Biochimie Medicală I - 2024-2025 (PDF)

BIOCHIMIE MEDICALĂ I LUCIANA DOBJANSCHI 1 2 I. Introducere Scopul principal al biochimiei de astăzi este să determine cum interacţionează grupele de molecule nevii din organismele vii pentru a constitui, menţine şi perpetua starea vie. Biochimia este o ştiinţă foarte tâ...

BIOCHIMIE MEDICALĂ I LUCIANA DOBJANSCHI 1 2 I. Introducere Scopul principal al biochimiei de astăzi este să determine cum interacţionează grupele de molecule nevii din organismele vii pentru a constitui, menţine şi perpetua starea vie. Biochimia este o ştiinţă foarte tânără. Până acum câteva zeci de ani puţine universităţi o recunoşteau ca ştiinţă în toate drepturile ei. Există două izvoare distincte în genealogia biochimiei actuale. Unul provine din medicină şi fiziologie şi este rezultatul unor vechi preocupări de a cunoaşte compoziţia chimică a sângelui, a urinii, şi a ţesuturilor, precum şi modificările acestora în stare normală şi patologică. Celălalt derivă din chimia organică, din vechi studii asupra compuşilor organici naturali. Multă vreme, biochimia a fost privită pur şi simplu, fie ca o ramură a fiziologiei, fie ca o ramură a chimiei. Până la începutul ultimului sfert de secol, ea nu a fost o ştiinţă bine conturată, de sine stătătoare, cu o solidă metodologie experimentală şi cu posibilitatea de aprofundare a fenomenelor biologice. Două descoperiri mai însemnate au contribuit la schimbarea situaţiei. Una a fost recunoşterea sistemelor multienzimatice ca unităţi catalitice pentru majoritatea căilor metabolice şi dezvoltarea unei ipoteze unitare pentru transferul de energie în celula vie. Cealaltă, a avut o inflenţă mult mai adâncă şi mai puternică, a fost recunoaşterea faptului că ereditatea, unul din aspectele cele mai importante ale biologiei, are o bază reală, moleculară. Biochimia de astăzi face investigaţii spectaculoase într-o serie de ramuri fundamentale ale biologiei – diferenţierea celulelor şi a organismelor, originea vieţii şi evoluţia, comportamentul şi memoria, patologia umană – cercetări ce au demonstrat că aceste probleme fundamentale pot fi eficient abordate prin metode biochimice. Într-adevăr, succesul biochimiei în explicarea multor procese celulare a fost atât de mare încât mulţi oameni de ştiinţă au ajuns la concluzia că biologia este chimie. Unii biologi nu acceptă acest punct de vedere, ei susţin că esenţa sau caracterul complex al organismelor vii nu poate fi redus, acum şi niciodată, la nivelul moleculelor sau al interacţiilor moleculare. Astăzi este probabil mai logic să presupunem, ca o filozofie curentă, că toate fenomenele biologice au în cele din urmă o bază moleculară şi să abandonăm această idee numai atunci când nu va mai fi utilă pentru proiectarea experimentelor cheie sau pentru explicarea datelor experimentale. Nu trebuie totuşi să privim biologia numai ca pe o ramură a chimiei clasice, cum este chimia organică, chimia fizică sau chimia anorganică. Dacă biologia este chimie, ea este un fel de suprachimie care include, dar în acelaşi timp depăşeşte chimia clasică. Aceasta deoarece moleculele din organismele vii nu numai că se supun principiilor fizice şi chimice obişnuite, care guvernează comportarea tuturor moleculelor, dar interacţionează şi între ele conform altui grup de principii pe care îl vom numi logica moleculară a stării vii. Aceste principii nu includ în mod necesar forţe sau legi fizice noi, nedescoperite încă. Mai curând ele trebuie privite ca un grup de reguli fundamentale care guvernează natura, funcţia şi interacţiile tipurilor 3 specifice de molecule din organismele vii, proprietăţi ce conferă acestora capacitatea de a se autoorganiza şi autoreplica. Până în prezent nu au fost identificate încă toate principiile cuprinse în logica moleculară a stării vii, iar unele dintre ele sunt vag înţelese. De fapt, este probabil mult mai potrivit să considerăm aceste principii ca axiome, deoarece unele dintre ele sunt intuitive şi nu pot fi demonstrate încă. Biochimia studiază procesele chimice care condiţionează viaţa şi structurile ce îi corespund. Biochimia apare şi dezvoltă ca ştiinţă de graniţă între chimie şi biologie, fără a se putea realiza însă o demarcaţie netă între cele două. Începuturile Biochimiei ca ştiinţă datează din sec.XVIII, dar empiric unele procese biochimice se cunosc cu mult timp înainte. Contibuţii din domeniul chimiei, biologiei şi medicinei se află într-o relaţie de reciprocitate cu dezvoltarea biochimiei. Astfel a apărut biochimia modernă care studiază procesele biochimice care se desfăşoară la nivel celular şi molecular. În ceea ce priveşte profesia de farmacist, Biochimia este o disciplină indispensabilă, deoarece ea ne oferă bazele moleculare pentru studiul medicamentului în ceea ce priveşte acţiunea principală, efectele secundare, biotransformarea medicamentului şi toxicitatea sa. Deasemenea în terapie sunt cunoscute un număr mare de produşi biologici cum ar fi: vitaminele, hormonii, enzimele, aminoacizii, glucidele, compuşii purinici şi pirimidinici precum şi derivaţii lor de sinteză. Prin inginerie genetică se obţin : hormoni, enzime, anticorpi, inetrferon, antitripsina. Deci, se poate concluziona că Biochimia studiază totalitatea proceselor biochimice din organism (procese catabolice şi anabolice), precum şi procesele de biotransformare a medicamentelor ajunse în organism. 4 II. Compoziţia chimică a organismului uman 1. Compoziţia elementară a organismului uman Au fost identificate un număr de peste 60 de elemente care intră în compoziţia chimică a organismului uman. Acestea au fost clasificate în funcţie de proporţia în care se găsesc în organism. Dintre acestea majoritatea se găsesc în urme. Astfel ele au fost clasificate în: macroelemente, oligoelemente şi microelemente. Tabelul 1. Repartiţia elementelor în organismul uman. Element Procent ( %) Element Procent (%) carbon 50 sulf 0,8 oxigen 20 sodiu 0,4 hidrogen 10 clor 0,4 azot 8,5 magneziu 0,1 calciu 4 fier 0,01 fosfor 1 iod 0,00005 Dintre acestea primele patru (C,O,H şi N) reprezintă peste 95% şi sunt considerate macroelemente. Ele sunt principalele bioelemente ale majorităţii biomoleculelor datorită tendinţei lor mărite de a forma legături covalente. Oligoelementele se găsesc în proporţie mai mică în organism şi la fel ca şi macroelementele intră în structura biomoleculelor. Microelementele se găsesc în urme, dar cu toate astea ele au un rol esenţial pentru viaţă. 2. Compoziţia fundamentală a organismului uman Bioelementele enumerate mai sus se găsesc în organism grupate în categorii de componenţi şi anume: componenţi organici şi componenţi minerali. Componenţii organici care intră în compoziţia organismului uman sunt: proteinele, glucidele, lipidele şi acizii nucleici. Aceşti compuşi sunt molecule complexe, care sunt alcătuite din molecule simple. Astfel, proteinele se formează prin policondensarea aminoacizilor, glucidele sunt formate din monozaharide, lipidele sunt formate din acizi graşi şi alţi componenţi, iar acizii nucleici sunt formaţi din ribonucleotide şi dezoxiribonucleotide. 5  Tabelul 2. Principalele biomolecule din organismul uman Biomolecula Unităţi strucurale Funcţii ADN dezoxiribonucleotide Material genetic ARN ribonucleotide Model pentru sinteza proteinelor proteine aminoacizi Funcţii multiple glucide monozaharide Rezervă de energie lipide Acizi graţi şi alţi Funcţii multiple componenţi Componenţii minerali prezenţi în organismul uman sunt apa şi electroliţii. Apa este constituientul major al tuturor organismelor vii. Organismul uman conţine între 58 şi 66% apă. O influenţă remarcabilă asupra conţinutului de apă al organismului o are vârsta. Conţinutul de apă variază şi în funcţie de sex, astfel femeile au un conţinut de apă mai redus în comparaţie cu bărbaţii. Apa din organism este repartizată în vasele sanguine şi limfatice, spaţiile intercelulare şi celule însăşi. Apa din organism se găseşte repartizată în două compartimente şi anume: compartimentul extracelular, care reprezintă aproximativ 20% din greutatea corpului şi compartimentul intracelular, care reprezintă aproximativ 50% din greutatea corporală. 6  Figura nr.1 Circulatia apei in organism Apa reprezintă mediul ideal al reacţiilor biochimice, vehiculul care asigură transportul şi schimburile metabolice. Apa ocupă cea mai mare parte din organism reprezentând 2/3 (55%-75%) din greutatea corporală. Cantitatea totală de apă din organism este în funcţie de vârstă, sex, adipozitate precum şi de ţesutul exploatat : ţesutul nervos conţine aproximativ 82-85%, plămânul, cordul, rinichiul 75-80%, osul 30%, iar dintele 10%. Apa totală liberă este repartizată în două sectoare principale celular şi extracelular. 7  Apa celulară: se gaseşte în citoplasmă, nucleu, mitocondrii, lizozomi. Ea reprezintă aproximativ 40% din greutatea corporală. Apa extracelulară: este separată de cea celulară prin membrane celulare, cantitatea ei se determină cu ajutorul unor substanţe care difuzează rapid prin membranele capilare, dar nu prin cele celulare (manitol, inulină, tiocianat de sodiu). La adult, apa extracelulară reprezintă 20% din greutatea corporală. Ea este depozitată în mai multe compartimente: intravascular, interstiţial, transcelular, şi cel din ţesutul conjunctiv dens cartilaje şi vase. a) Compartimentul intra vascular: conţine plasma sanguină şi limfa. Acesta reprezintă 5% din greutatea corporală cantitatea lor poate fi determinată fie cu ajutorul unor substanşe colorante (albastru Evans, rosu de Congo) fie cu ajutorul albuminei marcate. b) Compartimentul interstiţial: reprezintă adevăratul “mediul intern” al organismului. Este vorba de un ultrafiltrat plasmatic, care scaldă celulele, separat de compartimentul intravascular prin membranele capilare. Acestea permit o circulaţie hidroelectrolitică liberă, dar se opun ieşirii proteinelor din vase. Cantitatea de apă din compartimentul interstiţial este dedusă prin scăderea volumului plasmatic din cel extracelular. Se admite ca ea reprezintă 15% din greutatea corporală. c) Compartimentul transcelular: se referă la lichidul cefalorahidian, la mediile lichidiene oculare şi articulare şi la lichidele din seroase şi toate însumează aproximativ 200 ml sau 1,5 % din greutatea corporală. În acelaşi compartiment sunt înglobate şi secreţiile glandelor digestive. Acestea, aproximate la un total zilnic de 6-8 l, se resorb aproape complet la nivelul diverselor segmente ale tubului digestiv. d) Compartimentul hidric din ţesutul conjunctiv dens : (cartilaje şi oase) reprezintă aproximativ 10% din greutatea corporală. Apa acestui compartiment se deplasează lent şi are schimburi foarte reduse cu restul lichidelor organismului. Aportul de apă În organism poate avea o provenienţă : Exogenă: din digestia apei ca atare sau sub forma apei conţinute în alimente (aprox 2000ml / 24 ore). Endogenă: din oxidarea principiilor mediate în cadrul metabolismului intermediar. Astfel din metabolismul: - a 100 g proteine rezultă 46 ml apă - a 100 g lipide rezultă 107 ml apă - a 100 g glucide rezultă 55 ml apă. Există o interdependenţă între cantitatea de apă formată şi cea eliminată. Eliminarea apei se face pe cale : renală, cutanată, digestivă şi pulmonară. a) prin perspiraţie insensibilă: ( saturarea cu vapori de apă a aerului expirat ) se pierd zilnic aproximativ 400 ml apă. Această cantitate este mult depasită în 8 stări patologice însoţite de febră. b) prin perspiraţie sensibilă: (evaporare transcutanată ) se pierd zilnic între 200-500 ml apă. Intensitatea pierderilor prin perspiraţie insensibilă şi sensibilă nu poate fi reglată. c) prin eliminări hidrice digestive: Sunt minime la omul normal. Prin fecale se elimină aproximativ 150ml / 24 ore. d) prin eliminări hidrice renale: sunt egale în medie cu 1500 ml / 24 ore ( cu variaţii între 700-1700ml / 24 ore. Ele reprezintă elementul reglabil şi cel mai nobil al pierderilor lichidiene. Această eliminare de apă este reglată pe cale hormonală de către hormonul antidiuretic (ADH) şi prin aldosteron. Electroliţii sunt reprezentaţi de cationi şi anioni. Ei îndeplinesc în organism rol fizico- chimic, structural şi catalitic. Distribuţia cationilor în compartimentele intra şi extracelulare este diferită. Tabelul 3. Distribuţia cationilor intra- şi extracelular în mEg/l. Cationi intracelular extracelular Na+ 10 145 K+ 150 5 Ca+2 2 2 Mg+2 15 2 9  Transportul transmembranar Membrana celulară delimitează celula la exterior, are rol de susţinere şi separare, fiind sediul unor procese de schimb de substanţe între celulă şi mediul său extern. Membrana celulară este alcătuită distr-un strat dublu fosfo-lipidic, conţinând în forme şi proporţii diferite o serie de structuri proteice (modelul „mozaic lichid” ). Fig. nr. 2. Structura membranei celulare Celulele sunt individualizate de membranele celulare, dar membranele celulare, constituie punţi de legătură între exterior şi interior, în sensul că prin membrane se produce un transfer intens de substanţe şi energie. Într-o celulă vie au loc simultan o serie de reacţii independente, complexe la care participă un anumit număr de reactanţi. Structuralizara citoplasmei este dependentă, major, de topologia câmpului electric intracelular din cauza momentului dipolar al moleculeor de apă, component fundamental. Variaţiile câmpului lectric sunt date de ionii dizolvaţi. În vederea menţinerii unei compoziţii ionice necesare citoplasmei s-au dezvoltat mecanisme de transport transmembranar cu un rol deosebit de riguros, denumit trasport activ deoarece se realizează prin cuplare energetică cu degradarea enzimatică a unor compuşi macroergici. Acest tip de transport activ asigură şi menţine distribuţiile utile ale ionilor de intres. Astfel, apar gradienţi transmembranari ce dau naştere la o serie de fluxuri pasive ce tind să-i anuleze. 10  Membranele celulare asigură homeostazia chimică prin permeabilitata selectivă pentru ioni şi alte specii micromoleculare cât şi prin mecanisme de transport activ cu cuplaj energetic. Clasificarea fenomenelor de transport transmembranar În cazul membranei celulare ca fenomene de trasport avem: A – Transportul pasiv care se realizeză fără consum de energie metabolică, datorită gradienţilor de concentraţie, de potenţial electric, de presiune şi în sensul lor. B – Transportul activ care necesită consum de energie metabolică, se face împotriva gradienţilor prin molecule transportatoare cu proprietăţi enzimatice. Transportul activ este de mai multe tipuri:  primar ( cuplat cu reacţie exergonică)  secundar:  simport  antiport  translocaţia de grup Fig.nr.3. Tipuri de transport membranar Clasificarea acestor fenomene de tranport transmembranar se poate face după mai multe criterii precum dimensiune şi numărul particulelor transportate, suportul energetic, mecanismul implicat, etc. Microtransportul şi macrotransportul reprezintă cele două modalităţi de transfer a substanţelor prin membrană. După sens, macrotransferul poate fi endocitoză şi exocitoză. Dacă vezicula de endocitoză conţine sau nu material 11 solid acesta se numeşte fagocitoză sau pinocitoză iar funcţie de dimensiuni macro – sau microcitoză. Microtransportul reprezintă transportul prin membrană a unor particule individuale: ioni, micromolecule, apă. Transportul în „bloc” a unor ansambluri moleculare (solide sau lichide ) cum este cazul fenomenelor de fagocitoză sau pinocitoză reprezintă macrotransportul. Macrotransportul mai este considerat şi transferul de macromolecule. Transportul moleculelor ce nu pot trece prin canalele ionice, prin matricea lipidică, nefiind solubile, cum sunt zaharurile foarte importante pentru metabolismul celular, reprezintă un proces de „difuziune facilitată”. Transportul pasiv Acest tip de transport include difuzia ionilor şi a moleculelor prin membrană, are loc în sensul gradientului electro –chimic sau de presiune, fără consum de energie metabolică. Acest tip de transport este în esenţă un proces de difuziune prin membrană. Rata de difuziune prin membrană este proporţional cu temperatura absolută, gradientul de concentraţie şi coeficientul de permeabilitate, determinat la rândul său de coeficientul de partiţie între membrană şi mediu. În cazul subsatnţelor lipofile acestea difuzeză uşor prin bistratul lipidic iat cele hidrofile utilizeză diverse căi hidrofile. Funcţie de rata de transfer şi creşterea selectivităţii, precum şi pe baza diferenţelor structurale, căile hidrofile se pot clasifica în pori, canale şi transportori. Porii şi canalele reprezintă structuri proteice care delimitează căi apoase transmembranare. Canalele sunt bariere de permeabilitate şi selectivitate. În cazul difuziunii pe căi preferenţiale, difuzia se numeşte facilitată, în opoziţie cu difuzia simplă. Transportul pasiv este de fapt un proces de difuziune prin membrană. In general rata de difuzie printr-o membrană este proporţională cu temperatura absolută, gradientul de concentraţie şi coeficientul de permeabilitate, determinat la rândul său de coeficientul de partiţie între membrană şi mediu. Substanţele lipofile difuzează uşor prin bistratul fosfolipidic, iar cele hidrofile utilizează diverse căi hidrofile. In sensul scăderii ratei de transfer şi al creşterii selectivităţii, precum şi pe baza diferenţelor structurale, căile hidrofile pot fi clasificate în pori, canale şi transportori. Porii şi canalele sunt structuri proteice care delimitează căi apoase transmembranare. Canalele prezintă bariere de permeabilitate şi de selectivitate, unele din ele operate chimic sau electric. Difuziunea transmembranară pe căi preferenţiale specifice se numeşte facilitată, în opoziţie cu difuziunea simplă. Difuziunea apei prin membrană se numeşte osmoză. Presiunea osmotică este egală cu presiunea care aplicată în compartimentul cu osmolaritate mai mare poate împiedica osmoza. Osmolaritatea unei soluţii este numărul total de particule aprţinând substanţelor dizolvate raportat la numărul lui Avogadro şi la volumul soluţiei. In cazul transportorilor, transferul de substanţă presupune legarea acesteia de proteina transportoare pe o faţă a membranei, o anume modificare conformaţională a acesteia (flip-flop, ping-pong, situsuri succesive de legare), şi 12 eliberarea substanţei transportate pe cealaltă faţă a membranei. După numărul de specii moleculare transferate pentru un ciclu transportor, există uniport şi cotransport. Acesta din urmă se numeşte sinport dacă transferul este în acelaşi sens şi antiport dacă sensul transferului este opus. În acest tip de transport transferul se realizează pâna la momentul când energia potnţială totală în cele două compartimente ajunge la aceeaşi valoare şi astfel diferenţa dintre energiile poteţiale este zero. Din cadrul fenomenelor de transport pasiv prin membrană avem: 1. difuzia simplă – pentru molecule mici hidrofobe 2. difuzia prin canale ionice - pentru particule încărcate 3. difuzia facilitată – pentru molecule mari hidrofile prin molecule transporatoare cu rol enzimatic 4. osmoza – se referă la solvent (datorită gradientului de presiune); presiunea osmotică indică presiunea care aplicată în compartimentul cu osmolaritate mai mare poate împiedica osmoza; osmolaritatea unei soluţii reprezintă numărul total de particule aparţinând substanţelor dizolvate raportat la numărul lui Avogadro şi la volumul soluţiei. Fig. Nr. 4. Transpotul pasiv Transportul activ Transportul unor substanţe prin membrane constituie o modalitate de permeaţie cu adevărat specifică celulelor vii, împotriva „gradienţilor” de concentraţie, potenţial electric sau presiune osmotică, adică în sens invers tentaţiei entopice de anulare a acestor gradienţi, tendinţă dictată de principiul al doilea al termodinamicii. Transportul transmembranar al unor substanţe împotriva gradientelor fizice, precum şi menţinerea unor inegalităţi de concentraţie ionică (de exemplu, 13 pentru sodiu şi potasiu) nu pot fi explicate decât dacă se ia în considerare existenţa unor mecanisme de transport activ („pompe"). Aceste mecanisme, care se realizează cu consum de energie metabolică, pot interveni fie accelerând deplasarea de-a lungul unui gradient., fie diminuând sau chiar suprimând efectul gradientelor electro-chimice. In funcţie de modul în care se realizează şi se utilizează energia necesară, transporturile active pot fi de două tipuri: transportul activ primar şi transportul activ secundar (cotransportul electrogen). Transportul activ se realizează evident numai de către transportori proteici şi poate fi primar sau secundar, după cum proteina transportoare prezintă sau nu activitate ATP-azică proprie. Transportul activ secundar este întotdeauna cotransport, una din substanţe fiind transportată activ pe baza gradientului pentru o alta. Consumul de energie este indirect, realizându-se la nivelul unui transportor activ primar ce menţine gradientul menţionat, necesar pentru funcţionarea celui secundar. Numai prin impulsionarea moleculelor transferate de către metabolismul celular este posibil un astfel de transpor împotriva gradienţilor diferitelor mărimi (uphill transport), adică acest proces poate să aibă loc numai prin cuplarea sa energetică cu reacţii biochimice exergonice (donoare de energie liberă). Intervenţia metabolismului celular în realizarea unui astfel de transport, a determinat să i se atribuie acestui tip de transport adjectivul de „activ”. Orice ţesut este format din celule şi dintr-un lichid interstiţial care le scaldă. La răndul ei, celula cuprinde lichidul intercelular, citoplasma şi organitele celulare. Limita dintre mediul intra şi extracelular este reprezentată de membrana celulară (membrana plasmatică) având o grosime de circa 7,5nm. Organitele celulare sunt şi ele separate de citoplasmă printr-o membrană. Fenomenele de transport activ prin membrană sunt: - transport activ primar (exemplu pompa de Na+/K+) - transport activ secundar:  simport  antiport - translocaţie de grup 14 Fig.nr.5. Transportul activ primar Fig.nr.6. Transportul activ secundar O clasă diferită de biocompuşi sunt vitaminele care sunt indispensabile pentru funcţiile lor biologice, dar pe care organismul nu le poate sintetiza.Ele reprezintă componenţii nutritivi esenţiali. Hormonii sunt o altă clasă de biomolecule cu rol major în procesele endocrine, care au loc în organism. 15 II. Nucleotide şi structura covalentă a acizilor nucleici Acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi ribonucleic (ARN) sunt macromolecule tip lanţ, care au funcţia de a depozita şi transmite informaţia genetică. Aceştia sunt componente majore în toate celulele, reprezentând 5-15% din masa uscată a acestora. Acizii nucleici se găsesc şi în virusuri, care sunt complexe infecţioase proteină-acid nucleic, capabile să se autoreplice în celula gazdă. Deşi denumirea acizilor nucleici vine de la faptul că ADN a fost izolat prima dată din nucleii celulari, ei se găsesc totuşi şi în alte compartimente ale celulei. La fel cum aminoacizii sunt elementele constitutive ale proteinelor, aşa nucleotidele sunt componenţii de bază a acizilor nucleici. Structura generală a nucleotidelor Unităţile monomere ale ADN se numesc dezoxiribonucleotide, iar cele ale ARN se numesc ribonucleotide. Nucleotidele sunt formate din 3 componente caracteristice şi anume: o bază azotată, o pentoză şi moleculă de acid fosforic. Bazele azotate care intră în structura nucleotidelor sunt de două tipuri: baze purinice şi baze pirimidinice. Bazele purinice prezintă un nucleu de bază numit purina, de la care derivă cele două baze purinice: adenina şi guanina. N N N N H Bază purinică NH2 O H N N N N N N N N H2N H H adenina guanina Bazele pirimidinice prezintă un nucleu de bază numit pirimidina, de la care derivă 3 baze pirimidinice, care intă în structura acizilo nucleici, şi anume: citozina, uracilul şi timina. 16  N N Bază pirimidinică NH2 O O H H C H3 N N N O N O N O N H H H citozina uracilul timina Bazele azotate sunt compuşi slabi bazici, care pot exista în 2 sau mai multe forme tautomere în funcţie de pH. Uracilul, de exemplu, există în formă de lactamă şi lactimă. O OH H N N O N HO N H lactam lactimă Aceste forme, în special cea lactam, este responsabilă de formarea legăturilor cu celelalte componente din structura nucleotidei. Pe lângă bazele obişnuite, descrise mai sus, în acizii nucleici se mai găsesc în cantităţi mici şi alte baze, numite baze rare sau minore. 17  NH C H3 NH2 N N C H3 N N N O N H H N6 –metiladenina 5 – metilcitozina O NH2 H N C H2 OH N N HC N N O N HN 3 H H N3 – metilguanina 5 – hidroximetilcitozina A doua componentă care intră în structura nucleotidei este reprezentată de pentoză. Aceasta poate să fie D - riboza sau 2 – dezoxi –D – riboza. HO H2C H HO H2C H O O HH H H H OH H OH OH OH OH H D–riboza 2 – dezoxi – D – riboza Prin ataşarea unei pentoze la baza azotată rezultă o nucleozidă, care în funcţie de natura pentozei poate să fie ribonucleozid sau dezoxiribonucleozid. 18  NH2 NH2 N N N N N N N N HO H2C HO H2C O O H H H H H H H H OH H OH OH 2’–dezoxiadenozina adenozina Prin ataşarea unei molecule de acid fosforic la structura unei nucleozide se formează un nucleotid. N H2 N N OH OH OH N N HO P O P O P O H2 C O H H O O O H H OH H A MP A DP AT P Deci, prin ataşarea unei molecule de acid fosforic la o nucleozidă se formează nucleozid – monofosfatul (NMP), prin ataşarea a 2 molecule de acid fosforic se formează nucleozid – difosfatul (NDP), şi prin ataşarea a 3 molecule de acid fosforic se formează nucleozid – trifosfatul (NTP). Componentele majore ale ADN sunt 4 dezoxiribonucleotide, care se deosebesc între ele prin baza azotată, care le dă şi numele. Cele 4 baze specifice dezoxiribonucleotidelor din ADN sunt: adenina şi guanina (baze purinice) şi citozina şi timina (baze pirimidinice). Similar, pentru ribonucleotide, care sunt 19 componente fundamentale pentru acizii ribonucletidici (ARN), bazele azotate care intră în compoziţia lor sunt: adenina şi guanina (baze purinice), citozina şi uracilul (baze pirimidinice). Deci, timina se găseşte numai în ADN, nu şi în ARN, iar uracilul se găseşte numai în ARN şi nu şi în ADN. O altă diferenţă între compoziţiile celor două tipuri de acizi nucleici este dată de pentoza din structura nucleotidului: - dezoxiribonucleotidele conţin: 2 – dezoxi – D – riboza - ribonucleotidele conţin: D – riboza. OH HO baza azotatã P O H2C O HH O H H OH H dezoxiribonucleotid OH baza azotatã HO P O H2C O HH O H H OH OH ribonucleotid Nucleozidtrifosfaţii prezintă o serie de funcţii importante. ATP este un transportor de grupări fosfat şi pirofosfat în câteva recţii enzimatice implicate în transferal energiei chimice. ADP – ul rezultat prin defosforilarea ATP –ului este refosforilat la ATP în procesul respiraţiei. Sistemul ATP – ADP este sistemul principal pentru transferul grupărilor fosfat în celulă, dar şi ceilalţi nucleozidtrifosfaţi, şi anume: GTP, UTP şi CTP au rolul de a canaliza energia chimică pe anumite biosinteze specifice. A doua funcţie majoră a NTP şi NDP este cea de transportori de energie, energie pe care o înmagazinează sub formă de legături macroergice. NTP şi d – NTP sunt precursori bogaţi în energie în procesul de biosinteză enzimatică a ADN şi ARN. În acest proces NTP şi d- NTP îşi pierd grupările pirofosfat terminale, transformându –se în resturi de nucleozid monofosfaţi, care sunt elemente constitutive ale acizilor nucleici. O altă funcţie majoră a NTP şi NDP este cea de transportori energizanţi de tip coenzimă ai anumitor elemente constitutive. De exemplu: UDP este un 20 transportor pentru glucide în procesul de biosinteză a polizaharidelor. În toate cele 3 funcţii ale NTP şi d – NTP, energia chimică a legăturilor fosfat ß – şi γ – este folosită pentru formarea unor legături covalente noi. Pe lângă nucleozid 5’ – fosfaţii descrişi, în natură mai există şi nucleotide cu grupările fosfat în alte poziţii. Două nucleotide foarte importante au un rol cheie în acţiunea biochimică a unor hormoni: 3’, 5’ – ciclic – adenozin fosfatul (AMP ciclic) şi guanozin 3’,5’ ciclic – fosfatul (GMP ciclic). NH2 N N N N O H2C O H H H H O P O OH OH AMPc AMPc se formează în celulele eucariote, din ATP prin acţiunea unei enzime din membrane celulară, adenilat ciclaza, stimulată de anumiţi hormoni aduşi pe cale sanguină. AMPc mai este denumit şi al doilea mesager, întrucât el transmite şi amplifică în celulă semnalele chimice transmise pe calea sângelui de către hormoni, care sunt primii mesageri. ADN – ul este format din lanţuri de dezoxiribonucleotide legate covalent, iar ARN – ul este compus din lanţuri de ribonucleotide. Acizii dezoxiribonucleici şi acizii ribonucleici prezintă o serie de proprităţi fizice şi chimice commune, întrucât în ambele molecule, nucleotidele succesive sunt legate covalent prin punţi fosfodiesterice între gruparea 5’ – hidroxil a unei nucleotide şi gruparea 3’ – hidroxil a următoarei nucleotide. 21  b a z ã a z o ta tã H 2C 5 ' O H H H H O H 3 ' O P O H O 5 'C H 2 b a z ã a z o ta tã O H H 3 ' H O H H O P O O ADN 22  b a z ã a z o ta tã H 2C 5 ' O H H H H O O H 3 ' O P O H O 5 'C H 2 b a z ã a z o ta tã O H H 3 ' H O O H H O P O O ARN Astfel catena principală a ADN şi ARN constă în grupări fosforice alternând cu radicali de pentoză, legătura fosfodiesterică asigurând continuitatea covalentă. Bazele purinice şi pirimidinice din unităţile nucleotidice nu fac parte din catena principală, ele formează catene distincte în acelaşi mod în care radicalii R ai aminoacizilor sunt catenele laterale distinctive ale polipeptidelor. Acidul dezoxiribonucleic (ADN) a fost izolat pentru prima dată din celulele şi sperma de somon de către Friedrich Miesscher (1869). El a denumit produsul izolat nucleină, dată fiind prezenţa lui în nucleii celulari. De atunci au trecut peste 70 de ani de cercetări până la definirea completă a elementelor constitutive şi a structurii catenei principale a acizilor nucleici. 23  Figura nr. 7. Structura ADN Moleculele de ADN din diferite celule şi virusuri se deosebesc prin raportul dintre cele 4 tipuri de monomeri nucleotidici, prin secvenţa nucleotidelor şi prin masa moleculară. Pe lângă cele 4 tipuri de baze majore, în anumite tipuri de ADN, în deosebi de origine virală se găsesc cantităţi mici de derivaţi metilaţi ai acestor baze. Acizii dezoxiribonucleici izolaţi din diferite organisme şi virusuri au două lanţuri dispuse într-un aranjament complementar dublu elicoidal. În majoritatea celulelor moleculele de ADN sunt atât de mari, încât este greu să le izolăm sub formă intactă. În celulele procariote, care conţin un singur cromozom, întreaga cantitate de ADN este prezentă ca unică macromoleculă, o singură elice dublă, cu masa moleculară de peste 2 x 109. În celulele eucariote, ce conţin mai mulţi cromozomi, există mai multe molecule de ADN. În bacterii, molecula de ADN care reprezintă 1% din greutatea celulei se află zona nucleară; de obicei ea este ataşată printr-un singur punct de un pliu al membranei celulare, numit mezozom. Uneori, în citoplasma celulelor bacteriene se găsesc molecule mici de ADN extramitocondrial; aceste molecule de ADN, care poartă doar câteva gene, se numesc plasmide sau epizomi, în 24 funcţie de relaţia lor genetică cu ADN -ul cromozomial. În celulele eucariote diploide, aproape întreaga cantitate de ADN se găseşte în nucleu, combinată prin legături ionice cu proteine bazice, numite histone. Pe lângă ADN –ul din nucleu în celulele eucariote diploide mai găsim cantităţi foarte mici de ADN în mitocondrii, care diferă de ADN –ul nuclear prin bazele conţinute şi prin masa moleculară. Acizii ribonucleici Cele 3 tipuri majore de acizi ribonucleici din celule sunt: ARNm, ARNr şi ARNt. Toate cele 3 tipuri de ARN sunt lanţuri monocatenare poliribonucleotidice, dar se deosebesc între ele prin domenii caracteristice de mase moleculare şi de coeficienţi de sedimentare. Fiecare dintre cele 3 tipuri majore de ARN există în forme moleculare multiple. ARNr există în cel puţin 3 forme majore, ARNt există în 60 de forme, iar ARNm există în sute şi poate mii de forme distincte. Majoritatea celulelor conţin de 2- 8 ori mai mult ARN decât ADN. În celulele bacteriene, cea mai mare parte a ARN se află în citoplasmă, dar o anumită cantitate este ataşată necovalent de ADN, pe măsură ce se formează în procesul de transcripţie. În celulele eucariote diferitele forme de ARN au o distribuţie intracelulară distinctă. Figura nr.8. ARN ARNm conţine doar cele 4 baze majore. El se sintetizează în nucleu în procesul de transcripţie, prin care secvenţa bazelor dintr-un lanţ de ADN cromozomial este copiată enzimatic în lanţul de ARNm. O anumită cantitate de ARNm se sintetizează şi în mitocondrii. Secvenţa bazelor din lanţul de ARNm 25  este complementară celei din lanţul de ADN ce se transcrie. După transcripţie, ARNm trece în citoplasmă şi apoi la ribozomi, unde serveşte ca matriţă pentru ordonarea secvenţială a aminoacizilor în procesul de biosinteză a proteinelor. ARN –ul mitocondrial reprezintă doar o mică parte din ARN –ul total din celulă, dar el se află în foarte multe forme distincte, care se deosebesc prin masa moleculară şi secvenţa bazelor azotate. Fiecare din miile de proteine diferite sintetizate în celula este codificată de către un ARNm. ARNm din celulele eucariote se caracterizează prin prezenţa la capătul 3 terminal a unei secvenţe lungi de cca 200 de radicali adenilici, care pare să ’ aibă un rol în prelucrarea sau transportul ARNm de la nucleu la ribozomi. ARNt sunt molecule relativ mici, care funcţionează ca transportori specifici ai câte unei molecule de aminoacizi în procesul de biosinteză a proteinelor pe ribozomi. Ei au o masă moleculară de 23000 – 28000 şi un coeficient de sedimentare de 4S. Ei conţin 75 – 90 de nucleotide. Fiecare dintre cei 20 de aminoacizi din proteine are cel puţin un ARNt coerspunzător, iar unii au chiar mai mulţi ARNt. De exemplu: în celulele de Escherichia coli există 5 ARNt diferiţi pentru transferul leucinei. Mai mult, în celulele eucariote unui anumit aminoacid îi corespund ARNt mitocondriali diferiţi de ARNt citoplasmatici. Moleculele de ARNt prezintă câteva trăsături comune. Toate tipurile de ARNt au la un capăt al lanţului polinucleotidic un acid guanilic terminal, iar la celălalt capăt secvenţa terminală citidil – citidil – adenil (CCA). Gruparea 5’ –hidroxil a acidului adenilic terminal este legată de gruparea 3’ –hidroxil a acidului citidilic precedent print-o punte fosfodiesterică. Gruparea hidroxil liberă din acidul adenilic terminal este acilată enzimatic cu α-aminoacidul specific, formând aminoacil –ARNt. Acest aminoacid este transferat enzimatic la capătul lanţului polipeptidic în curs de formare pe suprafaţa ribozomilor, în procesul de biosinteză proteică. ARNr reprezintă 65% din masa ribozomilor. El se poate obţine din ribozomii de E.coli ca molecule lineare, monocatenare, prezente în 3 forme caracteristice, cu coeficienţii de sedimentare de 23S, 16S şi respectiv 5S. Aceste 3 forme se deosebesc prin secvenţa şi raportul bazelor. În celulele eucariote, care au ribozomi mai mari decât celulele procariote, există 4 tipuri de ARNr: 5S, 7S, 18S şi 28S. Deşi ARNr reprezintă o mare parte din ARN celular total, funcţia lui în ribozomi nu este încă, bine elucidată. Sinteza proteinelor Procesul de sinteză proteică constă în polimerizarea aminoacizilor, în celule sau în vitro. Într-o celulă pot exista circa 10000 proteine care au rol esenţial în funcţionarea şi reproducerea celulei şi organismului. Biosinteza proteinelor se desfăşoară în următoarele momente. În primul moment are loc transcriptia, care constă în sinteza mARN de către una dintre catenele de ADN dintr-o genă. Acest mARN are o structură complementară catenei de 26 ADN matrice, reprezentând o “imagine în oglindă” a acestuia, o transcriere mecanică a codonilor catenei de ADN, respectiv a mesajului genetic, cu simboluri complementare. În al doilea moment are loc translaţia care constă în migrarea mARN în citoplasma şi asocierea mARN cu ribozomii activi în sinteza proteică. Catena de mARN se fixează simultan prin absorbţie pe mai mulţi ribozomi la distanţa între ei de 300-350A, formând poliribozomi. În al treilea moment are loc activarea aminoacizilor, care constă în reacţia unui aminoacid cu adenozin-trifosfat (ATP) catalizată de aminoacil-ARN sinteza, şi formarea de aminoacil-adenilat (aminoacil AMP), care se ataşează de o moleculă de tARN, determinând apariţia unui complex aminoacil-tARN. Acest complex este transportat în locul lui propriu în lanţul proteic, determinat de mARN din polizomi. Pe catena mARN din polizom, se vor amplasa, la nivelul fiecărui ribozom, numai acele complexe aminoacil-tARN care, pe bucla centrală, reprezentând anticodonul, posedă o secvenţă de trei ribonucleotizi complementară codonilor mARN din complexul polizomului. În acest fel aminoacizii sunt legaţi enzimatic într-o ordine impusă de ADN care a matriţat mARN şi care joacă un rol direct în biosinteza proteinelor. În al patrulea moment are loc translatţa, polimerizarea sau asamblarea aminoacizilor. Legătura se realizează între gruparea COOH a primului aminoacil care reprezintă punctul activ al biosintezei progresive, cu gruparea NH2, a celui de al doilea aminoacil, în prezenţa enzimei peptid-polimeraza, care catalizeaza formarea legaturilor peptidice între aminoacizi; încorporarea aminoacizilor este ireversibilă; iau astfel naştere lanţuri polipeptidice care se eliberează de polizom, prin translocarea ultimului complex aminoacil-tARN de ultimul ribozom din polizom, când acesta a ajuns în urma rotirii la extremitatea matricei mARN de care se detasează. Un lant polipeptidic se sintetizează într- un minut. 27  Figura nr.9 Sinteza proteinelor Complexe supramoleculare acizi nucleici - proteine Unii acizi nucleici se află în celule asociaţi necovalent cu proteine specifice, formând complexe supramoleculare. Dintre aceste sisteme acid nucleic – proteine, cu structuri şi funcţii biologice foarte complexe; ribozomii şi virusurile sunt cele mai cunoscute. Cele mai complexe sisteme acid nucleic – proteină sunt probabil cromozomii din celulele eucariote. Ribozomii sunt particule ribonucleoproteice care se găsesc în toate tipurile de celule. Ei sunt esenţiali în biosinteza proteinelor. Virusurile sunt structuri subcelulare la limită între lumea biotică şi abiotică. Virusurile au capacitatea de a se antagoniza atunci când intră într-o celulă gazdă specifică. Implicaţiile medicale ale nucleotidelor Unele nucleotide naturale, precum şi derivaţii lor obţinuţi prin sinteză pot fi utilizate în terapie, fiind utilizate în: chimioterapia bolii maligne, tratamentul hiperuricemiei şi gutei, în afecţiuni virale, în hipertiroidism sau ca agenţi imunosupresori, hipogliceminaţi, antifungici şi antiparazitari. Mecanismul lor de acţiune este variat: - înhibă enzimele implicate în biosinteza acizilor nucleici, blocând procesul - înhibă enzimele care catalizează conversia xantinei în acid uric. 28 29 III. Proteine Proteinele sunt compuşi macromoleculari, respectiv biopolimeri rezultaţi din policondensarea aminoacizilor legaţi între ei prin legături peptidice. Diferenţa între proteine şi polipeptide se face pe baza dimensiunii moleculare, limita de delimitare fiind stabilită arbitrar la o greutate moleculară de 8 x 10 Kd. Lanţurile de peptide alcătuite din sub 10 resturi de aminoacizi se numesc oligopeptide, iar cele de până la 50 – 60 de resturi de aminoacizi se numesc polipeptide. Proteinele sunt formate din sute de resturi de aminoacizi, iar masa lor moleculară poate urca la sute de mii de daltoni. Aminoacizii Aminoacizii sunt unităţile structurale de bază din molecula proteinelor. Aminoacizii conţin două grupări funcţionale comune tuturor aminoacizilor: o grupare aminică şi o grupare carboxilică. Capacitatea unui aminoacid de a se condensa cu alţi aminoacizi pentru a forma peptide este dependentă de proprităţile chimice ale acestor două grupări funcţionale. Cea mai importantă proprietate a aminoacizilor este aceea de a servi ca subunităţi monomerice pentru proteine, dar ei prezintă şi alte roluri importante pentru celulă. De exemplu, glutationul este o tripeptidă cu funcţii importante, alte peptide mici au funcţii de hormoni, sau în unele organisme au rol de antibiotice. Acidul glutamic are rol de neuro –transmiţător. Aminoacizii sunt precursorii unei varităţi de biomolecule (de exemplu: hitidina pentru histamină). Unii aminacizi sunt metabolizaţi şi utilizaţi pentru producerea de glucoză (gluconeogeneză). Deoarece nu există rezerve de aminoacizi, cu excepţia celor implicaţi în structura proteinelor, atunci când gluconeogeneza are nevoie de aminoacizi, aceştia sunt eliberaţi prin decompunerea proteinelor. Structura aminoacizilor În proteinele tuturor speciilor procariote şi eucariote a fost identificat un set de cca 20 de aminoacizi, marea majoritate aprţinând seriei sterice L. Toţi aminoacizii, cu excepţia prolinei, prezintă aceeaşi strucutură generală în sensul că atomul de carbon α- este legat de o grupare –COOH, de una –NH2 şi de un rest R răspunzător de proprietăţile diferite ale diferiţilor aminoacizi. Formula generală a unui aminoacid: R C H C OO- NH3+ În toţi α- aminoacizii, cu excepţia glicinei, carbonul α este optic activ. Izomerii posibili aparţin seriei D sau L. S-a constatat că toţi izomerii existenţi în mod natural în constituţia proteinelor aparţin seriei sterice L. Sarcinile apărute în formulele aminoacizilor sunt cele care apar la pH 6-7. Ca urmare, la pH 6-7, un aminoacid poate să aibă caracter acid sau bazic. 30 Clasificare aminoacizilor Din punct de vedere structural aminoacizii se pot clasifica astfel: - aminoacizi alifatici HC C OOH H 3C CH C OOH 2 NH2 NH2 glicina ( glicocol, Gly) alanina (Ala) H 3C CH CH C OOH H3C CH CH2 CH COOH C H3 NH2 CH3 NH2 valina(val) leucina (leu) H3C CH2 CH CH COOH CH3 NH2 Izoleucina (ile) - aminoacizi hidroxilaţi HO CH2 CH COOH H 3C CH CH C OOH NH2 OH NH2 serin(ser) treonina (thr) - aminoacizi cu sulf HS C H2 C H C OOH H3C S CH2 CH2 CH COOH NH2 NH2 cisteina(cys) metionina (met) 31 - aminoacizii dicarboxilici şi amidele lor HOOC C H2 CH C OOH NH2 acidaspartic(asp) H 2 N C O C H2 C H C OOH NH2 asparagina ( asn) HOOC CH2 CH2 CH COOH NH2 acid glutamic (glu) HN 2 CO C H2 C H2 CH C OOH NH2 glutamina (gln) - aminoacizi cu două grupări bazice H2N C H2 C H2 C H2 C H2 CH C OOH NH2 lisina (lys) H2N C NH C H2 C H2 C H2 C H C OOH NH NH2 arginina (arg) 32  C H2 CH C OOH N NH NH2 histidina (his) - aminoacizi aromatici CH2 CH COOH NH2 fenilalanina (phe) HO CH2 CH COOH NH2 tirozina (tyr) C H2 CH C OOH N NH2 H triptofan (trp) C OOH N H prolina (pro) În funcţie de polaritatea radicalului, aminoacizii se clasifică, astfel: - aminoacizi neutri: Gly,Ala, Ser, Cys, Thr, Asn, Gln – care au radicalul polar, dar lipsit de sarcină electrică la pH=7. - aminoacizi hidrofili, cu caracter acid: Asp, Glu, Tyr – care sunt aminoacizi încărcaţi negative la pH fiziologic. - aminoacizi hidrofili cu caracter bazic: Arg, Lys, His – aminoacizi care la pH fiziologic sunt încărcaţi cu sarcină pozitivă. - aminoacizi hidrofobi: Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp. Există proteine care pe lângă aceşti 20 de aminoacizi esenţiali sau de bază, 33  conţin şi alţi aminoacizi. Aceştia pot să ia naştere prin modificări ulterioare sintezei lanţului polipeptidic, determinând astfel caracteristici noi ale activităţii biologice. Exemplu: - acetilarea capătului N-terminal, creşte rezistenţa la degradare - prin hidroxilarea resturilor de prolină şi lizină se formrează: hidroxiprolina şi hidroxilizina, cu rol în stabilizarea fibrei de colagen - γ – carboxiglutamatul are legătură cu acţiunea vitaminei K - fosforilarea resturilor de: Ser, Thr, Tzr, se foloseşte ca mecanism de reglare a multor procese celulare. o Alţi aminoacizi modificaţi se întâlnesc în structura unor peptide biologic active. Pe lângă aminoacizii prezenţi în proteine, există aminoacizi, care liberi sau în combinaţii îndeplinesc funcţii importante în metabolism. De exemplu: - β – alanina, din stuctura coenzimei A şi a unor peptide - homoserina şi homocisteina sunt intermediari metabolici - citrulina şi ornitina apar în biosinteza ureei - acidul γ- aminobutiric (GABA) este un mediator chimic nervos - 3,4 – dioxifenilalanina (DOPA) este precursor al adrenalinei - acidul p- aminobenzoic intră în structura acidului folic. Proprietăţile aminoacizilor Aminoacizii sunt substanţe solide, cristaline şi au puncte de topire sau de descompunere peste 2000C. Ei sunt mult mai solubili în apă decât în solvenţi nepolari. În reţeaua cristalină, moleculele de aminoacizi sunt atrase prin forţe electrostatice. Dacă aminoacizii ar cristaliza într-o formă neionică, datorită atracţiei Van der Waals, atunci ar avea puncte de topire mult mai scăzute. Toate acestea duc la concluzia că aminoacizii se găsesc în soluţii apoase şi în reţeaua cristalină sub formă de ioni dipolari sau amfioni. + H2N R C OOH HN 3 R C OO - Datorită caracterului lor amfoter, aminoacizii formează săruri atât cu acizii cât şi cu bazele. + + HN R C OO - + H+ HN 3 R C OOH + HN R C OO - + H2O HN 2 R C OO - + H2O 3 Deci, în mediu acid, aminoacizii se comportă ca baze, iar în mediu bazic se comportă ca acizi. Datorită faptului că aminoacizii posedă grupări carboxilice şi grupări 34 bazice, ei prezintă proprietăţi datorate grupărilor carboxil şi proprietăţi datorate grupării aminice precum şi proprietăţi determinate de ambele grupări. PEPTIDE Cea mai importantă proprietate a aminoacizilor, este aceea de condensare, care duce la formarea de peptide. Peptidele se formează prin eliminarea unei molecule de apă între gruparea carboxil a unui aminoacid şi gruparea aminică a unui alt aminoacid. H2N CH COOH+ H2N CH COOH H2N CH CO NH CH COOH +H2O R1 R2 R1 R2 Prin convenţie, un lanţ polipeptidic se scrie începând cu extremitatea ce are gruparea aminică liberă, numită capăt N- terminal şi se încheie cu capătul C –terminal, reprezentat de gruparea carboxilică a ultimului aminoacid. H2N CH CO NH CH CO....... NH C H C OOH R1 R2 Rn În unele cazuri aceste capete sunt derivatizate. Oligopeptidele se clasifică în di-, tri-, tetra- până la decapeptide, în funcţie de numărul de resturi de aminoacizi prezenţi în structura peptidei. Ca exemple de peptide cu rol biologic cunoscut amintim: - Dipeptidele: carnozina şi anserina, cu rol în metabolismul muscular. C H2 CH C OOH N N R NH2 NH CO C H2 C H2 R = H carnozina = C H3 anserina - Tripeptide. Glutationul este o tripeptidă formată acid glutamic, cisteină şi glicină, motiv pentru care se numeşte şi γ- glutamil-cisteinil-glicină. 35 HO O C CH C H2 C H2 CO NH CH CO NH C H2 C OOH NH2 C H2 SH Glutationul se întâlneşte în celulele animale, unde se găseşte în concentraţie ridicată. El funcţionează ca un sistem redox şi serveşte în transportul intercelular de aminoacizi. 2 Glu Cys - 2H Gly  Glu Cys Gly + 2H SH S S  Glu Cys Gly (GSH) (GSSH) glutation redus glutation oxidat Interconversiunea formelor reduse şi oxidate are loc sub acţiunea unor enzime şi serveşte în biosinteza eicosanoizilor, a dezoxiribonucleotidelor, în biotransformarea insulinei circulante, precum şi în alte procese. Deoarece glutationul redus protejează grupările tiol ale proteinelor, el este esenţial pentru integritatea eritrocitului şi deasemeni pentru menţinerea Fe din hemoglobină în stare bivalentă. Mecanismul implicat priveşte neutralizarea potenţialului agresiv al peroxizilor rezultaţi în metabolismul aerob. glutation 2 GSH + R- O- OH GSSH + R- OH +H2O peroxidaza Formarea unor astfel de peroxizi este favorizată de un număr de medicamente, la care pot să apară ca efecte adverse anemia hemolitică şi methemoglobinemia. O altă tripeptidă este hormonul de eliberare a tirotropine (TRH) de origine hipotalamică, care are ambele capete derivatizate. TRH se mai numeşte: piroglutamil- histidil- prolinamida. Glutamatul N-terminal apare ciclizat sub forma acidului piroglutamic, iar capătul C –terminal este reprezentat de prolinamidă. Există două grupe de oligopeptide formate din 7- 10 resturi de aminoacizi cu acţiune asupra musculaturii netede, care rezultă din hidroliza enzimatică a unor proteine plasmatice. 36  Angiotensinele provin din angiotensigen, o proteină formată din cca. 400 de aminoacizi. Angiotensinogen renina Angiotensina I (decapeptid) (proteina plasmaticã) captopril enzima de conversie Angiotensina II (octapeptid) aminopeptidaza Angiotensina III (heptapetid) Angiotensinele acţionează asupra vaselor, mai intens pe artere stimulând secreţia de aldosteron şi eliberarea de prostaglandine. Angiotensina II este socotită cel mai puternic agent presor present în circulaţia generală. Aceasta pare a fi implicată în patogeneza hipertensiunii arteriale esenţiale, deşi sunt cazuri cu activitate reninică normală sau chiar scăzută. Inhibitorii sistemului renină- angiotensină, în care rolul central îl are enzima de conversie, se utilizează în tratamentul hipertensiunii arteriale: de exemplu captoprilul. Un alt grup de polipetide este reprezentat de kininele plasmatice, formate din kininogeni sub acţiunea enzimelor numite kalikreine. Plasmakininele, considerate şi hormoni locali, produc vasodilataţie arterială (efect hipotensor), dar determină contracţia vaselor, musculaturii uterine, a intestinului şi bronhoconstricţie. Alte oligopeptide cu activitate biologică sunt encefalinele şi hormonii neurohipofizari. Un alt exemplu de polipeptide naturale este reprezentat de vasopresină şi oxitocină, care sunt peptide ciclice alcătuite numai din aminoacizi. Aceste două polipeptide au o structură foarte apropiată, fiind alcătuite din 9 resturi de aminoacizi, dar prezintă funcţii fiziologice diferite. Vasopresina are efect antidiuretic, iar oxitocina acţionează asupra musculaturii netede a uterului, producând contracţia uterului. Oxitocina stimulează şi contracţia musculaturii din jurul alveolelor mamare, determinând astfel eliminarea laptelui din canalele glandei mamare, având acţiune lactagogă. 37 Proteinele şi funcţiile lor biologice Proteinele sunt cele mai răspândite molecule organice din celulă. Masa moleculară a proteinelor este foarte mare, dar prin hidroliză acidă toate se transformă în compuşi organici simpli, şi anume L-aminoacizi. Proteinele se împart, în funcţie de compoziţia lor în două clase principale: - proteine simple - proteine conjugate Proteinele simple sunt acelea care prin hidroliză formează numai aminoacizi şi nici un alt compus organic sau anorganic. Proteinele conjugate sunt acelea care prin hidroliză pun în libertate pe lângă aminoacizi şi alţi compuşi organici sau anorganici. Partea conjugată a proteinei, care nu este aminoacid se numeşte grupare prostetică. În funcţie de natura grupării prostetice, proteinele conjugate se împart în: Tipul proteinei Gruparea prostetică Locul în care se găsesc - nucleoproteine acizi nucleici: - ADN cromozomi - ARN ribozomi, virusul mozaicului tutunului - lipoproteine fosfolipide β– lipoproteinele plasmatice lipide membranare - glicoproteine glucide: - hexozamine γ – globuline - galactoză - manoza - acid sialic - fosfoproteine fosfaţi esterificaţi cu cazeina radicali ai sernei - hemoproteine hem hemoglobina citocromul C - flavoproteine FAD succinat dehidrogenaza - metaloproteine metale feritina Masa moleculară a proteinelor se poate determina prin metode fizice şi poate fi cuprinsă între 5000 şi câteva milioane. Exemplu: - insulina: greutatea moleculară de 5700 daltoni - virusul mozaicului tutunului: greutatea moleculară de 40000000 de daltoni. Diversitatea funcţională a proteinelor Proteinele îndeplinesc în organism multiple funcţii, dintre care amintim următoarele: 1. Enzimele sunt proteine ce catalizează diverse reacţii biochimice. Exemplu: hexokinaza, lactat dehidrogenaza 2. Proteinele de rezervă 38 Exemplu: - ovalbumina – proteina din albuşul de ou - cazeina – proteina din lapte - feritina – proteina de depozitare a Fe în splină - zeina – proteina din seminţe de porumb - gliadina – proteina din grâu 3. Proteine de transport Exemplu: - hemoglobina – proteina ce transportă oxigenul în sîngele vertebratelor - hemocianina – proteina ce transportă oxigenul din sîngele nevertebratelor - mioglobina – proteina ce transportă oxigenul în celulele musculare - albumina serică – proteina ce transportă acizii graşi în sânge - β1-lipoproteina – proteina ce transportă lipidele în sânge - ceruloplasmina – proteina ce transportă cuprul în sânge Aceste proteine sunt capabile să lege şi să transporte pe calea sângelui anumite tipuri de molecule. 4. Proteinele contractile sunt proteine cu rol esenţial în fenomenul de contracţie şi în mişcare. Exemplu: - actina – filamentele subţiri din miofibrile - miozina – filamentele groase din miofibrile - dineina – proteinele din cili şi flageli. În muşchi, actina şi miozina sunt aşezate în şiruri paralele, alunecând unele pe lângă altele în timpul contracţiei. 5. Proteinele cu rol de protecţie în sângele vertebratelor Exemplu: - anticorpii formează complecşi cu proteinele străine - sistemul complement formează complexe cu anumite sisteme antigen- anticorp. - Fibrinogenul – precursor al fibrinei în coagularea sângelui - Trombina – participă la procesul de coagulare. Unele proteine au rol de apărare sau de protecţie. Proteinele sanguine (trombina şi fibrinogenul) participă la coagularea sângelui oprind astfel pierderile de sânge în sistemul vascular al vertebratelor. Cele mai importante proteine cu rol de apărare a organismului sunt anticorpii sau globulinele imune, care se combină cu proteinele străine sau cu alte substanţe străine intrate întâmplător în organism, neutralizându-le. 6. Toxinele Exemplu: - toxina din Clostridium botulinum - toxina difteriei - veninul de şarpe 39 - ricinul - gossipina Toxinele sunt substanţe foarte toxice pentru organismul animalelor superioare, chiar şi în cantităţi foarte mici. 7. Hormoni Există proteine care funcţioneză ca şi hormoni. Exemplu: - insulina este secretată de anumite celule specializate din pancreas şi reglează metabolismul glucozei. - Hormonul adrenocorticotrop: hormonul de ceştere sau somatotropina este un hormon al glandei hipofizare anterioare, care reglează sinteza corticosteroizilor. 8. Proteinele structurale Există o clasă de proteine care servesc ca şi elemente structurale. Exemplu: - proteinele din învelişul viral - glicoproteinele - α- keratina - sclerotina - fibroina - colagenul - elastina - mucoproteinele. Anticorpii şi răspunsul imun. Specificitatea de specie a proteinelor. Anticorpii sau imunoglobulinele au o importanţă foarte mare în demonstrarea faptului că proteinele sunt specifice pentru fiecare specie. Moleculele de anticorpi apar în serul sanguin sau în anumite celule de vertebrate ca răspuns la introducerea unei proteine sau a unei alte macromolecule străine acelei specii. O astfel de macromoleculă străină speciei respective se numeşte antigen. Moleculele specifice de anticorpi produse în acest mod se pot combina cu antigenul care a determinat formarea lor pentru a forma complexul antige-anticorp. Această reacţie, numită răspuns imun, este baza întregului domeniu al imunologiei. Imunitatea faţă de o anumită boală infecţioasă poate fi adesea realizată prin injectarea unei cantităţi foarte mici de componenţi macromoleculari din microorganisme sau virusuri care provoacă boala respectivă. Ca răspuns la antigenul străin se formează anticorpul specific, sau o imunoglobulină, care rămâne în sânge un timp îndelungat. Dacă microorganismul va pătrunde mai târziu în sânge sau în limfă, aceşti anticorpi specifici îl vor putea inactiva sau chiar omorî prin combinare cu componenţii lor antigenici. Răspunsul imun este dat numai de vertebrate. Anticorpii sunt foarte specifici pentru moleculele străine care le produc. Un anticorp format de un iepure injectat cu ou de găină, de exemplu, se va 40  combina cu acesta, dar nu şi cu alte proteine, cum ar fi hemoglobina umană. Mai mult ei sunt specifici pentru structura tridimensională a albuminei native din oul de găină, astfel încât dacă aceasta este denaturată prin încălzire sau prin alt mijloc, cu deplierea lanţurilor polipeptidice componente sau este modificată chimic, anticorpii nu se vor mai combina cu ea. De aici putem trage următoarele concluzii: 1. Proteine cu funcţii diferite aparţinând unei singure specii determină formarea unor anticorpi diferiţi. Astfel când se imunizează un iepure cu hemoglobină de cal, anticorpii vor precipita hemoglobina de cal şi nu celelalte proteine de cal. 2. Proteine omoloage de la specii diferite nu sunt identice imunologic. 3. Specificitatea anticorpilor reflectă relaţia filogenetică. Exemplu: Proteinele omoloage a speciilor foarte înrudite sunt mult mai asemănătoare între ele decât ale speciilor foarte îndepărtate. Astfel, anticorpii produşi de iepure faţă de hemoglobina de cal reacţionează cel mai bine cu hemoglobina de cal. Ei reacţionează, de asemenea puternic cu hemoglobina altor specii înrudite cu calul (zebra, vaca, porcul sau alte copitate) dar sunt mult mai puţin reactivi cu hemoglobina rozătoarelor, păsărilor sau amfibienilor. Astfel cu cât două specii sunt mai apropiate cu atât mai asemănătoare sunt şi secvenţele de aminoacizi ale proteinelor lor omoloage. Deci, secvenţa de aminoacizi ale proteinelor omoloage poate da informaţii preţioase despre evoluţia diferitelor organisme şi pentru legătura lor filogenetică. Structura proteinelor Lanţurile polipeptidice ale proteinelor se pliază în diferite moduri, atât în cadrul propriului lanţ, dar şi între lanţurile vecine, adică intracatenar şi intercatenar. Acest mod de pliere este esenţial pentru activitatea biologică a proteinelor şi această organizare complicată este cea care trebuie conservată pe parcursul procedurilor implicate în purificarea proteinelor. Deşi mult timp s-a considerat că modurile de pliere ale lanţurilor polipeptidice sunt determinate numai de secvenţa aminoacizilor din lanţ, astăzi s-a stabilit că proteinele având aceeaşi secvenţă a aminoacizilor pot exista în forme diferite de împachetare şi că astfel de plieri pot fi influenţate de prezenţa altor proteine. Structura proteinelor a fost imaginată ca având 4 nivele de organizare, şi anume: structura primară, secundară, terţiară şi cuaternară. 41 Fig. nr.10. Principalele tipuri de structuri ale proteinelor Figura nr.11 Structura proteinelor Structurile proteice sunt stabilizate de două tipuri de legături puternice: legătura peptidică şi puntea disulfidică, precum şi de trei tipuri de legături slabe. Legătura disulfidică se stabileşte între două resturi de cisteină, aparţinând sau nu aceluiaşi lanţ polipeptidic şi este la fel de rezistentă ca şi legătura peptidică la acţiunea agenţilor denaturanţi uzuali ai proteinelor. Această legătură poate fi distrusă prin oxidare cu acid performic sau prin reducere cu betamercatoetanol. Legăturile disulfidice sunt prezente de obicei în proteinele extracelulare şi 42 aproape că lipsesc din cele intracelulare. Legăturile slabe sunt reprezentate în general de legăturile necovalente, şi anume: legături de hidrogen, ionice şi hidrofobe. Legăturile de hidrogen se stabilesc între grupări –CO şi –NH aparţinând unităţilor peptidice diferite, aflate în poziţie adecvată. R C CH N O H legãturã de hidrogen O H N CH C R Forţele electrostatice se formează prin atracţia grupărilor cu sarcină opusă ce aparţin aminoacizilor ionizaţi. Exemplu: - între un aminoacid dicarboxilic şi gruparea ε – aminică a lizinei. Un rol semnificativ în menţinerea structuri îl au deasemeni interacţiunile hidrofobe prin care radicalii nepolari ai aminoacizilor hidrofobi tind să se asocieze. Proteinele în stare naturală au o structură tridimensională unică, ce se exprimă prin conformaţia, care îi determină de astfel şi funcţia. Structura primară În structura oricărei proteine sau peptide se distinge un element comun, reprezentat de axul covalent, care se formează prin repetarea grupării peptidice şi o parte a variabilei reprezentată de radicalii aminoacizilor constituienţi. H2N CH CO NH CH CO....... NH C H C OOH R1 R2 Rn Structura primară este definită ca secvenţa resturilor de aminoacizi ce derivă din policondensarea lor prin legături α- peptidice. Există mai multe argumente în favoarea acestei structuri, dintre care amintim: - proteinele au puţine grupări amino- şi carboxil titrabile, iar numărul lor creşte după hidroliză - dau uşor reacţia biuretului - sinteza de proteine este posibilă excusiv prin interacţiuni peptidice - proteinele sunt substrate pentru peptidaze - identificarea aminoacizilor componenţi prin difracţie cu raze X şi 43  spectroscopie în infraroşu (IR). Cunoaşterea structurii primare a proteinei constă în stabilirea naturii radicalilor, în ordinea înlănţuirii şi localizarea eventualelor punţi disulfidice şi stabilirea tuturor conexiunilor dintr-un lanţ polipeptidic. Pentru determinarea compoziţiei, proteina este supusă hidrolizei în cataliză acidă, bazică sau enzimatică, urmată de separarea şi identificarea aminoacizilor rezultaţi. Hidrolizatul obţinut în urma reacţiei de hidroliză este analizat prin cromatografie sau alte tehnici automatizate. După separarea aminoacizilor, cuatentificarea lor se face prin reacţia de culoare cu ninhidrina sau fluoresceina, care sunt reacţii de mare sensibilitate. Pentru determinarea succesiunii aminoacizilor dintr-un lanţ se folosesc tehnici manuale şi automate bazate pe procese chimice şi enzimatice. Dacă catena polipeptidică este relativ scurtă, se identifică mai întâi capetele N şi C terminale şi apoi secvenţa cuprinsă între ele. Pentru lanţuri mai lungi, după identicarea capetelor N şi C terminale, fragmentul rămas între ele se scindează în fragmente de până la 50 de resturi, care se separă prin cromatografie sau electroforeză. Se determină structura primară a fiecărui fragment şi apoi se potrivesc în ordinea lor iniţială, făcându-se reconstituirea lanţului. Numărul de grupări terminale găsite oferă informaţii asupra numărului de lanţuri ce compun proteina. Capătul N terminal se poate identifica prin marcarea sa cu un compus care formează o legătură covalentă, stabilă în condiţiile în care legăturile peptidice sunt hidrolizate. În acest scop s-au utilizat 2,4 – dinitrofluorbenzenul, clorura de Dansyl şi clorura de Dabsyl. O altă metodă enzimatică foloseşte aminopeptidaza, care hidrolizează legătura peptidică în care este cointeresată aminoacidul N terminal. Astfel, enzima va detaşa pe rând câte un aminoacid ce ajunge în poziţie terminală. Dezavantajul acestei metode este că acţiunea enzimei este foarte lentă în cazul unor aminoacizi. Capătul C terminal poate fi stabilit prin acţiunea carboxipeptidazei, enzimă ce scindează lanţul peptidic cu un rest, începând dinspre aminoacidul cu gruparea carboxilică liberă. După un timp de reacţie se separă şi se identifică aminoacizii eliberaţi. Odată ce fragmentele rezultate din lanţul iniţial au structura primară descifrată, urmeză rezolvarea succesiunii lor în lanţ, pentru care se foloseşte tehnica peptidelor suprapuse. Lanţul peptidic original se scindează prin două sau mai multe metode diferite de hidroliză specifică şi din compararea seturilor de peptide obţinute se deduce integral secvenţa iniţială. Pentru proteinele mari, cu peste 1000 de resturi de aminoacizi, secvenţarea lanţului devine o operaţie dificilă şi care cere mult timp. A apărut însă, tehnologia ADN-ului recombinat, care a permis o nouă modalitate de abordare experimentală în chimia proteinelor. Semnificaţia structurii primare Prima proteină a cărei structură primară a fost identificată este insulina. S-a dovedit că structura primară a proteinelor este determinată genetic şi că proteinele din toate organismele sunt sintetizate printr-un mecanism comun.S-a constatat că secvenţa de aminoacizi este veriga între mesajul genetic cuprins în ADN şi structura tridimensională responsabilă de funcţia biologică a proteinei. Cunoaşterea 44 secvenţei de aminoacizi aduce informaţii esenţiale pentru descifrarea conformaţiei şi mecanismului de acţiune, cu privire la înrudirea proteinelor, în legătură cu evoluţia filogenetică a speciilor precum şi cu domeniul patologiei moleculare. Activitatea biologică a unei proteine poate depinde direct şi indirect de structura ei primară. Modificări minore, ca înlocuirea, pierderea sau inserţia unui aminoacid se traduc biochimic prin polimorfismul proteinelor în cadrul speciei conferind individualitate organismelor prin specificitatea de specie şi prin boli genetice consecutive alterării sau pierderii funcţiei. Structura secundară a proteinelor Structura secundară a proteinelor se referă la dispunerea spaţială a resturilor de aminoacizi învecinaţi în secvenţa liniară, ce poate fi ordonată sau dimpotrivă cu puţine neregularităţi. Prin difracţie cu raze X a fost confirmată existenţa conformaţiilor ordonate şi au fost observate structuri ce se repetă periodic. Tot prin tehnica cristalografică cu raze X a fost stabilit caracterul planar, rigid al legăturii peptidice, datorat conjugării. Figura nr.12. Coplanaritatea celor 4 atomi Consecinţele formării acestui sistem puternic conjugat sunt coplanaritatea celor 4 atomi, ceea ce presupune imposibiliatea rotirii şi existenţei formelor cis şi trans. S-a observat că izomerul trans este favorizat, deoarece este mai sărac în energie. Scheletul lanţului polipeptidic apare, deci ca o succesiune de planuri rigide unite prin atomii de Cα ai aminoacizilor constitutivi. Două treimi dintre atomii lanţului poilpeptidic se află în poziţii fixe unul faţă de altul, dar de o parte şi de alta a fiacărei legături peptidice există o libertate de mişcare. Astfel 2 planuri succesive se pot roti în jurul aceluiaşi Cα. Prezenţa unor radicali mai mult sau puţin voluminoşi va impune amplitudinea rotaţiilor, astfel că unghiurile nu pot avea valori întâmplătoare, ci sunt caracteristice diferitelor tipuri de structuri secundare. Structura secundară prezintă 2 modele, şi anume: modelul α-helix şi foaie pliată. 45 Modelul α-helix Modelul α-helix reprezintă un tip de structură secundară ce presupune ca lanţul să se înfăşoare strâns pe o direcţie spiralată, formând un cilindru cu interiorul aproape plin, din care radicalii aminoacizilor apar înt-o dispunere helicoidală. Figura nr.13. Modelul de α-helix Ca sens de răsucire în proteine a fost identificat α-helix pe dreapta. Stabilitatea α-helixului este menţinută prin legături de H ce se formează între grupările carbonil şi aminice din lanţul spiralat aflate faţă în faţă la o distanţă adecvată. La α-helix fiecare aminoacid avansează spirala cu 1,5A0 la o rotire de 1000, pe fiecare spirală existând 3,6 resturi, deci pasul spiralei este de 5,4A0. Aceste dimensiuni arată formarea legăturii de H între grupările CO şi NH din cadrul lanţului polipeptidic. Există unii aminoacizi care sunt nefavorabili structurii de α-helix. Aceştia sunt aminoacizi ce stabilizează structura de α-helix. Exemplu: - prolina poate să rupă spirala. Aminoacizii cu resturi laterale voluminoase (arg, ile, lys, asp, glu) destabilizează helixul prin interfernţe fizice sau electrostatice. Conţinutul de α-helix în proteine cu structură spaţială este variabil. Lungimea şi repartizarea segmentelor de α-helix depinde de distribuţia resturilor favorabile sau destabilizatoare în lungul lanţurilor. În mioglobină şi hemoglobină apare ca motiv structural major, iar în altele lipseşte chimotripsina. La majoritatea proteinelor se găseşte ca helix singular pe distanţe scurte (40 A0), rar pe zone extinse de 1000A0. Două sau câteva α- 46 helixuri se pot împleti ca şuviţele unui şnur, aşa cum apar în proteinele fibroase: α-keratina din păr, miozina, fibroina, care îndeplinesc un rol mecanic de formare a mănunchiurilor rezistente de fibre. Figura nr.14 Structura secundara a proteinelor Figura nr.15 Modelul de alfa- helix Modelul β sau foia pliată Structura de foaie pliată a fost studiată tot de Pauling şi Corey, curând după α-helix, de aceea au numit-o structura β. Cele 2 modele diferă în primul rând prin faptul că lanţul polipeptidic în conformaţia β este mai relaxat, fiind aproape complet extins. Distanţa axială între două resturi succesive este de 3,5A0 faţă de 1,5A0 în α-helix, cu o periodicitate decorespunzând la cca 7A0. Lanţurile polipeptidice sunt aşezate în foi pliate, care sunt legate între ele prin legături de hidrogen. Radicalii aminoacizilor se situează deasupra şi dedesubtul planului foii. Dacă sensul de desfăşurare a lanţului în porţiunile adiacente coincide, foaia este numită paralelă. Aranjamentul alternativ în foaia 47 antiparalelă este favorabil, succesiunea grupărilor CO şi NH fiind complementare. Figura nr.16. Strucura de foaie pliată. Aminoacizi mici: gly, ala, avantajează foaia pliată, iar cei cu radical mare sau cu sarcină stânjenesc aranjamentul. Ca şi modelul de α-helix, structura β se întâlneşte în multe proteine globulare sau fibroase. Asocieri de lanţuri paralele apar în fibroina (mătase) şi antiparalele apar în β-keratina. Un exemplu de proteină fibrilară prezentă la animlaele superioare este colagenul din ţesutul conjunctiv, fiind cea mai răspândită proteină dintre proteinele vertebratelor superioare. Cu cât un animal este mai mare şi mai greu, cu atât proporţia de colagen este mai mare. Fibrele de colagen sunt aranjate în moduri diferite, depinzând de sarcina biologică pe care o are de îndeplinit proteina. Structura terţiară a proteinelor Structura terţiară a proteinelor reprezintă aranjamentul spaţial general al moleculei, rezultat prin asocierea dintre diferite regiuni ale aceluiaşi lanţ, a căror structură secundară poate sau nu varia. Aranjamentul spaţial al proteinelor s-a studiat cu raze X. Printre proteinele globulare ale căror structură terţiară este binecunoscută sunt: mioglobina, hemoglobina, lizozomii, ribonucleaza, citocromul c, lactat dehidrogenaza. Reprezentantul clasic al structurii terţiare este mioglobina. Mioglobina este o proteină globulară relativ mică, care conţine un singur lanţ polipeptidic format din 153 resturi de aminoacizi, a căror secvenţă încă nu se cunoaşte. Mioglobina conţine o feroproteină, sau hem, grupare identică cu cea a hemoglobinei, fiind şi ea capabilă să se oxigeneze şi să se deoxigeneze. Mioglobina se găseşte în celulele muşchilor scheletici şi este deosebit de abundentă la mamiferele acvatice, cum ar fi: balena, foca sau morsa, a căror 48 muşchi sunt atât de bogaţi în mioglobină încât sunt coloraţi în brun închis. Scheletul moleculei de mioglobină este format din opt segmente aproximativ drepte, unite prin porţiuni curbate. Fiecare segment drept este un α-helix, cel mai lung fiind constituit din 23 de aminoacizi, iar cel mai scurt este format din numai 7 aminoacizi şi toţi au sensul de răsucire spre dreapta. Aceste regiuni α- helicoidale reprezintă 70% din aminoacizii din moleculă. Deşi structura mioglobinei pare neregulată şi asimetrică, ea nu este deloc întâmplătoare. Toate moleculele de mioglobină au aceeaşi configuraţie. Figura nr.17. Structura mioglobinei Alte aspecte structurale legate de structura mioglobinei sunt următoarele: 1. Molecula este foarte compactă, în interiorul ei rămâne spaţiu pentru patru molecule de apă. 2. Toate grupările R polare ale resturilor de aminoacizi sunt localizate pe suprafaţa externă a moleculei şi sunt hidratate. 3. Aproape toate grupările R nepolare sau hidrofobe se află în interiorul moleculei, ferite de expunerea la apă. 4. Resturile de prolină se găsesc numai în zonele de curbură, care conţin, deasemenea aminoacizi care nu formează cu uşurinţă α-helix, de exemplu: izoleucina şi serina. 5. Conformaţia de ansamblu a lanţului polipeptidic este aparent aceeaşi la mioglobina tuturor speciilor speciilor studiate, deşi ele diferă oarecum în compoziţia de aminoacizi. Astfel, resturile constante de secvenţă pot fi implicate în determinarea poziţiei curburilor şi a direcţiei segmentelor drepte. Ribonucleaza, este o enzimă pancreatică ce depolimerizează molecula de ARN şi exemplifică un model diferit de împachetare tridimensională a lanţului. Catena ei este formată din 124 de aminoacizi şi este organizată în proporţie de 49 40% ca foaie pliată antiparalelă, 15% în α-helix, restul lanţului găsindu-se sub formă de bucle. În structura terţiară forma generală a moleculei aminteşte de cochilia unui melc, la a cărei stabilitate contribuie şi 4 punţi disulfidice. Structura cuaternară Structura cuaternară apare la proteinele alcătuite din două sau mai multe lanţuri polipeptidice care se asociază formând o unitate de sine stătătoare, cu formă spaţială bine definită şi posedând o anumită activitate biologică. Structura cuaternară se referă la felul, numărul şi aranjamentul lanţurilor polipeptidice încluzând şi natura contactelor dintre ele. Cele mai multe proteine oligomer sunt formate dintr-un număr mic şi par de lanţuri, care se numesc subunităţi sau protomeri. Subunităţile identice sau diferite au fiecare structura sa spaţială; ele se pot aşeza succesiv pe direcţie liniară, circulară sau mai compact suprapuse în forme geometrice diferite. Aceste posibilităţi de aranjare se referă la protomeri identici sau foarte puţin diferiţi. Ansamblul prezintă simetrie, suprafeţele de contact sunt complementare, sugerând gradul înalt de specificitate al structurii cuaternare. Monomerii realizează interacţiuni slabe: (legături saline, legături de hidrogen, forţe Wan der Waals, legături hidrofobe), proteina putând astfel disocia reversibil. Lanţurile izolate sunt lipsite de activitate, funcţia fiind rezultatul ansamblului cu structură cuaternară. Exemple de proteine cu structură cuaternară: - creatin kinaza, lactat dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, enzime, proteine neenzimatice: hemoglobina , imunoglobulina G. Alte exemple de proteine cu structură cuaternară sunt enzimele allosterice. Noţiunea de structură cuaternară se poate extinde şi la unele heteroproteine. Printre cele mai simple proteine oligomere este hemoglobina, care este formată din 4 lanţuri polipetidice. Hemoglobina conţine 2 lanţuri α formate din 141 de resturi de aminoacizi şi 2 lanţuri β formate din 146 de resturi de aminoacizi; fiecare dintre acestea având ataşat printr-o legătură necovalentă câte un radical hem. Molecula a fost studiată în forma sa oxigenată, care are o structură sferică, compactă, cu dimensiuni de: 6,4/5,5/5,0mm. În hemoglobină, între cele 2 lanţuri α, ca şi între cele două lanţuri β există foarte puţine contacte, în schimb, numeroase grupări R fac legătura între perechile de lanţuri care nu sunt asemenea. 50 Figura nr.18. Structura hemoglobinei Un inters deosebit îl prezintă aşezarea pe fiecare subunitate a câte uneia dintre cele 4 grupări hem, care leagă cele 4 molecule de oxigen. Aceste grupări hem, molecule plane, în care atomii de fier formează complecşi de coordinare plan-pătraţi, sunt destul de îndepărtate între ele şi sunt situate la anumite ungliuri unele de altele. În molecula hemoglobinei rămâne o cavitate centală, mărginită de grupări cu radical R polare. Figura nr.19 Formarea hemoglobinei În sângele uman adult s-au identificat trei hemoglobine a căror prezenşă este constantă,şi anume hemoglobinele A1, A2 şi F. Rolul fiziologic al hemoglobinei A2 nu este bine definit încă, iar în ceea ce priveşte hemoglobina F fetală aceasta reprezintă un tip de hemoglobină adaptat pentru condiţiile de 51 oxigenare din uter. După naştere hemoglobina F este înlocuită cu hemoglobina A1. Hemoglobina are proprietatea de a accepta oxigenul , proprietate dublată de posibilitatea de a l transporta organism. Acest lucru sete posibil datorită structurii tetramerice ce permite atât acceptarea unei cantităţi mari de oxigen în plămân, cât şi posibilitatea de eliberare a acestuia în mod treptat, în funcţie de presiunea de oxigen din ţesutul respectiv. Legarea oxigenului de hemoglobină se face la nivelul celor 4 atomi de fier conţinuţi în cele 4 molecule de hem ale lanţurilor α şi ß. Fierul din hemoglobină nu îşi schimbă valenţa în urma fixării oxigenului el rămâne deci sub formă de ion feros. Ia naştere astfel oxihemoglobina, compus labil care la presiune scăzută de oxigen la nivelul ţesuturilor pune în libertate oxigenul cu reformarea hemoglobinei. Legarea oxigenului de hemoglobină şi eliberarea sa constituie un model de adaptare biologică faţă de o anumită necesitate a organismelor superior organizate. Combinarea gradată şi controlată a hemoglobinei cu oxigenul, precum şi existenţa unor forme parţial saturate cu oxigen, permite oxigenarea tuturor celulelor, indiferent de presiunea de oxigen existentă la nivelul lor. În afară de oxigen hemoglobinele se pot uni reversibilşi cu alte gaze, iar valenţa fierului în compuşii care rezultă este caşi în oxihemoglobină şi anume +2. Gazul pentru care hemoglobina are o afinitate mare este oxidul de carbon, formându se carboxihemoglobina mai stabilă ca şi oxihemoglobina. Acest lucru este motivul pentru care într un mediu saturat oxid de carbon pot să apară intoxicaţii grave. Ambele forme oxi şi carboxihemoglobina se pot transforma prin desfacerea oxigenului respectiv a oxidului de carbon simultan cu o oxidare a ionului feros la feric, într un compus numit methemoglobină. Acest lucru are loc în mod continuu în eritrocit unde se găseşte într o concentraţie de 0,4% dintotalul hemoglobinei, constituid o etapă preliminară catabolizării sale. O cantitate limitată de methemoglobină se poate transforma în hemoglobină sub acţiunea unei enzime numită methemoglobinreductază. Concentraţia methemoglobinei nu creşte mai mult de 0,4% din totalul hemoglobinei eritrocitare numai prin introducerea în organism de oxidanţi ca fericianura şi azotiţi sau chiar a unor medicamente cum ar fi antipirina. Combinaţia hemoglobinei cu gazele au spectre de absorbţie caracteristice care permit identificarea fiecareia dintre ele. Denaturarea proteinelor Denaturarea proteinelor reprezintă perturbarea structurii lor native, înalt organizate, trecerea la o formă întâmplătoare cu creşterea entalpiei sistemului, astfel că activitatea biologică este compromisă. Denaturarea proteinelor are loc sub acţiunea unor agenţi denaturanţi. Agenţii denaturanţi sunt: temperatura, acizii, bazele, oxidanţii, unele metale, ureea, guanidina, solvenţii organici. Agenţii denaturanţi acţionează distrugând legăturile ce dau stabilitate structurii 52 tridimensionale. Fenomenul de denaturare priveşte nivelele de structură secundară, terţiară şi cuaternară, menţinute prin legături slabe, fără afectarea structurii primare. Procesul de denaturare poate să fie până la un punct reversibil. Însă, dacă agentul denaturant acţionează mai energic, proteina se denaturează ireversibil. În cazul unui proces reversibil, după îndepărtarea agentului cauzant, proteina se renaturează, redobândind structura nativă. Aceasta se explică prin dependenţa structurii spaţiale de cea primară. Figura nr.20. Procesul de denaturare şi renaturare a proteinelor Proteinele denaturate îşi schimbă proprietăţile fizice, cum ar fi: activitatea optică şi vâscozitatea. Deasemenea solubilitatea în apă scade producând precipitarea lor. Acest fenomen de precipitare este exploatat în biochimia analitică la cercetarea proteinelor din lichidele biologice în scopul deproteinizării. Alte aplicaţii ale fenomenului de denaturare sunt: procedeele de purificare a proteinelor şi operaţia de sterilizare. 53 IV. Enzime Enzimele sunt proteine ce posedă o funcţie înalt specializată şi anume aceea de biocataliză şi se deosebesc de catalizatorii din lumea nevie prin câteva proprietăţi care le definesc. Enzimele se caracterizează prin următoarele proprietăţi: - capacitatea catalitică mare, eficienţa catalitică creşte cu un factor de 106 – 1012 faţă de reacţia necatalizată. - Specificitatea superioară de reacţie – elimină formarea de produşi secundari - Activităţile catalitice enzimatice sunt reglate prin mecanisme diferite, care privesc fie acţiunea lor, fie cantitatea de enzimă sintetizată. Controlul enzimatic are semnificaţie majoră pentru reglarea metabolismului celular. - Enzimele acţionează în condiţii foarte blânde şi anume la temperatura celulelor vii, la pH aproape neutru şi la presiune atmosferică. Figura nr. 21 Exemplu de reactie necatalizata(a) si catalizata(b) Nomenclatură şi clasificare Multă vreme enzimele au fost denumite prin adăugarea sufixului aza la numele substratului. Ex. Amilaza, ureeza, alcool dehidrogenaza. Unele denumiri însă nu includeau nici substratul, nici reacţia catalizată. Ex. Tripsina, pepsina, catalaza. Datorită faptului că numărul de enzime este în continuă creştere, nomenclatura veche crea confuzii, astfel că s-a impus introducerea unei terminologii unitare şi a unei clasificări adecvate. În 1961, Comisia de Enzime a Uniunii Internaţionale de Biochimie, adoptă o claisficare şi o nomenclatură sistematică, bazată pe natura reacţiei chimice catalizate. Astfel, enzimele au fost clasificate în 6 clase, fiecare cuprinzând un număr de subclase şi, respectiv subsubclase. 1. Oxidoreductaze – enzime ce catalizează reacţiile de oxidoreducere. 54 2. Transferaze – enzime ce catalizează reacţiile de transfer de grupări funcţionale. 3. Hidrolaze – enzime ce catalizează reacţiile de hidroliză. 4. Liaze – enzime ce catalizează reacţiile de descompunere a substratului prin alte mecanisme decât cele de oxidare şi hidroliză. 5. Izomeraze – enzime ce catalizează reacţii de interconversiune a izomerilor. 6. Ligaze – enzime ce catalizează reacţii de formare a legăturii C-O, C-C, C-S, C-N, cuplată cu scindarea unui compus macroergic (ATP). Pentru a defini o enzimă, fiecăruia i se atribuie un număr sistematic format din numele substratelor, urmat de cuvântul ce indică tipul de reacţie catalizată, la care adaugă sufixul aza. Deasemenea, fiecărei enzime i se atribuie un cod determinat de poziţia pe care enzima o ocupă în sistemul zecimal. Exemplu: Acest număr de clasificare este alcătuit din iniţialele EC (Comisia de enzime) şi 4 cifre. Prima cifră indică clasa din care face parte enzima, a doua indică subclasa, determinată de felul grupării implicate în reacţie, a treia cifră reprezintă subsubclasa , adică natura particulară a substratelor din grupul respectiv, iar a patra cifră reprezintă poziţia ocupată de enzimă în subsubclasă. - alcool dehidrogenaza: E.C. 1.1.1.1. - glucozooxidaza: E.C. 1.1.3.4. Clasificarea enzimelor se face dupa urmatoarele criterii: - Solubilitate - Structura - Tipul reactiei catalizate Clasificarea enzimelor dupa solubilitate Enzimele se clasifica in enzime hidrosolubile si enzime partial hidrosolubile sau insolubile. Enzime hidrosolubile (ex. Enzimele cu localizare citosolica, lumenala sau matriceala). Enzime partial hidrosolubile sau insolubile in apa(ex. cu locali