Manual de Teoría Microbiología Veterinaria II PDF

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 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA Facultad de Ciencia Animal Departamento de Medicina Veterinaria “Por un Desarrollo Agrario Integral y Sostenible” Manual de Teoría Microbiologia Veterinária I I Autor: - Ing. Radamés L. García A. MSc. Profesor de Microbiología e Inmunología Universidad Nacional Agraria de la Habana, Cuba Managua, Nicaragua 2013  N 576 G216García A., Radamés L. Manual de teoría : microbiología veterinaria II / Radamés L. García A.-- 1a ed. -- Managua : UNA, 2013 143 p. ISBN 978-99924-1-020-2 1.HONGOS PATOGENOS 2.BACTERIAS 3.PRIONES 4.ENFERMEDADES MICROBACTERIANA 5.EDUCACION SUPERIOR ® Todos los derechos reservados 2013 © Universidad Nacional Agraria Centro Nacional de Información y Documentación Agropecuaria Km. 12½ Carretera Norte, Managua, Nicaragua Teléfonos: 2233-1501. 2233-1899, 2233-1871 Fax: 22331619 Dr. José Manuel Aparicio Medina PhD Profesor Titular Universidad de La Habana Cuba La UNA propicia la amplia diseminación de sus publicaciones impresas y electrónicas para que el público y la sociedad en general obtenga el máximo beneficio. Por tanto en la mayoría de los casos, los colegas que trabajan en do- cencia, investigación y desarrollo no deben sentirse limitados en el uso de los materiales de la UNA para fines académicos y no comerciales. Sin embargo, la UNA prohíbe la modificación parcial o total de este material y espera recibir los créditos merecidos por ellos. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II Prólogo El Manual de Teoría de Microbiología II tiene como principal objetivo reunir la mayor información básica de los contenidos establecidos en el programa de la asignatura, de esta forma los estudiantes adquieran los conocimientos necesarios. Les aporta además la forma estructurada para el aprendizaje, lo cual le posi- bilita un método de estudio y establecer las interrelaciones necesarias para un estudio sistemático. Como texto básico podrá después utilizar textos con mayor información te- niendo de antemano los conocimientos previos y necesarios. La información reunida en el presente Manual de Microbiología II es el re- sultado de la recopilación de la información de autores y especialistas, solo nos correspondió sobre las experiencias de los que nos precedieron reunir y estructurar los contenidos. Es necesario establecer para su estudio un pensamiento lógico y de constan- te interrelación y a la vez de integración hacia el desarrollo de un pensamien- to independiente y creativo. Es muy importante establecer un estudio sistemático y el uso de la síntesis y a la vez emplear un método científico, elevada avidez por saber y profundizar para adquirir la formación de un profesional preparado y capacitado para asumir las responsabilidades en el cumplimiento de sus compromisos sociales. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 1 Es de gran satisfacción saber que ha sido útil y se ha aportado a la formación y preparación de los estudiantes y de todos aquellos interesados por saber y conocer Ha sido nuestro deber y compromiso social, realizado con la mayor dedica- ción. Ing. Radamés L. García A. MSc. Prof. Microbiología e Inmunología Facultad de Medicina Veterinaria Universidad Agraria de La Habana UNAH Cuba Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 2 CONTENIDO I.- HONGOS PATOGENOS................................................................................7 Hongos monomórficos G. Coccidioides G. Rhinosporidium G. Mucor, Rhizopus y Absidia G. Aspergillus Hongos Dermatófitos G. Trichophyton G. Epidermophyton G. Microsporum Hongos gemantes ó Levaduras monomórficas G. Cándida G. Criptococcus Hongos dimórficos G. Histoplasma G. Blastomices G. Sporotrichum II.- BACTERIAS SUPERIORES..........................................................................29 Bacilos Gram(+) parecidos a hongos filamentosos G. Dermatophylus G. Nocardia G. Actynomices G. Mycobacterium Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 3 Espiroquetas patógenas y bacterias curveadas G.Treponema G. Borrelia G. Campylobacter G. Leptospira III.- BACTERIAS VERDADERAS......................................................................52 Bacilos Gram (+) no esporulados G. Pseudomona aeruginosa ( Gram (-)) G. Erysipelotrix rhusiopathiae G. Listeria monocitógenes G. Corynebacterium pyogenes. Bacilos Gram (+) esporulados G. Bacillus anthracis. Clostridium histotóxicos: C. chauvoei ó feseri C. sep cum C. novyi C. hemoly cum Clostridium toxigénicos: C. tetani C. botulinum C. perfringens ó welchii Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 4 Cocos piógenes Gram (+) G. Streptococcus y Staphylococcus S. agalactae S. dysgalacteae S. uberis G. Staphylococcus aureus Coco-bacilos Gram (-) entéricos, anaeróbios facultativos G. Escherichia G. Salmonella G. Klebsiella G. Serra a G. Proteus G. Yersinia Bacilos Gram(-) aeróbios y microaerófilos esporulados G. Brucella G. Moraxella G. Haemophylus G. Pasteurella G. Bordetella G. Ac nobacillus Bacilos Gram (-) anaerobios G. Fusobacterium Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 5 IV.- BACTERIAS INFERIORES........................................................................117 G. Mycoplasma Bacterias patógenas intracelulares G. Ricke sia G. Coxiella G. Ehrlichia G. Cowdria G. Anaplasma V.- PRIONES……………………………………………………………………..........................140 BIBLIOGRAFIA …………………………………………………………………........................142 Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 6 I. HONGOS PATOGENOS * Micosis por hongos filamentosos patógenos monomórficos - Género Coccidioides Especie: C. inmi s Enfermedad: Coccidiomicosis, granuloma coccidioico Introduccción: Se adquiere por la inhalación del polvo en zonas donde la enfermedad es endémica y por roturas de vegetales afectando los pulmones y ganglios con- sistiendo en una coccidiomicosis primaria, si el hongo no es destruido inicia una coccidiomicosis progresiva invadiendo la dermis, vísceras y el sistema óseo, lo que ocasiona una elevada mortalidad. Síntomas y signos clínicos: formación de nódulos ó granulomas., apenas se manifiestan las lesiones macroscópicas, la cual se confunde con la tubercu- losis en bovinos por la presencia de granulomas en los ganglios linfáticos, bronquiales y mediastínicos, estando los granulomas presente menos en los pulmones Animales susceptibles: personas, caninos causándoles una osteomielitis cró- nica. Muestras: esputo, líquido pleural, pus de los abscesos y exudados de lesiones cutáneas. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 7 Examen directo Observación microscópica: de las muestras se observan estructuras de la re- producción asexual con hifas fértiles con sus esporangios y las esporangios- poras en su interior. Cuando el hongo se ha aislado en un medio de cultivo (entre 1-2 semanas) se observan colonias algodonosas y con azul de algodón y lactofenol donde presentan en el campo óptico hifas en raqueta con típicas artrosporas rectan- gulares en forma de ¨tonel¨. Observación macroscópica: previamente las muestras se cultivan en: Agar Sangre a 37 grados Agar Saboraud CC (posee Cloranfenicol para inhibir a las bacterias y ci- clohexamida ó actidione para inhibir hongos contaminantes) se incuba a 25 grados Examen Indirecto Se realiza una Prueba Alérgica Cutánea con coccidioidina (es un antígeno ob- tenido por el filtrado del cultivo fúngico con crecimiento en un medio de cultivo, lo que permite identificar los anticuerpos precipitantes y fijadores del complemento del enfermo entre 1-2 semanas. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 8 Pruebas Biológicas Se realiza inoculación experimental en cobayos por vía intratesticular causan- do una orquitis a la semana., en ratones por vía extraperitonial ocasiona una micosis con la presencia de hifas con esporangios. - Genero Rhinosporidium Especie: R. seeberi Enfermedad: Rhinosporidiosis Lesiones: se presentan pólipos con una mácula blanca friable ó pedinculares, localizados en la nariz, ojos, oídos y el cuerpo. Animales susceptibles: bovino, equino y el humano Examen directo Observación microscópica: se observan hifas fértiles con esporangios típicos y las esporangiosporas en su interior. A los pólipos con mácula blanca se le realiza un corte histológico y se tiñen con hematoxilina y eosina. No se aíslan en medios artificiales. - Genero Mucor, Rhizopus y Absidia Especie: Mucor pusillus, Rhizopus equinus, Absidia ramosa Enfermedad: Mucormicosis Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 9 Introducción Son patógenos oportunistas en los organismos débiles afectados por enfer- medades como diabetes, leucemia etc...ó por el consumo de esteroides, an- tibióticos. Lesiones: formaciones granulomatosas ó ulcerosas en nódulos linfáticos del canal alimenticio, en la mucosa gástrica e intestinal. También causan lesiones en los pulmones, hígado, riñón, cerebro, etc… causando aborto, artritis y fle- bitis. Animales susceptible: bovinos, porcinos, equinos y el humano Muestras: líquido céfalo-raquídeo, mucosa gástrica y senos maxilares. Examen directo Observación microscópica: Las hifas del micelio no presentan tabiques ó sep- tas y la reproducción asexual es por esporangios, estableciéndose una dife- renciación morfológica entre los tres géneros. Genero Mucor: no tiene estolones, ni rizoides, los esporangios poseen sus hifas fértiles Genero Rhizopus: Posee estolón y rizoide. Las hifas fértiles con sus esporan- gios se inician en un punto rizoide. Genero Absidia: Posee estolón y rizoide, las hifas fértiles nacen del estolón. Observación macroscópica: Crecen en medio Agar Sangre a 37 grados y en Agar Saboraud con cloranfenicol y sin Actidione a 25 grados. Las colonias crecen con un micelio algodonoso, blanco, aéreo y después se torna gris. No se realiza Prueba Biológica, ni examen indirecto. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 10 - Genero Aspergillus Especie: A. fumigatus Introducción Los Aspergillus son hongos saprófitos comunes, le favorece su crecimiento en condiciones apropiadas de humedad y temperatura, se encuentran en heno, pienso, sustratos en descomposición y detritus de los animales. Producen cantidades abundantes de esporas que forman con facilidad aero- soles en el medio; las cuales, al ser inhaladas, producen la enfermedad. La aspergilosis es una enfermedad infecciosa en la cual se afecta de manera primaria el aparato respiratorio y se manifiesta por la formación de nódulos caseosos amarillos que se instalan primariamente en el pulmón, con poste- rior diseminación a otros sistemas orgánicos Enfermedad: Aspergilosis Animales susceptibles: aves, bovino y equino Aves: se presenta una aerosaculitis difusa, neumonitis y nodular. Se observan la presencia de nódulos caseosos amarillos ubicados en los pulmones pasan- do después a otros órganos diana. En aves de 2 semanas causan anorexia, diarrea, y aumento de la temperatura. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 11 En bovinos: ocasiona el aborto micótico, las esporas penetran por vías respi- ratorias y se incorporan al sistema circulatorio llegando al útero ocasionando una metritis, después en la placenta produce una placentitas originando en el feto una hiperqueratosis, todo lo anterior da lugar al aborto micótico as- pergilar. En equino: ocasiona infecciones en piel y mucosas En el humano: Produce infecciones en tejidos, pulmones, piel, senos nasales, oído externo, bronquios, huesos y meninges. Muestras: En caso de animales adultos se envían fragmentos de pulmones del lugar donde se encuentra la lesión. En aves, se envían muertas y enfermas, además de muestras de pienso, de la cama, excretas etc.… Cuando sucede un aborto micótico, se envían porciones de placenta, el feto, y si no es posible se envía contenido gástrico. Examen directo. Observación microscópica, se examinan las muestras de tejido (pulmones, sacos aéreos, placenta ó raspados de piel y mucosa en solución de NaOH al 10%, se observan hifas fértiles con sus cabezas conidiales de donde salen los esterigmas que sostienen cadenas de conidios globosos, pueden aparecer va- rios esterigmas sostenidos por una ó varias fiálides sobre la cabeza conidial. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 12 Observación macroscópica: Previa siembre de la muestra en el medio de cul- tivo Agar Saboraud con estreptopenicilina y sin actidione para inhibir bacte- rias y hongos contaminantes a pH 5.5 y temperatura 25-30 grados, A los 3-5 días crecen colonias blancas, después se tornan verdes y al final grises con un aspecto pulverulento. Diagnostico confirmativo: Se deben observar en las muestras de tejido las estructuras típicas del género Aspergillus, ratificando el examen directo. Aspergillus flavus Enfermedad: Micotoxicosis-aflatoxicosis producida por las aflatoxinas de los tipos B1, B2, G1, y G2. Especies susceptible: cerdo y bovino En el cerdo, disminuye la ganancia de peso diaria, por dificultades en la con- versión y el peso final, causa afección en el hígado y las mucosas se tornan ictérica, dificultad en la reproducción por el efecto de las micotoxinas. En las cerdas ocasiona aborto, crías muertas ó débiles. En el bovino las intoxicaciones ocasionan ceguera y marcha circulante. Muestras: porciones representativas del pienso y también materias primas que lo constituye. Examen directo. Observación microscópica: sobre las hifas fértiles están las estructuras glo- bosas y sobre esta los esterigmas con sus cadenas de conidios. Observación macroscópica: se observan colonias, con un micelio poco ele- vado y de color amarillo a verdoso en el centro y blanquecino hacia afuera. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 13 Diagnostico: Realizar: a) el aislamiento y clasificación del hongo b) identificación de las micotoxinas * Hongos Dermatófitos Géneros Trichophyton Epidermophyton Microsporum Introducción Los hongos dermatofitos tienen como características fundamentales, ser ca- paces de invadir la piel lisa, las uñas, el cabello y los pelos. Tiene selectiva por la queratina y son capaces de perforar los pelos debido a su intensa capacidad queratinolítica. Especies susceptibles: Todos Los animales son susceptible. Enfermedad: Tiñas ó Dermatomicósis. Lesiones: Se presentan placas llenas de escamas y en la periferia vesículas y pústulas formando costras de diferentes tamaños y grosor. En el cuerpo del animal se observan zonas alopécicas (caída del pelo); las uñas aparecen des- coloridas, friables y quebradizas. Examen directo: En la observación microscópica de las escamas epiteliales y uñas se obser- van filamentos con artrosporas. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 14 En el pelo según el tamaño de la espora y como se ordenan se clasifican en: Ectothrix: 1.- pelo microspórico: en vaina o mosaico. 2.- pelo microide: cadena de artrosporas 3.- pelo megasporado: es una vaina periférica de esporas grandes. Muestras: Se envían pelos, escamas, y costras de la piel, preferente del borde de la lesión Examen directo Observación microscópica. Con azul de algodón, lactofenol, NaOH y KOH al 10-40% se observan hifas septadas y segmentadas en cadenas de artrospo- ras. Para su cultivo se utilizan los siguientes medios de cultivo: Agar DTM (Dermatophytus Test Médium) con antibiótico. Agar Saboraud con antibiótico y actidione. Agar infusión cerebro corazón con sangre, cloranfenicol y actidione. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 15 Género Trichophyton Especies: Trichophytum verrucosum Introducción Causa una dermatomicosis en el ganado vacuno, afecta ocasionalmente tam- bién al equino, perros y otros animales domésticos. Las esporas se encuen- tran ampliamente diseminadas en las naves y establos. Enfermedad: Tiña favosa del ganado bovino Animales susceptibles:En el bovino las lesiones están por todo el cuerpo, tanto en la cabeza, cuello, lados del tronco y la espalda, y en el ternero las lesiones están alrededor de los ojos, orejas y final de la cabeza. Muestras: Se requiere realizar primero una limpieza y desinfección de la zona lesionada con alcohol al 70%, las muestras de pelo deben tomarse alrededor de la lesión alopécica, Tomar también escamas y costras con un raspado de la piel. Examen directo Observación microscópica Se emplea con el KOH del 10-40% ó el lactofenol, en muestras de pelos se ob- servan cadenas de artrosporas en disposición Ectothrix megasporado hacia la parte exterior y el micelio hacia adentro.. En caso de muestras de costras y escamas se encuentras ntras hifas y algunas nt g nas microconidias. algu Manual de Teoria Microbiologia i VVeterinaria t i i II 16 Observación macroscópica. Para la obtención de las colonias, se procede a la siembra de la muestra en Agar Saboraud con tiamina (B1) más inositol y se incuba a 25 grados por 2-3 semanas. Se emplea además el medio selectivo DTM el cual contiene tetraciclina ó gen- tamicina para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes y el actidione ó ciclohexamida para impedir el desarrollo de hongos saprófitos. El indicador rojo fenol del medio de cultivo muestra la reacción alcalina por la presencia de NH3en el sustrato. Las colonias se observan blancas hasta tonalidad amarilla con aspecto arru- gada. Vista al microscopio son abundantes las microconidias dispuestas en fila- mento a lo largo de las hifas tomando en su conjunto un aspecto de cande- labro fávico. A la colonia de hongo se le realizan las siguientes pruebas: Pruebas nutricionales con el aporte al medio de sustancias necesarias como caseína, tiamina e inositol. Pruebas enzimáticas donde se observa las siguientes reacciones: Tirosina(-), caseina (+), gelatina (+), almidón (-), urea: variable Prueba queratinolítica: se mantienen pelos en las placas donde se deposi- tan fragmentos de colonias, transcurridos unos días se observan la qeratino- lisis coaxial de forma longitudinal y rectangular. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 17 Género Epidermophyton Características microscópicas: macroconidios agrupados en racimos. Características macroscópicas: Colonias aterciopeladas Género Microsporum Espécie: Microsporum canis Enfermedad: Tiña microspórica Animales susceptibles: perros y gatos, otras especies domésticas Lesiones: caída del pelo en aéreas circulares Muestras: Se efectúa el mismo procedimiento del hongo anterior, con la mayor asepsia posible Examen directo: Observación microscópica: Añadiendo el lactofenol en portaobjeto, en las muestras se identifica la presencia de hifas septadas con formaciones de cadenas rectangulares de artrosporas u oidios en un ordenamiento ectothrix microspórico con una vaina en forma de mosaico rodeando el pelo Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 18 Observación macroscópica: Después del aislamiento en los mismos medios de cultivo (Agar Saboraud CC, y Agar DTM), las colonias se presentan blan- cas, lanosas ó vellosas tomando una coloración amarillenta con un cambio en la segunda semana de sembrada a pardo rojiza. Aisladas y vistas al microscopio se comprueba la presencia de macroconidias abundantes. Pruebas queratinolíticas: se sitúan en placas Petri pelos junto a porción de la colonia observándose la formación de ectothrix microspórico con las típicas macroconidias. * Hongos gemantes ó Levaduras monomórficas Género Cándida Especie: C. albicans Introducción La cándida es un microorganismo saprófito de la piel normal, mucosa de La boca, vagina y tracto gastrointestinal. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 19 Existe un conjunto de causas que estimulan su desarrollo como son las de tipo endógeno como es el tratamiento con antibióticos de amplio espectro ( la tetraciclina, eritromicina ) que destruyen la flora intestinal, favoreciendo el aumento de la Candida en el tracto gastrointestinal. Hay otro conjunto de causas como el embarazo, los trumatismos locales, dia- betes, hipotiroidismo, tratamiento con corticoesterioides, deblitamiento por enfermedades infecciosas y la mala nutrición. Es una causa exógena el contacto sexual, además de factores predisponentes como la humedad, el calor, el roce y la deficiencia de vitamina A. Enfermedad. Candidiasis ó moniliasis. Es una infección aguda en la piel, mu- cosa, pico, uñas y órganos. Animales susceptibles: aves, cerdos, bovino, ovejas, perros, gatos, equino y el humano. Patogenia:La candidiasis es resultado de la alteración de los tejidos por tera- pias muy prolongadas de antibióticos, lo que estimula directamente al hongo, elaborando toxinas y compitiendo por los nutrientes, causando además una depresión del sistema inmune y elaborando sustancias que dañan los tejidos. Síntomas clínicos En terneros: causa diarrea con melena (sangre), anorexia, deshidratación, postración y muerte. En bovino: mastitis (debido a infusiones de antibióticos), fiebre, disminuye la producción la producción láctea y aborto. En aves: ulceras en el buche (“muget”) con un exudado catarral a mucoide con pseudomembrana en la boca, senos infraorbiratios, esófago, proventrí- culo intestinal. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 20 En cerdos: causa vómitos, diarreas, desordenes metabólicos y úlceras esto- macales. La candidiasis se localiza en las siguientes regiones: Lesión cutánea en los pliegues de la piel ( intértrigo) Mucosas de la lengua (muget), de la vagina (vulvo-vaginitis) y el ano Broncopulmonar Pulmonar dan signos de neumonía y es grave Intestinal ocasionan úlceras Endocarditis Muestras: raspados de las mucosas * Fragmentos de vísceras dependiendo de los síntomas y las lesiones. * Heces fecales * Exudados y esputos Examen directo Observación microscópica: En los esputos y exudados se observan levaduras ovales y gemantes teñidas como Gram (+), también pueden presentarse alar- gadas ó pseudohifas lo que indica una colonización de la Cándida actuando como patógenas. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 21 Observación macroscópica: En Agar Sangre se siembran muestras de heces fecales e incuban a 37 grados, se observan colonias butirosas, blancas y bri- llantes En Agar Saboraud CC. Se observan colonias cremosas y con olor típico a le- vaduras. Se precede a la diferenciación sembrando la muestra en O.5 cc de suero hu- mano fresco ó en clara de huevo durante 2 horas a 37 grados C. Pasada la incubación se observa al microscopio y si tiene la célula de la leva- dura un tubo germinal, pseudohifa y pseudomicelio pueden ser la C. albicans ó la C. estellatoidea, Pruebas bioquímicas Se aplica para la diferenciación de las dos especies de Cándidas Estas pruebas son: * Lactosa---------acido y gas * Glucosa --------( - ) * Maltosa --------acido y gas * Sacarosa -----acidez. La Candida albicans no la utiliza * Rafinosa ------( _ ) Pruebas biológicas Se realiza una inoculación de una suspensión de cultivo por vía endovenosa a un animal de laboratorio causándole la muerte a los cinco días. Examen Serológico Se emplean las técnicas de aglutinación, hemoaglutinación, inmunofluores- cencia, RFC y precipitación. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 22 Aspectos a tener en cuenta según la muestra a) muestras cutáneas y de uñas----se observan con NaOH al 20% y es un agente patógeno. b) Muestra de exudado, pus ó sustancia semilíquida ------se realiza la tinción de Gram y de Giemsa. c) Muestras de sangre en un absceso ó en la orina ------ se considera un pa- tógeno d) Muestras de las mucosas donde se encuentra como saprofito-------se con- sidera patógeno cuando se comprueba microscópicamente la presencia de tubos germinales, pseudohifa y pseudomicelios. * Genero Criptococcus Introducción Presenta forma típica de levadura con una capsula abundante que rodea la célula y la colonia. Se encuentran en el suelo y en el excremento de las palo- mas. Especie: C. neoformans Lesiones: Formación de granulomas afectando los pulmones, huesos y piel también el sistema nervioso central y mastitis en los bovinos. Patogenia Se encuentra en el suelo y en el excremento de las palomas, puede penetrar por las vías respiratorias causando una infección primaria inadvertida pasan- do después al sistema nervioso central ocasionado una meningitis crónica, puede producir mastitis. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 23 Muestras: Los granulomas, esputo, secreciones, leche y líquido céfalo raquí- deo Examen directo Observación microscópica: utilizando una mezcla de tinta china para teñir el campo óptico, se observa una célula esférica con una capsula gelatinosa de constitución polisacarídica. Observación macroscópica: Se incuba en Agar Saboraud sin actydione a 37 grados formando colonias mucoides brillantes de color crema. Pruebas Bioquímicas Hidroliza la urea, lo cual le diferencia con el género Cándida. Pruebas Biológicas Se inoculan ratones de 45 días de nacido por vía intraperitonial, endoveno- sa, e intracerebral causando la muerte a las dos semanas con lesiones en pulmones y el cerebro. Diagnóstico indirecto Aplicación de la técnicas con fluoresceína Aplicación de la técnica de látex-aglutinación * Hongos Dimorficos - Género Histoplasma Especie: H. capsulatum Enfermedad: Htoplasmosis ó “Enfermedad de Darling” Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 24 Introducción: Se encuentra en el guano del murciélago, el gallinero y el polvo Lesiones Por vía respiratoria se disemina produciendo, granulomas, linfoadenopatía, esplenomegalia y hepatomegalia, anemia, leucopenia y úlcera naso-bucofa- ringeo e intestinales. Animales susceptibles: perro, gato, equino y humanos Especie: H. farsiminosum Enfermedad: linfangitis epizoótica Lesiones: en piel y vasos linfáticos Muestras: de secreciones ulcerosas, nódulos linfáticos y ganglionares y pus Examen directo Observación microscópica: Se tiñen con Giemsa y se observan levaduras ovoides dentro de los monocitos y macrófagos: Observación macroscópica: Empleando para su cultivo Agar Infusión Cerebro Corazón a 37 grados se observa colonias membranosas blancas ó cremosa y al microscopio se observan levaduras con yemas. Agar Saboraud CC a 25 grados se observa colonias algodonosas blancas ó cremosa con un cambio de coloración y al microscopio se observan hifas con microconidias y clamidosporas. clam cl amid amidos id ospo os p ra po rass. s. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 25 Prueba Biológica Se inoculan intraperitonialmente ratones y del hígado o bazo se hacen frotis observándose levaduras dentro de los macrófagos. Examen indirecto Se realiza la prueba alérgica cutánea con histoplasmina, se emplea además la prueba de precipitación y la técnica de RFC. * Genero Blastomices Especie: B. derma di s Enfermedad: Blastomicosis norteamericana Introducción: Se adquiere por vía aerógena y forma gránulos en los pulmones, más tarde se disemina a otros órganos y la piel. No es una enfermedad contagiosa. Animales susceptibles: hombre, perro, equino. Muestras: pus, secreciones ulcerosas con ganglios linfáticos inflamados. Examen directo: Observación microscópica: se observa una levadura grande en forma de 8 con una sola yema. Observación macroscópica: En el medio de cultivo Agar Infusión Cerebro Corazón (AICC) a 37 grados las colonias tienen aspecto cremosa y verrugosa, vista al microscopio es una típica levadura de pared gruesa con hifas cortas. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 26 En el medio de cultivo Agar Saboraud a 25 grados a las 3 semanas la colonia es levaduriforme y después algodonosa, y al microscopio se observan hifas gruesas con microconidias y clamidosporas. Prueba Biológica En ratones, ratas y hámster se inocula intraperitonialmente el pus, trans- curridas 3 semanas y resultado de la necropsia se observan las lesiones en ganglios mesentéricos, bazo, hígado y testículo. Examen indirecto Se realiza la prueba alérgica cutánea con blastomicina. * Genero Sporotrichum Especie: S. schenckii Enfermedad: Eorotricosis Lesión: Se origina a partir de espinas ó astillas contaminadas, formándose nódulos granulomatosos subcutáneos verrugoso ó ulceroso, produce pus en los ganglios con presencia de linfangitis, está presente además en huesos y vísceras. Animales susceptibles: equinos, caninos y al humano Muestras: pus, secreciones ulcerosas, nódulos linfáticos y ganglionares Examen directo: Observación microscópica: En las muestras de pus y tejidos se observan for- mas fusiformes en el interior de los neutrófilos. Observación macroscópica: En AICC sangre a 37 grados se observan colonias cremosas y al microscopio son levaduras fusiformes en forma de tabaco. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 27 En Agar Saboraud a 25 grados, se ven colonias blancas, brillante y después cambian para un aspecto membranoso y rugoso con color castaño, en el cam- po óptico se observan hifas conidióforos con grupos de microconidios e hifas con clamidosporas Examen indirecto Se realiza la prueba alérgica cutánea con esporotriquinina y las técnicas de seroaglutinación. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 28 II. BACTERIAS SUPERIORES Bacilos Gram ( + ) parecidos a hongos filamentosos Introducción Son bacterias parecidas a hongos filamentosos, constituyendo en lo morfoló- gico una estructura entre bacterias y hongos. Su similitud con las bacterias se basan en: Su pared celular está constituida por mureína y acido diaminopimélico. Sus filamentos son más estechos que los del hongo. Su composición celular es procariota. Es sensible al efecto de los antibióticos y no al afecto de los antimicóticos Es sensible a la acción de los virus bacteriófagos. Se presenta su micelio bien desarrollado con filamentos ramificado, el cual se fragmenta formando artrosporas cocoides y bacilares y zoosporas que se liberan. * Género Dermatophylus Especie: D. congolensis Enfermedad: Dermatofilosis ó Estreptotricosis cutánea Lesiones: Origina una dermatitis exudativa, formándose una acumulación exudativa que se diseca en el pelo o la lana, en las oveja se denomina “lana de palo”, también en las uñas; en los bovinos se forman estructuras corneas cutáneas. Patogenia: El agente etiológico se trasmite por las moscas procedentes de animales enfermos siendo favorecido por la humedad, la temperatura al inva- dir la piel a través de lesiones produciendo en el lugar las lesiones exudativas Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 29 Muestras: Fragmentos de las lesiones cornificadas de la piel, de lana y pezuña Examen directo Observación microscópica: Las muestras son previamente trituradas en are- na, y en una suspensión de suero fisiológico, después se realiza la tinción de Giemsa ó Kynyoun. Se observan filamentos estrechos con tabiques transversales y longitudinales Con formas cocoides en su interior, estas se fragmentan y se liberan forman- do zoosporas teñidas de azul y el filamento se tiñe de rosado con el empleo de la técnica de Giemsa. Observación macroscópica: Las muestras se fragmentan y se sitúa envuelta en gasa estéril y se introduce en suero fisiológico e incubada a 37 grados con atmósfera de 5% de C02, pasado dos horas se toma del sobrenadante y se siembra en AICC en las mismas condiciones de temperatura y atmósfera. La colonia adopta un color naranja y de aspecto rugoso, vista al microscopio, sus hifas son estrechas con las formas cocoides para la formación de zoosporas. Pruebas Bioquímicas: Es un microorganismo muy proteolítico y catalasa (- ) * Genero Nocardia Especie: N. asteroides N. farsinica Enfermedad: Nocardiosis Animales susceptibles: bovino, equino, perro, gato y el humano. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 30 Lesiones: La N. asteroides produce una nocardiosis visceral debido a la for- mación de lesiones granulomatosas en los pulmones, ganglios, glándulas mamarias, cerebro y piel. También producen supuraciones crónicas ocasio- nando mastitis e infecciones mamarias sépticas. La N. farcínica: es el causante del Lamparón bovino Muestras: pus, fragmentos de órganos con las lesiones granulomatosas, le- che de las infecciones mamarias. Examen directo Observación microscópica: Con la tinción de Gram ( + ) se ven filamentos ramificados en forma de maza ó clava que se fragmentan en formas cocoides y bacilares. Observación macroscópica: Previa incubación en Agar ICC a 27grados y en Agar Saboraud a 25 grados sin antibióticos en aerobiosis las colonias se ob- servan pigmentadas, amarillas y naranja, también secas ó rugosas. No hemo- líticas. Pruebas Bioquímicas. N. asteroides: carbohidratos ( - ) N. farcínica: acidifica la ramnosa gelatina ( - ) crece a 45 grados indol ( - ) hidrólisis de la tirosina Pruebas Biológicas La inoculación endovenosa al conejo causa la muerte Por vía intraperitonial causa la muerte en dos semanas al curiel. Examen indirecto Para su diagnostico se aplica la prueba alérgica cutánea. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 31 * Genero Actinomyces Especie: A. bovis Lesiones: forma abscesos encapsulados por lo general en los huesos. Animales susceptibles: Equino: afecta el maxilar inferior y aumento de los maseteros (”quijada hin- chada”) y glositis en la lengua (“lengua de madera¨), junto al género Brucella ocasiona una bursitis (¨mal de la Cruz´.) Cerdo: mastitis Caninos: afecta la piel y tejido subcutáneo y produce una actinomicosis pulmonar. Muestras: leche de ubres con mastitis, pus y fragmentos de las áreas de los abscesos. Examen directo: Observación microscópica: Previa centrifugación del pus y su sedimentación, se observan rosetas¨ típicas en forma de clavas y sus filamentos ramificados son Gram ( + ). Observación macroscópica: Previa trituración de los gránulos se siembran en Agar CC con sangre 5%, se incuba en anaerobiosis y microaerofília con 10% CO2 durante 4 días observándose las colonias blanco amarillas; al mi- croscopio coinciden sus formas típicas de filamentos finos y ramificados con fragmentos cocoides y bacilares. Pruebas Bioquímica * Acidifica la glucosa y lactosa * Hidroliza el almidón Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 32 * No es proteolítico * No causa hemólisis * Genero Mycobacterium Introducción Son microorganismos muy distribuidos en la naturaleza, unos son saprófitos y otros patógenos al hombre y animales, se encuentran en el suelo, excretas y en los tejidos de los animales. Es una bacteria acido alcohol resistente Causa una enfermedad conocida como tuberculosis, es de tipo crónico con formación de granulomas, puede ser una tuberculosis pulmonar. t. ganglio- nar, t. renal, t. mamaria, t. genital, t. intrauterina, t. cutánea y mastitis. Se trasmite por las vías de aire-polvo y aire-gota, también por el agua, los alimentos, por la cópula y a través de la piel en caso de heridas y castraciones Especies susceptibles - humano y animales----------------------------------M. tuberculosis - bovino y al hombre ----------------------------------M. bovis - aves -----------------------------------------------------M. avium Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 33 Diagnostico: Consta de 5 métodos a) Clínico: se realiza por medio de la observación de los síntomas y signos de la enfermedad. b) Alérgico: Consiste en una prueba alérgica cutánea llamada también simul- tánea) donde se utiliza dos tipos de tuberculinas : PPD (derivado proteico pu- rificado) ó la KOT (tuberculina vieja de Koch de Micobacterium bovis (origen mamífero) y de M. avium,( origen aviar) Se sitúa este ultimo en el pliegue del ano caudal, de ser positivo, se procede a situar ambos en la tabla del cuello del bovino con dosis de 0.2 ml siendo positivo a las 72 horas si se forma una pápula (hinchazón) superior a 5 mm en el lugar donde se situó la tuberculina mamífera es positivo, si se presenta en el lugar de la tuberculina aviar indica que el bovino esta sensibilizado con M. avíum ó M. a picas y es negativo. Las vías de inoculación pueden ser intradérmica, subcutánea y oftálmica. c) Matadero: se comprueban las lesiones macroscópicas llamadas tubercu- losas. d) Anatomopatológica: se observan las lesione granulomatosas. e) Microbiológico: consiste en el aislamiento e identificación del agente etio- lógico. Muestras: nódulos caseosos de las lesiones tuberculosas, esputo, leche, ori- na y ganglios linfáticos. Examen directo: Observación microscópica: el material se extiende sobre el portaobjeto y se tiñe por la técnica de Kinyoun y se observan bacilos agrupados en forma de Y, X , V ó en empalizada. * En X, Y, V Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 34 Observación macroscópica: Para eliminar la contaminación de las muestras se le aplica NaOH al 3%, se agita y se deja sedimentar; después se neutraliza con acido clorhídrico 3N y centrifuga, por último se añade a la muestra vio- leta genciana y verde malaquita y se siembre en tubos con Medio Petragnani unos sin y otros con glicerina (mantiene la humedad del medio). Se incuba a 37 grados en aerobiosis, siendo el crecimiento lento de hasta 6-8 semanas. Al observar las colonias el M. tuberculoso es de aspecto migajoso, el M. bovis es seco y escaso y el M. aviun tiene un aspecto húmedo y gris blanquecino. Pruebas bioquímicas Se emplea más que las pruebas de patogenicidad por ser más rápida y a la vez diferencial de una especie a otra dentro del género. M. tuberculosis es el único nitratasa( +) y niacina ( +) M. bovis es nicotinamida ( + ) M. avium es ureasa (- ) y catalasa ( + ) Examen indirecto Se emplea un derivado proteico purificado de M. tuberculosis y M. bovis con- teniendo 25,000 UI = 0.02 mg (PPD), se emplea también la KOT siendo un extracto de producto bacteriano. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 35 Se aplica en el pliegue ano caudal por vía intradérmica y después en la región cervical para la confirmación La lectura es a las 72 horas observándose una inflamación localizada. En la prueba alérgica cutánea a la tuberculosis aviar, la tuberculina se aplica en la barbilla, con una inflamación a las 48 horas denominada eritema. En las aves se aplica una reacción de aglutinación rápida con sangre total. y en el humano y el bovino se utiliza una prueba de precipitación en agar-gel donde se observan anillos. Pruebas biológicas Después de sembradas las muestras, al sedimento en el tubo se le añade 2 ml de SSF para obtener una suspensión. De cada muestra se inocula 1 ml por vía intramuscular en la región inguinal en dos cobayos Pasado 20 días se depila un cobayo en la región costal próximo a la línea dorsal y a las 24 horas se le inyecta 125 UI de tuberculina mamífera por vía intradérmica en la zona depilada, esto se repite en el otro cobayo a los 42 días de inoculado. Transcurrida 48 días de hecha la prueba de la tuberculina se le realiza la me- dición del eritema siendo positivo si es superior s 5 mm. Al cobayo se le hace la necropsia por la línea media observando el punto de inoculación, ganglio inguinal, bazo, hígado, si hay lesiones se les hace la tinción de acido alcohol resistente ó Ziehl-Neelsen. En el caso que el eritema sea superior a 5 mm, y no se observan lesiones en el primer cobayo, se procede igual con el segundo y si es negativo se considera negativa la presencia de M. mamífera y la reacción se deba a M. a picas. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 36 Evaluación de la Prueba Biológicas: - Con lesiones granulomatosas y el erietema sea mayor 5 y menos de 5 se considera Positivo. - Sin lesiones granulomatosas y el eritema mida mayor a 5 y menor de 5 se considera negativo. Interpretación general: Es positivo cuando mide el eritema más de 5 mm, la investigación anatomo patológica (micro y macro es positiva) y la Tinción acido alcohol resistente es positiva. Pruebas Biológicas diferencial Se inoculan 2 curieles, 2 conejos y 2 pollos. Resultado por especies: Cepa Curiel Conejo Pollo M. tuberculoso tuberculosis tuberculosis - generalizada localizada M. bovis tuberculosis tuberculosis - generalizada generalizada tubercolosis tuberculosis tuberculosis M. avium localizada generalizada generalizada * Genero Mycobacterium paratuberculosis Enfermedad: Disentería bacilar bovina Lesiones: Se presentan de tipo crónico con la mucosa intestinal engrosada y edematosa. Especies susceptibles: bovino, ovejas y cabras Muestras: secciones del intestino y raspados de la mucosa intestinal Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 37 Examen directo Observación microscópica: Un fragmento de mucosa rectal se le aplica la tin- ción de Kinyoun siendo ( + ), se observan bacilos cortos y gruesos agrupados en los nichos. Observación macroscópica: Las muestras de tejido se trituran, se digiere con tripsina, centrifuga y sedimenta en una suspensión de cloruro de benzalconio durante un día, después de sembrado e incubado, las colonias se muestran finas, húmedas y lisas. Examen indirecto Una prueba endovenosa de la tuberculina aviar provoca una diarrea entre las 4-8 horas siendo una reacción positiva. La prueba cutánea intradérmica en cantidad de 10 ml en la región del cuello, da positivo si a las 48 horas provoca un aumento del pliegue cutáneo. Pruebas biológicas: Una suspensión del cultivo en aceite se inyecta a cobayos, ratones, conejos, para comprobación de las lesiones y posterior aislamiento del agente. * Mycobacterias atípicas Introducción: Se han aislados Mycobacterias, que no ha sido identificadas como patógenas en animales y en el hombre, estando los hospederos aparentemente sanos. Se clasifican según el color y la velocidad de crecimiento en: Grupo I. Fotocromógena ( de crecimiento lento y colonias amarillas) Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 38 Grupo II. Escotocromógenas ( de crecimieto lento y colonias amarillas en la oscuridad) Grupo III. No fotocromógenas ( de crecimiento lento y colonias incoloras) Grupo IV de crecimiento rápido (colonias incoloras) Los grupos I y III reaciona positivo a la prueba de la tuberculina y producen enfermedades granulomatosas. * Espiroquetas patógenas y Bacterias curveadas Introducción: Son bacterias de formas estrechas en espiral y se desplazan con movimientos flexuosos. Se multiplican por división transversal. Los movimientos son en espiral y se observan en microscopio de campo os- curo por tinción de Giemsa * Genero Treponema. Especie: T. palidum Es el causante de la sífilis humana y se trasmite por el coito, pasando por in- fección intrauterina. Es sensible a la penicilina. Especie: T. hyodisenteriae Enfermedad: Disentería porcina Síntomas: presenta una depresión del sistema nervioso central, los flancos se ven hundidos, hay diarrea sanguinolenta mucus y exudado fibrinoso. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 39 Patogenia: Su implantación conlleva una rápida multiplicación en la superfi- cie de la mucosa del colon invadiendo las criptas mucosas del intestino pro- duciendo una colitis fibrinonecrótica. Su actividad patógena va asociada con especies del género Vibrio. Muestras: exudados del recto, del examen post morten se envía raspado de la mucosa del intestino grueso Examen directo Observación microscópica: la bacteria mide 5 micras de largo por 0.5 micras de ancho, con movimientos en espiral, pero no tiene flagelos. Pruebas Bioquímicas: La bacteria es anaerobio, catalasa (-), oxidasa (-) * Género Borrelia Introducción: Las bacterias se trasmiten de un ave a otra por las picaduras de ectoparásitos como las garrapatas, piojos y mosquitos, de ser eliminados estos vectores las aves se recuperan en un breve plazo. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 40 Especie: B. anserina Enfermedad: Espiroquetosis aviar Síntomas: causa una septicemia aguda con mortalidad de 3-4 días. Las aves presentan fiebre, diarrea, anemia, e infarto esplénico, la anemia en las aves se debe a los compones tóxicos de las bacteria destruidas. Muestras: sangre, del examen post morten se envía bazo e hígado. Examen directo. Observación microscópica: Con la tinción de Giemsa de los frotis y exten- siones de sangre se observa espiroquetas largas con espiras amplias, poco profundas e irregulares y con filamentos terminales. Las espiroquetas pueden comprobarse su movilidad en un microscopio de campo oscuro. Se tiñen de Gram (-) y no son acido alcohol resistente Observación macroscópica: Se requiere cultivar en condiciones de anaero- biosis, en el medio de Naguchi (líquido ascínico del riñón) a temperatura de 37 grados. También se cultivan las muestras de sangre en el saco vitelino de embrión de pollo y de pavo. Pruebas Bioquímicas: Son anaerobias y catalasa ( - ) - Genero Campylobacter Introducción El agente etiológico es causante de aborto y disminución de la fertilidad, el germen se elimina antes y después del aborto contaminando los pastos y alimentos e incluso lo trasmite a otros animales. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 41 El cerdo y la oveja son reservorios que contagian a vacas y ovejas en gesta- ción. El macho lo trasmite en el coito y en el lavado prepucial. Especie: C. foetus Enfermedad: Aborto micótico Animales susceptibles: bovino, ovino, cerdo, cabras, toro y el humano. Muestras: semen, lavado prepucial, contenido gástrico fetal, mucus cervical, estoómago, hígado, pulmones, feto y riñón. Examen directo: Observación microscópica: En campo oscuro se observa la movilidad de la bacteria (monotrica), su forma se asemeja a una coma con su filamento en S. Es Gram ( - ). Observación macroscópica: Previo al cultivo se pasa la muestra por un filtro miliporo de 0.65 micras para eliminar contaminantes, se centrifuga y sedi- menta. Los cultivos en Agar sangre y Agar Mc Conkey son a 37 grados y en Agar Sa- boraud a 25 grados en condiciones de microaerofília con 10% de CO2, es con- veniente añadir verde brillante, actidione y bacitracina para evitar el efecto de los contaminantes. Examen indirecto Se emplea: - la seroaglutinación con suero hemático. - microaglutinación del mucus vaginal. Como procedimiento quimioprofiláctico a los toros sementales para la inse- minación artificial, se añade 500 microgramos de estreptomicina/ ml de se- men para evitar la infección por el agente etiológico. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 42 * Genero Leptospira Introducción: Se observó por primera vez en el hombre presentando ictericia, fiebre, he- morragias petequiales y se le conoce como ¨enfermedad de Weil” Existen dos especies del genero Leptospira, La L. interrogans (patógena) y la L. biflexa (no patógena). Dentro de la especie existen los serovares de acuerdo a su afinidad serológica y se agrupan en serogrupos para su mejor identi- ficación siendo los más comunes : icterohaemorraghiae, canícola, pomona, ballum, australis, tarassovi, sejroe, etc.. Las bacterias pueden penetrar por heridas en los líquidos contaminados con la orina de animales enfermos, al llegar a sangre se manifiesta la primera fase denominada leptospiremia siendo febril y septicémica y después de 7-10 días pasa a los riñones originando una nefritis crónica y se elimina por la orina siendo esta fase denominada leptospiruria. Pueden ser vías de entrada también la mucosa de la nariz y la boca, conjunti- va y superficies erosionadas de la piel. Especie: L. Interogans Enfermedad: Leptospirosis Especies susceptibles Bovino: presenta fiebre, falta de apetito, flacidez mamaria, descenso de la producción de leche, aborto, hemoglobinuria, anemia hemolítica y muerte. Los fetos se abortan a los 2-3 meses de gestación. Cerdo: ocasiona aborto y muerte neonatal, fiebre, rigidez articular e inape- tencia. Equino: fiebre, ictericia, aborto entre (7-10 meses), oftalmía periódica ce- Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 43 guera lunática, teniendo conjuntivitis con edema de los párpados y ceguera. Canino: depresión, vómitos, esclerótica, conjuntivitis hiperémica, hematuria, uremia, ictericia, y diarrea sanguinolenta. Muestras Se envían para diagnostico bacteriológico ó serológico según la fase clínica de la enfermedad ya sea lepospiremia ó leptospiruria. Para diagnóstico bacteriológico de los animales vivos se obtienen muestras de sangre con anticoagulante y orina remitida al laboratorio ante de las 6 horas y conservada entre 4-8 grados. En animales muertos se envían muestras de riñón con su capsula, fragmento de 5-10 gramos de hígado y la vejiga completa y cerrada El feto se envía completo ó fragmentos de hígado y contenido estomacal. Para el diagnostico serológico, se envía sangre de: Bovino, equino y ovino mediante punción de la vena yugular. Porcino se toma de la vena marginal de la oreja y ó de losvasos periféricos de la cola. Canino de la vena safena o radial. Equino del humor ocular acuoso y humor del cristalino de donde la probabi- lidad del aislamiento es de 99%. Diagnostico bacteriológico Examen directo Observación microscópica: las muestras de orina y agua con pipeta Pasteur se sitúan gotas sobre el portaobjeto. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 44 En muestras de fragmentos de órganos, se añaden unas gotas de SSR (solu- ción salina reguladora) al portaobjeto y se frota la muestra. En muestras de sangre con anticoagulante, centrifugar, decantar el plasma y repetir la centrifugación, del sedimento se observa en el portaobjeto con cubre objeto. Todas las muestras se observan con el microscopio de campo oscuro donde se observan formas helicoidales con espirales, los extremos presentan for- mas de gancho, son estrechas y con motilidad. Utilizando la tinción de Giemsa en el microscopio de campo claro se observan finos filamentos en rojo con formas curveadas. Puede teñirse también con NO3 Ag. * Espiral flexible, sin flagelos (espiroquetas) Observación macroscópica: Para el aislamiento se empléa el medio de Kor- toff y para conservar los cultivos puros se emplea el medio de Fletcher., todos los medios contienen suero de conejo al 10% e incubando a temperatura de 28-30 grados. De las muestras de orina y de sangre se añade 2ó 3 gotas al medio de Kor- thoff; si la muestras es de riñon e hígado, se elimina primero la càpsula,se esteriliza la superficie con una espátula al rojo y se introduce una pipeta Pasteur en el interior de la muestra depositando lo obtenido en el medio de cultivo. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 45 Con las muestras del feto, (riñón, hígado y líquido estomacal) se procede de forma similar. Al observar los tubos semanalmente durante un mes se veran nubosidades en en el medio denominadas ¨manchas de muare¨. De repetir la observación en campo oscuro se observan las formas típicas de las bacterias. Pruebas Biológicas De los fragmentos de órganos triturados en S.S.R., y sedimentados se toma del sobrenadante para realizar la inoculación, en el caso de la sangre con an- ticoagulante se utiliza directamente. Son utilizados conejos jóvenes, curieles y hamsteres inoculando 2 animales por cada muestra por vía intraperitonial, diariamente se realiza termometría, Para el cultivo se extrae la sangre por punción cardiaca y se sitúan 2-3 gotas en el medio de cultivo, a esta muestra de sangre se le realiza la observación macro y micro. A los 4-5 días post inoculación se sacrifican uno de los animales para tomar muestras de riñón, hígado, orina y proceder a la siembra y aislamiento en el medio de Korthoff y obtener la observación macroscópica de las ¨manchas de muare¨ ; en caso que resulte negativo el resultado, se procede igual con el otro animal a los 14-16 días de haber inoculado. En el momento del sacrificio se obtiene la muestra de sangre para el diagnós- tico serológico Diagnóstico serológico Examen indirecto Consiste en comprobar la presencia de anticuerpos en la sangre del animal infectado ó vacunado, se fundamenta en tomar sangre y del suero presentar- lo a un antígeno (conocido) de serogrupo afín y comprobar la formación de inmunocomplejo, lo que permite la identificar al agente patógeno. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 46 Muestras: La sangre debe ser fresca tomada antes de las 24 horas, conser- vada entre lo 4-8 grados , no hemolisada y sin anticoagulante en tubos con tapón de goma e identificados. Se extrae de 5-10 ml de sangre si es un suero, podrá estar fresco o congela- do, manteniéndolo en tubos viales. Procedimiento en el laboratorio para obtener: a) Las cepas de leptospiras que serán empleadas como antígenos b) Los sueros hiperinmunes para la reacción cruzada. Tipificación de las cepas de leptospiras Se fundamenta en identificar las cualidades antigénicas, empleando la reac- ción de microaglutinación al presentarlo a un panel de sueros hiperinmunes- Obtención de los sueros hiperinmunes, se procede: Con cada una de las cepas de leptospiras conocidas se inocula a respectivos conejos con dos dosis de 4 ml cada uno de los 18 serogrupos en la vena mar- ginal de la oreja con un intervalo de 5 a 7 días con una jeringuilla de 5 ml, la primera dosis es inactivada a 56 grados durante 30 minutos en baño de María y la siguiente dosis se emplea la cepa viva. Pasado 7 días de la última inoculación se obtiene 5 ml de sangre de cada co- nejo mediante punción cardíaca. Los sueros son titulados mediante microaglutinaión, siendo aptos solo con título de 1/25000, de ser menos se aplica una tercera dosis de cepa viva a los 7 días. Después de sangrar cada conejo se separan los respectivos sueros y se con- servan añadiendo merthiolate 1/1000 ó fenol al 5% en cantidades de 0.05 ml en cada suero. Rotular y conserva a 4 grados. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 47 Identificación de una cepa desconocida mediante la Reacción Cruzada. Procedimiento: Se inocula un conejo con la cepa aislada en dos dosis; la pri- mera inactivada a 56 grados y la segunda con la cepa viva. Se extrae la sangre a los 14-21dias después de la primera inoculación por punción cardiaca para obtener el suero de la misma y proceder a la Reacción Cruzada., utilizando la microaglutinación. 1) Se enfrenta el suero obtenido de la cepa desconocida inoculada al conejo frente al panel de antígenos conocidos representante de cada serogrupo. 2) La cepa aislada y desconocida se enfrenta a los sueros hiperinmunes obte- nidos de los conejos que fueron inoculado individualmente con las respecti- vas cepas conocidas represente de cada serogrupo. 3) Como control positivo es necesario enfrentar cada cepa (antígeno) conoci- do a su respectivo suero hiperinmune (anticuerpo) homólogo. 4) La cepa objeto de investigación se identifica mediante el resultado de la coincidencia en la Reacción Cruzada. (Ag-Ac), en los puntos 1 y 2 menciona- dos- Aplicación de la Técnica de Microaglutinación (MAT) Mediante la reacción serológica en el MAT se determina la presencia de an- ticuerpos en el suero de animales infectados, el título y el serogrupo a que pertenece la leptospira infectante, en casos de dudas o no dar resultados positivos se realizan sueros pareados, es decir volver a tomar muestra a los 14 y 21 días, debiendo tener 4 veces el valor del primer título. Preparación de la muestra: Se recibe una muestra de suero en el tubo de ensayo y se procede a la sepa- ración del coagulo, decantar el suero en tubos serológicos con su tapa y se centrifuga a 1,500 rpm durante 10 minutos. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 48 Las cepas a emplear como antígeno se mantiene en medio de Kortoff con suero de conejo al 10%, haciendo pases sucesivos cada 10-15 días donde se pueden observar las ¨manchas de muare¨ que se presentan como nubosida- des en el medio. Para el empleo de las cepas como antígeno se añade una gota en el portaob- jeto y se observa en campo oscuro debiendo tener una concentración de 150-200 leptospiras /campo. Prueba cualitativa: determina presencia o no de anticuerpos leptospirales en el suero. Procedimiento: - Con pipeta de 1ml depositar en dos tubos serológicos 0.4 y 0.9 ml de SSR. - A primer tubo se le añade 0.1 ml de la muestra de suero, distribuyendo 0.05 ml en cada una de las excavaciones de la Placa de Plexi (cada muestra ocupa los pozuelos de una fila). - Con pipeta de 1ml añadir 0.05 ml de cada una de las cepas (antígenos) en cada una de las columnas verticales. -Como control de cada antígeno, en la primera fila con una pipeta de 1ml se añade 0.05 ml de S:S.R. y además al añadir cada antígenos por columna ver- tical se inicia por el pozuelo de la primera fila, donde no se ha añadido ningún suero y por tanto no debe presentarse aglutinación, (control). - Mover la Placa de Plexi con cuidado en el plano y en rotación e incubar a 30 grados durante una hora. - De cada excavación tomar una gota de la mezcla y situar en el portaobjeto para sus observaciones en el microscopio de campo oscuro. - Como resultado será positivo si se observa microaglutinación en más del 25% del campo óptico como promedio de 10 lecturas. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 49 - Con la reacción de microaglutinación en los pocitos quedan identificados los serogrupos de leptospiras presentes en el suero. Prueba cuantitativa: Determina el título de anticuerpo de los sueros que son positivos. Procedimiento: - De los sueros positivos, empleando una pipeta de 1ml, se diluyen cada uno partiendo del 2do tubo, el cual tiene el suero diluido a 1/50. - Se toma 0.2 ml y se deposita en tubo serológico, al cual se le añade 0.2 ml de S.S.R obteniendo así una dilución de 1/100. - A partir de esta dilución se procede igual al paso anterior de forma sucesiva en tubos serológicos para obtener diluciones de 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 y 1/3200. - Se añade en cada excavación de la columna vertical 0.05 ml de cada dilu- ción. Se utilizará tantas columnas verticales de la Placa de Plexi como sueros positivos hay. - Añadir a la columna vertical el correspondiente antígeno reaccionante en cantidad de 0.05 ml. - Mover la placa, incubar 1 hora a 37 grados y preparar una lámina de por- taobjeto de cada dilución. - Resultados: Donde se observa en campo oscuro más del 50% de microaglu- tinación ( + + ) se considera positivo, delimitando el título en la última dilu- ción donde se observa el 50% de microaglutinación. - Se consideran positivo por especies a partir de título de 1/100, Excepto el bovino con el serogrupo hebdomalis que es a 1/400 y el equino es a partir de Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 50 1/400. - Los serogrupos (antígenos) escogidos dependen de la prevalencia y frecuen- cia en la región y en el país, realizándose modificaciones al panel de antíge- nos para el serogrupo cada año y para el serovar cada 4 años. Se han realizado estudios para el diagnóstico serológico mediante proce- dimientos inmunoenzimáticos como el ELISA en sus diversas variantes que incluyen antígenos recombinante y se han evaluado comparándolos con la técnica de referencia que es el MAT. Siguiendo la tendencia actual del uso de ensayos rápidos, la técnica Lepto Tek Dip Stick utilizando antígeno de L. biflexa para el diagnóstico de la leptospiro- sis humana coincidiendo en el 85% de las muestras con el MAT y el 83% con la Hemoaglutinación. Para el diagnóstico de la misma enfermedad empleó también técnicas rápidas como el Lepto-Cuba y el Lepto-India comparándola con el MAT ha obteniendo resultados favorables. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 51 III. BACTERIAS VERDADERAS Bacilos Gram ( + ), no esporulados - Género Pseudomonas aeroginosa (Gram (-)) Introducción Son bacilos cortos distribuidos en la naturaleza, encontrándose en el agua dulce, salada y en el suelo, se puede aislar de procesos infecciosos en espe- cial de lesiones con presencia de pus incluyendo otitis, en casos de abortos y procesos infecciosos del aparato reproductor de hembras y machos. Por lo general el desarrollo de la Pseudomona aeruginosa en la lesión provoca un tinte azuloso con fetidez característico en las zonas afectadas, pueden provocar también graves trastornos renales. Las Pseudomonas mallei están relacionadas con las manifestaciones de muermo equino, pueden estar for- mando parte de la microflora normal transitoria de la piel y del intestino de los animales y personas. Producen la enfermedad debido a su capacidad invasiva y toxigénica median- te una exotoxina termolábil, es resistente a los antibióticos. Es una bacteria aerobia. Especie: P. aeruginosa Enfermedad: Piocianosis Lesiones: Produce un pus azul en las heridas infectadas por las bacterias, también otitis, meningitis, pericarditis, rinitis, mastitis, abortos, infecciones urinarias, neumonía, conjuntivitis y septicemia. Especies susceptibles: todas las especies, en el humano los lactantes y los que han tenido lesiones en la piel. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 52 Muestras: pus de las heridas, exudado ótico, líquido cefalo raquídeop, san- gre, orina, esputo; las muestras se tomaran de forma aséptica en cada uno de los casos, las que se enviaran en un periodo no mayor de 6 horas al labo- ratorio. Con la descripción de la lesión, sintomatología y evolución del proce- so infeccioso Examen directo Observación microscópica: Son Gram (- ), bacilos delgados con extremos re- dondeados , tiene un flagelo polar que le aporta movilidad. Observación macroscópica: Las colonas en Agar Nutriente son grandes, irre- gulares, translúcidas con un centro oscuro, produce un pigmento verde azu- loso. En Agar Sangre produce una beta hemólisis El crecimiento de la colonia en Caldo Nutriente muestra un aspecto azulado debido a la producción del pigmento piocianina, el cual es soluble en clo- roformo y agua, también produce otro pigmento verdoso soluble en agua denominado fluoresceína. Pruebas Bioquímicas Es una bacteria muy proteolítica, poco sacarolítica y oxida la glucosa. Produce una bacteriocina llamada piocinas, es una proteína liberada al me- dio, la cual se utiliza en la diferenciación de la Pseudomona aeruginosa. Especie: P. mallei Enfermedad: Muermo equino Lesión: Es una enfermedad crónica que tiene varios cuadros clínicos: pulmo- nar, nasal, cutáneo ó lamparón. Especies susceptibles: equino, asno y el humano. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 53 Muestras: pus de los nódulos Examen directo: Observación microscópica: Son Gram ( - ), bacilos delgados con extremos redondos, adoptando un pleomorfismo teniendo formas cocoide y filamen- tosa, es una bacteria bipolar. Observación macroscópica: Se cultiva en Agar Sangre con pH de 6.6 Prueba Biológica: Con una solución del cultivo se inocula por vía intraperito- nial un cobayo. Examen indirecto: Se realiza una prueba alérgico cutánea con malleina por vía subcutánea, of- tálmica, cutánea e intradermopalpebral * Genero Erysipelothrix rhusiopathiae Agente etilógico: E. rhusiopathiae Enfermedad : Erisipela porcina ó Mal Rojo del cerdo Lesiones: Es una enfermedad que se presenta en tres formas clínicas. Aguda ó septicémica: presenta fiebre, en el vientre aparecen hemorragias de color rojo oscuro y secreción ocular. Crónica: endocarditis y artritis crónica de las extremidades posteriores, ca- mina como si fuera en zancos. Cutánea: Aparece en la piel del dorso y de los lados del cuerpo manchas rojo oscuro ó púrpura (equimosis), con forma de rombo ó diamante elevado sobre el nivel de la piel, siguiendo una dermatitis gangrenosa con formación de escaras dérmicas por desprendimiento de la piel necrosada. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 54 Especies susceptibles: aves: septicemia sobre aguda bovino, equino y caninos: infecciones espórádicas humano: la enfermedad recibe el nombre de erisipeloide. Aparece necrosis de la piel y el tejido subcutáneo, los ganglios linfáticos se infartan y las articu- laciones pueden inflamarse. La infección se adquiere por vía digestiva, los animales infectados y enfermos expulsan las bacterias por las heces fecales y la orina. El patógeno se ha aislado de aguas superficiales, harinas de pescado, en las manipulaciones de las carnes. Muestras: sangre, piel, corazón, válvulas cardíacas, ganglios linfáticos, líquido sinovial articular, vísceras como hígado, bazo y riñón. Examen directo Observación microscópica: en tinción ó extensiones de sangre ó de tejido se observan bacilos cortos y finos, rectos ó encorvados, formando un ángulo, en parejas en V, en empalizadas ó en grupos. Son no esporógenos y Gram ( + ) Observación macroscópica: Se cultiva en Agar Sangre con cristal violeta y soda acídica de Packer mas kanamicina y neomicina, y en Caldo Nutriente con suero sanguíneo al 10%, en condiciones de microaerofília con CO2 al 5% a 37 grados durante 48 horas. Las colonias son lisas de bordes irregulares, pequeñas y redondas y los casos crónicos se ven hemololíticas. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 55  Colonias rugosas g Colonias Lisas Pruebas Bioquímicas: En Agar hierro de Kliger producen SH2 Al añadir H2 O 2(peróxido) es catalasa (- ) En el medio Edwars con esculina ( - ) al no hidrolizarla. En Caldo Nutriente no presenta motilidad. Pruebas Biológicas En ratones blancos suizos inoculados con dosis de 0.5-1ml por vía intrperito- nial mueren de septicemia aguda en un plazo de 24 horas. Examen indirecto Se realiza solo en la forma clínica crónica y se utiliza las técnicas de inmu- nofluorescencia y la aglutinación. Inmunoterapia: se emplea un inmunosuero desapareciendo la enfermedad. Inmunoprofilaxis: Se emplea el método simultáneo de serovacunación de Lorez formado por la mezcla de cultivo virulento con el antisuero. Se emplea una vacuna avirulenta con cepa viva y una bacterina. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 56 * Genero Listeria monocitógenes Introducción. Es una bacteria oportunista que se encuentra en las heces fecales de los ani- males y en el hombre puede constituir parte de la flora normal transitoria del intestino. Es una zoonosis. Agente etiológico: L. monocitógenes Enfermedad: Listeriosis Lesiones: Produce un cuadro clínico variado según la especie por lo común sucede en el Sistema Nervioso Central, con una meningitis intensa con in- filtración monocítica, esto último es un cuadro hemático de monocitosis ó mononucleosis. Especies susceptibles: en cerdos: origina un cuadro clínico nervioso. en aves: necrosis del miocardio en conejo: necrosis hepática en vacas y cabras: aborto en equino: septicemia en humano: meningitis Muestras: Se envía al laboratorio líquido céfalo-raquídeo, sangre, secreción genital, co- razón, encéfalo, médula ó bulbo raquídeo. Examen directo Observación microscópica: Son bacterias pequeñas, cortos y gruesa, Gram (+), no esporógenos, bacilos agrupados en V y en empalizada. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 57 Observación macroscópicas: Se cultivan en Agar Sangre con polimixin B y en Agar Mc Conkey; las colonias son pequeñas, redondas y beta hemolíticas en presencia de telurito de potasio, pueden ser oscuras con un aspecto verdoso en la periferia. Pruebas Bioquímicas: en el medio de Edwards con esculina la hidrólisis del mismo presenta colonias negras. No produce SH 2 Reduce N03 -N02 no aprovecha los azucares. en medios semisólidos tiene motilidad a 25 grados Pruebas Biológicas: La inoculación de una suspensión de la bacteria en conejos, curieles, coba- yos y ratas mueren en un plazo de 96 horas ocasionando lesiones necróti- cas, hepáticas y esplénicas. Examen indirecto Mediante la inmunofluorescencia, se puede aplicar una inmunoglobulina marcada para identificar el agente en las extensiones. * Genero Corynebacterium pyogenes Agente etiológico: C. pyogenes Enfermedad: Piobacilosis Lesiones: Se encuentran en la piel y mucosas ocasionando infecciones espo- rádicas con supuraciones crónicas, actua de forma oportunista Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 58 Especies susceptibles En cerdos ocasiona supuraciones crónicas, neumonía caseosa y poliartritis. Bovinos: supuraciones en la mastitis crónica y neumonías supuradas, aborto y poliartritis. En terneros. Ocasioan neumonías crónicas supuradas, onfaloflebitis y poliartritis En ovejas y cabras: ocasiona neumonia y mastitis. C. Equi En equinos: ocasiona bronconeumonías supuradas, con absceso en el pul- món, en ganglios linfáticos y cavidad peritoneal. En yeguas: produce una metritis y aborto En cerdos: abscesos encapsulados y neumonías. C. Renali En bovino: ocasiona pielonefritis y cistitis bovina En cerdos: abscesos renales. C. suis En cerdos: ocasiona pielonefritis y cistitis porcina C. Pseudotuberculosis En equino: causa una linfangitis ulcerosa equina, los vasos y ganglios linfá- ticos se inflaman y presentan úlceras parecidas al muermo. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 59  En ovejas y cabras: ocasiona linfoadenitis caseosa, necrosis caseosa en ganglios linfáticos. Muestras: pus de los abscesos Examen directo Observación microscópica: Son bacilos pleomorficos, Gram ( + ) Observación macroscópica. Se emplea Agar Sangre Examen indirecto Se utiliza la seroaglutinación rápida para el diagnóstico del Corynebacterim. pseudotuberculosis. * Bacilos Gram ( + ) esporulados - Genero Bacillus anthracis y Clostridium Genero Bacillus Introducción: Son bacilos aerobios, Gram (+)..endosporógenos, pueden presentar cadenas, las colonias son irregulares. Son microorganismos saprofitos, se encuentran en el suelo, agua, y el aire. Causan enfermedades de gran importancia eco- nómica con acción fatal en la ganadería de las zonas afectadas. Agente etiológico: B. anthracis Enfermedad: Ántrax, también se llama ¨carbunco bacteridiano¨, ¨fiebre, carbuncosa¨, ¨rayo¨ y ¨pústula maligna¨. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 60  Etiología. Bacillus anthracis. Lesiones: Existen tres formas de presentación clínica: sobreaguda, aguda, y subaguda. En la presentación sobreaguda: aparece repentinamente la fiebre, los anima- les pierden el equilibrio y caen, les resuma por la boca y la nariz una espuma sanguinolenta y en el ano se presenta una sangre oscura, mueren repenti- namente con disnea y convulsiones como si fueran fulminados por un rayo. En los casos de presentación clínica aguda y subaguda; se inicia con una fie- bre alta de 40-42 grados que se mantiene alta hasta próximo a la muerte. Tiene una respiración fatigosa, presenta anorexia, tiene diarreas con las he- ces mezcladas con sangre y orina rojo oscuro. En el examen postmorten se observa un infarto en el bazo, el cual tiene un color rojo oscuro y reblandecido, la sangre es rojo oscura e incoagulable, siendo esto el origen del término “carbono¨ de la enfermedad. El ántrax puede ser: anthrax pulmonar, cuando las esporas se inhalan y es mortal por las graves lesiones en el sistema respiratorio. anthrax cutáneo, es el resultado de una enfermedad dérmica debido a ero- siones de la piel. anthrax intestinal, cuando se consumen alimentos contaminados. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 61 Bacillus anthracis. Esta m micrografí icrogr icro fía e grafí afía electrónica lecttró le óni nica muestra ica m t un grupo de bacte- uest str rias de Bacillus anthracis en un capilar pulmonar. Especies susceptibles: En bovino, ovino, y equino: la enfermedad se presenta de color oscuro en órganos diana y en la sangre siendo incoagulable. En cerdos, perros y gatos: la enfermedad evoluciona como una faringitis aguda. En el hombre se ha presentado debido a las importaciones de lana, pelo y alimentos. Muestras: se recoge y envía pus de las lesiones local, esputos, sangre y tejido del animal enfermo, además las secreciones y excreciones antes de la muer- te, es conveniente además el envió de muestras de alimentos y de pastos. En los casos de los animales muertos no se puede hacer la necropsia, ya que el oxigeno favorece la esporulación y estando cerrado el proceso de la putre- facción destruye las esporas, es conveniente enviar un fragmento de tejido local como por ejemplo parte de las orejas. Examen directo Se tiene en cuenta el diagnostico clínico, el anatomopatológico y se procede al microbiológico. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 62 Observación microscópica: de las muestras de tejidos y líquidos de un animal enfermo se observan bacilos grandes y anchos rodeado de una capsula con sus extremos cuadrados, no esporulados, en cadenas cortas; si la muestra procede de una tejido que ha tenido contacto con el oxígeno, en la tinción Gram (+) se observa la presencia de esporas situada en el centro del bacilo. Observación macroscópica: Se requiere para el cultivo muestras de tejido y sangre de animales no putrefactos, de lo contrario sería muy difícil el aisla- miento. La muestra fresca se mantiene en suero fisiológico y se emplea como medio de cultivo el Agar Sangre a 37 grados, donde las colonias son de aspecto ru- goso, planas, grises y no hemolíticas. Pruebas Bioquímicas En el medio de gelatina es (+), con un crecimiento hacía el interior del sus - trato. En agar semisólido es inmóvil. Examen indirecto: Se emplea la técnica indirecta de precipitación de Ascoli-Valente, siendo muy efectiva para la comprobación de la presencia de bacteria en la muestra, don- de se aplica un suero hiperinmune (Ac.) con un alto contenido de precipitinas. Se procede con una muestra de tejido que puede ser un fragmento de car- tílago de la oreja, se tritura en agua obteniéndose un extracto en caliente, después se obtiene un líquido claro que contiene proteínas antracinas (preci- pitógeno), en la técnica al unirse ambos líquidos por difusión si se forma una anillo blanquecino se considera positiva la muestra. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 63 Pruebas Biológicas: La muestra se inoculan por vía subcutánea en cobayos y ratones: los anima- les mueren entre las 24-48 horas y del bazo e hígado se hacen frotis directos donde se observan bacilos, de estas muestras se procede al aislamiento en cultivos puros. Inmunoprofilaxis e Inmunoterapia Son efectivas las vacunas de cultivos vivos atenuados, así también las vacunas de esporas; como inmunoterapia se aplica un suero de efecto rápido pero de escasa duración. - Genero Clostridium histotáxicos Introducción: Son bacilos Gram (+), anaerobios, endosporógenos, catalasa (-), móviles, pro- ducen gas en determinados medios, son hemolíticos y se encuentran en su mayoría saprófitos del suelo y del tracto intestinal de los animales y el huma- no. Las especies del género se agrupan según el modo de acción en : a) Clostridium histotóxico aquellas especies que invaden los tejidos en donde causan las lesiones: C. chauvoei, sep cum, novyii y hemoly cum. b) Clostridium toxigénicos, aquellos que producen toxinas y se quedan en las puertas de entrada de la infección; C. tetani, botulinum y perfringens. Para su cultivo y crecimiento requieren estrictas condiciones de anaerobiosis, lo cual se realiza: En un recipiente herméticamente cerrado se extrae el aire sustituyéndolo por nitrógeno o hidrogeno con 10% de CO2. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 64  En medios líquidos, el sustrato contiene agentes ó sustancias reductoras como carne fresca picada ó 0.1% de agar junto a un agente reductor como el tioglicolato, adema de sellar la superficie con vaspar (vaselina mas parafina licuada que después solidifica), creciendo las bacterias en el fondo del reci- piente. Se emplea también un gaseado a presión de CO2 que desplaza el oxigeno de un recipiente de boca estrecha, quedando esta atmósfera cuando se cierra herméticamente. Empleo de una incubadora de anaerobiosis - Grupo de Clostridium histotóxicos C. chauvoei ó feseri Enfermedad: Carbunco sintomático ó pierna negra Lesiones: Los animales presentan hinchazón, edema y enfisema de los mús- culos y tejidos conjuntivos subcutáneos en la espalda y cuartos traseros. Especies susceptibles: terneros y ovejas Patogenia: La infección ocurre por la ingestión de las bacterias y sus esporas la cual llega al tejido conjuntivo subcutáneo y factores predisponentes del animal ayudan a su desarrollo y proliferación ocasionando las lesiones antes mencionadas. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 65 Muestras: músculos afectados. C. sepƟcum Enfermedad; edema maligno (en el hombre y raramente en los animales) causa fiebre y muerte en 2-3 días. Origina un edema sobre enfisema. Se produce un líquido edematoso gelati- noso y sanguinolento. Hay también hemorragias con necrosis de la mucosa y submucosa del cuajar o abomaso. Patogenia: Las bacterias producen una exotoxina letal, toxina necrotizante, hemotoxina y enzimas hialuronidasa, desoxirribonucleasa y colagenasa, pro- duce hemólisis en equinos, conejos y el hombre. Animales susceptibles: ovejas cobayos, vacunos, caballo, cerdo y hombre (origina gangrena gaseosa). Muestras: tejido afectado del estomago, líquido edematoso. C. novyi Enfermedad: Hepatitis necrótica infecciosa ó muerte negra (serotipo B) en bovinos y ovinos, prevalece en zonas bajas y pantanosas donde hay fasciola hepática. El serotipop A causa edema maligno en bovinos y el serotipo C osteomelitis en búfalos. Agente etiológico: Producida por Clostridium novyi tipo B junto a Fasciola he- pá ca. Hace falta la acción conjunta de los dos u otro parásito que provoque una acción hepática. Patogenia: Es una toxemia sobre aguda, donde el animal muere en las prime- ras 12 horas después de aparecer los síntomas. La bacteria se encuentra en el intestino de animales y el hombre. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 66 Por lo general sucede por el consumo de forraje que proceden de zonas bajas y pantanosas que vienen acompañado de fasciolas. No es diferente del resto de otras enterotoxemias porque aparece la muerte súbita o hay convulsión, depresión, coma y muerte. Necrosis hepática debido a la Fasciola, también hay congestión o decolora- ción del hígado. En condiciones normales los animales ingerirán esporas de C. novyi. las cuales se dirigen a intestino. Una vez allí, parte de esas esporas vía porta van al hígado y allí quedan latentes, (la espora necesita aerobiosis para germinar). El hígado tiene un potencial redox muy alto y no puede germinar, si hay necrosis por el efecto de la Fasciola hepá ca, disminuye el potencial redox y aparece la aerobiosis que necesita la espora para germinar. El Clostri- dium produce una toxina no compatible con el hígado, que lo colapsa. Animales susceptibles: ovejas y venado. Muestras: fragmentos de hígado En el examen post mortem da la piel, debido a una congestión venosa, tome un tinte oscuro conocido como “enfermedad negra”, en el hígado aparecen zonas necróticas verdosas donde se hallan las fasciolas jóvenes.. Examen Directo Observación microscópica Es un bacilo móvil con flagelos peritricos de 0,5- 1,5x1, 9-1,7 micras y se observan en parejas o filamentos, son Gram.(+), anaerobios estrictos, pleomorficos, esporulados, habitan el suelo y tracto gastrointestinal. C. hemolyƟcum Enfermedad: IHBB, ictero-hemoglobinuria bacilar bovina ó enfermedad de agua negra. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 67 Introducción: La enfermedad es provocada por la implantación de las esporas Clostridium haemolyticum en el hígado, el que requiere de factores predisponentes, fun- damentalmente el del daño hepático, que puede ser producido por parásitos entre otros factores y agentes; las esporas se desarrollan y extienden hasta un área de necrosis por coagulación que recibe el nombre de infarto pálido del hígado, patognomónico de esta enfermedad. Se caracteriza la enferme- dad por un cuadro hemolítico muy definido que puede variar con la evolución de la misma. Es un enfermedad de curso agudo y sobre agudo originando infarto claro del hígado; también ocasiona amplias hemorragias en el peritoneo parietal y se presentan hemorragias puntiformes (petequias) en la corteza renal. Hay ictericia en el tejido subcutáneo, la orina se presenta con un color oscuro (hemoglobinuria). Los animales toman el germen ó sus esporas con el consumo de alimentos y bebidas cuando pastan en zonas afectadas. Agente etiológico Es un bacilo móvil con flagelos peritricos de 0,6-1,6x1, 9-1,7 micras y , anae- robios estrictos, pleomórficos, habitan en el suelo y tracto gastrointestinal de los animales, intolerantes al oxigeno. Animales susceptibles: ovinos, bovinos y cerdos. Patogenia: actúa con sus toxinas sobre los tejidos. Alfa toxina---- es letal y necrotizante Beta toxina -----es una colagenasa. Epsilon toxina---es hemolítica Gamna y delta----son proteinasas. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 68 Muestras: hígado, sangre, orina. Examen directo: Observación microscópica: Son Gram(+), presentan endosporas, se observan en parejas, las esporas son anchas, ovales o espirales en posición central o subterminal. Cultivo Crecen en estrictas condiciones de anaerobiosis, podemos mencionar como medios al Caldo de hígado con hígado, y tioglicolate los que poseen reduc- tores de oxigeno o son preferentemente semisólido. Se puede emplear agar sangre para incubadoras de anaerobiosis o en cam- panas con gases reductores de oxigeno. Se incuban por 3 o más días, son de crecimiento lento, se describen colonias pequeñas lisas productoras de hemólisis beta muy amplia. Pruebas Bioquimicas - Son catalasa negativos, quimiorganotrópico y tiene capacidad sacarolitica y proteolítica, siendo gelatina positivo, ataca la leche tornasolada, reduce los nitratos a nitritos. En general es poco fermentativo. Diagnostico indirecto: Se puede realizar IFD, IFI (inmunofluorescencia * Diagnostico de Clostridium histotóxicos Examen directo Se realiza frotis con la muestra representativa, hígado, músculo, estómago y se tiñen de Gram, donde se observan bacilos azules (+). Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 69 En el C. hemoliticum los bacilos son largos y delgados con extremos redon- dos, cuando aparecen en cadenas presentan una espora terminal ó subter- minal en forma globoide. El C. septicum se observan como largos filamentos. Cultivo: Se emplea un medio líquido enriquecido ó caldo de hígado con hígado, ó cal- do con thioglicolato (agente reductor), se siembra en tres tubos, de estos dos se ponen en agua hirviendo durante 5 y 10 minutos respectivamente para eliminar el oxígeno, se incuban y después se siembran en Agar Sangre (89% de sangre mas 1% de glucosa) recientemente elaborado con la suspensión hística poniendo una placa en anaerobiosis y la otra en aerobiosis. Para la anaerobiosis se utiliza: Jarras anaeróbicas extrayendo el oxígeno del medio e insuflando gas hidró- geno o nitrógeno. En incubadoras anaeróbicas con el mismo procedimiento. Son agentes reductores la glucosa, tioglicolato, acido ascórbico, cisteína, for- maldehído, azul de metileno. Estos reducen el medio porque ceden electro- nes y por tanto se oxidan disminuyendo el potencial redox de los medios de cultivo. El peróxido de hidrógeno y el peroxido orgánico que se acumulan en el medio son los causantes de que las bacterias anaerobias mueran por la acumulación de oxígeno y se forma H2O 2; si la célula produce catalasa el H 2O 2 es elimina- do por esta enzima donde pueden reaccionar con varias sustancias reducto- ras que las células producen durante su crecimiento. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 70 Crecimiento Se comparan la placa situada en condiciones aerobias con la otra placa si- tuada en condiciones anaerobias. Si hay crecimiento en la última se le hace tinción de Gram a la colonia. En la observación macroscópica las colonias crece pequeñas, con bordes irregulares, son alfa hemolítico primero (difuso) y beta hemolítico después (zonas claras). C perfringen es el único cuyas colonias son redondas, grises y lisas. Prueba biológica: (inoculación experimental) A partir de la muestra se inoculan una suspensión de tejido en cantidad de 0.5ml. a 2 cobayos por vía intramuscular en la extremidad posterior, estos mueren antes de las 36 horas un edema sanguinolento, sin gas, en las cavi- dades serosas aparece liquido sanguinolento, esto lo produce el Cl. hemoly - cum. Del hígado se hacen frotis en Gram y se siembra en: a) Agar sangre b) Caldo de hígado con hígado y tioglicolato sellado con vas-par (vaselina parafina) y observar a las 48 horas. Pruebas bioquímicas: Se emplea un juego de discos impregnados con el o los sustratos que después se inoculan con el microorganismo puro en estudio. Estos resultados (+) y (-) se unen a las observaciones macro y micro para la identificación. Resultados del crecimiento del C. hemolyƟcum - Agar semisolido maltosa (negativo) - Suero Loeffer (negativo) Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 71 - Indol (+) - Reducción nitrato (negativo) En los tubos anaerobios hay enturbiamiento y después autoaglutinación, se produce gas con olor a queso. En placas de agar sangre a las 48 las colonias son pequeñas con bordes irregulares y hemolisis difusa. Diagnostico indirecto Con antisuero del Cl. chauvoei, septicum y novyi se inyectan cobayos sanos y después se inoculan con el cultivo problema; solo sobrevive el animal prote- gido con el antisuero homólogo ó específico. Procedimiento: de cada antisuero se inyectan 2 cobayos con 1ml., pasado 24 horas, se inyecta 1 de los cobayos por vía intramuscular con una dosis letal del cultivo problema. Obtención de la dosis de 0.1ml. a 1 ml. y se aplica a pa- rejas de cada una de las dosis. En la que mueren en la dosis letal. También se emplean técnicas de inmunofluorescencia, mediante antisueros marcados comercialmente con fluoresceína y rodamina. Diagnóstico Clostridium (grupo toxigénico). El diagnostico es clínico. Clostridium tetani Enfermedad: Tetano o pasmo (contracción espamódica de los músculos). Patogenia: El C. tetani penetra a través de la herida punzante, lesiones de la piel o mucosa, provienen de las heces fecales de animales que normalmente contienen el bacilo tetani. En el punto de entrada las esporas germinan y las formas vegetativas pasa a reproducirse y a producir la toxina tetánica lla- mada tetanospasmina produce una excitabilidad reflejas por acumulación de acetilcolina en las terminaciones nerviosas produciendo contracción de los músculos voluntarios, entre estas el musculo de la mandíbula, no pudiendo abrir la boca, produce una contracción general del cuerpo como una tabla Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 72 de planchar y se centraen los músculos intercostales y el diafragma trayendo como consecuencia la asfixia del animal. Existe otra toxina llamada tetanolisina que destruye los glóbulos rojos. Animales susceptibles: equinos, cerdos, monos y cabras. Menos sensibles: conejos, ovejas, bovino y cabras. Muestras: exudado de las heridas contaminadas Examen directo: Es difícil observarlo de la muestra y pueden verse bacilos rectos, móviles, con la espora en el extremo. Cultivo: Agar sangre es beta hemolitico, colonias de bordes regulares demostración de las toxinas: se neutraliza con la antitoxina. Clostridium botulinum Enfermedad: Botulismo (parálisis flácida parcial o total) Característica: Es una bacteria cuyas esporas pueden contaminar los alimentos, en condi- ciones de anaerobiosis producen exotoxinas, que al ser ingerida junto al ali- mento contaminado produce una intoxicación botulínica, debido al veneno en las embutidos Hay varios serotipos diferentes de las exotoxinas que al actuar según la espe- cie produce un cuadro clínico diferente. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 73 Serotipo A. produce “cuello blando” en las gallinas Serotipo C (alfa - botulismo ) en patos Serotipo C (beta) envenenamiento del forraje en equinos y bovinos Serotipo D = parálisis bulbar infecciosa del bovino Serotipo E= envenenamiento del forraje en caballos y mulos Serotipo A, B, E, F = botulismo en humanos. cefalea, vómitos, parálisis de los músculos, ojos, dificultad, en la deglución, sordera, muerte. Animales susceptibles y lesiones Aves: se presenta incoordinación locomotriz, caída de la cabeza. Equinos: ocasiona debilidad muscular, parálisis lingual, dificultad para masti- car, secreción salivar. Postración, micción involuntaria, y muerte. Bovino: parálisis de las extremidades, masticación difícil y debilidad. Patogenia: La exotoxinas que produce el Clostridium botulinum es una neurotoxina que causa una parálisis flácida de los músculos. Esta toxina es mas resistente que la tetánica y la diftérica al jugo gástrico, que al pasar al intestino se reabsorbe, pasa a sangre y va a afectar los músculos de la medula, el sistema cardiovas- cular y los músculos. También tiene las heridas como puerta de entrada y se han encontrado es- poras en diferentes órganos, tiene un periodo de incubación muy corto con frecuencia e/18-24 horas. Muestras: restos de alimentos, sangre, orina, vómitos, heces fecales, seg- mento de intestino grueso y delgado, encéfalo y médula espinal. Manual de Teoria Microbiologia Veterinaria II 74 Diagnostico directo Examen directo Son bacilos grandes Gram (+), filiformes entre formas cortas y filamentos lar- gos. En el medio ambiente produce esporas situadas próximo (subterminal) del bacilo. Cultivo: Se realiza en Agar Sangre en anaerobiosis y se utiliza diferentes temperaturas en dependencia del serotipo. Para los serotipos A, B, C, D y F = 30-40ºC serotipos E = 25-37ºC serotipos G = 30-37ºC Las colonias son irregulares, redondas con ramificaciones con hemólisis. Pruebas bioquímicas: Gelatina (+) al licuar la gelatina Lecitinasa (+) desintegra pedazos tisulares y la albúminas del huevo Es SH2 positivo. Peptonisa la leche, la glucosa, maltosa y glicerina positiva, fermenta produ- ciendo acido y gas, forma AGV, ácidos grasos, acético, butílico y láctico. Diagnostico indirecto: Existen dos procedimientos: 1. Macerar el alimento sospecho y suministrarlo a animales sanos de la mis- ma especie, lo cual producirá un cuadro clínico de parálisis típico de intoxica- ción botulínica. Autor: Ing. Radamés L. García A. MSc. 75 2. Se macera el alimento problema, con suero fisiológico estéril, se centrifuga y el líquido sobrenadante se pasa por filtro de Seitz, se inyecta intraperito- nialmente a cobayos adultos a dosis de 2ml. Se inyecta también en grupo testigo. A un grupo de cobayos se inyectan con cada una de las antitoxinas de cada serotipo, después se inoculan todos con el filtrado problema. Se morirán los cobayos no protegidos y los cobayos protegidos con una antitoxina no espe- cífica del serotipo problema, después de causarle la enfermedad. Clostridium perfringens /ó welchii Características: El patógeno habita normalmente en el intestino de animales y humanos, afuera permanece en forma de esporas durante años, permaneciendo en el suelo y causante de la gangrena gaseosa. Bajo el efecto de los antibióticos puede pasar a formar aerobios producien- do catalasa y peroxidasa. Produce una toxina compleja por su composición antigénica y estructura química que contiene varias fracciones (hemolisina y toxinas). Produce además enzimas tales como: - Proteinasas - Neuroaminidasa - Colagenasa - Gelatinasa - Fibrinolisinas - Desoxirribonucleasa - Hialuronidasa Actúa además combinado con la acción de las enzimas lecitinasa, colagena- sa y hialuronidasa como consecuencia el agente etiológico provoca la