Biochimie Metabolică - Note de curs MG (1) - 12-43 PDF

1.1. INTRODUCERE ÎN METABOLISMUL ENERGETIC Metabolismul energetic are ca scop regenerarea continuă a energiei chimice, consumată pe parcursul tuturor activităţilor organismului. Energia este înmagazinată sub forma legăturilor macroergice, a căror hidroliză este favorabilă din punct de vedere termodi...

1.1. INTRODUCERE ÎN METABOLISMUL ENERGETIC Metabolismul energetic are ca scop regenerarea continuă a energiei chimice, consumată pe parcursul tuturor activităţilor organismului. Energia este înmagazinată sub forma legăturilor macroergice, a căror hidroliză este favorabilă din punct de vedere termodinamic. Din punct de vedere energetic, reacţiile biochimice pot fi: Exergonice, dacă eliberează în mediul înconjurător o cantitate de energie mai mare decât cea consumată pentru desfăşurarea reacţiei; aceste reacţii au loc spontan. Endergonice, dacă primesc din mediul înconjurător o cantitate de energie mai mare decât cea eliberată în cursul reacţiei; aceste reacţii sunt imposibile din punct de vedere termodinamic. 1.2. MECANISMUL REACŢIILOR CUPLATE Mecanismul reacţiilor cuplate permite totuşi desfăşurarea reacţiilor endergonice, datorită intervenţiei enzimelor: aceeaşi enzimă catalizează ambele reacţii, folosind energia eliberată de reacţia exergonică pentru alimentarea reacţiei endergonice: A  X + E1 (E1 - energia eliberată de reacţia exergonică) B + E2  Y (E2 - energia consumată de reacţia endergonică) Reacţia generală este: A + B  X + Y + (E1-E2) Acest sistem este funcţional numai dacă energia eliberată de reacţia exergonică (E1) este mai mare decât energia consumată de reacţia endergonică (E2), astfel încât reacţia globală să elibereze o anumită cantitate de energie în mediul înconjurător. Reacţiile cuplate necesită intervenţia unor substraturi macroergice, a căror hidroliză furnizează peste 30 kJ/mol. Această energie provine din disocierea legăturilor chimice de tip macroergic, relativ instabile. Invers, sinteza compuşilor macroergici necesită un aport exogen de energie. 1.3. CLASIFICAREA LEGĂTURILOR MACROERGICE Din punct de vedere chimic, legăturile macroergice pot fi de mai multe tipuri: a. Legături de tip fosfo-anhidridă (ATP) sau anhidridă mixtă (1,3-difosfo-glicerat) b. Legături de tip fosfo-amidă (creatin-fosfat) c. Legături de tip fosfo-enol (fosfo-enolpiruvat) d. Legături de tip acil-tiol (succinil-CoA). Principalul compus macroergic este ATP (adenozin-5’-trifosfat), care eliberează o mare cantitate de energie prin hidroliza celor două legături de tip fosfo-anhidridă (Figura 1.1.): ATP  ADP + fosfat + 31 kJ/mol, sau ATP  AMP + pirofosfat + 42 kJ/mol Hidroliza pirofosfatului, catalizată de pirofosfatază, asigură ireversibilitatea reacţiilor cuplate cu aceste transformări. Energia rezultată din această hidroliză va fi eliberată în mediul înconjurător sub formă de căldură. Enzimele care utilizează ATP ca donor de energie necesită şi prezenţa cofactorului Mg2+. 12  Figura 1.1. Structura ATP şi a produşilor săi de hidroliză; ATP: adenozin-5’-trifosfat; ADP: adenozin-5’-difosfat; AMP: adenozin-5’-monofosfat 1.4. IMPORTANŢA ATP ŞI A GTP ATP este cel mai important donor de energie liberă, obţinută prin hidroliza legăturilor sale macroergice. Această energie chimică poate fi convertită în diverse alte forme de energie, utile diferitelor funcţii ale organismului: - Energie mecanică pentru contracţia musculară - Energie osmotică pentru realizarea schimburilor transmembranare - Energie chimică pentru reacţiile de sinteză - Energie calorică pentru menţinerea temperaturii constante - Energie electrică pentru propagarea influxului nervos - Energie luminoasă la organismele capabile să emită radiaţii luminoase. ATP nu este doar un donor de energie. Intervenţia sa în reacţiile biochimice se evidenţiază şi prin rolul structural pe care îl îndeplineşte în anumite transformări metabolice. Astfel, ATP poate fi: - Donor de grupări fosfat, pentru enzimele din clasa kinazelor - Donor de pirofosfat, pentru activarea tiaminei (vitamina B1) - Donor de AMP, în reacţiile de activare a acizilor graşi sau a aminoacizilor - Donor de adenozină, pentru sinteza S-adenozil-metioninei. Un alt compus macroergic care intervine frecvent în reacţiile biochimice este GTP (guanozin-5’- trifosfat) a cărui conversie în GDP şi fosfat eliberează aceeaşi cantitate de energie ca şi hidroliza ATP. Enzimele care utilizează GTP ca donor de energie necesită în acelaşi timp prezenţa cofactorului Mg2+. La fel ca şi ATP, GTP poate funcţiona ca donor de grupări chimice în cadrul reacţiilor metabolice: - Donor de fosfat, pentru sinteza de glucoză - Donor de GMP, în cadrul reacţiilor metabolismului glucidic - Donor de GDP, pentru activarea mitocondrială a acizilor graşi. 13 1.5. CICLUL ATP-ADP Energia care rezultă din oxidarea substratelor este stocată la nivelul legăturilor macroergice, în principal ale ATP. Hidroliza ATP însoţeşte fenomenele care necesită consum de energie. De aceea, ATP este regenerat permanent, având un turn-over accelerat. Aceste transformări constituie ciclul ATP-ADP (Figura 1.2). Resinteza ATP este scopul final al reacţiilor metabolismului energetic. Regenerarea ATP, prin cuplarea unui rest fosfat pe molecula ADP, este un proces defavorabil din punct de vedere termodinamic. Reacţia necesită un aport exogen de energie (31 kJ/mol), care poate fi obţinută prin două mecanisme principale: - Fosforilarea la nivel de substrat, prin cuplarea ADP cu acidul fosforic, utilizând energia eliberată de un alt compus macroergic - Fosforilarea oxidativă la nivelul lanţului respirator mitocondrial, utilizând energia unui gradient de protoni pentru fosforilarea ADP. Figura 1.2. Ciclul ATP - ADP Fosforilarea la nivel de substrat regenerează doar o mică parte din totalitatea ATP. Acest proces este însă important pentru ţesuturile anaerobe, care nu dispun de mitocondrii şi depind în totalitate de aceste reacţii pentru resinteza ATP sau a GTP. Fosforilarea la nivel de substrat se bazează pe principiul reacţiilor cuplate. Enzimele care catalizează aceste reacţii transferă ADP- ului (sau GDP) atât un radical fosfat, cât şi energia liberă obţinută prin disocierea unui alt compus macroergic (Figura 1.3.). 14  Figura 1.3. Exemple de reacţii de fosforilare la nivel de substrat Fosforilarea oxidativă mitocondrială presupune stabilirea unui gradient electrochimic prin oxidarea coenzimelor transportoare de electroni, în prezenţa oxigenului molecular, provenit din respiraţie. Energia care rezultă serveşte la fosforilarea ADP, de către ATP-sintetaza mitocondrială. Metabolismul energetic diferă în funcţie de starea nutriţională a organismului. În reglarea metabolismului energetic, un rol important revine stimulilor hormonali, în special insulina şi glucagonul, al căror raport permite ajustarea fluxului diferitelor căi metabolice, în funcţie de disponibilitatea resurselor nutritive. Cunoaşterea metabolismului energetic permite înţelegerea mecanismelor moleculare ale patogenezei unor afecţiuni frecvente: obezitatea, diabetul zaharat, sindromul metabolic sau intoleranţa la glucoză. Pe de altă parte, elucidarea patogenezei bolilor mitocondriale, cauzate de deficienţe ereditare ale enzimelor mitocondriale sau de leziuni dobândite ale ADN mitocondrial, a condus la dezvoltarea rapidă a acestui domeniu medical şi la extinderea posibilităţilor de recunoaştere, diagnostic şi intervenţie terapeutică. 15 16  2. Metabolismul glucidic 2.1. Glucide: roluri, clasificare, structură, izomerie 2.2. Glicoliza 2.2.1. Etapele si reglarea glicolizei 2.2.2. Importanța medicală 2.2.3. Soarta piruvatului 2.2.4. Ciclul acidului lactic (ciclul Cori) 2.3. Gluconeogeneza 2.3.1. Gluconeogeneza din piruvat 2.3.2. Gluconeogeneza din lactat 2.3.3. Gluconeogeneza din glicerol 2.3.4. Gluconeogeneza din aminoacizi 2.4. Calea pentozo-fosfat 2.4.1. Reacțiile căii pentozo-fosfat 2.4.2. Reglarea căii pentozo-fosfat 2.4.3. Importanța medicală 2.5. Calea acidului glucuronic 2.5.1. Rolul și reacțiile căii acidului glucuronic 2.5.2. Importanța medicală 2.6. Ciclul Krebs 2.6.1. Proveniența substratelor 2.6.2. Etapele și bilanțul energetic al ciclului Krebs 2.6.3. Reglarea ciclului Krebs 2.6.4. Importanța medicală 2.7. Lanțul respirator mitocondrial 2.7.1. Importanța și organizarea lanțului respirator mitocondrial 2.7.2. Bilanțul energetic și reglarea lanțului repirator 2.7.3. Bolile mitocondriale 2.7.4. Navetele mitocondriale 2.8. Metabolismul glicogenului 2.8.1. Glicogenoliza 2.8.2. Glicogenogeneza 2.8.3. Reglarea metabolismului glicogenului 2.8.4. Glicogenoze 2.9. Metabolismul fructozei, galactozei, manozei 2.9.1. Metabolismul fructozei 2.9.2. Transformarea manozei în fructoză 2.9.3. Transformarea glucozei în fructoză pe calea sorbitolului 2.9.4. Metabolismul galactozei 2.9.5. Importanța medicală 2.10. Glicozaminoglicanii. Proteoglicanii. Glicoproteinele. 2.10.1. Structura glicozaminoglicanilor 2.10.2. Clasificarea glicozaminoglicanilor 2.10.3. Importanța medicală 17 Obiectivele acestui capitol sunt: - Prezentarea noţiunilor de bază ale metabolismului glucidic - Explicarea principalelor căi de metabolizare ale glucozei, fructozei, galactozei, manozei; - Modalități de metabolizare ale carbohidraților și interrelațiile cu metabolismul proteinelor și al lipidelor - Însuşirea corelaţiilor şi a aplicaţiilor medicale privind deficitul unor enzime în metabolismul glucidic 18 2.1. GLUCIDE: ROLURI, CLASIFICARE, STRUCTURĂ, IZOMERIE Glucidele reprezintă cele mai abundente molecule organice din natură şi îndeplinesc roluri importante în organismul uman, cum ar fi: - Au un important rol energetic – reprezintă o formă de stocare a energiei în organism; - Sunt componente ale membranelor celulare, îndeplinind un important rol structural; - Mediază diferite tipuri de comunicare intercelulară. Glucidele (hidraţii de carbon) pot fi împărţite în trei mari clase: monozaharide, oligozaharide şi polizaharide. Monozaharidele (glucidele simple) sunt unităţi polihidroxialdehidice sau polihidroxicetonice. Figura 2.1. Monozaharidele cu o grupare aldehidică (A) în structura lor se numesc aldoze, iar monozaharidele cu o grupare cetonică (B) în structura lor se numesc cetoze. Formula generală a monozaharidelor este (CH2O)n, unde n≥3. În funcţie de numărul atomilor de carbon, monozaharidele sunt numite: trioze (C3), tetroze (C4), pentoze (C5), hexoze (C6) etc. Toate monozaharidele, cu excepţia dihidroxiacetonei, conţin unul sau mai mulţi atomi de carbon asimetrici (un atom de carbon cu patru substituenţi diferiţi). Datorită faptului că monozaharidele conţin atomi de carbon asimetrici în structura lor, mai mulţi izomeri (compuşi cu aceeaşi formulă moleculară, dar structuri diferite) pot fi descrişi. Izomerii care diferă doar după aranjarea în spaţiu a atomilor componenţi se numesc stereoizomeri. Dacă n reprezintă numărul atomilor de carbon asimetrici, atunci pot fi descrişi 2n stereoizomeri. Unii stereoizomeri sunt imaginea în oglindă a celuilalt şi se numesc enantiomeri; alţii, nu sunt imaginea în oglindă a celuilalt şi se numesc diastereomeri (Figura 2.2.). Figura 2.2. Exemple de enantiomeri și diastereomeri. 19 Cel mai simplu monozaharid cu grupare aldehidică în structura sa –gliceraldehida– conţine un singur atom de carbon asimetric şi, prin urmare, i se pot descrie doar doi stereoizomeri (enantiomeri) (Figura 2.3.). D-gliceraldehida L-gliceraldehida Figura 2.3 Cel mai simplu monozaharid, D-gliceraldehida, prezintă gruparea –OH legată de atomul de carbon asimetric, orientată în dreapta, iar izomerul L are gruparea hidroxil în stânga. Prin convenţie, dacă gruparea –OH este în dreapta, gliceraldehida aparţine seriei D (D- gliceraldehida), iar dacă gruparea –OH este în stânga, aparţine seriei L (L-gliceraldehida). Majoritatea monozaharidelor din organismul uman aparţin seriei D. În situaţia în care monozaharidul conţine mai mult de un atom de carbon asimetric în structura sa, poziţia grupării – OH de la ultimul atom de carbon asimetric este luat ca şi referinţă pentru apartenenţa structurii respective la seria D- sau L (Figura 2.4.). Figura 2.4. În structura liniară a glucozei poziția grupării -OH la ultimul carbon asimetric denotă izomerul D sau L în funcție de poziția grupării -OH la dreapta sau la stânga. Două monozaharide care diferă doar prin configuraţia substituenţilor de la nivelul unui singur atom de carbon asimetric se numesc epimeri. (Figura 2.5.) 20  Figura 2.5. Epimerii se deosebesc între ei prin configurația substituenților la un singur atom de C asimetric. Monozaharidele cu cinci sau mai mulţi atomi de carbon în structura lor se prezintă, de multe ori, sub forma unei structuri ciclice. Pentru aceste structuri ciclice sunt caracteristice alte tipuri de izomeri numite anomeri (α- şi β-anomeri). Diferenţa dintre aceste tipuri de izomeri (anomeri) este dată de poziţionarea grupării –OH de la C1 (pentru aldoze) sau C2 (pentru cetoze) faţă de gruparea –CH2OH ataşată lui C5 (ultimul atom de carbon asimetric) (Figura 2.6.). Figura 2.6. α- şi β-anomeri: α-Glucoza: gruparea –OH ataşată la C1 este poziționată trans față de gruparea –CH2OH de la C5. β-Glucoza: gruparea –OH ataşată la C1 este poziționată cis față de gruparea –CH2OH de la C5. Oligozaharidele sunt reprezentate de lanțuri scurte ce conţin două până la zece unități monozaharidice, legate între ele prin legături glicozidice. Polizaharidele conțin mai mult de zece unități monozaharidice. Homopolizaharidele sunt polizaharide cu un singur tip de unităţi monozaharidice în structura lor; heteropolizaharidele conţin diferite unităţi monozaharidice în structura lor. 21 2.2. GLICOLIZA 2.2.1. Etapele și reglarea glicolizei Glicoliza reprezintă o cale metabolică majoră, prin care glucoza este transformată în acid piruvic (piruvat), cu formare de energie, incorporată sub forma ATP (2 molecule de ATP se obțin strict din conversia unei molecule de glucoză în două molecule de acid piruvic). În condiții de aerobioză, piruvatul pătrunde în mitocondrie, unde este apoi complet oxidat la CO2 si H2O. În țesuturile în care necesarul de oxigen este insuficient (cum sunt hematiile, leucocitele, cristalinul, corneea, testiculele, mușchiul scheletic în timpul activitații), acidul piruvic este transformat în acid lactic (lactat); acidul lactic este produsul final al glicolizei anaerobe în celulele eucariote. Conversia unei molecule de glucoză la două molecule de piruvat în cadrul glicolizei este insoțită de transformarea netă a două molecule de ADP în ATP, precum și de reducerea a două molecule de NAD+ la NADH. Reacția generală a glicolizei poate fi redată în felul următor: GLUCOZA + 2ADP + 2NAD+ + 2P  2PIRUVAT + 2ATP + 2NADH + 2H+ +2H2O Glicoliza are loc în citoplasmă și cuprinde zece reacții (Figura 2.7), dintre care trei sunt ireversibile. Ea poate fi împărțită, din punct de vedere energetic, în două etape: a. O etapă utilizatoare de energie, în care ATP-ul este consumat (și care, didactic, ar include primele cinci reacții); b. O etapă generatoare de energie, în care se realizează un caștig net de ATP (în care ar intra ultimele cinci reacții). Figura 2.7.: Reacțiile biochimice ale glicolizei. 22 O explicație a reacțiilor catalizate enzimatic din glicoliză este redată în Tabelul I. Reacția Enzima Specificații 1 Glucoza + ATP → Glucozo - 6 - Hexokinaza, Hexokinaza este prezentă în toate celulele și fosfat + ADP Glucokinaza are un KM redus (afinitate mare) pentru glucoză. Glucokinaza este prezentă în ficat (și celulele β ale pancreasului) și are un KM ridicat (afinitate redusă) pt glucoză. Reacția este ireversibilă și este importantă în reglarea procesului de glicoliză. 2 Glucozo - 6 - fosfat ↔ Fructozo - 6 - Glucozo-6- Este o reacție de izomerizare. fosfat fosfat izomeraza 3 Fructozo - 6 - fosfat + ATP → Fosfofructo- Reacția este catalizată de FFK1 (există o Fructozo - 1,6 - difosfat + ADP kinaza 1 altă fosfofructokinază, FFK2, care (FFK1) catalizează fosforilarea fructozo-6- fosfatului la fructozo-2,6-difosfat). Reacția este ireversibilă și este importantă în reglarea glicolizei. 4 Fructozo - 1,6 - difosfat ↔ Aldolaza Fructozo-1,6 - difosfatul (C6) este clivat în Dihidroxiacetonfosfat (DHAF) + doua trioze (C3) fosforilate în prezența unei Gliceraldehid-3-fosfat (GA3F) aldolaze. 5 DHAF ↔ GA3F Triozofosfat Este o reacție de interconversiune a unor trioze izomeraza fosforilate. 6 GA3F + NAD+ + Pi ↔ 1,3- Gliceraldehid- 1,3–Difosfogliceratul conține o legatură Difosfoglicerat + NADH + H+ 3-fosfat macroergică în structura sa. dehidrogenaza 7 1,3 - Difosfoglicerat + ADP ↔ 3- Fosfoglicerat Este o reacție de fosforilare la nivel de Fosfoglicerat + ATP kinaza substrat. 8 3-Fosfoglicerat ↔ 2-Fosfoglicerat Fosfoglicerat Gruparea fosfat se mută din poziția 3 (C3) în mutaza poziția 2 (C2). 9 2-Fosfoglicerat ↔ Fosfoenolpiruvat Enolaza FEP conține o legatură macroergică. (FEP) + H2O 10 FEP + ADP → Piruvat (Acid Piruvat Această reacție este un alt exemplu de piruvic) + ATP kinaza fosforilare la nivel de substrat în cadrul glicolizei. Este o reactie ireversibilă, importantă în reglarea glicolizei. Tabelul I: Reacțiile biochimice ale glicolizei, enzimele participante și semnificația lor. Reacțiile ireversibile, importante în reglarea glicolizei sunt redate boldat. 23 Reglarea glicolizei Reacţiile din glicoliză sunt reversibile cu excepţia acelora catalizate de hexokinază (respectiv glucokinază), fosfofructokinaza-1 (FFK1) şi piruvat-kinaza (PK). Reglarea acestor enzime și, deci, a glicolizei în general, implică atât un mecanism allosteric, cât şi unul prin modificare covalentă, controlat hormonal. Cei mai importanţi hormoni implicaţi în controlul glicolizei (ca şi a gluconeogenezei) sunt insulina și glucagonul. Insulina, ca şi hormon hipoglicemiant, scade concentraţia glucozei în sânge. Prin urmare, insulina activează glicoliza şi inhibă gluconeogeneza. Glucagonul, hormon hiperglicemiant, creşte nivelul de glucoză în sânge. Prin urmare, glucagonul activează gluconeogeneza si inhibă glicoliza. (Figura 2.8.) Figura 2.8. Implicarea hormonilor în reglarea glicolizei. Hexokinaza, localizată la nivelul ţesuturilor extrahepatice, este inhibată de glucozo-6-fosfat (G- 6-P), produsul reacţiei catalizată de această enzimă. Glucokinaza în schimb este localizată în ficat şi are o afinitate mică pentru glucoză, nu este inhibată de glucozo-6-fosfat, ca produs final de reacţie. Activitatea enzimei creşte semnificativ atunci când nivelul de glucoză în sânge este mult mai mare (de exemplu postprandial). Insulina stimulează activitatea glucokinazei. Fosfofructokinaza 1 (FFK1/PFK1) este cel mai important element de control al glicolizei. Enzima este inhibată de nivelele crescute de ATP, citrat şi activată de AMP, fructozo-2,6-difosfat (Figura 2.9). Acesta din urmă rezultă din fructozo-6-fosfat sub acțiunea fosfofructokinazei 2 (PFK2/FFK2 De altfel, fructozo-2,6-difosfatul este, se pare, cel mai important activator al fosfofructokinazei-1. În ficat, fructozo-2,6-difosfatul semnalizează o concentraţie crescută a glucozei și este hidrolizat la fructozo-6-fosfat de către fructozo-2,6-bisfosfataza. 24  Figura 2.9.: Reglarea fosfofructokinazei 1. Principalul ei reglator în ficat este fructozo-2,6-difosfat-ul ce semnalează o prezența glucozei. Fosfofructokinaza-2 şi fructozo-2,6-bisfosfataza funcţionează ca şi o enzimă tandem. Mecanismul de acţiune al glucagonului şi al insulinei la nivelul acestei enzime tandem (reprezentată de fosfofructokinaza-2 şi fructozo-2,6-bisfosfataza) ca şi asupra fosfofructokinazei 1 este prezentat în Figura 2.10. Figura 2.10. : Reglarea activității FFK 2 și a Fructozo-2,6-bisfosfatazei este controlată hormonal. Piruvat kinaza (PK) reprezintă un alt nivel important de control al glicolizei. Enzima este inhibată alosteric de către ATP şi alanină şi activată de fructozo-1,6-difosfat. Enzima este, de asemenea, reglată şi printr-un mecanism de fosforilare/defosforilare, controlată hormonal. Mecanismul de acţiune a glucagonului şi a insulinei asupra piruvat kinazei este prezentat în Figura 2.11. 25 Figure 2.11.: Glucagonul inactivează prin fosforilare PK. Inactivând PK se inhibă glicoliza.Insulina are efect opus, stimulând glicoliza. 2.2.2. Importanţa medicală În mod obișnuit în hematii 1,3–difosfogliceratul (sau bisfosfogliceratul) este convertit la 2,3- difosfoglicerat (2,3-DFG=2,3-DPG) sub acțiunea bisfosfoglicerat mutazei; 2,3-DPG se găsește în cantități foarte mici (urme) în majoritatea celulelor, dar este prezent în concentrații mari în hematii. Acesta are rol în disocierea oxigenului din oxihemoglobină, prin interacționarea cu subunitatea beta a hemoglobinei, scăzându-i afinitatea față de oxigen, ajutând la eliberarea lui din hemoglobină, crescând astfel abilitatea hematiilor de a ceda oxigenul către celule/ țesuturi. Celulele cu un grad de hipoxie crescut au fosfatul crescut, prin urmare și 2,3- DPG crescut. Deficienţa de piruvat kinază (PK) eritrocitară este o boală ereditară asociată cu scăderea concentraţiei de ATP și modificări ale permeabilităţii membranei eritrocitare, ce se manifestă clinic prin apariţia anemiei hemolitice. În plus, datorită hipoxiei, nivelul 2,3-bisfosfogliceratului intraeritrocitar creşte, cu apariţia unor tulburări în oxigenarea tisulară, datorat eliberării reduse de oxigen din hematii. Deficitul de PK se transmite ereditar autosomal recesiv și are ca efect reducerea metabolizării glucozei, având consecință scăderea ATP-ului din eritrocite cu apariția unei anemii hemolitice cronice. De asemenea, subiecții cu deficiență de hexokinază au nivele de 2,3-DPG scăzute (cu 70% față de normal), astfel încât afinitatea hemoglobinei față de oxigen este mai mare decât normal, eliberararea oxigenului din hematii spre țesuturi fiind semnificativ redusă. 2.2.3. Soarta piruvatului Piruvatul (acidul piruvic) rezultat din glicoliză are mai multe posibilităţi de transformare. Transformarea piruvatului în acetil-CoA (decarboxilarea oxidativă a piruvatului) Procesul reprezintă o cale metabolică importantă în țesuturile cu o capacitate oxidativă înaltă si este catalizat de complexul multienzimatic al piruvat dehidrogenazei (PDH). Acetil-CoA rezultat constituie o sursă importantă de energie prin participarea sa la ciclul acizilor 26 tricarboxilici, dar reprezintă și o unitate structurală esențială pentru sinteza acizilor grași, a colesterolului sau a corpilor cetonici. PDH este un complex multienzimatic localizat în matricea mitocondrială, format din trei enzime: 1. Piruvat decarboxilaza 2. Dihidrolipoil transacetilaza 3. Dihidrolipoil dehidrogenaza Piruvatul rezultat din glicoliză pătrunde în mitocondrie, unde este decarboxilat oxidativ la acetil- CoA (reacția este ireversibilă si are loc în mitocondrie), în prezența PDH, conform reacției prezentate în Figura 2.12. Dacă reacția generală este relativ simplă, mecanismul de acțiune al PDH este complex și implică participarea și a celor cinci coenzime care intră în structura acestui complex multienzimatic si anume: tiaminpirofosfatul, acidul lipoic, HSCoA, FAD si NAD+. Figura 2.12.:Formarea acetil-CoA din piruvat sub acțiunea complexului piruvat dehidrogenaza (PDH). PDH există sub două forme: 1. O formă activă, defosforilată 2. O formă inactivă, fosforilată Transformarea formei defosforilate (active) în forma fosforilată (inactivă) este catalizată de o kinază. Kinaza la rândul său este activată de concentrații crescute de acetil-CoA și NADH (produși finali de reacție). Aceștia stimulează transformarea sa în forma inactivă, fosforilată. În schimb, o scădere a ATP-ului inhibă kinaza și permite fosfatazei să transforme forma fosforilată a enzimei (inactivă) în forma defosforilată (activă) (Figura 2.13). Transformarea piruvatului în lactat (acid lactic) Formarea lactatului reprezintă calea majoră de transformare a piruvatului în țesuturile în care necesarul de oxigen este insuficient (hematii, leucocite, cristalin, cornee, testicule, mușchi scheletic în timpul activității). Lactatul este produsul final al glicolizei anaerobe în celulele eucariote.Reacția este catalizată de lactat dehidrogenază (LDH) și are loc la nivelul citoplasmei (Figura 2.14.). 27  Figura 2.13.: Reglarea complexului PDH în funcție de produșii de reacție sau de prezența unor microelemente. Figura 2.14.: Transformarea piruvatului în lactat este catalizată de LDH. Transformarea piruvatului în oxaloacetat Oxaloacetatul este un intermediar al gluconeogenezei, dar și al ciclului citric. Reacția este catalizată de piruvat carboxilază, o enzimă biotin-dependentă. Procesul are loc la nivel mitocondrial, reacția fiind de tip ireversibil (Figura 2.15). Figura 2.15.: Transformarea piruvatului în oxalacetat este catalizată de piruvat carboxilază. 28 Transformarea piruvatului în etanol Unele microorganisme au capacitatea de a transforma glucoza în etanol și CO2 în două etape, cu formare de acetaldehidă ca produs intermediar. Reacția are loc în citoplasma celulară și este dependentă de tiaminpirofosfat (TPF) (Figura 2.16.). Figura 2.16.: Transformarea piruvatului în etanol este catalizată de piruvat carboxilază și alcool dehidrogenază. 2.2.4. Ciclul acidului lactic (ciclul Cori) În muşchiul scheletic, în timpul unui exerciţiu fizic intens, majoritatea moleculelor de acid piruvic, rezultate din glicoliză, sunt transformate în acid lactic (şi doar aproximativ 8% sunt transformate în acetil-CoA şi utilizate apoi în ciclul citric). Aceste molecule de acid lactic difuzează în sânge şi ajung la ficat, unde sunt apoi oxidate la acid piruvic. Piruvatul este transformat în glucoză (prin gluconeogeneză), care ajunge în sânge fiind preluată apoi de către muşchi. Acest ciclu este numit ciclul Cori (Figura 2.17), prin care acidul lactic este folosit eficient în beneficiul organismului. Acumularea de acid lactic în mușchi duce la apariţia crampelor musculare. Figura 2.17.: Ciclul Cori este responsabil de transformarea piruvatului în lactat (mușchi) și a lactatului în piruvat (ficat). Reacțiile reversibile sunt catalizate de LDH. 29 2.3. GLUCONEOGENEZA Gluconeogeneza reprezintă procesul de sinteză a glucozei din compuşi neglucidici de tipul: piruvat, lactat, glicerol, unii aminoacizi. 2.3.1. Gluconeogeneza din piruvat Procesul are loc predominant în ficat, localizat parţial la nivel mitocondrial și parţial citoplasmatic. În această cale metabolică, piruvatul este convertit la glucoză în urma a zece reacţii. Dintre acestea unele reacții reversibile sunt comune cu calea glicolitică, dar parcurse în sens opus glicolizei: Cele trei reacţii ireversibile din glicoliză sunt diferite în gluconeogeneză, fiind catalizate de enzime specifice. Reacţiile gluconeogenezei (din piruvat) sunt prezentate în figura de mai jos. Figura 2.18.: Etapele gluconeogenezei. Transformarea piruvatului în oxaloacetat are loc la nivelul mitocondriei celulare, în timp ce celelalte reacţii din gluconeogeneză au loc în citoplasmă. 30 Etapele gluconeogenezei (din piruvat) A. Transformarea piruvatului în fosfoenolpiruvat (FEP) Figura 2.19. Fosfoenolpiruvatul (FEP) rezultă din oxaloacetat. Conversia piruvatului la fosfoenolpiruvat (FEP) are loc în două etape: În prima etapă, piruvatul este transformat în oxaloacetat, printr-o reacţie de carboxilare catalizată de o enzimă biotin-dependentă numită piruvat carboxilază. Aceasta este o enzimă localizată în mitocondria celulelor hepatice şi renale, dar nu şi în cele musculare. Enzima este activată alosteric de acetil-CoA. Reacţia este un proces consumator de energie (ATP). În a doua etapă, oxaloacetatul este transformat în fosfoenolpiruvat (FEP) în prezenţa enzimei numită fosfoenolpiruvat carboxikinaza (FEPCK), prin pierderea unei molecule de CO2 şi ataşarea unei grupări fosfat (printr-o legătură macroergică), provenită din hidroliza GTP; reacţia are loc în citoplasma celulară. Întrucât oxaloacetatul format în mitocondrie (din piruvat) este incapabil de a traversa membranele mitocondriale pentru a fi apoi transformat în FEP, este necesar ca acesta (oxaloacetatul) să fie mai întâi redus la malat (sub acţiunea MDH – malat dehidrogenazei), care poate trece din mitocondrie în citoplasmă. În citoplasmă, malatul este retransformat în oxaloacetat, care este apoi convertit la fosfoenolpiruvat (FEP). (Figura 2.21) 31  Figura 2.20. Oxaloacetatul este transformat în malat, putând trece doar în această formă din mitocondrie în citosol. B. Transformarea fructozo-1,6-difosfatului (bisfosfatului) în fructozo-6-fosfat Fructozo-1,6-difosfatul (bisfosfatul) este transformat în fructozo-6-fosfat printr-o reacţie de hidroliză catalizată de fructozo-1,6-bisfosfataza, enzimă citoplasmatică prezentă în ficat (şi rinichi). Enzima este stimulată de nivelele crescute de ATP şi inhibată de concentraţiile înalte de AMP. (Figura 2.20) Figura 2.21. Transformarea Fructozo-1,6-difosfatul (bisfosfatul) în fructozo-6-fosfat C. Transformarea glucozo-6-fosfatului în glucoză Hidroliza glucozo-6-fosfatului la glucoză este o reacţie catalizată de glucozo-6-fosfatază. Enzima este localizata la nivelul celulelor hepatice (şi renale), dar nu şi la nivelul celulelor musculare, astfel încât muşchiul nu poate furniza glucoză prin procesul gluconeogenezei. De altfel, doar ficatul (unde enzima este activă) poate realimenta sângele cu glucoză prin gluconeogeneză. Glucoza asfel eliberată din ficat şi ajunsă în circulaţie, este transportată apoi la celelalte ţesuturi. 32  Figura 2.22. Transformarea glucozo-6-fosfatului în glucoză este catalizată de glucozo-6-fosfatază. Reglarea gluconeogenezei Reglarea procesului de gluconeogeneză este realizată de enzimele cheie implicate în această cale metabolică: piruvat carboxilaza, fosfoenolpiruvat carboxikinaza, fructozo-1,6-bisfosfataza şi glucozo-6-fosfataza. Piruvat carboxilaza este o enzimă alosterică activată de acetil-CoA. În acest fel va fi diponibil suficient oxaloacetat pentru condensarea cu acetil-CoA pentru a forma citrat în cadrul ciclului citric. În acelaşi timp, acetil-CoA este un inhibitor al complexului multienzimatic al piruvat dehidrogenazei (PDH), astfel încât conversia piruvatului spre oxaloacetat este favorizată. Fosfoenolpiruvat carboxikinaza este stimulată de concentraţiile crescute de ATP şi oxaloacetat. Un raport crescut glucagon/insulină favorizează, de asemenea, inducerea sintezei acestei enzime gluconeogenetice. Când nivelul de glucagon este crescut, concentraţia de cAMP intracelular creşte, piruvat dehidrogenaza (PDH) este fosforilată, devenind inactivă. Aceasta va face ca mai mult piruvat sa fie convertit înspre oxaloacetat şi în acest mod canalizat înspre gluconeogeneză. Fructozo-1,6-bisfosfataza este activată de oxaloacetat. În acelaşi timp, enzima este inhibată de fructozo-2,6-bisfosfat şi AMP. Toţi aceşti efectori au un efect opus asupra fosfofructokinazei 1, enzimă implicată în reglarea glicolizei. Şi sinteza aceastei enzime este indusă de un raport crescut glucagon/insulină. Activitatea glucozo-6-fosfatazei este influenţată de nivelul glucozei serice. Când glicemia scade, activitatea glucozo-6-fosfatazei creşte şi invers. Enzima este, de asemenea, indusă de un raport crescut glucagon/insulină. 33 2.3.2. Gluconeogeneza din lactat Figura 2.23. Transformarea lactatului în piruvat este o reacţie reversibilă, catalizată de către lactat dehidrogenază (LDH). 2.3.1. Gluconeogeneza din glicerol Figura 2.24. Transformarea glicerolului în glucoză. 34 2.3.2. Gluconeogeneza din aminoacizi Aminoacizii glucoformatori sunt acei aminoacizi al căror catabolism generează piruvat sau unul dintre intermediarii ciclului citric. Alanina este cel mai important aminoacid glucoformator. Alanina, obţinută din piruvat printr-o reacţie de transaminare, este eliberată din muşchi şi transportată la ficat, unde este convertită la piruvat. Apoi, piruvatul este transformat în glucoză prin procesul de gluconeogeneză. Odată ajunsă în sânge (din ficat), glucoza este preluată de către muşchi şi poate fi transformată în piruvat (prin glicoliză), care, apoi, din nou, poate fi transaminată la alanină. Figura 2.25. Gluconeogeneza din aminoacizi 2.4. CALEA PENTOZO-FOSFAT Calea pentozo-fosfat este o cale alternativă de metabolism a glucozei şi are două roluri importante: de a genera echivalenţi reducători de tipul NADPH și de producere a ribozo-5-fosfat. NADPH (nicotinamid adenin dinucleotid fosfat) este folosit în diferite procese de sinteză: a acizilor graşi, a colesterolului sau a hormonilor steroizi. În acelaşi timp, NADPH este utilizat de către eritrocite pentru a menţine glutationul în formă redusă (Figura 2.26). Glutationul redus este important în menţinerea integrităţii membranei eritocitare întrucât reacţionează cu peroxizi (de tipul peroxidului de hidrogen, de exemplu) şi radicali liberi formaţi în celulă, care pot distruge membrana eritrocitară. NADPH este, de asemenea, folosit şi pentru meţinerea ionului de fier hemoglobinic în forma redusă (Fe2+), prevenind acumularea de methemoglobină. NADPH este utilizat şi în sinteza oxidului nitric (NO), compus care îndeplineşte câteva roluri importante şi anume: are acţiune vasodilatatoare, previne agregarea plachetară şi acţionează şi ca neurotransmiţător. Ribozo-5-fosfatul este folosit pentru sinteza nucleotidelor, dar intră și în componenţa unor coenzime (de tipul NAD+, FAD, HS-CoA) sau poate fi convertit în alte monozaharide cu 3, 4, 5, 6 sau 7 atomi de carbon. 35 Figura 2.26. Glutationul redus (G-SH) este un tripeptid compus din: glicină, cisteină şi acid glutamic ce se formează sub acțiunea glutation reductazei. 2.4.1. Reacţiile căii pentozo-fosfat Calea pentozo-fosfat are loc la nivelul citoplasmei celulare (este o cale metabolică importantă în eritrocite, ficat, glande mamare, ţesut adipos, testicule) si poate fi împărţită în două etape: Etapa oxidativă – reacţiile sunt ireversibile şi conduc la formarea de NADPH şi ribulozo-5- fosfat. (Figura 2.27) Etapa nonoxidativă – reacţiile sunt reversibile; în această etapă, ribulozo-5-fosfatul (obţinut în etapa oxidativă) este transformat în ribozo-5-fosfat (compus important în sinteza nucleotidelor), dar şi în intermediari ai glicolizei, de tipul fructozo-6-fosfatului şi gliceraldehid-3-fosfatului. (Figura 2.28.). Figura 2.27. Etapa oxidativă a căii pentozo-fosfat este ireversibilă și duce la formarea NADPH și ribulozo-5-fosfat. 36  Figura 2.28. Etapa nonoxidativă a căii pentozo-fosfat este reversibilă și duce la formarea ribozo-5-fosfat, fructozo-6-fosfat. Evoluţia ulterioară a componentelor căii pentozo-fosfat este influenţată de necesităţile celulei: a. Atunci când este nevoie de mai mult NADPH decât de ribozo-5-fosfat, transcetolaza şi transaldolaza vor converti ribozo-5-fosfatul la fructozo-6-fosfat şi gliceraldehid-3-fosfat, care sunt intermediari ai glicolizei. b. Când necesităţile celulei impun mai mult ribozo-5-fosfat decât NADPH, reacţiile din etapa non-oxidativă pot furniza ribozo-5-fosfat din fructozo-6-fosfat şi gliceraldehid-3- fosfat în absenţa reacţiilor din etapa oxidativă. 2.4.2. Reglarea căii pentozo-fosfat Cel mai important element în reglarea căii pentozo-fosfat este reprezentat de nivelul de NADP+. Reacţia catalizată de glucozo-6-fosfat dehidrogenază este etapa limitantă de viteză a procesului, enzima fiind inhibată de NADPH. Etapa oxidativă este, prin urmare, controlată de nivelul de NADP+, în timp ce etapa non-oxidativă de necesităţile de pentoze. Insulina induce sinteza de glucozo-6-fosfat dehidrogenază, enzima find astfel stimulată de către acest hormon. 37 2.4.3. Importanţa medicală Deficienţa de glucozo-6-fosfat dehidrogenază este o boală ereditară frecventă, cauzată de deficienţa enzimei care transformă glucozo-6-fosfatul în 6-fosfo-glucono-lactonă şi este caracterizată prin anemie hemolitică. Cauza reală a bolii este reprezentată de numeroase mutaţii la nivelul genei ce codifică enzima. Însă, numai unele din aceste mutaţii se manifestă clinic. Majoritatea celor cu deficienţă de glucozo-6-fosfat dehidrogenază nu prezintă manifestări clinice. Totuşi, unii dintre aceşti pacienţi pot dezvolta anemie hemolitică dacă sunt trataţi cu medicamente oxidante, de tipul primaquinei (un antimalaric), a sulfametoxazolului (un antibiotic) sau a acetanilidei (un antipiretic), sau dacă contractează o infecţie severă. Deşi deficienţa enzimatică se manifestă la nivelul tuturor celulelor, ea este mai severă la nivelul eritrocitelor, unde calea pentozo-fosfat reprezintă practic unica sursă de NADPH (alte celule au căi alternative de producere a NADPH-ului care să menţină glutationul în formă redusă). O activitate scăzută a glucozo-6-fosfat dehidrogenazei are ca şi consecinţă imediată o producţie scăzută de NADPH, esenţial în detoxificarea celulei de peroxizi şi radicali liberi. Un nivel redus de NADPH conduce la o cantitate scăzută de glutation redus (G-SH), care nu va mai reacţiona în cantitate suficientă cu peroxizii şi radicalii liberi, ducând la acumularea intraeritrocitară a acestora. Prin urmare, membrana eritrocitară va fi alterată, ceea ce va conduce la apariţia anemiei hemolitice. 2.5. CALEA ACIDULUI GLUCURONIC 2.5.1. Rolul și reacțiile căii acidului glucuronic Calea acidului glucuronic este importantă pentru organismul uman întrucât furnizează acid uridin difosfo glucuronic (UDP-glucuronic). Acidul UDP-glucuronic este forma activă a acidului glucuronic şi poate fi folosit pentru: - Sinteza glicozaminoglicanilor - Conjugarea: bilirubinei, a unor steroizi, a unor medicamente și a unor toxine. - Sinteza vitaminei C (în plante şi unele animale, dar nu şi în organismul uman) - Producerea xilulozo-5-fosfatului, care poate pătrunde apoi în calea pentozo-fosfat şi care reprezintă produsul final al căii acidului glucuronic la om. Reacţiile căii acidului glucuronic sunt prezentate în Figura 2.29. 2.5.2. Importanţa medicală Xiluloza, generată din acidul gulonic (prin intermediul unui compus intermediar – acidul 3-ceto- gulonic), este produsă iniţial sub formă de L-xiluloză, care, sub acţiunea xilitol dehidrogenazei, este transformat în xilitol. Acesta (xilitolul), sub acţiunea unei reductaze, este convertit la D- xiluloză, care, ulterior, este transformat în xilulozo-5-fosfat. Deficienţa de xilitol dehidrogenază generează o boală numită pentozuria esenţială. Maladia este ereditară şi se caracterizează prin apariţia în urină a L-xilulozei, datorită imposibilităţii transformării L-xilulozei în xilitol (prin urmare, L-xiluloza va fi excretată în urină). Deficiența UDP glucuronil transferazei (sindrom Criegler Najjar), enzimă care este implicată în conjugarea bilirubinei la nivel hepatic, duce la creșteri semnificative ale bilirubinei neconjugate în sânge, aceasta având un efect toxic asupra sistemului nervos central. Absența totală a enzimei (transmisă AR) este incompatibilă cu viața, pe când deficiența ei parțială (transmisă AD) presupune tratament cronic medicamentos ce vizează inducerea sintezei acestei enzime. 38  Figura 2.29. Formarea acidului glucuronic 2.6. CICLUL KREBS Mitocondriile, considerate „centralele energetice‖ ale celulei, regenerează peste 90% din necesarul de ATP. Aceste organite sunt prevăzute cu o membrană dublă, care delimitează un spaţiu intermembranar şi un compartiment interior, denumit matricea mitocondrială. Membranele mitocondriale asigură compartimentalizarea proceselor biochimice, accesul substratelor şi exportul produşilor fiind dependent de funcţionarea transportorilor şi a navetelor mitocondriale. Mitocondriile reprezintă sediul căilor metabolice aerobe, având ca scop regenerarea ATP: Ciclul Krebs asigură oxidarea acetil-CoA, iar energia care rezultă serveşte la sinteza GTP şi a coenzimelor reduse NADH + H+ şi FADH2. Lanţul respirator mitocondrial recuperează energia coenzimelor NADH şi FADH2, printr-o succesiune de reacţii de oxidoreducere care au loc în membrana internă. 39 Ciclul Krebs (ciclul acizilor tricarboxilici sau ciclul citric) este o cale metabolică strict aerobă, localizată în matricea mitocondrială. Din punct de vedere funcţional, ciclul Krebs se situează la interfaţa dintre catabolism – degradarea substanţelor nutritive provenite din alimentaţie sau din mobilizarea rezervelor – şi anabolism – utilizarea intermediarilor biochimici pentru reacţiile de sinteză. Ca urmare, rolul acestei căi metabolice este dublu: - Producerea de energie prin oxidarea totală a acetil-CoA - Sinteza de intermediari pentru reacţiile anabolismului. (Figura 2.30).. Figura 2.30. Importanţa ciclului Krebs (Hb: hemoglobina; Mb: mioglobina) 2.6.1. Provenienţa substratelor Principalul substrat al ciclului Krebs, acetil-CoA (CH3-CO~SCoA), provine din oxidarea tuturor carburanţilor (Figura 2.31.). - Catabolismul glucidelor prin glicoliza, glicogenoliza şi oxidarea acidului lactic converg spre formarea piruvatului în citoplasmă; acesta va fi transformat în acetil-CoA prin intervenţia complexului multienzimatic al piruvat-dehidrogenazei mitocondriale – PDH. - Catabolismul lipidelor, prin beta-oxidarea acizilor graşi, care generează acetil-CoA - Catabolismul proteinelor, prin conversia aminoacizilor în acetil-CoA - Catabolismul alcoolului, care constă în conversia la acetaldehidă (de către alcool- dehidrogenază) şi ulterior în acid acetic; ambele reacţii produc NADH + H+; în muşchiul scheletic, acidul acetic este convertit în acetil-CoA. - Catabolismul corpilor cetonici, prin oxidarea la acetil-CoA în ţesuturile extrahepatice. 40  Figura 2.31. Principalele surse de acetil-CoA Oxaloacetatul, regenerat la fiecare parcurs al ciclului Krebs, trebuie să fie suplimentat în permanenţă, pentru a menţine constant fluxul intermediarilor. Principalele surse de oxaloacetat sunt: - transaminarea acidului aspartic, sub acţiunea aspartat-aminotransferazei (ASAT) - carboxilarea piruvatului, sub acţiunea piruvat-carboxilazei, enzimă activă în perioadele inter-alimentare. Oxaloacetatul se situează la intersecţia mai multor căi metabolice. Pe lângă ciclul Krebs, acest substrat intervine şi în iniţierea altor căi metabolice, cum ar fi: ureogeneza, gluconeogeneza sau sinteza acizilor graşi. Acidul piruvic este un alt nod metabolic important. Provine din oxidarea citoplasmatică a glucozei (glicoliza) sau din catabolismul aminoacizilor. Piruvatul controlează intrarea acetil-CoA şi a oxaloacetatului în ciclul Krebs, datorită posibilităţilor de transformare în aceste substrate: - conversia piruvatului în acetil-CoA este catalizată de complexul multienzimatic al piruvat-dehidrogenazei (PDH) - conversia piruvatului în oxaloacetat este catalizată de piruvat-carboxilaza. (Figura 2.32.) 41  Figura 2.32. Conversia piruvatului în acetil-CoA şi oxaloacetat Acidul piruvic poate alimenta mai multe căi metabolice, în funcţie de necesităţile organismului şi de particularităţile metabolice ale ţesuturilor: - în perioadele interalimentare, piruvatul este dirijat spre gluconeogeneză - în perioadele post-prandiale, piruvatul serveşte la biosinteza acizilor graşi - în celulele aerobe, piruvatul este convertit în acetil-CoA, în vederea aprovizionării ciclului Krebs - în celulele anaerobe, piruvatul rezultat din glicoliză este transformat în lactat, sub acţiunea lactat-dehidrogenazei (LDH). 2.6.2. Etape şi bilanţ energetic Ciclul Krebs reuneşte 8 reacţii diferite. Principalele etape, ilustrate în figura 2.33, sunt: a. Condensarea acetil-CoA (2 atomi de carbon) cu oxaloacetatul (4 atomi de carbon) b. Formarea acidului citric (6 atomi de carbon) şi conversia succesivă a acizilor tricarboxilici c. Eliberarea secvenţială a celor doi atomi de carbon din molecula acetil-CoA sub formă de CO2 d. Regenerarea finală a oxaloacetatului, cu iniţierea unei noi serii de reacţii, dacă substratele sunt prezente în continuare în matricea mitocondrială. 1. Prima reacţie constă în condensarea acetil-CoA cu oxaloacetatul şi este catalizată de enzima numită citrat-sintetază. Rezultă acidul citric, primul din seria celor trei acizi tricarboxilici. Reacţia este ireversibilă şi depinde de disponibilitatea celor două substrate, acetil-CoA şi oxaloacetat. 42  2. Izomerizarea citratului în izocitrat are loc sub acţiunea aconitazei, în prezenţa ionilor de fier. Reacţia are loc în două etape: - Formarea intermediară a cis-aconitatului - Rehidratarea acestuia cu formarea izocitratului. 3. Formarea alfa-cetoglutaratului este catalizată de izocitrat-dehidrogenază, în prezenţa coenzimei NAD+ şi a ionilor de Mg2+ sau Mn2+. Reacţia permite reducerea NAD+ la NADH + H+. Enzima este principala ţintă a mecanismelor reglatoare, fiind activată alosteric de ADP şi NAD+, şi inhibată de ATP şi NADH, în funcţie de starea energetică al celulei. Această reacţie eliberează prima moleculă de dioxid de carbon. 4. Formarea succinil-CoA prin decarboxilarea oxidativă a alfa-cetoglutaratului este catalizată de complexul multienzimatic al alfa-cetoglutarat-dehidrogenazei. Acesta necesită o serie de coenzime (tiamin-pirofosfatul – TPP, acidul lipoic, HSCoA, FAD, NAD+), pe lângă cofactorul Mg2+. Reacţia eliberează cea de-a doua moleculă de dioxid de carbon şi o nouă moleculă de NADH + H+. 5. Conversia succinil-CoA la succinat are loc prin acţiunea succinat-tiokinazei şi conduce la sinteza GTP, prin recuperarea energiei rezultate din scindarea succinil-CoA. Reacţia este un exemplu de fosforilare la nivel de substrat. GTP poate fi transformat în ATP, fără consum suplimentar de energie, conform reacţiei: GTP + ADP  GDP + ATP 6. Oxidarea succinatului la fumarat necesită intervenţia succinat-dehidrogenazei, o flavoproteină ataşată de membrana internă mitocondrială, unde participă şi la reacţiile lanţului respirator mitocondrial. Reacţia este însoţită de reducerea FAD la FADH2, care va fi preluat de lanţul transportor de electroni. 7. Intervenţia fumarazei constă în adiţionarea unei molecule de apă cu formarea malatului, care dispune de un transportor specific la nivelul membranei mitocondriale. Conversia intermediarilor intra-mitocondriali în malat permite exportul citoplasmatic al acestora, deoarece malatul citoplasmatic poate fi transformat mai departe în piruvat, fumarat sau oxaloacetat. 8. Regenerarea finală a oxaloacetatului are loc sub acţiunea malat-dehidrogenazei, care eliberează cea de-a treia moleculă de NADH + H+. Fiecare parcurgere a ciclului Krebs duce la oxidarea completă a unei molecule de acetil- CoA. Energia rezultată din această oxidare progresivă se regăseşte în următoarele structuri: - moleculă de GTP, sintetizată prin acţiunea succinat-tiokinazei - 3 echivalenţi NADH + H+, sintetizaţi de enzimele izocitrat-dehidrogenaza, alfa- cetoglutarat-dehidrogenaza şi malat-dehidrogenaza; aceştia vor alimenta lanţul respirator mitocondrial, unde vor produce în total 9 ATP - un echivalent reducător FADH2, sintetizat prin acţiunea succinat-dehidrogenazei, care generează 2 ATP în lanţul respirator mitocondrial. Oxidarea completă a unui mol de acetil-CoA produce în final echivalentul a 12 moli de ATP. Ciclul Krebs este deosebit de eficient în recuperarea energiei substratului său principal, deoarece aproximativ 90% din energia chimică a acetil-CoA (228 kcal/mol) se regăseşte în structura GTP şi a coenzimelor reduse NADH şi FADH2 (care pot elibera în total 206 kcal/mol). 43