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AMMINOACIDI Gli -amminoacidi o 2-amminoacidi sono l'unità strutturale delle proteine Tutti gli -amminoacidi sono molecole chirali poiché possiedono un atomo di carbonio asimmetrico cioè un atomo al quale sono legati quattro gruppi differenti: un gruppo carbossilico – COOH un gr...

AMMINOACIDI Gli -amminoacidi o 2-amminoacidi sono l'unità strutturale delle proteine Tutti gli -amminoacidi sono molecole chirali poiché possiedono un atomo di carbonio asimmetrico cioè un atomo al quale sono legati quattro gruppi differenti: un gruppo carbossilico – COOH un gruppo amminico – NH2 un atomo di – H una catena laterale – R diversa in ciascun amminoacido. La catena laterale della glicina è un atomo di idrogeno (il secondo), per questo motivo la glicina non è una molecola chirale). Essendo molecule chirali gli -amminoacidi (con la eccezione della glicina) esistono in forma di 2 stereoisomeri (enatiomeri): D - e L- amminoacidi a seconda che l’atomo di carbonio asimmetrico abbia la configurazione assoluta del carbonio asimmetrico della D- oppure della L-gliceraldeide. Gli amminoacidi fisiologici appartengono alla serie degli L-amminoacidi CLASSIFICAZIONE DEGLI AMMINOACIDI Sulla base delle caratteristiche chimico-fisiche delle diverse catene laterali i 20 amminoacidi fisiologici vengono classificati in 3 gruppi: 1. Aminoacidi con catena laterale non polare alifatica: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro aromatica: Phe, Tyr, Trp 2. Aminoacidi con catena laterale polare non ionizzata Ser, Thr, Cys, Asn, Gln 3. Aminoacidi con catena laterale ionizzata carica positivamente: Lys, Arg, His carica negativamente: Asp, Glu  Glicina (Gly, G): acido amminoetanoico Alanina (Ala, A): acido 2-aminopropanoico Prolina (Pro, P): acido pirrolidin-2-carbossilico Valina (Val, V): acido 2-amino-3-metilbutanoico Leucina (Leu, L): acido 2-amino-4-metilpentanoico Isoleucina (Ile, I): acido 2-amino-3-metilpentanoico Metionina (Met, M): acido 2-amino-4-(metiltio)butanoico Serina (Ser, S): acido 2-ammino-3-idrossipropanoico Treonina (Thr, T): acido 2-ammino-3-idrossibutanoico Cisteina (Cys, C): acido 2-ammino-3-mercaptopropanoico Asparagina (Asn, N): acido 2-ammino-3-carbamilpropanoico Glutammina (Gln, Q): acido 2-ammino-4-carbamilbutanoico  Fenilalanina (Phe, F): acido 2-amino-3-fenilpropanoico Tirosina (Tyr, Y): acido 2-ammino-3-(4-idrossifenil)-propanoico Triptofano (Trp, W): acido 2-amino-3- indolil-propanoico Lisina (Lys, K): acido 2,6-diamminoesanoico Arginina (Arg, R): acido 2-ammino-5-guanidinopentanoico Istidina (His, H): acido 2-ammino-3-imidazolil-propanoico Aspartato (Asp, D): acido 2-amminobutandioico Glutammato (Glu, E): acido 2-amminopentandioico IL LEGAME PEPTIDICO Le proteine sono polimeri di amminoacidi. In una proteina che può essere costituta da centinaia di amminoacidi, gli amminoacidi sono legati fra loro mediante i legami peptidici. Un legame peptidico si forma quando il gruppo carbossilico dell’amminoacido che precede reagisce con il gruppo amminico dell’amminoacido che segue. + + H2O In termini generali si tratta di una reazione di sostituzione nucleofila acilica a seguito della quale il gruppo –OH del carbossile viene sostituito dal gruppo –NH – del secondo amminoacido con eliminazione di una molecola di acqua. Il legame peptidico è un legame di tipo ammidico. Il meccanismo di reazione è complesso e richiede dapprima la reazione del gruppo carbossilico dell’amminoacido con una molecola di ATP e formazione di un amminoacil-AMP (fase 1). Succesivamente il gruppo carbossilico dell’amminoacido viene trasferito sul gruppo –OH in 3’ del tRNA con la formazione di un legame estere (fase 2). Entrambe le reazioni sono catalizzate dall’enzima amminoacil-tRNA sintetasi I ribosomi utilizzano gli amminoacil-tRNA per la polimerizzazione degli amminoacidi. Una molecola di GTP viene idrolizzata per ciascun legame formato. Dopo la formazione del legame peptico il tRNA non più legato all’amminoacido viene rilasciato nel citoplasma. sintesi degli amminoacil-tRNA fase 1 amminoacil-AMP ATP PPi fase 2 amminoacil-AMP + tRNA amminoacil-tRNA + AMP amminoacil-tRNA primo nucelotide del tRNA (A) tRNA sito di legame fra tRNA e amminoacido legame estere fra il carbossile amminoacido dell’amminoacido e il gruppo −OH all’estremità 3’ del tRNA  Non vi è libertà rotazionale per gli atomi di N e C impegnati nel legame peptidico. Il legame peptidico è un ibrido di risonanza fra due strutture limite. il legame peptidico è caratterizzato un momento di dipolo elettrico Sia l’atomo di C che quello di N sono ibridati sp2 Energia di risonanza ≈ 88kJ/mole L’assenza di libertà rotazionale attorno al legame C–N fa sì che i quattro atomi coinvolti nel legame peptidico (O, C, N e H) di due amminoacidi adiacenti in una catena peptidica siano sullo stesso piano. La maggior parte dei legami peptidici è in configurazione trans: 1. l’atomo di ossigeno del gruppo carbonilico e l’azoto ammidico sono orientati verso i lati opposti del legame peptidico 2. orientamento opposto hanno anche gli atomi di C e le catene laterali di due amminoacidi adiacenti. La configurazione trans è energeticamente favorevole in quanto limita le interazioni fra le nuvole elettroniche delle catene laterali di amminoacidi adiacenti (-8 kJ/mole). Meno frequentemente i legami peptidici in configurazione cis. Fra i legami peptidici con geometria cis quello che ricorre con maggior frequenza è X-Pro. Si tratta di un legame fra il gruppo carbossilico di un qualsiasi amminoacido e l’amminogruppo di una prolina. (l’atomo di N della pro è legato a due atomi di carbonio tetraedrici: questo rende l’energia potenziale della configurazione cis simile a quella della configurazione trans). Legami peptidici in configurazione cis caratterizzano i ripiegamenti β o β-turns cis Nei legami peptidici in configurazione cis: 1. l’ atomo di ossigeno del gruppo carbonilico e l’azoto ammidico sono dallo stesso lato del legame peptidico 2. gli atomi di C e le catene laterali di due amminoacidi adiacenti sono dallo stesso lato del legame peptidico Diversamente dal legame peptidico i restanti legami dello scheletro polipeptidico di una proteina: -N-C- -C-C- sono legami semplici (σ) e permettono, in teoria, la libera rotazione degli atomi legati Vengono definiti:  l’angolo di torsione intorno al legame -N-C-  l’angolo di torsione intorno al legame -C-C- La libera rotazione intorno a questi due legami è di fatto limitata da interazioni energeticamente sfavorevoli (determinano un aumento della energia potenziale). Si tratta di interazioni repulsive fra: 1. gruppi peptidici adiacenti (fra l’idrogeno ammidico e l’ossigeno carbonilico di due legami peptidici adiacenti) 2. catene laterali di amminoacidi contigui. ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DELLE PROTEINE I livelli di organizzazione strutturale riconoscibili nelle proteine sono quattro Struttura primaria: corrisponde alla sequenza degli aminoacidi uniti con legami peptidici. Struttura secondaria: corrisponde alla disposizione tridimensionale degli atomi di amminoacidi adiacenti in un segmento polipeptidico organizzati in strutture tridimensionali locali: elica- proteine globulari (enzimi, proteine di trasporto, immunoglobuline, proteine del plasma) foglietto- tripla elica allungata → collagene (proteine fibrose) Struttura terziaria: corrisponde alla disposizione tridimensionale di tutti gli atomi di una proteina quando i diversi segmenti di una proteina organizzati in strutture secondarie e supersecondarie si ripiegano intorno a un nucleo centrale idrofobico. Struttura quaternaria (è caratteristica di alcuni enzimi multisubunità e della emoglobina): descrive i rapporti tridimensionali che intercorrono fra le subunità di proteine multimeriche cioè proteine costituite dalla associazione non covalente di più catene polipeptidiche. struttura cristallografica della esochinasi 1 (HK1) umana https://www.rcsb.org/3d-view/1HKB/1 STRUTTURA PRIMARIA E’ la sequenza degli amminoacidi all’interno di una catena polipeptidica. La sequenza degli amminoacidi di una proteina è specificata dalla sequenza dei nucleotidi del gene che la codifica. La sequenza degli amminoacidi di una proteina viene orientata a partire dalla estremità ammino-terminale o N-terminale verso l’ estremità carbossil-terminale o C-terminale. L’estremità ammino-terminale corrisponde al primo L’estremità carbossil-terminale corrisponde all’ultimo amminoacido di una proteina (di solito una metionina) (il amminoacido di una proteina (il gruppo carbossilico gruppo α-amminico di il questo amminoacido non è di questo amminoacido non è impegnato in un legame impegnato in un legame peptidico). peptidico). Dalla struttura primaria di una proteina dipendono : la massa: la somma delle masse atomiche degli atomi che la costituiscono. L’unità di misura è il Dalton o uma. Vengono solitamente utilizzati multipli del dalton (kDa). il punto isoelettrico (pI): il valore di pH in corrispondenza del quale la carica netta della proteina e uguale a 0. Posta in un campo elettrico la proteina non si sposta nè in direzione dell’anodo (-) nè del catodo (+). STRUTTURE SECONDARIE 1. Elica- Si tratta di strutture ad avvolgimento destrogiro (angoli di torsione  = – 57°,  = – 47°) Vi sono 3,6 aminoacidi per giro dell’elica. L’innalzamento dell’elica è 0.54 nm/giro (0.15 nm/aa). L’elica si ripete esattamente ogni 18 aminoacidi cioè ogni 5 giri. Le eliche- sono stabilizzate dai legami a idrogeno fra i gruppi N – H (donatori) e gruppi C=O (accettori) della catena peptidica. Il gruppo C=O di ciascun amminoacido forma un ponte a idrogeno con il gruppo N – H dell’amminoacido che si trova 4 residui più avanti nella sequenza. Le catene laterali degli amminoacidi sono dirette verso l’esterno dell’elica Una -elica è molto compatta e rigida poiché nella parte centrale dell’elica le distanze interatomiche degli atomi costituenti lo scheletro polipeptidico corrispondono alle distanze di van der Waals (sono in contatto). 2. Foglietti- E’ la seconda struttura regolare individuato nelle proteine globulari. Originano dall’appaiamento di tratti della catena polipeptidica denominati filamenti  (-strands) che hanno una conformazione quasi completamente distesa. i foglietti- sono stabilizzati da ponti idrogeno fra i gruppi –NH e -C=O di filamenti adiacenti nei foglietti- sono gli atomi C successivi e i gruppi R ad essi legati si alternano sopra e sotto il piano mediano dalla catena polipeptidica. Al contrario dell'elica-, che è costituita da residui adiacenti nella sequenza amminoacidica, i foglietti-  risultano dall’appaiamento di regioni della catena polipeptidica che possono essere distanti nella struttura primaria. Esistono diversi tipi di foglietti-: 1. Foglietti- paralleli costituiti in media in media da 5-6 filamenti polipeptidici appaiati aventi la medesima direzione biochimica. Ciascun filamento è costituito in media da 6 amminoacidi. Gli angoli di torsione sono: = -119°, = +113°. I legami idrogeno hanno tutti la stessa lunghezza e risultano angolati rispetto ai filamenti. 2. Foglietti- antiparalleli costituiti da almeno 2 filamenti polipeptidici appaiati aventi direzione biochimica opposta. Gli angoli di torsione sono: = -139°, = +135°. I legami idrogeno sono perpendicolari ai filamenti polipeptidici. 3. Foglietti- misti costituiti da almeno 3 filamenti polipeptidici paralleli e antiparalleli appaiati. STRUTTURE NON RIPETITIVE Regioni ad ansa La struttura della maggior parte delle proteine risulta dalla combinazione di più elementi di struttura secondaria quali -eliche e filamenti- collegati da regioni ad ansa di lunghezza variabile (6-16 residui) caratterizzate da un minore ordine strutturale. Le regioni ad ansa oltre a svolgere funzioni di collegamento tra segmenti della catena polipeptidica aventi diversa struttura secondaria, spesso partecipano alla formazione del sito attivo di numerosi enzimi e dei siti di riconoscimento intermolecolare (es sito di legame per l’antigene delle immunoglobuline). Nelle regioni ad ansa che si trovano alla superficie della proteina, i gruppi -C=O e -N-H non formano legami di idrogeno fra loro ma sono esposti al solvente e formano legami di idrogeno con l'acqua. Un sottotipo di regioni ad ansa sono quelle che connettono due filamenti  antiparalleli adiacenti e sono denominate ripiegamenti  o -turn. Mediante un ripiegamento  la catena polipeptidica è in grado di effettuare una completa inversione di direzione (180°) in soli 4 residui. I ripiegamenti  sono stabilizzati da un ponte idrogeno fra il gruppo -C=O del primo amminoacido coinvolto e l’idrogeno ammidico del gruppo -N-H in posizione +4. Esistono due tipi di ripiegamenti β: tipo-I e tipo-II che differiscono per il diverso orientamento del gruppo peptidico fra l’amminoacido 2 e 3. legame peptidico In entrambi i tipi l’amminoacido 2 è CIS legame Pro. peptidico CIS Nel tipo II l’amminoacido 3 è Gly. tipo I tipo II STRUTTURE SUPERSECONDARIE Si tratta di organizzazioni locali di una proteina derivanti dalla combinazione di un numero limitato di strutture secondarie Struttura a forcina  (hairpin ) Si tratta della più semplice struttura supersecondaria associata ai filamenti beta antiparalleli è costituita da due filamenti antiparalleli uniti da un  turn. Struttura -- Si tratta di un motivo strutturale che caratterizza i foglietti- paralleli. L’elica  unisce l’estremo carbossile terminale di un filamento  con l’estremità amino terminale del secondo filamento . Le regioni a da ansa che connettono i filamenti  con l’elica  possono avere lunghezze molto disparate (da 4-5 amminoacidi a diverse decine).  STRUTTURA TERZIARIA Caratteristica delle proteine globulari. Rappresenta l’organizzazione tridimensionale complessiva di una proteina ripiegata in conformazione nativa. Descrive i rapporti tridimensionali che intercorrono fra i diversi tratti di una proteina organizzati in strutture secondarie allorché questi si ripiegano intorno a un nucleo centrale idrofobico. I dominî strutturali caratterizzano le proteine di grandi dimensioni > 200 aa che solitamente si ripiegano a formare più unità globulari strutturalmente indipendenti La struttura terziaria di tutte le proteine è stabilizzata da interazioni di natura elettrostatica (forze di van der Waals) fra le catene laterali degli amminoacidi GAPD struttura cristallografica della esochinasi 1 (HK1) umana Ponti disolfuro. La struttura terziaria di numerose proteine extracellulari è stabilizzata mediate la formazione di ponti disolfuro fra residui di cisteina. Particolarmente frequenti nelle proteine secrete: ormoni peptidici (es insulina), enzimi digestivi (tripsina 6, chimotripsina 5, amilasi 3), immunoglobuline (IgG 4 intercatena e 4 intracatena), proteine del complemento, lisozima (4). Molto frequenti anche nei domini extracellulari delle proteine di membrana. I ponti disolfuro sono assenti nelle proteine intracellulari. R-CH2-SH + R'-CH2-SH R-CH2-S-S-CH2-R' + 2e- + 2H+ La formazione di un ponte disolfuro è catalizzata dall’enzima PDI (proteina disolfuro isomerasi) espresso nel reticolo endoplasmico) Legami di coordinazione con ioni metallici Gli ioni di alcuni metalli di transizione e dei gruppi principali stabilizzano la struttura terziaria di numerose proteine attraverso la formazione di complessi di coordinazione con atomi di N, O, S delle catene laterali di His, Cys, Asp, Glu, Gln, Asn Complessi di coordinazione dello zinco (Zn++) - zinc finger. Strutture supersecondarie attraverso le quali numerose fattori di trascrizione interagiscono con la doppia elica del DNA. I fattori di trascrizione sono proteine che riconoscono specifiche sequenze di DNA delle quali favoriscono la trascrizione attivando la RNA polimerasi II. Fattore di trascrizione TFIIA: si tratta di una struttura supersecondaria contenente uno ione Zn2+ coordinato a quattro aminoacidi (H, H, C, C) Recettori intracellulari per gli ormoni steroidei. Strutturalmente questo secondo tipo di zinc-finger è molto simile a una struttura helix-loop-helix : due eliche  unite da una loop region legano due ioni Zn2+ Complessi di coordinazione del calcio (Ca++) Proteine leganti Ca2+ quali parvalbumina, la troponina C e calmodulina. In queste proteine il calcio è al centro di un sistema di coordinazione (n di coordinazione = 6-8). Gli amminoacidi che funzionano da ligandi per il calcio sono D, N, E, Q.