensip: Alkali ortamda sodyum nitropürissiyat ile proteinlerdeki –S-S- gruplarının reaksiyonuna dayalı bir deneydir. İdrarda sistin aranması için kullanılır. Sistinüri adı verilen hastalıkta idrarda sistin miktarı artar. Ayıraçlar Taze hazırlanmış sodyum nitropürissiyat (%2) Derişik amonyum hidroksit Deneyin Yapılışı 1. Bir deney tüpüne 2 mL idrar üzerine 0,5 mL derişik amonyum hidroksit konur. 2. 0,5 mL sodium nitropurissiyat ilave edilir. 3. Karıştırılır. 4. Kırmızı rengin oluşumu reaksiyonun pozitif olduğunu, dolayısıyla -S-S- gruplarının varlığını gösterir. AROMATİK AMİNO ASİTLERİN GÖSTERİLMESİ DENEY-4 BECHER KSANTOPROTEİN REAKSİYONU Prensip: Becher’in ksantoprotein reaksiyonu, serumdaki aromatik aminoasidlerin tanımlanmasına yönelik bir testtir. Proteinler asit varlığında ısıtıldıktan sonra alkali ile muamele edildiğinde, amino asitin miktarına bağlı olarak açık sarıdan, portakal rengine doğru değişen bir renk oluşur. Sarı renk oluşumun nedeni HNO3 ile kaynatılmayı takiben aromatik çekirdeğe nitro grubunun (benzen çekirdeğinin nitrasyonu) girmesidir. Asidik ortamda hafif tonda olan sarı renk, ısı ve alkali ilavesiyle şiddetlenir. Sağlıklı bireylerde gözlenen açık sarı renk, serumda az miktarda bulunan tirozin, fenil alanin ve bir dereceye kadar triptofan gibi halkalı aminoasidlerden ileri gelir. Fenolle zehirlenme vakalarında ksantoprotein reaksiyonu şiddetlidir. Serumda serbest aromatik amino asidlerin analizi amaçlandığında öncelikle deproteinize edilmiş serum numuneleri kullanılması gereklidir. Patolojik reaksiyonlar en fazla böbrek yetersizliğinde görülür. Bu durumda fenol, krezol, dioksifenol vb. gibi aromatik ve azotsuz maddelerin kan dolaşımındaki düzeyinde artış söz konusudur. Karaciğer hastalıklarında da ksantoprotein reaksiyonu pozitif olur. Karaciğer sirozunda, karaciğer komasında kanda ürenin artması veya az artması buna karşılık ksantoprotein reaksiyonunun şiddetlenmesi ağır bir karaciğer yetersizliğini gösterir. Ayıraçlar Derişik HN0 3 Triklorasetik asid (TCA, % 20) NaOH (% 33) Deneyin Yapılışı 1. 2-3 mL seruma aynı miktarda triklorasetikasid damlatılarak çalkalanır. 2. 10 dakika beklenir. 3. Filtre kağıdından süzülür. 4. Bu yolla elde edilen proteinsiz süzüntüden 2 mL bir tüpe konur, üzerine 0,5 mL derişik HNO3 ilave edilir, çalkalanır. 5. Tam 30 saniye açık alev üzerinde tutulup ısıtılır, sonra musluk suyu altında soğutulur. 6. NaOH çözeltisinden 1,5 mL konur. Normal durumda açık sarı renk görülür. Patolojik durumlarda çok koyu sarı renkler, portakal rengi hatta kahverengiye çalan renkler görülebilir. 7. Ortaya çıkan rengin normal ya da patolojik olduğuna kolayca karar vermek için, sabit bir renk veren potasyum bikromatın su ile yapılan seyreltilmelerinde ortaya çıkan renkler, reaksiyonda oluşan renklerle karşılaştırılır ve değerlendirilir. Becher’e göre yapılan sıralama aşağıdaki biçimde özetlenebilir. % 0,038 g’lık K Cr O çözeltisinden: 2 2 7 2,5 mL alınıp su ile 10 mL’ye seyreltilirse - Normal reaksiyon 5,0 mL alınıp su ile 10 mL’ye seyreltilirse - Patolojik reaksiyon 7,5 mL alınıp su ile 10 mL’ye seyreltilirse - Kuvvetli patolojik reaksiyon 10 mL % 0.038 g. K Cr 0 çözeltisi 2 2 7 - Üremi  DENEY-5 PAULY REAKSIYONU Prensip: Histidin ve diğer imidazol halkasına sahip bileşiklere özgü bir reaksiyondur. Bu tip bileşikleri içeren biyolojik örnekler, alkali ortamda, diazolandırılmış sülfanilik asit çözeltisi ile muamele edildiklerinde kırmızı bir renk oluştururlar. Ayıraçlar HCl (%10) içinde hazırlanmış sülfanilik asit (%1) çözeltisi Sodyum nitrit (%5) Sodyum karbonat (%10) Amino asit çözeltisi Deneyin Yapılışı 1. Bir tübe 2 mL amino asit çözeltisi konulur. 2. 1 mL sülfanilik asit ilave edilir, karıştırılır ve buzda soğutulur. 3. Soğuduktan sonra tübe 1 mL sodyum nitrat ilave edilerek 3 dakika soğukta bekletilir. 4. 5 dakika sonra 2 mL sodyum karbonat ilave edilip renk değişimi gözlenir. DENEY-6 HOPKINS COLE REAKSIYONU Prensip: Hopkins Cole reaksiyonu glioksilik asit reaksiyonu olarakta bilinir ve proteinlerde triptofan bulunmasına dayalı bir reaksiyondur. Triptofan ve indol halkası içeren diğer moleküller kuvvetli asitlerle (glioksilik asit ve sülfürik asit ile) muamele edildiklerinde mor renkli bileşikler oluşturur (Glioksilik reaksiyon). Ayıraçlar Glasiyel asetik asit (%99,9) Derişik H SO 2 4 Deneyin Yapılışı 1. Bir test tüpüne 2mL amino asit çözeltisi konur. 2. Üzerine 2mL glasiyel asetik asit (%99,9) ilave edilir, karıştırılır. 3. Üzerine tübü eğerek damla damla tübün cidarından sızdırarak 2mL derişik H2SO4 katılır. 4. Birkaç saniye beklenir.  5. Renk oluşumu gözlenir. 6. İki sıvının yüzeyinde mor renkli bir halkanın oluşumu reaksiyonun pozitif olduğu gösterir. PEPTİD BAĞLARININ GÖSTERİLMESİ BIÜRET REAKSIYONU Prensip: Üre kristalleri kuru olarak ısıtıldığında, 2 molekül üre arasında, bir mol amonyak çıkışı ile biüret adı verilen bir bileşik meydana gelir.Üre kristalleri arasında -C-N- şeklinde oluşan bağ proteinlerin yapısında da yer alır ve “peptid bağı” olarak bilinirler. Aminoasidler, birbirlerine peptid bağları ile bağlanarak proteinlerin birincil yapısını oluştururlar. İki veya daha fazla peptid bağına sahip moleküller bazik 2+ ortamda Cu ile pembe veya menekşe renk verirler. Peptid bağlarının verdiği bu reaksiyonu, biürat bileşiği de verdiğinden test biüret reaksiyonu olarak adlandırılır ve proteinlere özgü değildir. NH ¾C¾NH¾C¾NH 2 2 çê çê O O Ayıraçlar NaOH 10 % CuSO 0.1% 4 Serum, yumurta akı, süt, alanin veya üre çözeltisi Biüret ayıracı: 8g NaOH bir miktar suda 1L’lik balon jojede çözülür. Buna her aşamada, maddelerin tamamıyla çözünmesi sağlanarak, 15g Sodyum-potasyum-tartarat, 5g Bakır sülfat pentahidrat (CuSO4+5 H2O) ve 5g potasyum iyodür (KI) ilave edilir ve çözelti 1L ’ye distile su ile tamamlanır. DENEY-7 1. Bir deney tüpüne 1 mL serum konur.  2. Üzerine 4 mL biuret çözeltisi eklenir. 3. Karıştırılır ve beklenir. 4. Mavi-menekşe renk oluşması gözlenir. 5. Aynı deney yumurta akı, süt, alanine ve üre çözeltisi ile de yapılabilir. DENEY-8 1. Kuru bir deney tüpüne bir miktar üre konur ve açık alevde ısıtılır. 2. Bu sırada tüpten NH gazının çıktığı, keskin kokusundan anlaşılabilir. 3 3. Tüpün ağzına ıslak bir kırmızı turnusol kağıdı tutulur. 4. NH gazının turnusolu mavileştirdiği gözlenir. 3 5. Tüp soğutulduktan sonra, kalıntı birkaç damla su katılarak çözülür. 6. 1mL NaOH ve 10 damla CuSO çözeltisi ilave edilir. 4 7. Menekşe renk meydana gelir. METALLERİN ETKİSİYLE PROTEİNLERİN ÇÖKTÜRÜLMESİ DENEY-9 Prensip: Proteinler bazı metal iyonlarıyla çözünmez tuzlar oluştururlar. Bu reaksiyon bir çözeltiyi proteinsizleştirmede kullanılır. Bu aynı zamanda civa II klorür gibi bir metalik zehir alanlara süt veya yumurta verilmesinin temel dayanağını oluşturur. Bir protein çözeltisi bazik yapıldığında protein üzerindeki net yük negatif olur. Bu nedenle ağır metal katyonların varlığında, kullanılan metale bağlı olarak + + 2+ çözünebilir veya çözünmez, metal proteinat tuzları oluşur. Proteinlerin Na , K ve Mg tuzları çoğunlukla çözünebilir fakat civa, kurşun, bakır ve çinko ise çözünmez tuzlar oluşturur. Ayıraçlar Albumin çözeltisi (% 2)/Seyreltik serum Sodyum karbonat (%10) HgCl (%5) 2 Glasiyel asetik asid Kurşun asetat (%2) FeCl (%2) 3 EDTA (0, 05 M) Deneyin Yapılışı 1. 3mL albumin çözeltisi/seyreltik serum, hafifçe bazik yapılır ve civa klorürden 1mL eklenir.  2. Birkaç damla glasiyel asetik asid eklenerek çökeltinin eridiği gözlenir. 3. Deney kurşun asetat, bakır sülfat ve demir (3) klorür çözeltileriyle de tekrarlanır. 4. Birkaç dakika bekletildikten sonra üzerine kuvvetli bir metal kelatörü olan EDTA çözeltisinden 1 mL eklenir. Çökeltinin eridiği gözlenir. ASİT ETKİSİ İLE PROTEINLERİN ÇÖKTÜRÜLMESİ Prensip: Proteinler asid etkisi ile molekül içi hidrojen bağlarının yıkılmasıyla, ikinci, üçüncü ve dördüncü yapıları bozulur, biyolojik aktiteleri koybulur ve denatüre olurlar. Protein çözeltileri asidlendirildiğinde net yükleri pozitif olur. Proteinler baz olarak davrandıklarında asidler veya anyonlar ile tuz oluşturabilir. Bu tuzların bazıları çözünemez. Proteinlerin izole edilmesi ve çözeltilerin proteinsizleştirilmesi için tungstik asid gibi asidler kullanılır. Protein içermeyen kan/serum filtratları bu şekilde hazırlanır. Bu amaçla triklorasetik asid veya perklorik asidler de sık kullanılmaktadır. Ayıraçlar Albumin çözeltisi (% 1)/ Yumurta beyazı çözeltisi /Süt / Seyreltik serum Asetik asit (%20) / Pikrik asit (% 10) /Triklorasetik asit (% 20)/Sülfosalisilik asit (% 20) /Sülfirik asit (2/3N) Sodyum tungstat (% 10) DENEY-10 Deneyin Yapılışı 1. Bir tübe yaklaşık 3 mL serum/yumurta beyazı/süt veya albümin çözeltisi konur. 2. Asetik asid / pikrik asid / triklorasetik asid / sülfosalisilik asid veya sülfirik asid eklenince denatürasyon gerçekleşir. 3. Çözünmez yapıda çökelti meydana gelir. DENEY-11 Deneyin Yapılışı 1. Bir tübe yaklaşık 3 mL serum konur. 2. Üzerine birkaç damla sodyum tungstat çözeltisi konur. 3. Çözünmez albumin tunstat oluşmaz. 4. Asetik asid /Pikrik asid / Triklorasetik asid /Sülfosalisilik asid veya Sülfirik asid eklendiğinde ( yani asit ortamda) denatürasyon olur 5. Çözünmez yapıda çökelti meydana gelir. Deproteinize edici yöntemden biri uygulandıktan sonra örneklere ya santrifüj ya da filtre kağıdından süzme işlemleri uygulanır. Santrifüj sonrası  üstteki berrak çözelti (süpernatanat) veya filtrasyonda süzülerek oluşan berrak çözelti (filtrat) protein içermez. Bu şekilde elde edilen serum supernatantlar, glukoz veya kreatinin gibi moleküllerin analizinde kullanılmaktadır. SPEKTROSKOPİK ANALİZ YÖNTEMLERİ - SPEKTROFOTOMETRİ Prof.Dr.Remisa GELIŞGEN Öğrenim Hedefleri Spektroskopik analiz yöntemlerini sınflandırabilmeli Spektrofotometri ile ilişkili temel kavramları tanımlayabilmeli Elektromanyetik radyasyonun ve görünen kısmı olan ışığın dalga boyu ve foton (partikül) özelliklerini tanımlayabilmeli Elektromanyetik spektrum terimini tanımlayabilmeli Absorbans, transmitans yüzdesi terimlerini açıklayabilmeli Işık geçirgenliği ve absorbsiyonu arasındaki ilişkiyi açıklayabilmeli Lambert- Beer Kanunu tanımlayabilmeli Molar absorbsiyon katsayısını (є) tanımlayabilmek, Spektrofotometrenin bileşenlerini sınıflandırabilmek ve her bir bileşen için en az 3 örnek verebilmeli Absorbsiyon spektrofotometrisinin temel ilkelerini açıklayabilmeli Spektrofotometrik analizde ölçüm için kullanılacak dalga boyunun seçimini yapabilbeli Absorbsiyon spektrumunu çizebilmeli Kalibrasyon eğrisi çizilmesini uygulama yaparak öğretmek, ölçüm için önemini açıklayabilmeli Spektrofotometrik yöntem ile çözeltideki madde konsantrasyonu  hesaplayabilmeli Işın-madde etkileşmesini inceleyen bilim dalına spektroskopi denir. Spektroskopi, örnekteki atom, molekül veya iyonların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan, saçılan, kırılan veya yayılan elektromanyetik ışımanın(radyasyonun) ölçülmesi ve değerlendirilmesidir. Yöntemlerin temelinde absorpsiyon ve emisyon yatmaktadır. Klinik laboratuvarda çoğu ölçümler kontrollü koşullarda yayılan, geçirilen, absorblanan ya da yansıtılan radyan enerjinin ölçümlerine dayandırılmaktadır (Tablo 1). Spektrofotometri, renkli ve bazı renksiz maddelerin çözeltilerinin absorbe ettiği ışık şiddetinin ölçülmesi ile yapılan miktar belirtim yöntemidir. Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen cihazlar kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılır, difraksiyon kafesi ya da prizmalar aracılığı ile belli dalga boyunda ölçüm yapan ise spektrofotometre olarak adlandırılırlar. Fotometre / Spektrofotometre, bir bileşik tarafından absorblanan, geçirilen ya da yansıtılan ışığın şiddetini ölçen cihazlardır. Spektrofotometrik ölçümler çözeltinin elektromanyetik radyasyon geçirgenliğinin dedektör tarafından ölçülmesi prensibine dayandığı için, elektromanyetik radyasyonun temel özelliklerinin anlaşılması önem taşımaktadır. Tablo 1. Spektroskopik yöntemler ve sınıflandırılması Işının Spektrofotometri absorplanması Kolorimetri temeline göre Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Spektroskopisi Elektron Spin Rezonans (ESR) Spektroskopisi Işının yayılması Kütle Spektrometrisi (emisyon) temeline Emisyon Spektroskopisi göre Atomik Emisyon Spektroskopisi Fluoresan Spektroskopisi Radyokimyasal Yöntemler Diğer Türbidimetri spektroskopik Nefelometri Yöntemler Raman Spektroskopisi Refraktometri İnterferometri X ışını Difraksiyonu TEMEL KAVRAMLAR Elektromanyetik radyasyon Elektromagnetik radyasyon (elektromanyetik dalga, ışıma veya ışın) uzayda çok büyük bir hızla hareket eden bir enerji türüdür. Bu enerjinin çeşitli şekilleri bulunur, en çok karşılaşılan türleri; gözle algıladığımız görünür ışık, ısı şeklinde algılanan infrared (kırmızı ötesi) ışınları, X-ışınları ve radyo dalgalarıdır. Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki elektromanyetik radyasyon enerjisidir. Elektromanyetik radyasyon (EMR), kısa dalga boylu gama ışınlarından uzun dalga boylu radyo dalgalarına kadar olan radyan/ışıma enerjisini içerir. Elektromanyetik spektrum (tayf), yüksek enerjili gama ışınlarından çok düşük enerjili radyo dalgalarına kadar bilinen tüm elektromanyetik dalgaların dizilimidir (ya da tüm ışınlar yelpazesine verilen isim) (Tablo 1). Elektromanyetik radyasyonun dalga ve partikül özelliği Işık, gerek dalga ve gerekse partikül (foton) özellik gösteren elektromanyetik bir radyasyon enerjisi türüdür. Ölçümler ışığın hem dalga ve hem de partikül özelliklerine bağlıdır. Elektromanyetik radyasyon birbirine dik iki yatay düzlemde salınım gösteren elektriksel ve manyetik alanlardan oluşur. Elektrik ve manyetik komponentler dalganın/ radyasyonun yayılma doğrultusuna birbirlerine dik düzlemlerde titreşirler. EMR’nin madde ile ilişkilerinde aktif olan komponent elektrik komponentidir (Şekil 1). Absorpsiyon, emisyon (yayılma) ve fotoelektrik olaylarını açıklamak için, ışığın dalga özelliği yetersiz kalır ve partikül özelliği tanımlanmıştır. Dalga boyu özellikleri yanı sıra, ışık ve EMR spektrumunun diğer kısımları, sinüsoidal dalga hareketi gösteren enerji taşıyan foton denilen partiküllerden oluşmuştur. EMR dalga boyu ( ), l frekans (υ) ve dalga sayısı ile karakterize edilir. l Dalga boyu ( ) = Elektromanyetik spektrumda birbirini takip eden sinüsoidal dalga pikleri arasındaki mesafe (birbirini takip eden iki dalga tepe noktaları arasındaki 0 uzaklık) dalga boyudur. Birimi Angstrom (A ), milimikron (m m) veya nanometre (nm)'dir. Uluslararası standart ünite birimi nm olarak önerilmiştir. 1 nm =1 m m =10 A =10 m 0 -9 - Frekans (υ) = Sabit bir noktadan birim zamanda geçen dalga sayısıdır ve birimi (s 1 , devir/sn veya 1/sn) dir ve Hertz (Hz) olarak tanımlanır. Frekans (υ) = ışık hızı (c) / dalga boyu (λ) değerine eşittir. υ=c/λ Fotonların enerjisi ile frekansları aşağıdaki denklemle gösterilir; E= h υ -27 E= Fotonun enerjisi (erg), υ= frekans, h= Planck sabiti (6.6256 x 10 erg/sn) Işığın enerjisi, dalga boyu ile ters orantılıdır. Uzun dalga boyunda az sayıda foton bulunduğundan enerji, kısa dalga boyuna göre daha düşüktür. Bir diğer ifadeyle yüksek frekanstaki ışığın fotonlarıda yüksek enerjilidir. Bu ilişki aşağıdaki eşitlikte görülmektedir E= h υ = h c/ λ Örneğin, 200 nm’deki mor ötesi (UV) radyasyonu, 750 nm lik kırmızı ötesi (IR) radyasyonundan daha fazla enerji içerir.. Şekil 1. Elektromanyetik radyasyonun / dalganın genel özellikleri Elektromanyetik radyasyonun/ışımanın madde ile etkileşimleri EMR, madde ile temas edince yansıyabilir, kırılabilir, bir engel ile karşılaştığında difraksiyona uğrayabilir. Aynı veya farklı dalga boylu ışık halinde tekrar yayılabilir ve absorbe edilebilir. Işığın oriyantasyonunda örneğin, polarizasyonunda değişiklikler olabilir. Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon) Yayılma (emisyon) Geçiş (transmitans) Absorbsiyon (absorbans) Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (fluoresans) İnsan gözü, yaklaşık 380-750 nm arasında dalga boylarına sahip olan radyan enerjiye /ışık enerjilerine cevap verebilmektedir. Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan yayılan ışık, insan gözünün “beyaz” olarak algıladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır. Şekil 2 ve Tablo 2 , spektrumun UV, görünür ve IR bölgelerinde dalga boyları ile renk özellikleri arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Şekil 2. UV, Görünür ve IR Spektrum  Tablo 2. UV, Görünür ve IR Spektrumunun Özellikleri. Dalga Boyu Bölge Gözlenen Renk (nm) 750 İnfraruj(Kırmızı-ötesi, IR) Görünür değil Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini absorpluyorsa siyah görünür. Görünür ışık spektrumunda mavi rengi absorplayan bir madde sarı renkli, sarı rengi absorplayan bir madde mavi renkli görünür. Yeşil rengi absorplayan bir madde kırmızı renkli, kırmızı rengi absorplayan bir madde ise yeşil renkli görünür. Genellikle çözeltinin görünen rengini çözeltideki maddeden geçen (absorbe edilen değil) dalga boyları belirler. Transmite olan ve absorbe edilen dalga boyları bir diğerinin tamamlayıcısıdır. (Tablo 3). Böylece bir solüsyonun görünen rengi absorbe edilen dalga boylarının tamamlayıcısıdır. Örneğin, kırmızı renkli hemoglobin çözeltisi 540 nm’de yeşil ışığı absorblar ve sarı bilirubin çözeltisi 450 nm’de mavi ışığı absorblar. Madde tarafından absorblanan ışınların rengi ile maddenin görünür rengini oluşturan ışınların rengi, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır (Kırmızı-Yeşil, Sarı- Mavi). Tablo 3. Görünür Işığın Özellikleri ≈Dalga Boyu Absorbe edilen