Aula Teórica nº3_Polimorfismos Genéticos PDF

Genética Inês Rebelo Crespo Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Escola Universitária Vasco da Gama 2024/2025  Genética AULA TEÓRICA 2024/2025 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária 3º semestre...

Genética Inês Rebelo Crespo Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Escola Universitária Vasco da Gama 2024/2025  Genética AULA TEÓRICA 2024/2025 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária 3º semestre MEDICINA VETERINÁRIA 1 Polimorfismos Genéticos 2 Conceitos chave Gene = elemento de hereditariedade, transmitido dos pais para a respectiva descendência, durante a reprodução, que influencia um ou mais traços genéticos. E quimicamente? Gene = sequência de nucleótidos numa molécula de DNA. 3 Conceitos chave Numa população de organismos, nem todas as cópias dos genes têm a mesma sequência de nucleótidos: Ex.: 1) uma forma do gene tem o codão GCA, que determina a alanina na cadeia polipeptídica que o gene codifica. e 2) outra forma do mesmo gene pode ter, na mesma posição, o codão GCG que também determina a alanina È Assim, as duas formas do gene, codificam a mesma sequência de aa, contudo diferem na sequência de DNA! GCA alanina GCG 4 Conceitos chave As formas alternativas de um gene, num determinado locus, são designadas ALELOS do gene. Diferentes alelos, podem também codificar para diferentes aminoácidos, por vezes, com efeitos drásticos! Ex.: gene PAH codifica para a hidroxilase da fenilalanina (converte a fenilalanina em tirosina): no codão 408, a troca de CGG (arginina) para TGG (triptofano) resulta na expressão de uma enzima inactiva " resultado: fenilcetonúria! 5 Conceitos chave Dentro de uma célula, os genes estão arranjados de uma forma linear, em estruturas designadas de CROMOSSOMAS. Cromossomas homólogos Cada cromossoma, ao longo do seu comprimento, contém uma única molécula de dupla hélice de DNA, complexada com proteínas e altamente condensada. A posição física de um gene ao longo de um cromossoma é designada de LOCUS do gene (plural = LOCI) 6 Conceitos chave Na maioria dos animais, cada célula (excepto os espermatozóides e óvulos) contém duas cópias de cada tipo de cromossoma: um de origem materna e outro de origem paterna. Cada membro deste par de cromossomas é considerado HOMÓLOGO do outro (=par de cromossomas homólogos). È Por essa razão, em qualquer locus, cada indivíduo carrega dois alelos, porque cada alelo está presente na posição correspondente em cada um dos cromossomas homólogos materno e paterno. 7 Conceitos chave - genes polimórficos Um gene é polimórfico se tem mais de um alelo a ocupar o seu locus específico, dentro de uma população. Alelos Ocupam o mesmo locus em cromossomas homólogos Um alelo é considerado polimórfico se ocorrer na população a uma taxa de pelo menos 1%. Os alelos polimórficos apresentam diferentes sequências de nucleótidos.. Diferentes genótipos são definidos por diferentes combinações alélicas: vários alelos estão presentes, mas cada indivíduo possui apenas dois alelos! 8  Conceitos chave - genes polimórficos Podem existir mais de dois alelos numa população (i.e. A,B,C,D ou 1,2,3,4,5,6, etc). HAPLOTIPO = combinação de um grupo de alelos de loci adjacentes, que fazem parte do mesmo cromossoma, geralmente herdados como uma unidade: Ex.: A2, B1, C3, D2 para os loci A,B,C,D e 1,2,3,4,5,6. 9 Conceitos chave GENÓTIPO = constituição genética de um indivíduo. Para um determinado gene, se os dois alelos no locus de um cromossoma são indistinguíveis entre si, então, para este gene, o genótipo do indivíduo é HOMOZIGÓTICO Se os dois alelos no locus são diferentes entre si, então para este gene, o genótipo do indivíduo é HETEROZIGÓTICO 10 Conceitos chave Cromossomas homólogos 11 Conceitos chave Genes escritos em itálico Os alelos são distinguidos por letras maiúsculas e minúsculas (A versus a), inferior à linha (A1 versus A2), superior à linha (a+ versus a-) ou, por vezes, apenas + e – Usando estes símbolos, os genes homozigóticos poderiam ser indicados por qualquer uma das seguintes formas: AA, aa, A1 A1, A2 A2, a+ a+, a- a-, +/+, ou -/- Usando estes símbolos, os genes heterozigóticos poderiam ser indicados por qualquer uma das seguintes formas: Aa, A1 A2 a+ a- +/- N.B.: o “/” é por vezes usado para separar alelos presentes em cromossomas homólogos para evitar ambiguidade 12 Conceitos chave Enquanto os alelos presentes num indivíduo constituem o seu GENÓTIPO, a expressão física ou bioquímica do genótipo é o FENÓTIPO De uma forma simples: O genótipo de um indivíduo é o que está no interior (os alelos no DNA), enquanto que o fenótipo corresponde ao exterior (os traços observáveis, incluindo traços bioquímicos, comportamentais, etc). Essencial distinguir porque: a correspondência entre genes e traços não é proporcional e direta. !!! a maioria dos traços complexos, são influenciadas por vários genes. 13 Genomas e diferenças genéticas entre indivíduos 14 Todos diferentes ou todos iguais? 15 Genoma e diferenças genéticas entre indivíduos diferente O que difere entre genomas de 0,1% diferentes indivíduos da mesma espécie? - Mutações (responsáveis por doenças genéticas) - Diferenças hereditárias A maioria: inócuas e só podem ser detectadas por análise do próprio DNA (mas são importantes porque servem como MARCADORES igual 99,9% GENÉTICOS ou MARCADORES DE DNA). 16 Marcadores de DNA MARCADOR GENÉTICO = gene ou sequência de DNA com uma localização conhecida num cromossoma, que pode ser usado para identificar indivíduos ou espécies. Um marcador genético pode ser: - sequência curta de DNA (sequência envolvendo uma única alteração de par de bases) - sequência longa de DNA (sequência de DNA repetitivo de 10 a 60 pb que se repete várias vezes). 17 Marcadores de DNA Pode ser descrito como uma variação (devido a mutação ou alteração nos locais genómicos) que se pode observar. Um gene mutante, ou determinada porção de um gene mutante, pode servir como marcador genético. O padrão de transmissão de um marcador genético, de geração em geração, pode ser monitorizado. 18 Marcadores de DNA Embora estes marcadores genéticos sejam geralmente inofensivos, permitem que as posições dos genes de doenças sejam localizados e o seu DNA isolado, identificado e estudado. Marcadores genéticos detectados por análise directa do DNA são designados MARCADORES de DNA. Servem como marcos no DNA e permitem detectar diferenças genéticas entre indivíduos. Permitem identificar as posições de genes normais, mutantes, quebras nos cromossomas e outras características importantes na análise genética. 19  Marcadores de DNA A detecção de marcadores de DNA requer que o DNA genómico seja fraccionado em fragmentos de tamanho manipulável (milhares de pb), para poderem ser estudados em laboratório. DNA genómico: totalidade do DNA extraído das células de um organismo. 20 Polimorfismos genéticos e sua detecção 21 Então… VARIAÇÃO GENÉTICA (na forma de múltiplos alelos de muitos genes) existe na maioria das populações de organismos As diferenças genéticas entre indivíduos são designadas marcadores de DNA ou polimorfismos de DNA (formas múltiplas) Existem vários métodos de manipulação de DNA (sequenciação DNA, RFLP- PCR, DNA fingerprinting, Southern blot…) que podem ser usados para detectar diferenças entre indivíduos. Nenhum método é ideal para todas as aplicações, cada um tem vantagens e desvantagens… 22 Polimorfismos Alterações na sequência de DNA (ex.: substituições, inserções ou deleções), que ocorrem normalmente em regiões não reguladoras ou não codificantes e por isso não apresentam expressão fenotípica, não sendo patogénicas. Traduzem-se em: Diversidade individual numa população Milhares de polimorfismos herdados individualmente Elevada combinação de genótipos Perfil único e individual, determinado geneticamente (DNA fingerprinting) 23 Polimorfismos Marcadores genéticos moleculares Marcadores bioquímicos Marcadores moleculares Detectam variações no nível do Detectam variações no nível do DNA, produto génico como alterações nos nucleótidos (ex.: alterações em proteínas e aa.) (deleção, duplicação, inversão e/ou inserção) 24 Polimorfismos Os marcadores podem exibir dois modos de herança: Dominante: - Só se observa o alelo dominante. Co-dominante: - Permite distinção entre o padrão A1A1 A1A2 A2A2 A1A1 A1A1 A1A2 A2A2 genético de indivíduos homozigóticos e de heterozigóticos. - São marcadores mais informativos. Apenas o alelo dominante é Ambos os alelos se detectam no detectado no heterozigótico. heterozigótico. 25 Tipos de polimorfismos 26 Tipos de polimorfismos SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs SSCPs STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) Minissatélites (VNTRs) Microssatélites RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) 27 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) Ocorre quando as moléculas de DNA na população diferem num único par de nucleótidos. Ex.: algumas moléculas de DNA podem ter um par de bases G-C numa determinada posição, enquanto que indivíduo #1 outras moléculas de DNA, na mesma indivíduo #2 população, podem apresentar um par de bases A-T. Esta diferença constitui um SNP. 28 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) O SNP define dois “alelos” para os quais podem existir três genótipos entre os indivíduos de uma população: Homozigótico: A-T em ambos os cromossomas homólogos. Homozigóticos: G-C em ambos os cromossomas homólogos. Heterozigóticos: A-T num cromossoma e G-C no cromossoma homólogo. 29 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) No genoma humano, quaisquer duas moléculas de DNA escolhidas aleatoriamente, provavelmente diferem num local SNP em cada 1000-3000 bp em DNA codificante de proteínas e de cerca de um SNP em cada 500-1000 bp em DNA não codificante Considera-se a existência de um SNP se as moléculas de DNA diferirem FREQUENTEMENTE em determinada posição de nucleótidos. q Variações genéticas raras encontradas em menos de 1% das moléculas de DNA numa população não são consideradas SNPs, mas sim mutações pontuais. 30 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) SNPs são excelentes marcadores de DNA porque: são as formas mais comuns de diferenças genéticas entre indivíduos. estão distribuídos quase uniformemente ao longo dos cromossomas. 31 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) Tipos de SNPs: RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) SSCPs (Single Stranded Conformation Polymorphisms) Resultam da substituição de uma única base 32 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Princípio: RFLPs são fragmentos de DNA resultantes da ação de endonucleases de restrição: enzimas que cortam DNA longo em fragmentos curtos. Cada endonuclease de restrição tem como alvo diferentes sequências de nucleótidos numa cadeia de DNA e, portanto, corta em locais diferentes. 33 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Os locais de reconhecimento destas enzimas Exemplo: sequência curta de GAGC que ocorre têm geralmente 4 a 6 pb de comprimento. repetidamente numa amostra de DNA: Quanto mais curta for a sequência GAGCTTTCGATGCCAAATCGAGAGCTCAA reconhecida, maior a probabilidade de se repetir ao longo do DNA e maior será o GAGCTTTCGAGCGATGCCAGAGCAATCGAGAGCTCAA número de fragmentos gerados na digestão. Ex.: endonuclease de restrição que O número de vezes que a sequência GAGC se repete determinará o comprimento dos reconhece a sequência GAGC corta o DNA a fragmentos gerados pela enzima de restrição, cada repetição do padrão GAGC. que será assim diferente para cada amostra. 34 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 35 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) A distância entre os locais de clivagem de uma determinada endonuclease de restrição difere entre indivíduos. Assim, o comprimento dos fragmentos de DNA produzidos por uma endonuclease de restrição será diferente entre organismos individuais e espécies. Podem ser identificados por Southern blotting, porque os RFLPs fazem com que os fragmentos de DNA produzidos por digestão com a enzima de restrição sejam diferentes em número e tamanho. 36 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 37 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Southern blotting ETAPAS: - Extração DNA - Fragmentação DNA - Electroforese em gel - Visualização das bandas (sondas radiactivas) 38 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Nesta situação podem existir 3 genótipos: AA, Aa, aa 39 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Individuo homozigótico AA: apresentará Homozigótico AA 1 banda no gel. Individuo heterozigótico Aa: possuirá 2 Heterozigótico Aa bandas no gel. Individuo homozigótico aa: apresentará apenas 1 banda no gel. Homozigótico aa 40 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 41 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 1 2 3 4 5 6 1 D D D N: D: 42 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Os marcadores RFLP permitem a deteção de variações alélicas co-dominantes: Nos genótipos heterozigóticos Aa podem ser detetados ambos os alelos (A e a), estes alelos consideram-se co- dominantes. 43 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Pai Mãe Locus Locus 1 2 1 2 Os genótipos RFLP são Pais herdados. Para cada locus, Locus é herdado um alelo de cada 1 2 progenitor. Filho Padrão de bandas 44 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Qual dos alegados pais corresponde ao verdadeiro pai deste filho? Possível Pai 1 Possível Pai 2 Mãe Locus Locus Locus 1 2 1 2 1 2 Locus 1 2 Filho 45 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Qual dos suspeitos (S1 ou S2) estava na cena do crime? M S1 S2 V C M M S1 S2 V C M M S1 S2 V C M V = Vítima C = amostra da cena do crime M = padrão de peso molecular 46 Locus 1 Locus 2 Locus 3 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Aplicações do uso de marcadores RFLPs: Mapeamento do genoma Genotipagem Ciência forense Testes de paternidade Deteção de doenças hereditárias etc... 47 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Vantagens Marcadores podem cobrir todo o genoma. Expressão co-dominante permite identificar genótipos heterozigóticos e homozigóticos. Limitações Técnica trabalhosa (várias etapas) e difícil de automatizar. Uso de sondas radioactivas. Busca de marcadores é lenta, exige bibliotecas de DNA para a procura de sondas. 48 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) SSCPs (Single Stranded Conformation Polymorphisms) - Resultam da substituição de uma única base. - O princípio da deteção deste tipo de polimorfismos baseia-se no facto das cadeias simples de DNA possuírem uma conformação bem definida. - Após desnaturação, as cadeias únicas são sujeitas a um enrolamento tridimensional e podem assumir diferentes conformações de acordo com a sequência de DNA. 49 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) SSCPs Single Stranded Conformation Polymorphisms) Dependendo da estrutura que assumem, deslocam-se mais rápida ou mais lentamente num gel de electroforese (apesar do nº de nucleótidos ser semelhante) 50 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) SSCPs ALELO 1 ALELO 2 5’ A 3’ 5’ G 3’ (2 fragmentos de DNA de tamanho igual) 3’ 5’ 3’ 5’ T C Desnaturação Diferente conformação de das cadeias sequências com o mesmo comprimento! 5’ A 3’ 5’ G 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ T C (4 cadeias simples de DNA do mesmo tamanho, MAS com conformações distintas) 51 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) SSCPs Limitações Estados conformacionais estão dependentes das condições experimentais e diferenças na sequência podem não ser detectadas. Substituídos por técnicas de sequenciação (+ eficiência e exactidão). Aplicações Genotipagem 52 Tipos de polimorfismos SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs SSCPs STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) Minissatélites (VNTRs) Microssatélites RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) 53 STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) STRPs - repetição em tandem de número variável. - Uma curta sequência de DNA pode repetir-se muitas vezes, uma após a outra, em determinado locus do genoma. Úteis para: - genotipificação (identificação individual). - avaliação do grau de proximidade genética entre indivíduos. STRPs presentes em diferentes loci podem diferir: na sequência e comprimento da unidade de repetição. no número mínimo e máximo de cópias tandem que ocorrem em moléculas de DNA numa população. 54 STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) = SSLP = simple sequence length polymorphism Microssatélite Corresponde a um STRP com uma unidade de repetição de 2-9 pb = VNTR = variable number of tandem repeats Minissatélite Corresponde a um STRP com uma unidade de repetição de 10-60 pb 55 STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) Exemplo de um STRP com um número de cópias variável entre 2 a 5 número de cópias: Porque o nº de cópias (unidade de repetição) determina o tamanho de qualquer fragmento de restrição que inclui o STRP, cada molécula de DNA gera um fragmento de restrição de tamanho único, dependendo do número de cópias que contém. 56 STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) Numa população de indivíduos, um locus possui diferentes alelos - alelos múltiplos. Mesmo com múltiplos alelos, qualquer genótipo individual só pode possuir, no máximo, dois alelos diferentes. Contudo, um grande número de alelos numa população significa um número de genótipos ainda maior, o que torna os STRPs muito úteis na identificação individual. 57 STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) Por exemplo, considerando que numa população existem 10 alelos diferentes, isto significa que: Existem 10 genótipos homozigóticos diferentes! e 45 genótipos heterozigóticos diferentes! ? 58 STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) De uma forma geral, com n alelos existem: n genótipos homozigóticos e n(n-1)/2 genótipos heterozigóticos 10 (10-1)/2 = 10 (9)/2 n= 45 59 Tipos de polimorfismos SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) RFLPs SSCPs STRPs (Simple Tandem Repeat Polymorphism) Minissatélites (VNTRs) Microssatélites RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) 60 Mas… Há limitações nas técnicas de análise: Southern blotting: requer sondas disponíveis na forma de DNA clonado PCR: requer informação sobre a sequência (para síntese dos primers) Não é limitação nos animais mais estudados, mas, e nos restantes?! 61 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): são fragmentos de DNA amplificados ao acaso (“random”) pela técnica de PCR, utilizando iniciadores (primers) curtos de sequência aleatória. Estes primers ligam-se ao DNA alvo, ao acaso, em múltiplos locais. Assim, é possível trabalhar com qualquer espécie, uma vez que não é necessária nenhuma informação prévia acerca da sequência nucleotídica do DNA-alvo. O polimorfismo identificado é consequência de eventos de mutação, deleção e inserção. 62  Aplicação dos marcadores de DNA 63 Existem várias razões pelas quais existe interesse no estudo dos marcadores de DNA (polimorfismos de DNA): 1) Identificação individual - DNA fingerprinting - identificação do grau de proximidade genética 2) Epidemiologia e segurança alimentar 3) História da evolução, domesticação 4) Selecção e melhoramento animal 5) Identificação e localização dos alelos que determinam características de interesse 6) Acelerar a introdução de uma nova característica na criação. 64 Existem várias razões pelas quais existe interesse no estudo dos marcadores de DNA (polimorfismos de DNA): 65 Existem várias razões pelas quais existe interesse no estudo dos marcadores de DNA (polimorfismos de DNA): Testes de paternidade Identificação de indivíduos desaparecidos 66 Existem várias razões pelas quais existe interesse no estudo dos marcadores de DNA (polimorfismos de DNA): Ciências forenses 67 Existem várias razões pelas quais existe interesse no estudo dos marcadores de DNA (polimorfismos de DNA): 68 Existem várias razões pelas quais existe interesse no estudo dos marcadores de DNA (polimorfismos de DNA): Estudos Antropológicos 69